JPWO2006098423A1 - 植物に環境ストレス耐性を付与するポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含むベクター；このベクターを導入した形質転換植物体などを提供する。本発明の配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、植物に耐塩性を付与することができるので、本発明の形質転換植物体などは、塩集積土壌の緑化、塩集積土壌における農耕などに有用である。
Description
本発明は、植物に塩ストレス耐性を付与するポリヌクレオチド、および、このポリヌクレオチドを導入した形質転換植物などに関する。
植物が受ける環境ストレスには、塩、乾燥、高温、低温、空気汚染など様々なものがあるが、農業生産の観点から最も問題となっているのが塩および乾燥である。
地球上の不毛乾燥地域は、陸地の１／３までも占め、さらに６万ｋｍ２／年（九州と四国を合わせて面積）ずつ増大している。また、熱帯雨林は１３万ｋｍ２／年（北海道と九州を合わせた面積）ずつ減少している。多くの農耕地において水分蒸発による土壌中塩分（主に塩化ナトリウム）の地表層集積が問題になっており、地球上に分布する塩集積土壌の総計は９５５万ｋｍ２である。これは、アメリカ合衆国の国土面積に匹敵する。
一方、地球上の餓死者は、２８人（うち子供２１人）／分であり、餓死人口は１，５００万人／年になる。世界の２／３以上の人は、空腹を満たされておらず、世界的な食糧の枯渇は明白である。さらに世界人口は増加傾向にあるため、２０３０年ごろに「世界食糧恐慌」が予測される。
また、近年地球温暖化が深刻化していることから、環境問題の観点からも、生物による大気中二酸化炭素の固定量を増大させる必要性が高く、塩集積土壌の緑化が強く望まれている。
一方、耐塩性植物の研究は種々行われており、例えば、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２に関する報告がある（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｓｈｏｗｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．，１１，１１９５−１２０６（１９９９）参照）。
地球上の不毛乾燥地域は、陸地の１／３までも占め、さらに６万ｋｍ２／年（九州と四国を合わせて面積）ずつ増大している。また、熱帯雨林は１３万ｋｍ２／年（北海道と九州を合わせた面積）ずつ減少している。多くの農耕地において水分蒸発による土壌中塩分（主に塩化ナトリウム）の地表層集積が問題になっており、地球上に分布する塩集積土壌の総計は９５５万ｋｍ２である。これは、アメリカ合衆国の国土面積に匹敵する。
一方、地球上の餓死者は、２８人（うち子供２１人）／分であり、餓死人口は１，５００万人／年になる。世界の２／３以上の人は、空腹を満たされておらず、世界的な食糧の枯渇は明白である。さらに世界人口は増加傾向にあるため、２０３０年ごろに「世界食糧恐慌」が予測される。
また、近年地球温暖化が深刻化していることから、環境問題の観点からも、生物による大気中二酸化炭素の固定量を増大させる必要性が高く、塩集積土壌の緑化が強く望まれている。
一方、耐塩性植物の研究は種々行われており、例えば、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２に関する報告がある（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｓｈｏｗｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．，１１，１１９５−１２０６（１９９９）参照）。
上記状況において、耐塩性を有する植物の研究は種々行われているが、現在のところ、十分な耐塩性を有する植物の開発は成功していない。そこで、十分な耐塩性を有する形質転換植物体などの開発が強く望まれている。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の配列を有するポリヌクレオチドが植物に耐塩性を付与することができ、該ポリヌクレオチドを導入した形質転換植物が耐塩性を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のようなポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、このポリヌクレオチドなどによって形質転換された植物細胞、このポリヌクレオチドなどによって形質転換された植物体などを提供する。
［１］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［２］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２６に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［４］ 上記［１］に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つと、上記［２］もしくは［３］に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つとを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
［５］ 配列番号：５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、上記［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［７］ ＤＮＡである上記［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［８］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［９］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または上記［８］に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
［１０］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または上記［８］に記載のベクターを導入した形質転換植物体。
［１１］ 上記［１０］に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
本発明のポリヌクレオチドを用いれば、植物に耐塩性を付与することができるので、耐塩性を有する形質転換植物細胞および形質転換植物体を得ることができる。そのようにして得られる本発明の形質転換植物体は、塩集積土壌においても育成することができるので、塩集積土壌の緑化に貢献することができる。また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを食用植物に組み込んでなる耐塩性形質転換植物体は、塩害で通常育成しにくい場所でも育成できるという利点がある。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の配列を有するポリヌクレオチドが植物に耐塩性を付与することができ、該ポリヌクレオチドを導入した形質転換植物が耐塩性を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のようなポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、このポリヌクレオチドなどによって形質転換された植物細胞、このポリヌクレオチドなどによって形質転換された植物体などを提供する。
［１］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［２］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２６に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［４］ 上記［１］に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つと、上記［２］もしくは［３］に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つとを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
［５］ 配列番号：５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、上記［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［７］ ＤＮＡである上記［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［８］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［９］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または上記［８］に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
［１０］ 上記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または上記［８］に記載のベクターを導入した形質転換植物体。
［１１］ 上記［１０］に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
本発明のポリヌクレオチドを用いれば、植物に耐塩性を付与することができるので、耐塩性を有する形質転換植物細胞および形質転換植物体を得ることができる。そのようにして得られる本発明の形質転換植物体は、塩集積土壌においても育成することができるので、塩集積土壌の緑化に貢献することができる。また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを食用植物に組み込んでなる耐塩性形質転換植物体は、塩害で通常育成しにくい場所でも育成できるという利点がある。
図１は、ｂＨＬＨ１９遺伝子ゲノム配列を示す図である。
図２は、ｂＨＬＨ１９遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物（定性実験）を示す図である。
図３は、サイズの異なるｂＨＬＨ転写因子ｍＲＮＡが生じる機構の可能性を示す図である。
図４は、Ｎ末端側イントロンに対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図５は、イントロン１の選択的スプライシングを示す図である。
図６は、ｂＨＬＨ１９遺伝子のバイナリーベクターへの導入を示す図である。
図７は、塩ストレス条件下での発芽からの生育を示す図である。
図８は、Ｃ末端側イントロンに対するＲＴ−ＰＣＴの結果を示す図である。
図２は、ｂＨＬＨ１９遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物（定性実験）を示す図である。
図３は、サイズの異なるｂＨＬＨ転写因子ｍＲＮＡが生じる機構の可能性を示す図である。
図４は、Ｎ末端側イントロンに対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図５は、イントロン１の選択的スプライシングを示す図である。
図６は、ｂＨＬＨ１９遺伝子のバイナリーベクターへの導入を示す図である。
図７は、塩ストレス条件下での発芽からの生育を示す図である。
図８は、Ｃ末端側イントロンに対するＲＴ−ＰＣＴの結果を示す図である。
以下、本発明を、その実施態様に基づいて詳細に説明する。
本発明者らは、核ゲノムＤＮＡ全塩基配列が決定されているシロイヌナズナ（例えば、Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｎａｔｕｒｅ，４０８，７９６−８１５（２０００）参照）において、変異原メタンスルホン酸エチル処理により突然変異を誘発し、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｓｈｏｗｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．，１１，１１９５−１２０６（１９９９））について、非ストレス条件下において発現している遺伝子をＤＮＡチップ（オリゴマイクロアレイ）を用いて解析し、Ａｔ２ｇ２２７６０（ｂＨＬＨ１９）遺伝子が野生系統に対して特異的に高発現していることを見いだした。さらに、驚くべきことに、このＡｔ２ｇ２２７６０遺伝子において、塩ストレスにより選択的スプライシングが起こり、新たな転写産物（ＲＮＡ）が生じることを見出した。本発明で見出された新たな転写産物のｃＤＮＡのコード配列を配列番号：３、４、７、９および１１に示す。本発明で見出された新たなｃＤＮＡには、配列番号：３で示されるコード配列と、配列番号：４で示されるコード配列とを共に含む塩基配列（配列番号：５）を含むものも含まれる。
これら本発明のｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１、２、６、８および１０に示す。後述する実施例においては、配列番号：５のｃＤＮＡを含むベクターを作成し、このベクターによって形質転換した形質転換植物体を作成した。この本発明の新たな転写産物のｃＤＮＡを含むベクターによって形質転換した形質転換植物体は、Ａｔ２ｇ２２７６０遺伝子における通常の転写産物のｃＤＮＡを含むベクター、すなわち、通常のｂＨＬＨ１９（配列番号：１２）をコードする塩基配列（配列番号：１３）を有するＤＮＡを含むベクターを導入した植物体よりも耐塩性が高いことを見出した。
本発明は、これらの知見に基づき、塩ストレス耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、このベクターまたはポリヌクレオチドを導入した形質転換植物細胞および形質転換植物体を提供するものである。
１．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、具体的には、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＤＮＡが由来する生物種としては、特に制限はないが、好ましくは植物である。植物としては、例えば、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ダイズ、トマト、ワタ、タバコ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、シバ、樹木（ポプラやユーカリなど）などがあげられるが、これに限定されるものではない。
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または、
（ｆ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、
［２］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドのさらに他の具体例としては、例えば、
［３］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記［１］に例示されたポリヌクレオチドのいずれか１つと、上記［２］に例示されたポリヌクレオチドのいずれか１つとを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが好ましく、さらに配列番号：５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが好ましい。
あるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が、その生物学的活性を維持することはすでに知られている（例えば、Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，５６６２−５６６６（１９８４）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，６４８７−６５００（１９８２）、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，６４０９−６４１３（１９８２）、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１３０６−１３１０（１９９０）、など参照）。したがって、配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
あるアミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６（１９８４）、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８）、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６（１９８４）、など参照）などを用いることにより得ることができる。
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ｈｏ Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，５１（１９８９）、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
また欠失変異体の一種であるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
欠失、付加、置換および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されず、１以上の任意の数であればよいが、上記の部位特異的変異法やＰＣＲ等の周知の方法により欠失、付加、置換および／または挿入できる程度の数であることが好ましく、一般的には１個から５０個程度であり、好ましくは１から３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個（例、６個）である。
また、本発明のタンパク質が植物の耐塩性を高める機能を有するためには、配列番号：１、２、６、８または１０に記載のアミノ酸配列との相同性がＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）、など参照）やＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３，６３（１９９０）、など参照）等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であることが好ましい。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。。本発明のハイブリダイゼーション反応においては、さまざまな程度のストリンジェントな条件を用いることができる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。
本発明の目的に適した「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く２×ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣ、室温での洗浄である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃での洗浄である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，６５℃での洗浄である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ポリヌクレオチドが配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであるためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが望ましい。
本発明のポリヌクレオチドの核酸の種類としてはＤＮＡまたはＲＮＡを挙げることができる。また本発明のポリヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖でもよく、両者が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のタンパク質（例えば、配列番号：１、２、６、８または１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードするＤＮＡを有する適当な細胞または組織から調製したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、本発明のポリヌクレオチドを基にして調製したプローブを用いてスクリーニングを行うことにより取得することができる。また、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことにより取得することもできる。
また、配列情報を利用したＰＣＲ（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ，Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））によって、ｃＤＮＡをクローニングすることもできる。このようなｃＤＮＡのクローニングには、例えば、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が用いられる。
得られたｃＤＮＡの塩基配列は、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社やアマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ライコア（ＬＩ−ＣＯＲ）社製のＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７７など）やジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３（１９７７））により確認することができる。
２．本発明の植物の形質転換用組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明の上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって作成することができる。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターなどが使用できる。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクターなどのバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のＤＮＡを導入できるという点で好ましい。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）などがあげられる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などがあげられる。
ｐＵＣ系のベクターは、植物にＤＮＡを直接導入することができるという点で好ましい。
ベクターは、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激（例えば、乾燥、紫外線の照射、塩ストレス）により誘導的に活性化されるプロモーターを有していてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６（１９９０））、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１（１９８９））、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．３，２１７−２２３（２０００））などがあげられる。
さらに、本発明のベクターには、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ付加シグナルなどを連結してもよい。
プロモーターとしては、植物細胞において機能することができれば植物由来のものでなくてもよい。具体的には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターイネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のＰＲタンパク質プロモーターなどがあげられる。さらに、前述の外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターもあげられる。
エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。
ターミネーターとしては、前述のプロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、ＣａＭＶポリＡターミネーターなどがあげられる。
本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる。
３．本発明の形質転換植物細胞および形質転換植物体
本発明の形質転換植物細胞は、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することによって得ることができる。組換えベクターの植物細胞への導入は、従来公知の方法、例えば、植物に感染するウイルスや細菌を介して導入する方法（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｌｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５（１９９１））、外来ＤＮＡを直接導入する方法などがあげられる。具体的には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。これらの方法は、例えば、形質転換する宿主植物の種類などに応じて適宜決定できる。
植物に感染するウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、プロムモザイクウイルスなどが使用できる。細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネスなどが使用できる。
アグロバクテリウムへのベクターの移行は、エレクトロポレーション法によって行うことができる。
植物細胞に外来ＤＮＡを直接導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックペネトレーション法等の従来公知の方法があげられる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５（１９９１）参照）。エレクトロポレーション法は、例えば、プロトプラストの培養が安定かつ容易であり、再生が容易な植物細胞に適用することが好ましい。また、パーティクルガン法は、宿主の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難な植物細胞に適用することが好ましい。なお、このようにエレクトロポレーション法を行う場合、前記組換えベクターを構成するベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が好ましい。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、ＤＮＡ導入法として汎用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用できないため、これらの直接導入法が有効である。
次に、本発明のベククーを導入したアグロバクテリウム等から植物へＴ−ＤＮＡを導入して、植物の形質転換を行う。例えば、上述のようにしてベクターを導入したアグロバクテリウム株を植物細胞のカルスまたは組織片と数分間程度共存させた後、２Ｎ６−ＡＳまたはＮ６ＣＯなどの培地中で、２５〜２８℃で３日間程度共存培養する。ここで共存培養する植物としては、共存培養の難易度に差があるものの種子植物が用いられる。特に、これまで形質転換の困難であった単子葉作物、すなわち、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シバなど、さらに樹木（ポプラやユーカリなど）なども対象となり得る。
上記のアグロバクテリウムとの共存培養の後、カルスまたは組織片は、適当な抗生物質を含む培地で選択培養を行う。例えば、ベクターに選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した場合には、ハイグロマイシン（１０〜１００μｇ／ｍＬ）とアグロバクテリクム除去のためのセフォタキシム（２５μｇ／ｍＬ）またはカルベニシリン（５００μｇ／ｍＬ）とを含む２Ｎ６−ＣＨまたはＮ６Ｓｅ培地を用いて、１〜３週間選択培養を行うことにより、形質転換したカルス体を選択的に得ることができる。選択的に得たカルス体を、Ｎ６Ｓ３−ＣＨ、ＭＳｒｅなどの適当な再分化培地を用いて再分化を誘導し、再分化個体を得る。以上のようにして、本発明のベクターを用いてＤＮＡ断片を植物に導入し形質転換することができる。
組換え個体の選抜は、マーカー遺伝子で抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン遺伝子）の発現を調べることによって行うことができる。また、得られた形質転換植物細胞および形質転換植物体の染色体ＤＮＡをそれぞれ調製し、例えば、目的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーやプローブを用いたＰＣＲやサザンブロッティング法等により、前記目的ＤＮＡの発現が確認されれば、所望の形質転換植物細胞および形質転換植物体が得られたこととなる。
形質転換植物体が得られれば、その植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができ、公知の方法によりクローンを得ることもできる。また、その植物体、その子孫もしくはクローンから、さらに子孫もしくはクローンを得ることもできる。
本発明のベクターまたはポリヌクレオチドが導入されることで形質転換される植物としては、特に制限はなく、例えば、農作物、観賞用植物などをあげることができる。農作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ダイズ、トマト、ミカン、リンゴ、イチゴ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、チャ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、ゴムノキなどがあげられる。観賞用植物としては、例えば、キク、カーネーション、バラ、シクラメン、カトレア、ペチュニア、チューリップ、ガーベラなどがあげられる。
本発明において、「耐塩性を高める」とは、例えば、植物細胞または植物体を、０．２ＭＮａＣｌを含む培地で３週間培養または育成した場合に、形質転換していない植物細胞または植物体と比較して、カルスまたは植物体の総重量、根の伸長、葉の総面積もしくは枚数などがより大きいか、または／および、葉（双葉、本葉など）の白色化が抑制されているなど、塩ストレス下での生育を向上させることを意味する。
塩ストレスに用いられる塩類、その濃度、育成期間などの塩ストレスの条件は、用いられる植物の種類などに応じて適宜設定することができる。塩ストレスに用いる塩類としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどがあげられ、塩化ナトリウムが好ましい。塩濃度としては、例えば、０．０１〜２Ｍ、好ましくは０．０５〜１Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍ、特に好ましくは０．２〜０．３Ｍである。塩ストレスを付す期間としては、例えば、１時間〜１０週間、好ましくは２時間〜８週間、より好ましくは１日〜４週間、特に好ましくは１週間〜３週間である。
なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。
本発明者らは、核ゲノムＤＮＡ全塩基配列が決定されているシロイヌナズナ（例えば、Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｎａｔｕｒｅ，４０８，７９６−８１５（２０００）参照）において、変異原メタンスルホン酸エチル処理により突然変異を誘発し、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｓｈｏｗｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．，１１，１１９５−１２０６（１９９９））について、非ストレス条件下において発現している遺伝子をＤＮＡチップ（オリゴマイクロアレイ）を用いて解析し、Ａｔ２ｇ２２７６０（ｂＨＬＨ１９）遺伝子が野生系統に対して特異的に高発現していることを見いだした。さらに、驚くべきことに、このＡｔ２ｇ２２７６０遺伝子において、塩ストレスにより選択的スプライシングが起こり、新たな転写産物（ＲＮＡ）が生じることを見出した。本発明で見出された新たな転写産物のｃＤＮＡのコード配列を配列番号：３、４、７、９および１１に示す。本発明で見出された新たなｃＤＮＡには、配列番号：３で示されるコード配列と、配列番号：４で示されるコード配列とを共に含む塩基配列（配列番号：５）を含むものも含まれる。
