JP2002291484A - プロモーター活性を有する新規ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物において機能する、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターと同等程度の能力を有する、新規なプロモータ
ーを提供する。 【解決手段】 配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａ、配列番号１に示す塩基配列中１ｂｐから１２４３ｂ
ｐまでの塩基配列からなるＤＮＡ、又は、これらのＤＮ
Ａとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ
植物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡをプ
ロモーターとして使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、植物において構
造遺伝子を発現させるための新規なプロモーターに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年の植物分子生物学の発展に伴い、セ
ンス遺伝子やアンチセンス遺伝子を利用し、病虫害抵抗
性や除草剤耐性などの有用形質を備えた植物品種等を育
種することが可能となってきた。即ち、目的の形質の発
現に関与する構造遺伝子を、植物で機能するプロモータ
ーにセンス方向又はアンチセンス方向に連結してキメラ
遺伝子を作成し、これを植物に導入することにより、そ
の目的形質の発現を促進、抑制するのである。現在、既
に、かかる手法を応用して、例えば、Bacillus thuring
ensis由来の殺虫性ＢＴ毒素遺伝子をセンス方向に導入
した病虫害抵抗性植物（D.A.Fischhoff等、Bio/Technol
ogy、vol.232、p.738-743、1987）や、トマト果実の過
熟に関するポリガラクツロナーゼ遺伝子をアンチセンス
方向に導入した日持ち良好なトマト（C.J.Smith等、Nat
ure、vol.334、p.724-727、988）等が作出されている。

【０００３】このような形質転換植物を作成する場合
に、プロモーターとして最も汎用されているのが、カリ
フラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモー
ターである。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物とそ
の組織、そして構造遺伝子の種類を問わず非特異的に、
しかも強力な構造遺伝子の転写促進作用を発揮すること
から、上記の例を始め、実用上は専ら、このプロモータ
ーが用いられていると言っても過言ではない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、プロモーター
に関しては、いわゆるジーンサイレンシング現象という
ものが報告されている。これは、同一核内に同種のプロ
モーターが２以上存在すると、その転写促進作用が抑制
される、という現象である。

【０００５】従って、２以上の遺伝子を植物の同一染色
体に導入する場合に、これらの構造遺伝子にそれぞれ連
結するプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
１種類のみを使用したのでは、このジーンサイレンシン
グ現象が起こると考えられる。この場合には、ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター以外のプロモーターが必要であり、
かかるプロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと
同等程度の能力を有することが望ましい。

【０００６】本願発明は、上記問題点に鑑み、植物にお
いて機能する、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと同等程度
の能力を有する、新規なプロモーターの提供を目的とし
てなされたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記課
題を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞内タンパク
のＡＴＰ依存性分解に寄与するタンパク、ユビキチン構
造遺伝子の新規なプロモーターが、植物においてＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターと同等程度の能力を有すること、
つまり、植物とその組織、そして遺伝子の種類を問わず
非特異的に、しかも強力な構造遺伝子の転写促進作用を
恒常的に発揮することを見出し、本願発明を完成した。

【０００８】より具体的には、本願発明の上記課題は、
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１
に示す塩基配列中１ｂｐから１２４３ｂｐまでの塩基配
列からなるＤＮＡ、又は、これらのＤＮＡとストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物細胞におい
てプロモーター活性を有するＤＮＡにより解決される。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に、本願発明を詳細に説明す
る。

【００１０】本願発明において、構造遺伝子とは、ある
タンパクのアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの領域
をいい、開始コドンと終止コドンとに挟まれ、その内部
にはエキソンとイントロンとを含んでいる。プロモータ
ーとは、短い塩基配列からなるＤＮＡであって、これを
ＲＮＡポリメラーゼが認識することによってｍＲＮＡが
合成され、その下流域にある構造遺伝子の転写が開始さ
れ、遺伝子が発現する。もっとも、遺伝子の発現には、
ｍＲＮＡの合成の終結を制御する、ターミネーターと呼
ばれるＤＮＡ上のシグナルも必要である。通常、遺伝子
を導入して植物の形質を転換しようとする場合は、構造
遺伝子だけでなく、その上流に当該構造遺伝子の転写促
進作用を有するプロモーターを、下流にはターミネータ
ーを連結し、プロモーター、構造遺伝子及びターミネー
ターをセットにして植物染色体に導入する（ただし、以
下の説明においては、特に必要がない限りターミネータ
ーについての記載を省略する。）。

