JPH11269188A - オリゴマーの製造方法 - Google Patents

オリゴマーの製造方法

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JPH11269188A
JPH11269188A JP10336442A JP33644298A JPH11269188A JP H11269188 A JPH11269188 A JP H11269188A JP 10336442 A JP10336442 A JP 10336442A JP 33644298 A JP33644298 A JP 33644298A JP H11269188 A JPH11269188 A JP H11269188A
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prp
synthetic
oligomer
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チョン ペレ
Ali Kandil
カンディル アリ
Charles Sia
シーア チャールズ
Michel H Klein
エイチ． クライン マイケル
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 インフルエンザ菌の感染に対するワクチンと
して有用である免疫原性合成ペプチドとＰＲＰとの接合
体を調製するために有用なオリゴマーを提供すること。 【解決手段】 下記の一般式で表される化合物を固体ポ
リエチレングリコールモノメチルエーテル（ＰＥＧ）に
結合させた多糖類（オリゴマー）を免疫原性合成ペプチ
ドとＰＲＰとの接合体の調製に用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】本発明は、インフルエンザ菌
（Ｈｉ）に対する合成ワクチンに関する。特に、本発明
は、ポリリボシルリビトール リン酸（ｓＰＲＰ）の反
復ユニットを含む合成オリゴ糖に共有結合させることに
より、哺乳動物において高力価の抗ＰＲＰおよび抗ＯＭ
Ｐ抗体を誘導することのできる免疫原性合成ＰＲＰペプ
チド抱合体ワクチンを形成させるための、Ｈｉの外膜タ
ンパク（ＯＭＰ）Ｐ１，Ｐ２およびＰ６の強力なＴヘル
パー細胞決定因子（ＴＨＤ）およびＢ細胞エピトープ
（ＢＥ）の利用に関する。
【従来の技術】インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）は、５
才未満の子供における細菌性髄膜炎の主要な病因である
（参考文献１、２）。（参考文献は、本開示の最後に示
す）。細菌は、ポリリボシルリビトール リン酸（ＰＲ
Ｐ）の反復重合体である多糖類の夾膜によって、食菌作
用から守られている。生物の夾膜多糖類に対して誘導さ
れた抗体は、保護作用を有する（参考文献３）。ジフテ
リア トキソイド（ＰＲＰ−Ｄ）、破傷風トキソイド
（ＰＲＰ−Ｔ）、ＣＲＭ１９７（ＨｂＯＣ）等の各種担
体タンパクおよびナイセリアの外膜タンパクにＰＲＰを
リンクさせた効果の高い抱合体ワクチンが開発されてい
る（参考文献４、５）。しかし、これらの抱合体ワクチ
ンは、その他の感染性夾膜インフルエンザ菌ａ型および
ｃ型、特に重要なワクチンの全くない中耳炎の一般的な
病因の１つであり、いずれの型にも属さない非夾膜イン
フルエンザ菌株に対しては保護作用がない。したがっ
て、現在のＨｉｂワクチンに特定の非夾膜インフルエン
ザ菌免疫原を含めることは、多目的Ｈｉワクチンの開発
にあたって重要である。グラノフら（Ｇｒａｎｏｆｆ
＆ Ｍｕｎｓｏｎ）（参考文献６）は、Ｈｉｂ外膜タン
パク（ＯＭＰ）Ｐ１、Ｐ２およびＰ６に対する抗体が菌
血症のラット仔動物モデルで保護作用を有すると報告し
ている。したがって、追加免疫原およびＰＲＰ担体とし
て精製ＯＭＰまたはその保護エピトープを利用すること
によって、保護作用の高い多目的インフルエンザワクチ
ンが得られると考えられる。いくつかのＨｉｂ亜型か
ら、Ｐ１をコード化した遺伝子がクローン化されている
（参考文献７、８）。これらＨｉｂ分離株からのＰ１タ
ンパクの配列について、広範な分析が行なわれ、過変性
領域が３個所あることが知られている。実際に、ハンセ
ン（Ｈａｎｓｅｎ）のグループによって報告されている
Ｐ１特異性ＭＡｂは、試験したＨｉｂ分離株のわずか５
０％を識別するに過ぎない（参考文献７、９）。Ｐ２タ
ンパクについては、２種類のＨｉｂ亜型（１Ｈおよび３
Ｌ）から分離したＰ２遺伝子のニュクレオチド配列が全
く同じであることが知られている（参考文献１０、１
１）が、Ｈｉｂの別の２亜型（２Ｌおよび６Ｕ）ではＰ
２タンパク配列のアミノ酸が異なることが知られている
（参考文献１１）。それに対して、抗原決定因子、遺伝