これら本発明のｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１、２、６、８および１０に示す。後述する実施例においては、配列番号：５のｃＤＮＡを含むベクターを作成し、このベクターによって形質転換した形質転換植物体を作成した。この本発明の新たな転写産物のｃＤＮＡを含むベクターによって形質転換した形質転換植物体は、Ａｔ２ｇ２２７６０遺伝子における通常の転写産物のｃＤＮＡを含むベクター、すなわち、通常のｂＨＬＨ１９（配列番号：１２）をコードする塩基配列（配列番号：１３）を有するＤＮＡを含むベクターを導入した植物体よりも耐塩性が高いことを見出した。
本発明は、これらの知見に基づき、塩ストレス耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、このベクターまたはポリヌクレオチドを導入した形質転換植物細胞および形質転換植物体を提供するものである。
１．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、具体的には、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＤＮＡが由来する生物種としては、特に制限はないが、好ましくは植物である。植物としては、例えば、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ダイズ、トマト、ワタ、タバコ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、シバ、樹木（ポプラやユーカリなど）などがあげられるが、これに限定されるものではない。
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または、
（ｆ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、
［２］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドのさらに他の具体例としては、例えば、
［３］ 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２６または２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記［１］に例示されたポリヌクレオチドのいずれか１つと、上記［２］に例示されたポリヌクレオチドのいずれか１つとを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが好ましく、さらに配列番号：５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが好ましい。
あるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が、その生物学的活性を維持することはすでに知られている（例えば、Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，５６６２−５６６６（１９８４）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，６４８７−６５００（１９８２）、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，６４０９−６４１３（１９８２）、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１３０６−１３１０（１９９０）、など参照）。したがって、配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
あるアミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６（１９８４）、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８）、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６（１９８４）、など参照）などを用いることにより得ることができる。
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ｈｏ Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，５１（１９８９）、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
また欠失変異体の一種であるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
欠失、付加、置換および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されず、１以上の任意の数であればよいが、上記の部位特異的変異法やＰＣＲ等の周知の方法により欠失、付加、置換および／または挿入できる程度の数であることが好ましく、一般的には１個から５０個程度であり、好ましくは１から３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個（例、６個）である。
また、本発明のタンパク質が植物の耐塩性を高める機能を有するためには、配列番号：１、２、６、８または１０に記載のアミノ酸配列との相同性がＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）、など参照）やＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３，６３（１９９０）、など参照）等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であることが好ましい。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。。本発明のハイブリダイゼーション反応においては、さまざまな程度のストリンジェントな条件を用いることができる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。
本発明の目的に適した「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く２×ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣ、室温での洗浄である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃での洗浄である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃条件でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，６５℃での洗浄である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ポリヌクレオチドが配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであるためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが望ましい。
本発明のポリヌクレオチドの核酸の種類としてはＤＮＡまたはＲＮＡを挙げることができる。また本発明のポリヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖でもよく、両者が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のタンパク質（例えば、配列番号：１、２、６、８または１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードするＤＮＡを有する適当な細胞または組織から調製したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、本発明のポリヌクレオチドを基にして調製したプローブを用いてスクリーニングを行うことにより取得することができる。また、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：３、４、７、９または１１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことにより取得することもできる。
また、配列情報を利用したＰＣＲ（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ，Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））によって、ｃＤＮＡをクローニングすることもできる。このようなｃＤＮＡのクローニングには、例えば、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が用いられる。
得られたｃＤＮＡの塩基配列は、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社やアマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ライコア（ＬＩ−ＣＯＲ）社製のＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７７など）やジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３（１９７７））により確認することができる。
２．本発明の植物の形質転換用組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明の上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって作成することができる。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターなどが使用できる。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクターなどのバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のＤＮＡを導入できるという点で好ましい。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）などがあげられる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などがあげられる。
ｐＵＣ系のベクターは、植物にＤＮＡを直接導入することができるという点で好ましい。
ベクターは、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激（例えば、乾燥、紫外線の照射、塩ストレス）により誘導的に活性化されるプロモーターを有していてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６（１９９０））、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１（１９８９））、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．３，２１７−２２３（２０００））などがあげられる。
さらに、本発明のベクターには、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ付加シグナルなどを連結してもよい。
プロモーターとしては、植物細胞において機能することができれば植物由来のものでなくてもよい。具体的には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターイネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のＰＲタンパク質プロモーターなどがあげられる。さらに、前述の外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターもあげられる。
エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。
ターミネーターとしては、前述のプロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、ＣａＭＶポリＡターミネーターなどがあげられる。
本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる。
３．本発明の形質転換植物細胞および形質転換植物体
本発明の形質転換植物細胞は、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することによって得ることができる。組換えベクターの植物細胞への導入は、従来公知の方法、例えば、植物に感染するウイルスや細菌を介して導入する方法（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｌｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５（１９９１））、外来ＤＮＡを直接導入する方法などがあげられる。具体的には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。これらの方法は、例えば、形質転換する宿主植物の種類などに応じて適宜決定できる。
植物に感染するウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、プロムモザイクウイルスなどが使用できる。細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネスなどが使用できる。
アグロバクテリウムへのベクターの移行は、エレクトロポレーション法によって行うことができる。
植物細胞に外来ＤＮＡを直接導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックペネトレーション法等の従来公知の方法があげられる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５（１９９１）参照）。エレクトロポレーション法は、例えば、プロトプラストの培養が安定かつ容易であり、再生が容易な植物細胞に適用することが好ましい。また、パーティクルガン法は、宿主の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難な植物細胞に適用することが好ましい。なお、このようにエレクトロポレーション法を行う場合、前記組換えベクターを構成するベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が好ましい。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、ＤＮＡ導入法として汎用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用できないため、これらの直接導入法が有効である。
次に、本発明のベククーを導入したアグロバクテリウム等から植物へＴ−ＤＮＡを導入して、植物の形質転換を行う。例えば、上述のようにしてベクターを導入したアグロバクテリウム株を植物細胞のカルスまたは組織片と数分間程度共存させた後、２Ｎ６−ＡＳまたはＮ６ＣＯなどの培地中で、２５〜２８℃で３日間程度共存培養する。ここで共存培養する植物としては、共存培養の難易度に差があるものの種子植物が用いられる。特に、これまで形質転換の困難であった単子葉作物、すなわち、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シバなど、さらに樹木（ポプラやユーカリなど）なども対象となり得る。
上記のアグロバクテリウムとの共存培養の後、カルスまたは組織片は、適当な抗生物質を含む培地で選択培養を行う。例えば、ベクターに選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した場合には、ハイグロマイシン（１０〜１００μｇ／ｍＬ）とアグロバクテリクム除去のためのセフォタキシム（２５μｇ／ｍＬ）またはカルベニシリン（５００μｇ／ｍＬ）とを含む２Ｎ６−ＣＨまたはＮ６Ｓｅ培地を用いて、１〜３週間選択培養を行うことにより、形質転換したカルス体を選択的に得ることができる。選択的に得たカルス体を、Ｎ６Ｓ３−ＣＨ、ＭＳｒｅなどの適当な再分化培地を用いて再分化を誘導し、再分化個体を得る。以上のようにして、本発明のベクターを用いてＤＮＡ断片を植物に導入し形質転換することができる。