【００１１】本願発明においては、配列番号１に示す塩
基配列からなるＤＮＡはもちろん、この塩基配列中、構
造遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンよりも上流域、つまり
１ｂｐから１２４３ｂｐまでの塩基配列からなるＤＮＡ
のみでも、プロモーターとして使用することができる。
生物の遺伝子において、プロモーターとしての活性を有
するのは、ＡＴＧ翻訳開始コドンよりも上流の領域だか
らである。更に、本願発明においては、これらのＤＮＡ
とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
も、これが植物細胞においてプロモーター活性を発揮す
るものである限り、使用することができる（以上の３種
のＤＮＡを総称して、ユビキチンプロモーターともい
う。）。生物の遺伝子は、同じ機能を果たすもの同士で
も、各種ごと、また、各個体ごとに、そのＤＮＡの付
加、欠損、置換等によって、塩基配列はある程度相違す
るのが、むしろ普通である。従って、上記ＤＮＡと同一
でなくとも、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
又はこの塩基配列中１ｂｐから１２４３ｂｐまでの塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブ
リダイズする程度の相同性があり、植物細胞においてプ
ロモーター活性を有するものであれば、これらのＤＮＡ
と実質的に変わらないものとして、本願発明の目的を達
成すると考えられる。なお、ここでストリンジェントな
条件としては、緩衝液として６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム）、温度５５
℃を採用する。

【００１２】これらのユビキチンプロモーターは、ユー
カリ属の植物より、Doyleらの方法（Focus、12、p.13-1
5、1989）等の定法を用いて抽出したゲノムＤＮＡを鋳
型として、ポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）にて、
これを増幅することで得ることができる。ゲノムＤＮＡ
の抽出に用いるユーカリの部位に制限はないが、種子、
未展開葉、幼植物体等の幼若組織を用いる方が抽出操作
は容易となる。ＰＣＲは、配列番号1に示す塩基配列、
及び、必要に応じて公知のユビキチン構造遺伝子の共通
配列を参照し、対象となるゲノムＤＮＡからユビキチン
プロモーターを増幅するよう設計したプライマーを用い
て行う。

【００１３】なお、ユビキチンプロモーターは、その全
長をＰＣＲにて増幅することにより得てもよいが、その
一部をＰＣＲにて増幅し、得られたＤＮＡに、ホスファ
イトトリエステル法（H.Hunkapiller等、Nature、vol.3
10、p.105-111、1984）等の一般的な方法により化学合
成した他の部分を連結して得ることもできる。また、ユ
ビキチンプロモーターと共に、ユビキチン構造遺伝子の
一部又は全部をＰＣＲにて増幅し、得られたＤＮＡから
制限酵素等を用いて当該構造遺伝子の一部又は全部を除
くことで得ることもできる。もっとも、プロモーターと
共に得られた構造遺伝子の一部がイントロンである場合
には、これを除去しなくとも、さらにその下流に外来の
構造遺伝子を連結してそのまま使用することができ、こ
の方がむしろ有利とも言える。このようにイントロンを
介在させてプロモーターと構造遺伝子とを連結した場合
には、その構造遺伝子の植物細胞以外での発現を防止で
き、しかも、植物細胞でのその転写を一層促進させるこ
とがあるからである。もちろん、ユビキチンプロモータ
ーは、上記の化学合成法によりその全長を合成して得る
こともできる。

【００１４】本願発明のユビキチンプロモーターをプロ
モーターとして使用するにあたっては、換言すれば、請
求項１、２又は３に記載のＤＮＡによりある構造遺伝子
の転写を制御するためには、これらの下流域、一般的に
は、そのＤＮＡの下流１０ｂｐ以内に当該構造遺伝子を
連結する。ただし、プロモーターと構造遺伝子の最適な
位置関係は、構造遺伝子の種類や、最終的にその転写が
行われることとなる植物の種類等によっても異なるの
で、本願発明のユビキチンプロモーターと構造遺伝子の
具体的な連結位置も、ユビキチンプロモーターにより構
造遺伝子の転写が最も促進されるよう、適宜、決定すれ
ばよい。ユビキチン構造遺伝子のイントロンを介在させ
て、本願発明のユビキチンプロモーターと構造遺伝子と
を連結することも、上記した効果が期待されることか
ら、有利な方法である。