子配列および制限フラグメント長多型表現等の分析結果
は、Ｈｉの全ての株でＰ６タンパクは高度に保存されて
いることを暗示している（参考文献１２）。
【発明が解決しようとする課題】最近の研究で、分類可
能またはいずれの型にも属さないインフルエンザ株から
の精製Ｐ１に対するマウスＰ１特異性モノクローナル抗
体（ＭＡｂ ７Ｃ８）およびウサギ抗血清が哺乳動物モ
デルで保護作用を有することが認められている（参考文
献９、１３、１４）。また、マーフィーら（Ｍｕｒｐｈ
ｙ ＆ Ｂａｒｔｏｓ）（参考文献１５）は、いずれの
型にも属さないインフルエンザ菌のＰ２タンパクの表面
露出エピトープを識別するモノクローナル抗体がｉｎ
ｖｉｔｒｏで抗細菌活性を有することを報告している。
抗Ｐ１および抗Ｐ２モノクローナル抗体は、分類可能お
よびいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株と交差
反応を示すことが知られている（参考文献１６〜１
８）。しかし、分類可能およびいずれの型にも属さない
インフルエンザ菌株の両方に対して効果的な多目的ワク
チンとして在来のＨｉｂ ＯＭＰ全体を使用することに
は大きな問題がある。第１に、いずれの型にも属さない
Ｈｉに起因する中耳炎から回復した子供は、一般にＰ２
およびリポオリゴ糖類等の変動性抗原に対する抗細菌性
抗体を獲得する。第２に、上記のＰ１およびＰ２の交差
保護性エピトープは、現在のところ同定されていない。
第３に、抗Ｐ６抗細菌性抗体によって識別されるエピト
ープは細菌の表面に少量しか表現されないので、再感染
の恐れがある（参考文献１２）。第４に、ＯＭＰに対す
る細胞免疫反応の役割について、ほとんど知られていな
い。Ｈｉ ＯＭＰの免疫優勢Ｔヘルパー細胞エピトープ
の特性は、知られていない。したがって、これらのエピ
トープがＨｉ感染に対して免疫反応を誘発するか否かを
明らかにするためには、機能的Ｔヘルパー細胞エピトー
プならびにＰ１、Ｐ２およびＰ６タンパクの保存、表面
露出かつ／または保護的Ｂ細胞エピトープを同定する必
要がある。疾病に対する免疫を誘導する方法は常に進歩
し、現在では抗原として特性の明らかな物質をできるだ
け少量使用する傾向にある。その目的は、ある種の在来
免疫原の副次的影響を排除し、かつ疾病に対するそれら
の免疫原性および保護作用を保存するためである。最近
の研究で、ウイルス性または細菌性タンパクの特定の領
域有する合成ペプチドを実験動物に免疫投与すると、親
タンパクに対する免疫反応の誘導およびそれらの生物学
的機能の中和が可能であることが示唆されている（参考
文献１９〜２２）。このように、合成タンパクは、感染
性疾病に対する安価で、安全なワクチンとして有望であ
る。基礎免疫学の最近の進歩によって、優れた、効果の
高い免疫原は２つの明瞭な機能性抗原決定因子（エピト
ープ）をもっていなければならないことが明らかにされ
ている。その１つ（Ｔ細胞エピトープ）は、免疫系の適
当なＭＨＣクラスＩＩ抗原コンテキスト中に存在するよ
うに設計する。もう１つのエピトープ（Ｂ細胞エピトー
プ）は、抗体の生産を誘導するうえで、認知Ｂ細胞抗原
受容体によって認知されなければならない（参考文献２
３〜２６）。したがって、強力で、有効な合成ワクチン
を製造するためには、機能ＴヘルパーおよびＢ細胞エピ
トープの両方を合成構成物中に含める必要がある。合成
ＰＲＰ二量体、三量体および四量体が合成し、精製し、
担体タンパクと抱合体を形成させて、動物を用いた免疫
原性試験が行なわれている（参考文献２７、２８）。こ
れらの試験で、合成ＰＲＰ三量体タンパク抱合体は、フ
ロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）の存在下で、実
験動物において抗ＰＲＰ抗体反応を誘導することが認め
られている。
【課題を解決するための手段】我々の目的は、従来の非
相同担体タンパクを用いるかわりに、Ｈｉ ＯＭＰから
の免疫優勢エピトープを有する合成ペプチドを追加免疫
原およびＰＲＰ担体として用い、優れた保護作用と自己
由来Ｔ細胞プライミングを有する第１世代の完全合成Ｐ
ＲＰペプチド抱合体ワクチンを開発することであった。
このようなワクチンは、ＰＲＰが異質タンパク、例えば
ジフテリアトキソイド（ＰＲＰ−Ｄ）、破傷風トキソイ
ド（ＰＲＰ−Ｔ）またはＣＲＭ１９７（ＨｂＯＣ）、ま
たはナイセリアのＯＭＰと抱合体を形成している従来の
ワクチンに対して、その他にも優れた点を持っている。
第１に、合成Ｈｉワクチンを使用することによって、将
来多価複合ワクチンとする場合にＤまたはＴの量を減ら
すことができ、これらの担体タンパクに対する過剰免疫
の危険性を軽減することができる。第２に、ＰＲＰを保
存されている保護エピトープと共役させて、感染性Ｈｉ
疾患及び中耳炎の両方に有効なワクチンを製造すること