組換え個体の選抜は、マーカー遺伝子で抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン遺伝子）の発現を調べることによって行うことができる。また、得られた形質転換植物細胞および形質転換植物体の染色体ＤＮＡをそれぞれ調製し、例えば、目的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーやプローブを用いたＰＣＲやサザンブロッティング法等により、前記目的ＤＮＡの発現が確認されれば、所望の形質転換植物細胞および形質転換植物体が得られたこととなる。
形質転換植物体が得られれば、その植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができ、公知の方法によりクローンを得ることもできる。また、その植物体、その子孫もしくはクローンから、さらに子孫もしくはクローンを得ることもできる。
本発明のベクターまたはポリヌクレオチドが導入されることで形質転換される植物としては、特に制限はなく、例えば、農作物、観賞用植物などをあげることができる。農作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ダイズ、トマト、ミカン、リンゴ、イチゴ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、チャ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、ゴムノキなどがあげられる。観賞用植物としては、例えば、キク、カーネーション、バラ、シクラメン、カトレア、ペチュニア、チューリップ、ガーベラなどがあげられる。
本発明において、「耐塩性を高める」とは、例えば、植物細胞または植物体を、０．２ＭＮａＣｌを含む培地で３週間培養または育成した場合に、形質転換していない植物細胞または植物体と比較して、カルスまたは植物体の総重量、根の伸長、葉の総面積もしくは枚数などがより大きいか、または／および、葉（双葉、本葉など）の白色化が抑制されているなど、塩ストレス下での生育を向上させることを意味する。
塩ストレスに用いられる塩類、その濃度、育成期間などの塩ストレスの条件は、用いられる植物の種類などに応じて適宜設定することができる。塩ストレスに用いる塩類としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどがあげられ、塩化ナトリウムが好ましい。塩濃度としては、例えば、０．０１〜２Ｍ、好ましくは０．０５〜１Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍ、特に好ましくは０．２〜０．３Ｍである。塩ストレスを付す期間としては、例えば、１時間〜１０週間、好ましくは２時間〜８週間、より好ましくは１日〜４週間、特に好ましくは１週間〜３週間である。
なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ａｕｓｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
まず、本発明で用いた材料、実験方法について説明する。
１．植物材料
本研究ではシロイヌナズナ野生型系統Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）および当研究室において保存・継代されてきたシロイヌナズナを用いた。２−１−６系統形質転換植物は当研究室で作成されたもので、光合成遺伝子ＲＢＣＳ−３Ｂプロモーター制御下にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｕｉｄＡ）およびクロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質遺伝子ＣＡＢ１プロモーター制御下にルシフェラーゼ遺伝子を持つコンストラクトと、ＲＢＣＳ−３Ｂプロモーター制御下にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）およびＣＡＢ１プロモーター制御下にビアラフォス耐性遺伝子（ｂａｒ）を持つコンストラクトがアグロバクテリウム法によって野生型系統Ｃｏｌに導入されている。変異体植物は２−１−６系統由来の、ｐｓｔ２（６３）を用いた。
２．生育条件
人工気象機（Ｂｉｏｔｒｏｎ ＮＣ２２０、Ｎｋｓｙｓｔｅｍ）を用い、２２℃、湿度４０−６０％、照度３，０００〜５，０００ ｌｕｘの連続白色光条件下で、３週間生育させた。塩ストレスを付す場合は、０．２Ｍ Ｎａｃｌを添加した培地に移植し、同条件下で培養した。
３．種子の滅菌、播種
１．５−ｍＬチューブに種子を分注し、７０％エタノール１ｍｌを加え、１分間振盪した。遠心し、上清を捨て、滅菌溶液（０．２５％次亜塩素酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを加えて、１０−１５分振盪した。クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、１ｍＬ超純水を加えてリンスした。リンスを５回繰り返し、１ｍＬ超純水を加えた状態でアルミホイルに包み、４℃で約１週間春化処理を行った。再び、クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）した０．３％アガロース溶液１ｍＬに懸濁した。オートピペットのチップにとり、別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）したろ紙を培地上に敷いたシャーレに播種した。
４．無菌培地の調製
（１）ミネラル培地
以下の組成を含む。５．０ｍＭ ＫＮＯ３、２．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ［７０ｍＭ Ｈ３ＢＯ４、１４ｍＭ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］、０．１ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．３％Ｇｅｌｒｉｔｅ。培地溶液を調製後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、約５０℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。ただし、Ｃａ（ＮＯ３）２は別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、分注前に加えた。また、２００ｍＭ ＮａＣｌを添加する場合は上記培地組成に１１．６９ｇ ＮａＣｌ／１Ｌの割合で加えた。
（２）Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）
超純水１Ｌ中に以下の組成を含む（２Ｎ ＫＯＨでｐＨ６．３に調製）。培地溶液を調製後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、約５０℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地用混合塩類 ４．３ｇ
Ｓｕｃｒｏｓｅ ２０ｇ
１０００×ビタミンストック １ｍＬ
８．９ｍＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
４０．６ｍＭ ｎｉｃｏｔｉｃ ａｃｉｄ
２．４ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ｇｅｌｒｉｔｅ ３ｇ
（３）ＬＢ培地
超純水１Ｌ中に以下の組成を含む。培地溶液を調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。固形培地の場合は、培地溶液にＢａｃｔｏ−ａｇａｒを１．５％加え、オートクレーブ処理後、約５０℃まで冷ましてからシャーレに分注した。
Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ
Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
ＮａＣｌ １０ｇ
５．オリゴマイクロアレイ
（１）ＲＮＡ精製・螢光標識
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製したＲＮＡ２０μｇをＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて螢光標識した。
（２）ハイブリダイゼーションおよびデータ処理
Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ １ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、標準プロトコールに従い行った。データの取り込みは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、シグナルの数値化にはＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。その後の解析にはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用した。
６．ＲＡＣＥ
ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、標準プロトコールに従って、プライマーの設計、ｃＤＮＡの調整およびＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。
（１）ＴＡクローニング
ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターを用いて、Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ Ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（Ｔｏｙｏｂｏ）をホスト大腸菌とし、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍの標準プロトコールに従いライゲーション、形質転換を行った。
（２）コロニーＰＣＲ
正しくクローニングできたかどうか確認するため、コロニーＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、９４℃ ５分→（９４℃ １５ｓｅｃ、５５℃ １５ｓｅｃ、７２℃ ３０ｓｅｃ）×３５ｃｙｃｌｅ→７２℃ ５分の温度条件を基本とし、プライマーと目的産物の大きさに合わせてＰＣＲさせた。アガロースゲル電気泳動を行って産物の大きさを確認した。
（３）プラスミド回収
形質転換を行った大腸菌を、５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で約１５０ｒｐｍ３７℃、１４時間しんとう培養を行った。培養液を１．５ｍＬのチューブに移し、６，０００ｒｐｍ４℃３分間遠心した。上清を除き、ペレットを２００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩでピペッティングし懸濁した。３００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを加え２〜３回穏やかに倒置し、氷上で１０分間静置した。３００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを加え２〜３回穩やかに倒置し、氷上で１０分間静置した。１５，０００ｒｐｍ４℃１０分遠心し、上清を回収した。１μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａを加え３７℃、２０分以上静置した。２００μＬのクロロホルムを加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ４℃１０分間遠心し、上層（水層）を回収した（２回行った）。等量のイソプロパノールを加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ４℃１０分遠心し、上清を除きペレットを６００μＬの７０％エタノールで洗浄した。１５，０００ｒｐｍ４℃１０分間遠心し、上清を除きドライアップした。１０〜２０μＬのＴＥもしくは超純水にて溶解し、プラスミド溶液とした。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（超純水１Ｌ中）
Ｇｕｌｃｏｓｅ ４ｍＬ
０．９ｇ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２．５ｍＬ
調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ（使用時調整：超純水で目的量を調製）
２Ｎ ＮａＯＨ（使用時調整） １／５倍容
１０％ＳＤＳ １／１０倍容
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ（超純水１Ｌ中）
酢酸カリウム ２９．４４ｇ
酢酸 １１．５ｍＬ
調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。
（４）制限酵素処理
回収したプラスミド溶液を、正しいコンストラクトの確認ができるような制限酵素を用いて、消化を行った。処理後、アガロースゲル電気泳動を行った。
（５）ＤＮＡシークエンス
回収したプラスミドをテンプレートとし、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、反応液は２０μＬ（テンプレート１μＬ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、プレミックス８μＬ、超純水で２０μＬ）、反応条件は９４℃ ２０秒→（９５℃ ２０秒、５０℃ １５秒、６０℃ １分）×３０ｃｙｃｌｅ、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＡｕｔｏｓｅｑ Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い標準プロトコールに従いサンプルの精製を行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３１０ ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）により泳動、解析を行った。
７．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
（１）ＲＮＡ精製およびＤＮａｓｅＩ処理
植物個体（約０．１ｇ）を液体窒素で凍らせ、乳鉢で破砕したものを新しいチューブに移した。あらかじめ５０℃にインキュベートしておいた１ｍＬ Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を加え、激しくボルテックスした。５０℃で１０分間インキュベートし、その後、室温で５分間静置した。０．２ｍＬクロロホルムを加え、ボルテックスし、室温で２分間静置した。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心し、上層（水層）を回収して新しいチューブに移した。０．２ｍＬクロロホルムを加え、１分間激しく混合し、１２，０００ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で５分間（４℃）遠心し、上層（水層）を回収した。このクロロホルム処理を中間層のタンパクがなくなるまで繰り返した。上層（水層）に０．５ｍＬイソプロパノールを加え、５分間軽く混和した。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心し、上清を捨てて、沈殿を風乾した。沈殿を０．１ｍＬ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解し、１０μＬ ３Ｍ酢酸ナトリウムを加え混合した。氷上で２０分間静置し、１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心した。上清を回収し、０．２５ｍＬエタノールを加えて、−７０℃で１時間インキュベートした。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１０分間（４℃）遠心し、上清を捨て１ｍＬ７０％エタノールを加えて、リンスした。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で５分間（４℃）遠心し、上清を捨て、沈殿を風乾した。沈殿を２０μＬ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解した。ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ）を用い、標準プトロコールに従って３７℃で３０分間反応させた。クロロホルム処理を中間層のタンパクがなくなるまで繰り返し、エタノール沈殿で全ＲＮＡを回収した。