【００１５】本願発明のユビキチンプロモーターはユー
カリ属に由来するものであるが、構造遺伝子の種類やそ
の構造遺伝子が由来する生物の種類を問わず、プロモー
ターとして使用することができる。即ち、本願発明のユ
ビキチンプロモーターは、ユーカリ属のユビキチン構造
遺伝子のみならず、タバコ、イネ、ヤマナラシ等の植物
や、さらに微生物に由来する、ユビキチン構造遺伝子以
外の構造遺伝子の転写も制御することができる。連結さ
れる構造遺伝子の向きは、ユビキチンプロモーターに対
してセンス方向でもアンチセンス方向でも構わない。ユ
ビキチンプロモーターに対してセンス方向に構造遺伝子
を連結したキメラ遺伝子を植物細胞に導入した場合に
は、その植物細胞において、構造遺伝子が関与する形質
の発現は増幅され、一方、アンチセンス方向に構造遺伝
子を連結したキメラ遺伝子を植物細胞に導入した場合に
は、同じ植物細胞において構造遺伝子が関与する形質の
発現は抑制される。

【００１６】また、構造遺伝子の下流に連結されるター
ミネーターとしては、その構造遺伝子本来のものの他、
ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナル（A.Depick
er et al.、J.Mol.Appl.Gen.、1:561、1982）、オクト
ピン合成酵素のポリアデニル化シグナル（J.Gielen et
al.、EMBO J.、3:835、1984）等を使用することができ
る。

【００１７】以上のようにしてユビキチンプロモータ
ー、構造遺伝子、ターミネーターが連結されたキメラ遺
伝子は、公知の方法により植物染色体に導入することが
できる。具体的には、このキメラ遺伝子は、マイクロイ
ンジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエ
チレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネ
トレーション法等を用いて、そのまま植物細胞に直接導
入することも、あるいは、植物への遺伝子導入用プラス
ミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあ
るウィルスや細菌を介して間接的に植物細胞に導入する
こともできる。かかるウィルスとしては、例えば、カリ
フラワーモザイクウィルス、ジェミニウィルス、タバコ
モザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が使用で
き、また、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens 以下、Ａ．
ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リ
ゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）等を使用する
ことができる。Ａ．ツメファシエンスを用いるアグロバ
クテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合に
は、かかるプラスミドとして、例えばｐＢＩ１０１、ｐ
ＢＩ１２１（いずれもClontech社）等を用いることがで
きる。なお、こうして得られた遺伝子導入細胞から植物
体を再分化させるためには、その植物の種類等に応じた
適当な条件下でこれを培養すればよい。

【００１８】遺伝子導入の対象となる植物の種類は特に
限定されない。基本的に、ユビキチン遺伝子を有してお
り、ユビキチンタンパクの発現が認められる植物であれ
ば、本願発明のプロモーターは所定のプロモーター活性
を発揮し、本願発明の効果を得ることができると考えら
れる。ちなみに、ユビキチンタンパクは原核生物から真
核生物まで普遍的に分布している。従って、本願発明の
プロモーターは、殆どの植物、例えば、タバコを始め、
イネ、アラビドプシス、ペチュニア等の草本植物、ポプ
ラ、ユーカリ、アカシア、スギ、マツ等の木本植物全て
に使用することができ、また、本願発明の効果を得るこ
とができると考えられる。

【００１９】

【作用】ユビキチンは、前記のように原核生物から真核
生物まで普遍的に分布する細胞内タンパクであり、真核
細胞中では８．５ｋＤａのタンパクとして細胞質膜、細
胞質及び核に存在している。ユビキチンは、細胞質にお
いてはＡＴＰ依存性のタンパク代謝経路にて、目印とし
て機能する。即ち、細胞内で何らかの理由により不要に
なったり、望ましくない修飾や変性を受けたタンパクに
はユビキチンが結合した後、このタンパク−ユビキチン
複合体がＡＴＰ依存性プロテアーゼによって分解され
る。