もできる。 記号およびその定義 ＣＲＭ１９７：ジフテリア毒素と抗原的に交差反応性を
有する非毒性タンパク Ｈｉ：インフルエンザ菌 Ｈｉｂ：インフルエンザ菌ｂ型 ＭＡＰ：多価抗原性ペプチド ＭＢＳ：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミド ＯＭＰ：外膜タンパク ＰＥＧ：ポリエチレン グリコール モノメチルエーテ
ル ＰＲＰ：ポリリボセリビトール リン酸 本発明は、合成ＰＲＰオリゴマーとＨｉ外膜タンパクの
抗原決定因子からなる免疫原性合成抱合体ワクチンの提
供を目的とする。本発明の別の目的は、特定の長さを有
する合成ＰＲＰオリゴマーからなる合成抱合体ワクチン
を提供することである。さらに、本発明の目的は、固体
担体としてポリエチレン グリコール モノメチルエー
テル（ＰＥＧ）を用い、特定部位でＨｉ外膜タンパクの
抗原性決定因子と抱合体を形成することのできる化学的
反応性の高い官能基を有する合成ＰＲＰを効率よく製造
するための化学工程を提供することである。本発明は、
さらに別の側面において、Ｔ細胞エピトープに対して糖
成分の適切な配位を選ぶことによって、合成ＰＲＰペプ
チド抱合体の免疫原性を改善する方法を提供するもので
ある。さらに、本発明の別の目的は、Ｈｉｂの抗原性決
定因子を含む多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）を担体とし
て用いて合成ＰＲＰペプチド抱合体中の炭水化物部分の
密度を高めることによって、炭水化物の免疫原性を向上
させることのできる化学工程を提供することである。本
発明は、別の側面において、免疫原性合成ＰＲＰペプチ
ド抱合体と交差反応性Ｈｉ抗原とからなる多目的Ｈｉワ
クチンの提供を目的とする。本発明の別の目的は、免疫
原性合成ＰＲＰペプチド抱合体と、別のワクチン、例え
ばＤＴＰポリオ、ナイセリア血清型Ａ、Ｂ、Ｃおよび
Ｗ、ならびにＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ、
１４、１９Ｆおよび２３Ｆ等と混合したＨｉ抗原とから
なる新しい世代の多価ワクチンを提供することである。
さらに本発明は、抗Ｈｉｂ抗体、例えば抗ＰＲＰおよび
抗ＯＭＰ抗体の存在を検出するための診断用免疫検定に
使用できる合成ＰＲＰペプチド抱合体の提供を目的とす
る。さらに本発明の目的は、分類可能またはいずれの型
にも属さないＨｉ株の生物標本中における有無を検出す
るための診断用免疫検定キットの成分として、ＰＲＰ特
異性抗体とＯＭＰ特異性抗体の混合物を提供することで
ある。
【発明の実施の形態】本発明は、Ｈｉｂの外膜タンパク
（Ｐ１、Ｐ２およびＰ６）の各種抗原性決定因子（Ｔヘ
ルパー細胞およびＢ細胞エピトープ）のアミノ酸配列を
有するペプチドからなる免疫原およびワクチンの提供に
関する。これらのペプチドの１つ以上からなり、遊離の
ペプチドとして、または免疫原性を向上させるために合
成糖抱合体ワクチンとして合成ＰＲＰオリゴマーと共役
結合させ、かつ／または脂質性部分とリンクさせて投与
することのできる合成ワクチンを開示する。本発明は、
その１側面において、インフルエンザ菌の少なくとも１
種類のタンパク、望ましくはインフルエンザｂ型の外膜
タンパクの少なくとも１つの抗原性決定因子に相当する
アミノ酸配列を有する合成ペプチドを提供する。本発明
は、その１実施例において、ＨｉのＰ１タンパクの保存
されている抗原性決定因子に相当する少なくとも１つの
アミノ酸配列を有する基本的に純粋なペプチドからな
り、このペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＨｉを認
識することのできるポリクローナル抗体を哺乳動物にお
いて誘導することができる。これらのＰ１特異性ポリク
ローナル抗体は、生物試料中のＨｉの存在を検出する試
験キットの成分として使用することができる。例えば、
ペプチドは以下の表１に規定するように、Ｈｉｂ Ｍｉ
ｎｎＡ株の成熟Ｐ１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
１、１２、３、４、５、６、７、９、１３または１４お
よび１５）または免疫原性を保持しているあらゆるタン
パクまたはその変異体のそれぞれアミノ酸配列１−２
９、３９−６４、１０３−１３７、１６５−１９３、１
８９−２１８、２２６−２５３、２４８−２８３、３０
７−３３１、４００−４３７および１７９−２１８に相
当するアミノ酸配列を有する。別の実施例で、本発明は
ＨｉのＰ２タンパクの保存されている抗原性決定因子に
相当する少なくとも１つのアミノ酸配列を有する基本的
に純粋なペプチドからなり、このペプチドはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏにおいてＨｉを認識することのできるポリクロー