（２）ｃＤＮＡ合成および検量線用テンプレートの調製
ｃＤＮＡは１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）（Ｒｏｃｈｅ）を用い、標準プロトコールに従って調製した。検量線用テンプレートは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、アガロースゲルで泳動後、ゲルを切り出して、Ｑｕａｎｔｕｍ ＰｒｅｐＴＭＦｒｅｅｚｅ‘Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。
（３）測定
測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムＤＮＡのコンタミネーションを確認するためにイントロンを挟むように２２〜２５ｍｅｒのプライマーを設計した。試薬はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、標準プロトコールに従って、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。測定値はアクチン２遺伝子（ＡＣＴ２）を内部標準として、補正した。
８．植物形質転換
（１）バイナリーベクターの構築
フォワードプライマーに制限酵素ＸｂａＩサイトを付加（プライマー（ｉｘ）（ｂＨＬＨ１９−Ｎｆ Ｆｗ「５’−ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１４）」）、リバ−スプライマーにＳａｃＩサイトを付加したもの（プライマー（ｘ）（ＨＬＨ１９−Ｃｒ Ｒｖ「５’−ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＣＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＡＧＧ−３’（配列番号：１５）」）を設計した。プライマー（ｉｘ）と（ｘ）の組み合わせで、通常の開始コドンと終止コドンを含んだ長鎖の断片を増幅させた。ストレス条件サンプルにはＳａｌｔ−ｆｕｌｌを、非ストレス条件のサンプルにはＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌをテンプレートとして増幅させた。
それぞれのインサートをまずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）（ニッポンジーン）ベクターのＥｃｏＲＩサイトへサブクローニングし、コロニーＰＣＲ、プラスミド回収、制限酵素処理及びＤＮＡシークエンスにより確認を行った。その後、上記プラスミドおよびｐＳＭＡＢ７０１ベクターを、それぞれ制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩで処理し、アガロースゲルで電気泳動後、目的のバンドをゲルから切り出して、Ｑｕａｎｔｕｍ ＰｒｅｐＴＭＦｒｅｅｚｅ’ＮＳｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）を用いて、標準プロトコールに従ってライゲーションし、Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い標準プロトコールに従い形質転換を行った。
インサートはｐＳＭＡＢ７０１ベクター上のＸｂａＩ／ＳａｃＩサイトで切断されるＧＵＳのコード領域へ挿入した（図６）。ｐＳＭＡＢ７０１に含まれる薬剤マーカーであるスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢ固形培地で、生育してきたコロニーを形質転換候補株として回収した。コロニーＰＣＲで選抜後、プラスミド回収、制限酵素処理、ＤＮＡシークエンスを行い、バイナリーベクター構築の最終的な確認を行った。
（２）アグロバクテリウムへの形質転換
エレクトロポレーション法でアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１）への形質転換を行った。ＧＶ３１０１ ４０μＬとプラスミド溶液を１０倍希釈したものを１μＬを、エレクトロポレーション用キュベットに移した。ジーンパルサーの条件は、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωにて行った。キュベット内の菌液をＬＢ液体培地１ｍＬに移し、３０℃２０分約１５０ｒｐｍで培養を行った。ＧＶ３１０１およびｐＳＭＡＢ７０１の選択マーカーである、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ固形培地で２８℃、一晩培養し、生育してきたコロニーを形質転換候補株として回収した。
形質転換したアグロバクテリウムを、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地１．５ｍＬに植菌した。２８℃約１７０ｒｐｍで約２０時間培養を行った。その後、プラスミド回収、制限酵素処理を行って確認した。形質転換には上記の長鎖２パターンを使って形質転換を行った。
（３）シロイヌナズナ野生系統への形質転換
バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１）を、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地１．５ｍＬに植菌し、前培養として２８℃約１７０ｒｐｍで約２０時間培養を行った。本培養として前培養液を同じ組成の液体培地２００ｍＬに１／１０００倍容移し、２８℃約１７０ｒｐｍで、約２２時間培養を行った。遠心して集菌した菌を、ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ約８０ｍＬに懸濁させた。適当な大きさの容器に懸濁液を移し、さらにｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ数ｍＬを加えて懸濁させた。
ＭＳ培地にて約２週間育成させたシロイヌナズナ野生系統Ｃｏｌをロックウールに移し、さらに約２週間育成させ、開花直前の蕾が出てきた頃の株を用いた。直接懸濁液に浸して３分おき、感染させ、形質転換を行った。
ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地用混合塩類 ４．３ｇ
１０００×ｖｉｔａｍｉｎ ｓｔｏｃｋ ２ｍＬ
ｓｕｃｒｏｓｅ １００ｇ
１ｍｇ／ｍＬ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ ｐｕｒｉｎｅ ２００μＬ
ｓｉｌｉｃｏｎ Ｌ−７７ ４００ｍＬ
超純水で２Ｌ。
実施例１
オリゴマイクロアレイ
ｐｓｔ２変異系統および野生系統を低Ｋ＋培地（ミネラル培地）および高Ｋ＋培地（ＭＳ培地）において３週間生育させ、葉からＲＮＡを調製し、シロイヌナズナ核遺伝子チップ（１４，８８０遺伝子６０ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた解析に供した。標準偏差による検定およびノイズ除去の結果有意差のＰ値（有意確率）が０．０１以下となることを指標とした。野外での生育条件により近い低Ｋ＋培地において、ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂＨＬＨ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ｂＨＬＨ１９）は、ｐｓｔ２系統特定的に高発現を示した（表１）。この高発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した（図２）。
実施例２
ＲＡＣＥ
塩ストレス特異的な転写開始点の存在、または塩ストレス選択的スプライシングのどちらかの可能性が考えられたため（図３）、ＲＡＣＥによる解析を行った。５’側のＲＡＣＥ ＰＣＲには、確実に末端領域を増幅させるために、プライマーを、スプライシングが変化すると考えられるイントロンの上流と下流に一つずつ（プライマー（ｉ）（ｐｓｔ−ｐ６−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧ−３’（配列番号：１６）」）、（ｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ３−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号：１７）」）、３’側のＲＡＣＥ ＰＣＲにはイントロンの上流に一つ（プライマー（ｉｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ１−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｃ−３’（配列番号：１８）」）設計した。塩ストレス１２時間の処理を行った植物から全ＲＮＡを回収し、それぞれのプライマーと、逆転写の際に末端に付加する配列に相補するプライマーでＲＡＣＥを行った。ＤＮＡシークエンスには上記プライマーと、さらに三つのプライマー（プライマー（ｉｖ）（ｐｓｔ−５５５−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＡＧＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１９）」）、（ｖ）（ｐｓｔ−１７７６−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＧＡ ＣＣ−３’（配列番号：２０）」）、（ｖｉ）（ｐｓｔ−１１４０−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ（５’−ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号：２１）」）を使用して解析を行った。塩基配列を決定した結果、塩ストレス１２時間処理を行った植物と非ストレス条件下の植物ともに、転写開始点と予想される５’側の末端は、開始コドンと予想される部位から約１１０ｂｐ上流のＡであることがわかった（図１）。また、ＲＡＣＥ産物を５７に対しシーケンスを行いイントロンの状態を調べたところ、スプライシングのされ方は五つのパターンがあり、それぞれ、通常のスプライシングが起こっている通常型、塩ストレスで誘導すると考えられる三つのパターン（塩誘導型２、３、４）、スプライシングが起こっていない塩誘導型１が存在していた（図５）。
通常型は転写開始点から５５１塩基から６８８
塩誘導型４は転写開始点から５５１塩基から６６０
塩誘導型３は転写開始点から５５１塩基から６４３
塩誘導型２は転写開始点から５５１塩基から６１８がイントロンとして除かれ、
塩誘導型１は５５１塩基から６８８は除かれない。
５’側ＲＡＣＥ、３’側ＲＡＣＥの産物あわせて５７サンプルのシークエンスの結果、通常型が２８サンプル、塩誘導型４が２サンプル、塩誘導型３が１５サンプル、塩誘導型２が７サンプル、塩誘導型１が５サンプルであった（図５）。ここでクローニングした塩誘導型３および通常型の完全長ｃＤＮＡをそれぞれＳａｌｔ−ｆｕｌｌ（ＳＦ）、Ｎｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（ＮＦ）として今後の実験に用いた。
実施例３
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびスプライシングパターンを観察しようと試みた。サンプルは３週間ＭＳ培地で生育させた植物を１６時間ミネラル液体培地で馴化した後、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地に移し、０、１、２、５、１０、２４時間後に根と葉を分けて回収したＲＮＡを用いた。プライマー（ｖｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｆ Ｆｗ「５’−ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＣ−３’（配列番号：２２）」）、（ｖｉｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｒ Ｒｖ「５’−ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＧＣ Ｃ−３’（配列番号：２３）」）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスが２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図４）。
実施例４
形質転換系統の作製
形質転換によって得られた各系統の第一世代種子をＴ１種子とした。形質転換に用いたＴ−ＤＮＡは遺伝子ｂａｒをコードする領域を持ち、除草剤ビアラホスによる選抜が可能である。各形質転換系統のＴ１系統はＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌを１６系統、Ｓａｌｔ−ｆｕｌｌを９系統用いていた。各系統のホモ接合系統を維持した。リアルタイムＰＣＲにより導入した遺伝子の発現量を調べた後、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地に各形質転換系統の種子及びＣｏｌをそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。
実施例５
塩ストレス条件下での表現型
実施例４で得られたシロイヌナズナの各形質転換系統及び野生系統Ｃｏｌの種子を、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地にそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。塩ストレス条件下における生育では、各系統で野生系統より高い耐塩性を示した（図７）。また、ＮＦを導入した系統が最も耐塩性を獲得していた。ＳＦを導入した系統も野生株に比べ耐塩性を獲得していた。各形質転換系統も通常のＭＳ培地における生育では野生系統Ｃｏｌとの差は観察されなかった。本実験により、ｂＨＬＨ１９の発現が耐塩機構に関与していることが示された。
実施例６
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびＣ末端側イントロンに対するスプライシングパターンを観察しようと試みた。プライマー（ｘｉ）（ｐｓｔ−ｐ７−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＧＡＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＣＧ−３’（配列番号：２９）」）、（ｘｉｉ）（１３２８−ｆ Ｆｗ「５’−ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＴＣ−３’（配列番号：３０）」）を用いた以外は実施例３と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスから２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図８）。
まず、本発明で用いた材料、実験方法について説明する。
１．植物材料
本研究ではシロイヌナズナ野生型系統Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）および当研究室において保存・継代されてきたシロイヌナズナを用いた。２−１−６系統形質転換植物は当研究室で作成されたもので、光合成遺伝子ＲＢＣＳ−３Ｂプロモーター制御下にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｕｉｄＡ）およびクロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質遺伝子ＣＡＢ１プロモーター制御下にルシフェラーゼ遺伝子を持つコンストラクトと、ＲＢＣＳ−３Ｂプロモーター制御下にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）およびＣＡＢ１プロモーター制御下にビアラフォス耐性遺伝子（ｂａｒ）を持つコンストラクトがアグロバクテリウム法によって野生型系統Ｃｏｌに導入されている。変異体植物は２−１−６系統由来の、ｐｓｔ２（６３）を用いた。