【００２０】真核細胞においては、こうしたユビキチン
の構造遺伝子は、熱の上昇や金属（亜ヒ酸塩等）濃度の
増大といった、細胞に加えられるストレスによりその転
写が促進されると考えられており、事実、現在までに酵
母、トウモロコシ、マウス、アレチネズミ、ニワトリ等
で、かかるストレスの存在によって、ユビキチンｍＲＮ
Ａ及び／又はユビキチンタンパクのレベルが増大したこ
とが報告されている。そして、このような場合に構造遺
伝子の転写を制御するユビキチンプロモーターには、以
下に示す熱ショック配列と呼ばれる、遺伝子のストレス
応答性の転写促進に関与するコンセンサス配列が存在
し、この配列は真核細胞中で高度に保存されていた。

【００２１】 熱ショック配列：−ＣＴＧＧＡＡＴＮＴＴＣＴＡＧＡ− （但し、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか１種である。）

【００２２】ところが、本願発明者らは、ユーカリより
単離されたユビキチンプロモーターにはこの熱ショック
配列が存在せず、このプロモーターが恒常的にその下流
の構造遺伝子の転写を促進すること、しかも、その転写
促進作用は強力であり、植物組織や構造遺伝子の種類を
問わず非特異的に機能することを見出した。一方、この
ユビキチンプロモーターと共に、同じくユーカリから単
離されたユビキチン構造遺伝子は、他の植物から単離さ
れたユビキチン構造遺伝子と非常に高い相同性を示して
いる。つまり、ユーカリにおいては、他の植物において
見出され、ストレスに応答してその転写が促進されるユ
ビキチン構造遺伝子が、他の植物、更には微生物や動物
のユビキチンプロモーターとは全く異なるプロモーター
に制御されていることになる。これは、これまでのユビ
キチンに関する知見からは、全く予想されなかった、驚
くべき事実である。

【００２３】

【実施例】以下に、本願発明を実施例に基づいて説明す
る。

【００２４】［実施例１］１．ユーカリゲノムＤＮＡの単離・精製 播種後、約６ヶ月間生育させたユーカリプタス・グロブ
ルス（Eucalyptus globurus 以下、Ｅ．グロブルスと
略す。）より完全に展開する前の葉を採取し、液体窒素
下で粉砕した。この粉砕した葉を材料として、Doyleら
の方法（Focus、12:13、1989）に従い、できるだけ物理
的損傷を受けないようにしてゲノムＤＮＡの単離・精製
を行ったところ、材料に供した葉約１０ｇ（新鮮重）当
り約１ｍｇのゲノムＤＮＡを採取することができた。

【００２５】２．ユーカリゲノムＤＮＡライブラリーの
作成 １で得られたユーカリゲノムＤＮＡ２０μｇをＨ緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）
２００μｌに溶解し、これに１^-4ユニットの制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（東洋紡績（株）製）を加えて３７℃で部分消
化を行い、１時間後、反応液にエチレンジアミン四酢酸
塩（ＥＤＴＡ）を５０ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を０．５％加えて反応を停止させた。なお、
ここでユニットとは、上記緩衝液５０μｌに溶解したラ
ムダＤＮＡ１μｇを、３７℃、６０分間で完全に分解す
る酵素活性を１ユニットとする単位である。部分消化さ
れたＤＮＡは、反応停止後の反応液に２．５倍量のエタ
ノールを加え、−８０℃で１時間冷却することにより析
出させ、遠心分離によりこれを回収した。この結果、ベ
クターに連結可能なゲノムＤＮＡの部分消化物１４μｇ
を得ることができた。

【００２６】次いで、このユーカリゲノムＤＮＡ部分消
化物を、ラムダファージベクターに連結した。即ち、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸
化処理した置換型のラムダファージベクターＺＡＰＩＩ
（STRATAGENE社製）２μｇと上記のようにして得られた
ゲノムＤＮＡ部分消化物５μｇとを、ＡＴＰ１ｍＭ及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績（株）製）２ユニットの
存在下、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ
７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ）２０
μｌ中で１６℃、１晩反応させた後、６５℃で５分間熱
処理を行って反応を停止させ、組換えファージＤＮＡを
得た。なお、ここでのユニットとは、上記緩衝液２０μ
ｌに溶解させたラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ
分解物６μｇを、１６℃、３０分間で９０％以上ライゲ
ーションさせる酵素活性を１ユニットとする単位であ
る。得られた組換えファージＤＮＡは、ラムダファージ
外被タンパクと混和し、２２℃、２時間放置してin vit
roパッケージングを行い、組換えＤＮＡを有するラムダ
ファージを再生した（STRATAGENE社製 in vitroパッケ
ージングキット Gigapack GOLDを使用。）。