２．生育条件
人工気象機（Ｂｉｏｔｒｏｎ ＮＣ２２０、Ｎｋｓｙｓｔｅｍ）を用い、２２℃、湿度４０−６０％、照度３，０００〜５，０００ ｌｕｘの連続白色光条件下で、３週間生育させた。塩ストレスを付す場合は、０．２Ｍ Ｎａｃｌを添加した培地に移植し、同条件下で培養した。
３．種子の滅菌、播種
１．５−ｍＬチューブに種子を分注し、７０％エタノール１ｍｌを加え、１分間振盪した。遠心し、上清を捨て、滅菌溶液（０．２５％次亜塩素酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを加えて、１０−１５分振盪した。クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、１ｍＬ超純水を加えてリンスした。リンスを５回繰り返し、１ｍＬ超純水を加えた状態でアルミホイルに包み、４℃で約１週間春化処理を行った。再び、クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）した０．３％アガロース溶液１ｍＬに懸濁した。オートピペットのチップにとり、別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）したろ紙を培地上に敷いたシャーレに播種した。
４．無菌培地の調製
（１）ミネラル培地
以下の組成を含む。５．０ｍＭ ＫＮＯ３、２．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ［７０ｍＭ Ｈ３ＢＯ４、１４ｍＭ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］、０．１ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．３％Ｇｅｌｒｉｔｅ。培地溶液を調製後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、約５０℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。ただし、Ｃａ（ＮＯ３）２は別にオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、分注前に加えた。また、２００ｍＭ ＮａＣｌを添加する場合は上記培地組成に１１．６９ｇ ＮａＣｌ／１Ｌの割合で加えた。
（２）Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）
超純水１Ｌ中に以下の組成を含む（２Ｎ ＫＯＨでｐＨ６．３に調製）。培地溶液を調製後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）し、約５０℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地用混合塩類 ４．３ｇ
Ｓｕｃｒｏｓｅ ２０ｇ
１０００×ビタミンストック １ｍＬ
８．９ｍＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
４０．６ｍＭ ｎｉｃｏｔｉｃ ａｃｉｄ
２．４ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ｇｅｌｒｉｔｅ ３ｇ
（３）ＬＢ培地
超純水１Ｌ中に以下の組成を含む。培地溶液を調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。固形培地の場合は、培地溶液にＢａｃｔｏ−ａｇａｒを１．５％加え、オートクレーブ処理後、約５０℃まで冷ましてからシャーレに分注した。
Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ
Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
ＮａＣｌ １０ｇ
５．オリゴマイクロアレイ
（１）ＲＮＡ精製・螢光標識
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製したＲＮＡ２０μｇをＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて螢光標識した。
（２）ハイブリダイゼーションおよびデータ処理
Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ １ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、標準プロトコールに従い行った。データの取り込みは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、シグナルの数値化にはＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。その後の解析にはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用した。
６．ＲＡＣＥ
ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、標準プロトコールに従って、プライマーの設計、ｃＤＮＡの調整およびＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。
（１）ＴＡクローニング
ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターを用いて、Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ Ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（Ｔｏｙｏｂｏ）をホスト大腸菌とし、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍの標準プロトコールに従いライゲーション、形質転換を行った。
（２）コロニーＰＣＲ
正しくクローニングできたかどうか確認するため、コロニーＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、９４℃ ５分→（９４℃ １５ｓｅｃ、５５℃ １５ｓｅｃ、７２℃ ３０ｓｅｃ）×３５ｃｙｃｌｅ→７２℃ ５分の温度条件を基本とし、プライマーと目的産物の大きさに合わせてＰＣＲさせた。アガロースゲル電気泳動を行って産物の大きさを確認した。
（３）プラスミド回収
形質転換を行った大腸菌を、５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で約１５０ｒｐｍ３７℃、１４時間しんとう培養を行った。培養液を１．５ｍＬのチューブに移し、６，０００ｒｐｍ４℃３分間遠心した。上清を除き、ペレットを２００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩでピペッティングし懸濁した。３００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを加え２〜３回穏やかに倒置し、氷上で１０分間静置した。３００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを加え２〜３回穩やかに倒置し、氷上で１０分間静置した。１５，０００ｒｐｍ４℃１０分遠心し、上清を回収した。１μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａを加え３７℃、２０分以上静置した。２００μＬのクロロホルムを加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ４℃１０分間遠心し、上層（水層）を回収した（２回行った）。等量のイソプロパノールを加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ４℃１０分遠心し、上清を除きペレットを６００μＬの７０％エタノールで洗浄した。１５，０００ｒｐｍ４℃１０分間遠心し、上清を除きドライアップした。１０〜２０μＬのＴＥもしくは超純水にて溶解し、プラスミド溶液とした。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（超純水１Ｌ中）
Ｇｕｌｃｏｓｅ ４ｍＬ
０．９ｇ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２．５ｍＬ
調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ（使用時調整：超純水で目的量を調製）
２Ｎ ＮａＯＨ（使用時調整） １／５倍容
１０％ＳＤＳ １／１０倍容
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ（超純水１Ｌ中）
酢酸カリウム ２９．４４ｇ
酢酸 １１．５ｍＬ
調整後オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。
（４）制限酵素処理
回収したプラスミド溶液を、正しいコンストラクトの確認ができるような制限酵素を用いて、消化を行った。処理後、アガロースゲル電気泳動を行った。
（５）ＤＮＡシークエンス
回収したプラスミドをテンプレートとし、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、反応液は２０μＬ（テンプレート１μＬ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、プレミックス８μＬ、超純水で２０μＬ）、反応条件は９４℃ ２０秒→（９５℃ ２０秒、５０℃ １５秒、６０℃ １分）×３０ｃｙｃｌｅ、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＡｕｔｏｓｅｑ Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い標準プロトコールに従いサンプルの精製を行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３１０ ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）により泳動、解析を行った。
７．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
（１）ＲＮＡ精製およびＤＮａｓｅＩ処理
植物個体（約０．１ｇ）を液体窒素で凍らせ、乳鉢で破砕したものを新しいチューブに移した。あらかじめ５０℃にインキュベートしておいた１ｍＬ Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を加え、激しくボルテックスした。５０℃で１０分間インキュベートし、その後、室温で５分間静置した。０．２ｍＬクロロホルムを加え、ボルテックスし、室温で２分間静置した。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心し、上層（水層）を回収して新しいチューブに移した。０．２ｍＬクロロホルムを加え、１分間激しく混合し、１２，０００ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で５分間（４℃）遠心し、上層（水層）を回収した。このクロロホルム処理を中間層のタンパクがなくなるまで繰り返した。上層（水層）に０．５ｍＬイソプロパノールを加え、５分間軽く混和した。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心し、上清を捨てて、沈殿を風乾した。沈殿を０．１ｍＬ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解し、１０μＬ ３Ｍ酢酸ナトリウムを加え混合した。氷上で２０分間静置し、１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１５分間（４℃）遠心した。上清を回収し、０．２５ｍＬエタノールを加えて、−７０℃で１時間インキュベートした。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で１０分間（４℃）遠心し、上清を捨て１ｍＬ７０％エタノールを加えて、リンスした。１５，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）で５分間（４℃）遠心し、上清を捨て、沈殿を風乾した。沈殿を２０μＬ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解した。ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ）を用い、標準プトロコールに従って３７℃で３０分間反応させた。クロロホルム処理を中間層のタンパクがなくなるまで繰り返し、エタノール沈殿で全ＲＮＡを回収した。
（２）ｃＤＮＡ合成および検量線用テンプレートの調製
ｃＤＮＡは１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）（Ｒｏｃｈｅ）を用い、標準プロトコールに従って調製した。検量線用テンプレートは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、アガロースゲルで泳動後、ゲルを切り出して、Ｑｕａｎｔｕｍ ＰｒｅｐＴＭＦｒｅｅｚｅ‘Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。
（３）測定
測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムＤＮＡのコンタミネーションを確認するためにイントロンを挟むように２２〜２５ｍｅｒのプライマーを設計した。試薬はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、標準プロトコールに従って、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。測定値はアクチン２遺伝子（ＡＣＴ２）を内部標準として、補正した。
８．植物形質転換
（１）バイナリーベクターの構築
フォワードプライマーに制限酵素ＸｂａＩサイトを付加（プライマー（ｉｘ）（ｂＨＬＨ１９−Ｎｆ Ｆｗ「５’−ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１４）」）、リバ−スプライマーにＳａｃＩサイトを付加したもの（プライマー（ｘ）（ＨＬＨ１９−Ｃｒ Ｒｖ「５’−ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＣＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＡＧＧ−３’（配列番号：１５）」）を設計した。プライマー（ｉｘ）と（ｘ）の組み合わせで、通常の開始コドンと終止コドンを含んだ長鎖の断片を増幅させた。ストレス条件サンプルにはＳａｌｔ−ｆｕｌｌを、非ストレス条件のサンプルにはＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌをテンプレートとして増幅させた。
それぞれのインサートをまずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）（ニッポンジーン）ベクターのＥｃｏＲＩサイトへサブクローニングし、コロニーＰＣＲ、プラスミド回収、制限酵素処理及びＤＮＡシークエンスにより確認を行った。その後、上記プラスミドおよびｐＳＭＡＢ７０１ベクターを、それぞれ制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩで処理し、アガロースゲルで電気泳動後、目的のバンドをゲルから切り出して、Ｑｕａｎｔｕｍ ＰｒｅｐＴＭＦｒｅｅｚｅ’ＮＳｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）を用いて、標準プロトコールに従ってライゲーションし、Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い標準プロトコールに従い形質転換を行った。
インサートはｐＳＭＡＢ７０１ベクター上のＸｂａＩ／ＳａｃＩサイトで切断されるＧＵＳのコード領域へ挿入した（図６）。ｐＳＭＡＢ７０１に含まれる薬剤マーカーであるスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢ固形培地で、生育してきたコロニーを形質転換候補株として回収した。コロニーＰＣＲで選抜後、プラスミド回収、制限酵素処理、ＤＮＡシークエンスを行い、バイナリーベクター構築の最終的な確認を行った。
（２）アグロバクテリウムへの形質転換
エレクトロポレーション法でアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１）への形質転換を行った。ＧＶ３１０１ ４０μＬとプラスミド溶液を１０倍希釈したものを１μＬを、エレクトロポレーション用キュベットに移した。ジーンパルサーの条件は、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωにて行った。キュベット内の菌液をＬＢ液体培地１ｍＬに移し、３０℃２０分約１５０ｒｐｍで培養を行った。ＧＶ３１０１およびｐＳＭＡＢ７０１の選択マーカーである、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ固形培地で２８℃、一晩培養し、生育してきたコロニーを形質転換候補株として回収した。
形質転換したアグロバクテリウムを、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地１．５ｍＬに植菌した。２８℃約１７０ｒｐｍで約２０時間培養を行った。その後、プラスミド回収、制限酵素処理を行って確認した。形質転換には上記の長鎖２パターンを使って形質転換を行った。
（３）シロイヌナズナ野生系統への形質転換
バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１）を、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬ、リファンピシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地１．５ｍＬに植菌し、前培養として２８℃約１７０ｒｐｍで約２０時間培養を行った。本培養として前培養液を同じ組成の液体培地２００ｍＬに１／１０００倍容移し、２８℃約１７０ｒｐｍで、約２２時間培養を行った。遠心して集菌した菌を、ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ約８０ｍＬに懸濁させた。適当な大きさの容器に懸濁液を移し、さらにｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ数ｍＬを加えて懸濁させた。
ＭＳ培地にて約２週間育成させたシロイヌナズナ野生系統Ｃｏｌをロックウールに移し、さらに約２週間育成させ、開花直前の蕾が出てきた頃の株を用いた。直接懸濁液に浸して３分おき、感染させ、形質転換を行った。
ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地用混合塩類 ４．３ｇ
１０００×ｖｉｔａｍｉｎ ｓｔｏｃｋ ２ｍＬ
ｓｕｃｒｏｓｅ １００ｇ
１ｍｇ／ｍＬ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ ｐｕｒｉｎｅ ２００μＬ
ｓｉｌｉｃｏｎ Ｌ−７７ ４００ｍＬ
超純水で２Ｌ。
実施例１
オリゴマイクロアレイ
ｐｓｔ２変異系統および野生系統を低Ｋ＋培地（ミネラル培地）および高Ｋ＋培地（ＭＳ培地）において３週間生育させ、葉からＲＮＡを調製し、シロイヌナズナ核遺伝子チップ（１４，８８０遺伝子６０ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた解析に供した。標準偏差による検定およびノイズ除去の結果有意差のＰ値（有意確率）が０．０１以下となることを指標とした。野外での生育条件により近い低Ｋ＋培地において、ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂＨＬＨ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ｂＨＬＨ１９）は、ｐｓｔ２系統特定的に高発現を示した（表１）。この高発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した（図２）。
ＲＡＣＥ
塩ストレス特異的な転写開始点の存在、または塩ストレス選択的スプライシングのどちらかの可能性が考えられたため（図３）、ＲＡＣＥによる解析を行った。５’側のＲＡＣＥ ＰＣＲには、確実に末端領域を増幅させるために、プライマーを、スプライシングが変化すると考えられるイントロンの上流と下流に一つずつ（プライマー（ｉ）（ｐｓｔ−ｐ６−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧ−３’（配列番号：１６）」）、（ｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ３−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号：１７）」）、３’側のＲＡＣＥ ＰＣＲにはイントロンの上流に一つ（プライマー（ｉｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ１−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｃ−３’（配列番号：１８）」）設計した。塩ストレス１２時間の処理を行った植物から全ＲＮＡを回収し、それぞれのプライマーと、逆転写の際に末端に付加する配列に相補するプライマーでＲＡＣＥを行った。ＤＮＡシークエンスには上記プライマーと、さらに三つのプライマー（プライマー（ｉｖ）（ｐｓｔ−５５５−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＡＧＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１９）」）、（ｖ）（ｐｓｔ−１７７６−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＧＡ ＣＣ−３’（配列番号：２０）」）、（ｖｉ）（ｐｓｔ−１１４０−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ（５’−ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号：２１）」）を使用して解析を行った。塩基配列を決定した結果、塩ストレス１２時間処理を行った植物と非ストレス条件下の植物ともに、転写開始点と予想される５’側の末端は、開始コドンと予想される部位から約１１０ｂｐ上流のＡであることがわかった（図１）。また、ＲＡＣＥ産物を５７に対しシーケンスを行いイントロンの状態を調べたところ、スプライシングのされ方は五つのパターンがあり、それぞれ、通常のスプライシングが起こっている通常型、塩ストレスで誘導すると考えられる三つのパターン（塩誘導型２、３、４）、スプライシングが起こっていない塩誘導型１が存在していた（図５）。
通常型は転写開始点から５５１塩基から６８８
塩誘導型４は転写開始点から５５１塩基から６６０
塩誘導型３は転写開始点から５５１塩基から６４３
塩誘導型２は転写開始点から５５１塩基から６１８がイントロンとして除かれ、
塩誘導型１は５５１塩基から６８８は除かれない。
５’側ＲＡＣＥ、３’側ＲＡＣＥの産物あわせて５７サンプルのシークエンスの結果、通常型が２８サンプル、塩誘導型４が２サンプル、塩誘導型３が１５サンプル、塩誘導型２が７サンプル、塩誘導型１が５サンプルであった（図５）。ここでクローニングした塩誘導型３および通常型の完全長ｃＤＮＡをそれぞれＳａｌｔ−ｆｕｌｌ（ＳＦ）、Ｎｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（ＮＦ）として今後の実験に用いた。
実施例３
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびスプライシングパターンを観察しようと試みた。サンプルは３週間ＭＳ培地で生育させた植物を１６時間ミネラル液体培地で馴化した後、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地に移し、０、１、２、５、１０、２４時間後に根と葉を分けて回収したＲＮＡを用いた。プライマー（ｖｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｆ Ｆｗ「５’−ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＣ−３’（配列番号：２２）」）、（ｖｉｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｒ Ｒｖ「５’−ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＧＣ Ｃ−３’（配列番号：２３）」）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスが２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図４）。
実施例４
形質転換系統の作製
形質転換によって得られた各系統の第一世代種子をＴ１種子とした。形質転換に用いたＴ−ＤＮＡは遺伝子ｂａｒをコードする領域を持ち、除草剤ビアラホスによる選抜が可能である。各形質転換系統のＴ１系統はＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌを１６系統、Ｓａｌｔ−ｆｕｌｌを９系統用いていた。各系統のホモ接合系統を維持した。リアルタイムＰＣＲにより導入した遺伝子の発現量を調べた後、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地に各形質転換系統の種子及びＣｏｌをそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。
実施例５
塩ストレス条件下での表現型
実施例４で得られたシロイヌナズナの各形質転換系統及び野生系統Ｃｏｌの種子を、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地にそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。塩ストレス条件下における生育では、各系統で野生系統より高い耐塩性を示した（図７）。また、ＮＦを導入した系統が最も耐塩性を獲得していた。ＳＦを導入した系統も野生株に比べ耐塩性を獲得していた。各形質転換系統も通常のＭＳ培地における生育では野生系統Ｃｏｌとの差は観察されなかった。本実験により、ｂＨＬＨ１９の発現が耐塩機構に関与していることが示された。
実施例６
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびＣ末端側イントロンに対するスプライシングパターンを観察しようと試みた。プライマー（ｘｉ）（ｐｓｔ−ｐ７−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＧＡＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＣＧ−３’（配列番号：２９）」）、（ｘｉｉ）（１３２８−ｆ Ｆｗ「５’−ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＴＣ−３’（配列番号：３０）」）を用いた以外は実施例３と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスから２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図８）。
本発明のポリヌクレオチドを用いると、植物に耐塩性を付与することができるので、耐塩性を有する形質転換植物細胞および形質転換植物体を提供することができる。また、耐塩性は、水分枯渇耐性（乾燥耐性）を含むたの環境ストレスに対する耐性を伴っていることが多いので、不毛乾燥地帯の緑化およびこれらの地域における農耕への寄与が期待される。さらに、果物の栽培においては、糖度を上げるために灌漑を制限するが、これに伴う収量の減少の緩和への貢献が期待される。加えて、ビルの屋上緑化や道路のり面などにおける灌漑コストの低減も期待される。さらに、強光、低温、高温等の環境ストレスに対しても耐性の付与が期待される。
［配列表］
［配列表］
【０００１】
［技術分野］
本発明は、植物に塩ストレス耐性を付与するポリヌクレオチド、および、このポリヌクレオチドを導入した形質転換植物などに関する。
［背景技術］
植物が受ける環境ストレスには、塩、乾燥、高温、低温、空気汚染など様々なものがあるが、農業生産の観点から最も問題となっているのが塩および乾燥である。
地球上の不毛乾燥地域は、陸地の１／３までも占め、さらに６万ｋｍ２／年（九州と四国を合わせて面積）ずつ増大している。また、熱帯雨林は１３万ｋｍ２／年（北海道と九州を合わせた面積）ずつ減少している。多くの農耕地において水分蒸発による土壌中塩分（主に塩化ナトリウム）の地表層集積が問題になっており、地球上に分布する塩集積土壌の総計は９５５万ｋｍ２である。これは、アメリカ合衆国の国土面積に匹敵する。
一方、地球上の餓死者は、２８人（うち子供２１人）／分であり、餓死人口は１，５００万人／年になる。世界の２／３以上の人は、空腹を満たされておらず、世界的な食糧の枯渇は明白である。さらに世界人口は増加傾向にあるため、２０３０年ごろに「世界食糧恐慌」が予測される。
また、近年地球温暖化が深刻化していることから、環境問題の観点からも、生物による大気中二酸化炭素の固定量を増大させる必要性が高く、塩集積土壌の緑化が強く望まれている。
一方、耐塩性植物の研究は種々行われており、例えば、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２に関する報告がある（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ
［技術分野］
本発明は、植物に塩ストレス耐性を付与するポリヌクレオチド、および、このポリヌクレオチドを導入した形質転換植物などに関する。
［背景技術］
植物が受ける環境ストレスには、塩、乾燥、高温、低温、空気汚染など様々なものがあるが、農業生産の観点から最も問題となっているのが塩および乾燥である。
地球上の不毛乾燥地域は、陸地の１／３までも占め、さらに６万ｋｍ２／年（九州と四国を合わせて面積）ずつ増大している。また、熱帯雨林は１３万ｋｍ２／年（北海道と九州を合わせた面積）ずつ減少している。多くの農耕地において水分蒸発による土壌中塩分（主に塩化ナトリウム）の地表層集積が問題になっており、地球上に分布する塩集積土壌の総計は９５５万ｋｍ２である。これは、アメリカ合衆国の国土面積に匹敵する。
一方、地球上の餓死者は、２８人（うち子供２１人）／分であり、餓死人口は１，５００万人／年になる。世界の２／３以上の人は、空腹を満たされておらず、世界的な食糧の枯渇は明白である。さらに世界人口は増加傾向にあるため、２０３０年ごろに「世界食糧恐慌」が予測される。
また、近年地球温暖化が深刻化していることから、環境問題の観点からも、生物による大気中二酸化炭素の固定量を増大させる必要性が高く、塩集積土壌の緑化が強く望まれている。
一方、耐塩性植物の研究は種々行われており、例えば、光合成生育（独立栄養生育）が野生系統よりも耐塩性になった耐塩性光合成生育突然変異系統ｐｓｔ（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の一種であるｐｓｔ２に関する報告がある（例えば、Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｉｗａ，Ｙ．，Ｏｈｂａ，Ｙ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ
【００２６】