【００２７】一方、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´株
を１０ｍｌのＬＢＭＭ培地（トリプトン１％、食塩１
％、酵母エキス０．５％、硫酸マグネシウム１０ｍＭ及
びマルトース０．４％）に接種し、３７℃で１２時間振
とうして前培養した。前培養後、遠心分離により菌体を
集めて、予め４℃に冷却された１０ｍＭの硫酸マグネシ
ウム１０ｍｌに懸濁し、ラムダファージを感染しやすく
しておいて上記の組換えラムダファージと混和し、３７
℃、１５分間放置してこれに感染させた。感染後の菌
は、０．７％アガロース含有ＬＢＭＭ培地に懸濁し、更
にこの懸濁液を、１．５％の寒天で固化させたＬＢＭＭ
培地の表面に薄く広げ、３７℃で１２時間培養を行っ
た。培養後、このシャーレにＳＭ緩衝液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、７
ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．０１％ゼラチン）１０ｍｌを添
加して４℃で８時間保持した後、この緩衝液を回収し、
得られた回収液をユーカリゲノムＤＮＡライブラリーと
して以後の操作を行った。

【００２８】３．ユーカリユビキチン遺伝子の単離と塩
基配列の決定 ２で得られたユーカリゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型
として、ＰＣＲ法により、ユーカリユビキチン遺伝子を
含むＤＮＡ断片の増幅を行った。

【００２９】即ち、プライマーとして、アラビドプシ
ス、イネ、インゲンマメのユビキチン遺伝子においてＡ
ＴＧ翻訳開始コドンより２７２〜２９１ｂｐ下流側に存
在する共通領域に対応したプライマーＡ（５´−ＧＴＣ
ＣＴＧＤＡＴＹＴＴＮＧＣＹＴＴＮＡＣＲＴＴＲＴＣ
なお、ここでＤはＧ、Ａ、Ｔのいずれか１種、ＹはＴ、
Ｃのいずれか１種、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃのいずれか１
種、そしてＲはＧ、Ａのいずれか１種を示す。）と、Ｚ
ＡＰＩＩベクターのクローニングサイト脇に存在する一
方の領域に対応したＫＳプライマー（５´−ＴＣＧＧＧ
ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣ）とを用い、上記ライブラリー
を鋳型としてＰＣＲ法を行い、増幅されたＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動にて分離したところ、約２ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。そこで、このＤＮ
Ａ断片の両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平
滑化した後、ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化
し、プラスミドｐＵＣ１９の脱リン酸化処理したＳｍａ
Ｉ制限酵素部位に組込んでサブクローニングを行い、こ
のサブクローニングされたＤＮＡ断片について、ダイデ
オキシ法により塩基配列を決定した。なお、このとき、
ダイデオキシ法の反応試薬としてはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
^ＴＭ Dye Terminater Cycle Sequencing ReadyReactio
n Kit（Perkin-Elmer社製）を、塩基配列の決定に当っ
てはＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエンサー Mod
el 373S（Perkin-Elmer社製））を使用した。

【００３０】決定された塩基配列を配列番号１に示す。
このＤＮＡ断片は、５´末端から１２４４ｂｐの位置に
存在するＡＴＧ翻訳開始コドン以下の構造遺伝子の領域
に関しては、他の公知の植物ユビキチン構造遺伝子と非
常に高い相同性を有している。しかし、このＤＮＡ断片
は、ＡＴＧ翻訳開始コドンよりも上流のプロモーター領
域に熱ショック配列を有しておらず、このプロモーター
領域の構造に関し、公知のユビキチンプロモーターと全
く異なっている。

【００３１】４．ユーカリユビキチンプロモーターの活
性の確認 ３で塩基配列が決定されたＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ制
限酵素部位を含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅
した後、これをＢａｍＨＩ制限酵素にて消化して、植物
形質転換用ベクターｐＢＩ１０１（CLONTHEC社製）のＢ
ａｍＨＩ制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐＥｇＵｑ
−ＧＵＳを作成した。このｐＥｇＵｑ−ＧＵＳにおい
て、上記ＤＮＡ断片の下流約１２００ｂｐにはβ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）構造遺伝子が位置し、上記ＤＮ
Ａ断片がプロモーターとして機能する場合には、ＧＵＳ
構造遺伝子の発現が制御されるようになっている。

【００３２】次いで、このｐＥｇＵｑ−ＧＵＳをアグロ
バクテリウム法により、タバコ（Nicotiana tabacum L
cv. SR-1）に導入した。即ち、ｐＥｇＵｑ−ＧＵＳをエ
レクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥ
ＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パ
ルスとして２５００Ｖ、２５μＦを付与。バイオラッド
社製 GENE PUSERII を使用。）後、このＡ．ツメファシ
エンスをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地
（トリプトン１％、食塩０．５％、酵母エキス０．５
％）で２８℃、２日間培養することにより選抜し、これ
を種子発芽後４週間無菌培養したタバコの葉に感染させ
た。

【００３３】感染は、約５ｍｍ角に切断した上記タバコ
葉を、ｐＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入Ａ．ツメファシエンスの
培養液に、その葉の表皮を下にして１〜３分間浸漬する
ことにより行った。感染処理後の葉片は、滅菌した紙タ
オル等で付着している培養液を除去してから、カルス誘
導培地（ムラシゲ・スクーグ（以下、ＭＳと略す。）基
本培地、３％しょ糖、０．８％寒天、１ｍｇ／ｌナフタ
レン酢酸、０．１ｍｇ／ｌベンジルアデニン）に置床
し、２５℃連続照明下で３日間培養、更にシュート形成
用培地（ＭＳ基本培地、３％しょ糖、０．２５％ゲラン
ガム、０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベン
ジルアデニン、１００ｍｇ／ｌカナマイシン 、５００
ｍｇ／ｌカルベニシリン）に移植して同じ温度・光条件
下で培養を続け、茎葉を分化させた。分化した茎葉は、
シュート形成用培地での培養から約４週間後に切取り、
カナマイシン１００ｍｇ／ｌとカルベニシリン５００ｍ
ｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ基本培地（しょ糖３
％、寒天０．８％又はゲランガム０．２５％も添加。）
に移植して、同じ温度・光条件下で約４週間培養するこ
とにより発根させて植物体を再生した後、バーミキュラ
イト（日本耐火工業社製）とピートモス（和泉農材製）
を１:２の割合で混合した培養土に移植して、２５℃の
温室で生育させた。

【００３４】得られたｐＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入タバコ、
即ち、前記３で単離されたＤＮＡ断片とＧＵＳ構造遺伝
子が連結されたキメラ遺伝子を有するタバコについて、
その茎頂点、茎、葉、根及びカルスを対象とし、Jeffer
sonらの方法（Plant Mol.Biol.Rep.、vol.5:387、198
7）に準拠してＧＵＳ活性を測定した。その結果、いず
れの組織においても、その組織全体で強いＧＵＳ活性が
認められ、これらの組織の全体においてＧＵＳ遺伝子が
強く発現していることが確認された。これは、前記３で
単離されたＤＮＡ断片が、タバコ細胞において、その下
流に位置するＧＵＳ構造遺伝子の強力な転写促進作用
を、組織非特異的に発揮することを示すものである。

【００３５】［実施例２］実施例１の４にて得られたｐ
ＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入Ａ．ツメファシエンスを、無菌培
養された交雑ヤマナラシ（Populus sieboldii×P.grand
identata）Ｙ６３の葉柄に感染させた。

【００３６】感染処理後の葉柄は、感染に用いたＡ．ツ
メファシエンス培養液をその表面より除去してから、ゼ
アチン０．５ｍｇ／ｌを含み、ＮＨ₄ ⁺、ＮＯ₃ ^-の濃度を
それぞれ１０ｍＭ、３０ｍＭとした改変ＭＳ培地（３％
しょ糖、０．８％寒天）に置床して３日間培養し、次い
で、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ
／ｌ、カルベニシリン４００ｍｇ／ｌを添加した改変Ｍ
Ｓ培地（３％しょ糖、０．８％寒天）に移植し、約４ヶ
月培養して茎葉を分化させた。ｐＥｇＵｑ−ＧＵＳが導
入された交雑ヤマナラシは、この茎葉を、無機塩成分を
２／３に希釈したホルモンフリーＭＳ培地（しょ糖３
％、寒天０．８％又はゲランガム０．２５％、カナマイ
シン１００ｍｇ／ｌ、カルベニシリン４００ｍｇ／ｌ）
に移植して発根させることにより得た。