プライシングが変化すると考えられるイントロンの上流と下流に一つずつ（プライマー（ｉ）（ｐｓｔ−ｐ６−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧ−３’（配列番号：１６）」）、（ｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ３−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号：１７）」）、３’側のＲＡＣＥ ＰＣＲにはイントロンの上流に一つ（プライマー（ｉｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ１−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｃ−３’（配列番号：１８）」）設計した。塩ストレス１２時間の処理を行った植物から全ＲＮＡを回収し、それぞれのプライマーと、逆転写の際に末端に付加する配列に相補するプライマーでＲＡＣＥを行った。ＤＮＡシークエンスには上記プライマーと、さらに三つのプライマー（プライマー（ｉｖ）（ｐｓｔ−５５５−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＡＧＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１９）」）、（ｖ）（ｐｓｔ−１７７６−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＧＡ ＣＣ−３’（配列番号：２０）」）、（ｖｉ）（ｐｓｔ−１１４０−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ（５’−ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号：２１）」）を使用して解析を行った。塩基配列を決定した結果、塩ストレス１２時間処理を行った植物と非ストレス条件下の植物ともに、転写開始点と予想される５’側の末端は、開始コドンと予想される部位から約１１０ｂｐ上流のＡであることがわかった（図１）。また、ＲＡＣＥ産物を５７に対しシーケンスを行いイントロンの状態を調べたところ、スプライシングのされ方は五つのパターンがあり、それぞれ、通常のスプライシングが起こっている通常型、塩ストレスで誘導すると考えられる三つのパターン（塩誘導型２、３、４）、スプライシングが起こっていない塩誘導型１が存在していた（図５）。
通常型は転写開始点から５５１塩基から６８８
塩誘導型４は転写開始点から５５１塩基から６６０
塩誘導型３は転写開始点から５５１塩基から６４３
塩誘導型２は転写開始点から５５１塩基から６１８がイントロンとして除かれ、
塩誘導型１は５５１塩基から６８８は除かれない。
５’側ＲＡＣＥ、３’側ＲＡＣＥの産物あわせて５７サンプルのシークエンスの結果、通常型が２８サンプル、塩誘導型４が２サンプル、塩誘導型３が１５サンプル、塩誘導型２が７サンプル、塩誘導型１が５サンプルであった（図５）。ここでクローニングした塩誘導型３（配列番号：５）および通常型（配列番号：１３）の完全長ｃＤＮＡをそれぞれＳａｌｔ−ｆｕｌｌ
プライシングが変化すると考えられるイントロンの上流と下流に一つずつ（プライマー（ｉ）（ｐｓｔ−ｐ６−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧ−３’（配列番号：１６）」）、（ｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ３−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号：１７）」）、３’側のＲＡＣＥ ＰＣＲにはイントロンの上流に一つ（プライマー（ｉｉｉ）（ｐｓｔ−ｐ１−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｃ−３’（配列番号：１８）」）設計した。塩ストレス１２時間の処理を行った植物から全ＲＮＡを回収し、それぞれのプライマーと、逆転写の際に末端に付加する配列に相補するプライマーでＲＡＣＥを行った。ＤＮＡシークエンスには上記プライマーと、さらに三つのプライマー（プライマー（ｉｖ）（ｐｓｔ−５５５−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＡＧＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＴＡ Ｇ−３’（配列番号：１９）」）、（ｖ）（ｐｓｔ−１７７６−ｆ−ｆｕｋｕｙａ Ｆｗ「５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＧＡ ＣＣ−３’（配列番号：２０）」）、（ｖｉ）（ｐｓｔ−１１４０−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ（５’−ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号：２１）」）を使用して解析を行った。塩基配列を決定した結果、塩ストレス１２時間処理を行った植物と非ストレス条件下の植物ともに、転写開始点と予想される５’側の末端は、開始コドンと予想される部位から約１１０ｂｐ上流のＡであることがわかった（図１）。また、ＲＡＣＥ産物を５７に対しシーケンスを行いイントロンの状態を調べたところ、スプライシングのされ方は五つのパターンがあり、それぞれ、通常のスプライシングが起こっている通常型、塩ストレスで誘導すると考えられる三つのパターン（塩誘導型２、３、４）、スプライシングが起こっていない塩誘導型１が存在していた（図５）。
通常型は転写開始点から５５１塩基から６８８
塩誘導型４は転写開始点から５５１塩基から６６０
塩誘導型３は転写開始点から５５１塩基から６４３
塩誘導型２は転写開始点から５５１塩基から６１８がイントロンとして除かれ、
塩誘導型１は５５１塩基から６８８は除かれない。
５’側ＲＡＣＥ、３’側ＲＡＣＥの産物あわせて５７サンプルのシークエンスの結果、通常型が２８サンプル、塩誘導型４が２サンプル、塩誘導型３が１５サンプル、塩誘導型２が７サンプル、塩誘導型１が５サンプルであった（図５）。ここでクローニングした塩誘導型３（配列番号：５）および通常型（配列番号：１３）の完全長ｃＤＮＡをそれぞれＳａｌｔ−ｆｕｌｌ
【００２７】
（ＳＦ）、Ｎｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（ＮＦ）として今後の実験に用いた。
［実施例３］
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびスプライシングパターンを観察しようと試みた。サンプルは３週間ＭＳ培地で生育させた植物を１６時間ミネラル液体培地で馴化した後、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地に移し、０、１、２、５、１０、２４時間後に根と葉を分けて回収したＲＮＡを用いた。プライマー（ｖｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｆＦｗ「５’−ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＣ−３’（配列番号：２２）」）、（ｖｉｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｒ Ｒｖ「５’−ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＧＣ Ｃ−３’（配列番号：２３）」）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスが２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図４）。
［実施例４］
形質転換系統の作製
形質転換によって得られた各系統の第一世代種子をＴ１種子とした。形質転換に用いたＴ−ＤＮＡは遺伝子ｂａｒをコードする領域を持ち、除草剤ビアラホスによる選抜が可能である。各形質転換系統のＴ１系統はＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（配列番号：１３）を１６系統、Ｓａｌｔ−ｆｕｌｌ（配列番号：５）を９系統用いていた。各系統のホモ接合系統を維持した。リアルタイムＰＣＲにより導入した遺伝子の発現量を調べた後、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地に各形質転換系統の種子及びＣｏｌをそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。
［実施例５］
塩ストレス条件下での表現型
実施例４で得られたシロイヌナズナの各形質転換系統及び野生系統Ｃｏｌの種子
（ＳＦ）、Ｎｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（ＮＦ）として今後の実験に用いた。
［実施例３］
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびスプライシングパターンを観察しようと試みた。サンプルは３週間ＭＳ培地で生育させた植物を１６時間ミネラル液体培地で馴化した後、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地に移し、０、１、２、５、１０、２４時間後に根と葉を分けて回収したＲＮＡを用いた。プライマー（ｖｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｆＦｗ「５’−ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＣ−３’（配列番号：２２）」）、（ｖｉｉｉ）（ａｔ２ｇ２２７６０−ｒ Ｒｖ「５’−ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＧＣ Ｃ−３’（配列番号：２３）」）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスが２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図４）。
［実施例４］
形質転換系統の作製
形質転換によって得られた各系統の第一世代種子をＴ１種子とした。形質転換に用いたＴ−ＤＮＡは遺伝子ｂａｒをコードする領域を持ち、除草剤ビアラホスによる選抜が可能である。各形質転換系統のＴ１系統はＮｏｒｍａｌ−ｆｕｌｌ（配列番号：１３）を１６系統、Ｓａｌｔ−ｆｕｌｌ（配列番号：５）を９系統用いていた。各系統のホモ接合系統を維持した。リアルタイムＰＣＲにより導入した遺伝子の発現量を調べた後、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地に各形質転換系統の種子及びＣｏｌをそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。
［実施例５］
塩ストレス条件下での表現型
実施例４で得られたシロイヌナズナの各形質転換系統及び野生系統Ｃｏｌの種子
【００２８】
を、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地にそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。塩ストレス条件下における生育では、各系統で野生系統より高い耐塩性を示した（図７）。また、ＮＦ（配列番号：１３）を導入した系統が最も耐塩性を獲得していた。ＳＦ（配列番号：５）を導入した系統も野生株に比べ耐塩性を獲得していた。各形質転換系統も通常のＭＳ培地における生育では野生系統Ｃｏｌとの差は観察されなかった。本実験により、ｂＨＬＨ１９の発現が耐塩機構に関与していることが示された。
［実施例６］
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびＣ末端側イントロンに対するスプライシングパターンを観察しようと試みた。プライマー（ｘｉ）（ｐｓｔ−ｐ７−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＧＡＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＣＧ−３’（配列番号：２９）」）、（ｘｉｉ）（１３２８−ｆ Ｆｗ「５’−ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＴＣ−３’（配列番号：３０）」）を用いた以外は実施例３と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスから２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図８）。
［産業上の利用可能性］
本発明のポリヌクレオチドを用いると、植物に耐塩性を付与することができるので、耐塩性を有する形質転換植物細胞および形質転換植物体を提供することができる。また、耐塩性は、水分枯渇耐性（乾燥耐性）を含むたの環境ストレスに対する耐性を伴っていることが多いので、不毛乾燥地帯の緑化およびこれらの地域における農耕への寄与が期待される。さらに、果物の栽培においては、糖度を上げるために灌漑を制限するが、これに伴う収量の減少の緩和への貢献が期待される。加えて、ビルの屋上緑化や道路のり面などにおける灌漑コストの低減も期待される。さらに、強光、低温、高温等の環境ストレスに対しても耐性の付与が
を、７５ｍＭのＮａＣｌを加えたミネラル培地にそれぞれ播種し、育成し、その表現型の観察を行った。塩ストレス条件下における生育では、各系統で野生系統より高い耐塩性を示した（図７）。また、ＮＦ（配列番号：１３）を導入した系統が最も耐塩性を獲得していた。ＳＦ（配列番号：５）を導入した系統も野生株に比べ耐塩性を獲得していた。各形質転換系統も通常のＭＳ培地における生育では野生系統Ｃｏｌとの差は観察されなかった。本実験により、ｂＨＬＨ１９の発現が耐塩機構に関与していることが示された。
［実施例６］
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ストレス処理時間、植物の各部位（葉、根）におけるＲＮＡ量の変化およびＣ末端側イントロンに対するスプライシングパターンを観察しようと試みた。プライマー（ｘｉ）（ｐｓｔ−ｐ７−ｒ−ｆｕｋｕｙａ Ｒｖ「５’−ＧＡＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＣＧ−３’（配列番号：２９）」）、（ｘｉｉ）（１３２８−ｆ Ｆｗ「５’−ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＴＣ−３’（配列番号：３０）」）を用いた以外は実施例３と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行いゲルによる増幅産物の観察を行ったところ、塩ストレスから２時間で根、葉ともにスプライシングが起こらないパターンの大きさのＲＮＡ量が最大になり、その後徐々にイントロンが短いパターンへと移行し、通常のスプライシングパターンへと戻っていった。２４時間後には再び変則的なスプライシングが起こっていた（図８）。
［産業上の利用可能性］
本発明のポリヌクレオチドを用いると、植物に耐塩性を付与することができるので、耐塩性を有する形質転換植物細胞および形質転換植物体を提供することができる。また、耐塩性は、水分枯渇耐性（乾燥耐性）を含むたの環境ストレスに対する耐性を伴っていることが多いので、不毛乾燥地帯の緑化およびこれらの地域における農耕への寄与が期待される。さらに、果物の栽培においては、糖度を上げるために灌漑を制限するが、これに伴う収量の減少の緩和への貢献が期待される。加えて、ビルの屋上緑化や道路のり面などにおける灌漑コストの低減も期待される。さらに、強光、低温、高温等の環境ストレスに対しても耐性の付与が
Claims (11)
- 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：１、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：３、７、９または１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２６に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 請求項１に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つと、請求項２もしくは３に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つとを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
- 配列番号：５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
- 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：２８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有し、かつ植物の耐塩性を高める機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - ＤＮＡである請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項８に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項８に記載のベクターを導入した形質転換植物体。
- 請求項１０に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
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