【００３７】なお、以上の実験で、特に記載しない条件
等は実施例１の４と同様にして行った。

【００３８】得られたｐＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入交雑ヤマ
ナラシについて、実施例１の４と同様にしてＧＵＳ活性
を測定したところ、タバコの場合と同様に、いずれの組
織においても、その組織全体で強いＧＵＳ活性が認めら
れ、これらの組織の全体においてＧＵＳ遺伝子が強く発
現していることが確認された。これは、実施例１の３で
単離されたＤＮＡ断片は、交雑ヤマナラシにおいても、
その下流に位置するＧＵＳ構造遺伝子の強力な転写促進
作用を、組織非特異的に発揮することを示すものであ
る。

【００３９】［実施例３］実施例２にて得られ、温度２
５℃で生育させたｐＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入交雑ヤマナラ
シのうち３個体を、温度４２℃の環境に移し、０、１、
３又は８時間後に葉を採取して粗酵素液を抽出し、この
粗酵素液につき、実施例１、２と同様、Jeffersonらの
方法に準拠してＧＵＳ活性を測定した。粗酵素液は、上
記交雑ヤマナラシから採取された葉を液体窒素で凍結
し、これに酵素抽出溶液（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、０．１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ βメルカプトエタノ
ール、ｐＨ７．５）を加えてポリトロンホモジナイザー
で破砕した後、２３０００ｇ、４℃で５分間遠心するこ
とによって分離した上清を用いた。

【００４０】その結果、これらの粗酵素液は全て強いＧ
ＵＳ活性を示し、高温下での培養及びその培養時間によ
るＧＵＳ活性の差は認められなかった。従って、実施例
１の３で単離されたＤＮＡ断片は、熱ショックの有無に
関わらず、恒常的に、その下流に位置するＧＵＳ構造遺
伝子の転写を促進すると考えられる。

【００４１】［実施例４］無菌下で播種し、出芽させた
Ｅ．グロブルスの胚軸を、実施例１の４にて得られたｐ
ＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入Ａ．ツメファシエンスの培養液に
１〜５分間浸漬することにより、このＡ．ツメファシエ
ンスに感染させた。

【００４２】感染処理後の胚軸は、感染に用いたＡ．ツ
メファシエンス培養液をその表面より除去してから、ゼ
アチン１．０ｍｇ／ｌを含む改変ＭＳ培地（３％しょ
糖、０．８％寒天）に置床して３日間培養し、次いで、
ゼアチン１．０ｍｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ、
ティカルシリン５００ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地
（３％しょ糖、０．２５％ゲランガム）で培養して、ｐ
ＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入ユーカリカルスを得た。

【００４３】なお、以上の実験で、特に記載しない条件
等は実施例１の４と同様にして行った。

【００４４】得られたｐＥｇＵｑ−ＧＵＳ導入ユーカリ
カルスについて、実施例１の４と同様にしてＧＵＳ活性
を測定したところ、タバコ及び交雑ヤマナラシの場合と
同様に、いずれの組織においても、その組織全体で強い
ＧＵＳ活性が認められ、これらの組織の全体においてＧ
ＵＳ遺伝子が強く発現していることが確認された。これ
は、実施例１の３で単離されたＤＮＡ断片は、Ｅ．グロ
ブルスにおいても、その下流に位置するＧＵＳ構造遺伝
子の強力な転写促進作用を、組織非特異的に発揮するこ
とを示すものである。

【００４５】

【発明の効果】本願発明により、植物とその組織、そし
て遺伝子の種類を問わず非特異的に、しかも強力な構造
遺伝子の転写促進作用を有するプロモーターが提供され
る。しかも、このプロモーターは、かかる転写促進作用
を恒常的に発揮する。

【００４６】即ち、本願発明により、ＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの転写促進作用に匹敵する、新規なプロモー
ターが提供される。

【配列表】 ＜１１０＞ 日本製紙株式会社 Nippon Paper Industries Co.,Ltd. ＜１２０＞ プロモーター活性を有する新規ＤＮＡ断片 ＜１３０＞ ５ −ＢＩＯＪＯ ＜１６０＞ ３ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ １５４２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Eucalyptus globulus ＜２２０＞ ＜２２１＞ promoter ＜２２２＞ （１）．．．（１２４３） ＜４００＞ １ gaattcgcaa gccagtgaaa gatcgtggat attgaagaga ggagaaaaac atgaaaactt 60 ctttccactt ttgacttaaa tcccacacgc agctttggtt gcgaacaaaa ggatcttcat 120 ttcttttgtt ttttcatcag acatacgaag ttcctgccac cctgttgagc attagccaaa 180 gtctataatt gattttggac ctcatatttg aagactcaac aatttagaat cgtgtcaacc 240 tcgctttgca ttccttcagc aactaccata ctccaatcaa aatgaatctc aagggcatgc 300 taaacttcca cgatttatta gccactaata tttatcaaca cttccctgta ataacttaat 360 ccaaataaaa tcaggcaatc gttgctagca taattaaatt taacactaac aggaattaaa 420 acttgacatg gcgtaccttt ttcctctcat ggacttcaga cgatactagc cagatgagca 480 cattaacttt acacccgctt gttcatggtc ccttagtaag caaacaaaat ctgaataccg 540 aaaccaagtg tcctgtaaat tagttcacca ataattacta gtgtacatcc acttagtcgc 600 gccctttaaa tttctttgat cgcattccat ggcaccagga gtcgtcgtat tggaccggtg 660 cgagccacct cgtgatcgcc gcgtgtcgat ttcccattgg gttgtctttg ctggtagatg 720 tcggttgaca gtcgccctgc ctcaactggg aatcttgaaa atatcaataa agttacgtaa 780 ttagtcgtaa aaaaatgagt aattaaattt cgtgcccaaa aaagtgacta atttatttat 840 ttattgccga aattaattga cattagttgc cccttacctt tttttagtcg ctttccatgg 900 cacctagagt tgccgtattg gactggtgcg agccacgtga tgaccgctac gtgtcggcct 960 cccattggtt tctttacata tataaaagct tgttgttggc caattcctgt tcttgttcca 1 020 ctaatacggc aactcactct ctctcctctc tctctctctc tctctctctc tctcggattt 1 080 catctctctt tcccgattga ttcccggcca agccctcaag gtggccttct caatctcttg 1 140 gtcttgaatc tgggttctcg tttcctgttc ttcgcgtttt cttgatttct cgggtccgac 1 200 ggttgaaagg aaggctcaaa ttcgtgtttt gttggctttg cag atg cag atc tcc 1255 gtc gag aca ctc acc ggg aag ctc cga cac cat caa caa cat caa ggc 1303 caa gat cca gga caa gga aga cat ccc gcc gga cca gca gcg cct gat 1351 ctt tgc cgg caa gca tct cga gga cag cag cac cct tgc cga tta caa 1399 cat cca gaa gga ggc cac cct cca cct tgt gct cag gct ccg ggg agg 1447 cag gca gat ctt ccg taa gtc tca ccg gcg aga cca tta agc tcg agg 1495 tcg aga gct ccg aca cca tcg aca acg taa aag cca aga tcc agg ac 1542 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ２７ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜２２０＞ ＜２２３＞ primer for PCR ＜４００＞ ２ gtcctgdaty ttngcyttna crttrtc ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜２２０＞ ＜２２３＞ primer for PCR ＜４００＞ ３ tcgggtcgac ggtatc

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 海老沼 宏安 東京都北区王子５丁目21番１号 日本製紙 株式会社技術研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD03 CD06 CD09 CD10 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 CA01 FA02 FA07 GA17 4B065 AA88X AA88Y AB01 AB08 AC14 BA01 CA53

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列中、１ｂｐか
   ら１２４３ｂｐまでの塩基配列からなるＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡとストリ
   ンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物細胞に
   おいてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ、そ
   の転写が当該ＤＮＡにより制御される構造遺伝子、ター
   ミネーターをこの順で有するキメラ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のキメラ遺伝子を有する
   組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のキメラ遺伝子が導入さ
   れた植物細胞。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の植物細胞から再生され
   た植物体。