ナル抗体を哺乳動物において誘導することができる。こ
れらのＰ２特異性ポリクローナル抗体は、生物試料中の
Ｈｉの存在を検出する試験キットの成分として使用する
ことができる。例えば、ペプチドは以下の表２に規定す
るように、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ２タンパク
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６、２３、２８、２９、３
０、３１および３２）または免疫原性を保持しているあ
らゆるタンパクまたはその変異体のそれぞれアミノ酸配
列１−１４、１２５−１５０、２４１−２６５、２６３
−２８９、２８５−３０６、３０２−３１９および３１
４−３４１に相当するアミノ酸配列を有する。別の実施
例で、本発明はＨｉのＰ６タンパクの保存されている抗
原性決定因子に相当する少なくとも１つのアミノ酸配列
を有する基本的に純粋なペプチドからなり、このペプチ
ドはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＨｉを認識することので
きるポリクローナル抗体を哺乳動物において誘導するこ
とができる。これらのＰ６特異性ポリクローナル抗体
は、生物試料中のＨｉの存在を検出する試験キットの成
分として使用することができる。例えば、ペプチドは以
下の表３に規定するように、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成
熟Ｐ６タンパク（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３５−４１）ま
たは免疫原性を保持しているあらゆるタンパクまたはそ
の変異体のそれぞれアミノ酸配列１−２２、１９−４
１、３５−５８、５４−７７、７３−９６、９０−１１
４および１０９−１３４に相当するアミノ酸配列を有す
る。別の実施例で、本発明はＰ１タンパクの免疫優勢直
線性Ｂ細胞エピトープに相当する少なくとも１つのアミ
ノ酸配列を有する少なくとも１種類のＰ１ペプチドから
なる。これらのペプチドは、抗Ｈｉ抗体、例えば保護抗
体の存在を検出ための診断用キットにおける標的抗原と
して使用することができる。これらのペプチドは、例え
ば、以下の表１に規定するように、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ
株の成熟Ｐ１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２、
３、４、７、９、１３または１４および１５）または免
疫原性を保持しているあらゆるタンパクまたはその変異
体のそれぞれアミノ酸配列３９−６４、１０３−１３
７、１６５−１９３、２４８−２８３、３０７−３３
１、４００−４３７および１７９−２１８に相当するア
ミノ酸配列を有する。別の実施例で、本発明はＰ２タン
パクの免疫優勢直線性Ｂ細胞エピトープに相当する少な
くとも１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１種類の
Ｐ２ペプチドからなる。これらのペプチドは、抗Ｈｉ抗
体、例えば保護抗体の存在を検出ための診断用キットみ
いおける標的抗原として使用することができる。これら
のペプチドは、例えば、以下の表２に規定するように、
Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ２タンパク（それぞれＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０、２４、２８および３２）また
は免疫原性を保持しているあらゆるタンパクまたはその
変異体のそれぞれアミノ酸配列５３−８１、１４８−１
７４、２４１−２６５および３１４−３４２に相当する
アミノ酸配列を有する。別の実施例で、本発明はＰ６タ
ンパクの免疫優勢直線性Ｂ細胞エピトープに相当する少
なくとも１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１種類
のＰ６ペプチドからなる。これらのペプチドは、抗Ｈｉ
抗体、例えば保護抗体の存在を検出ための診断用キット
における標的抗原として使用することができる。これら
のペプチドは、例えば、以下の表３に規定するように、
Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ６タンパク（それぞれＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３９、４０および４１）または免疫
原性を保持しているあらゆるタンパクまたはその変異体
のそれぞれアミノ酸配列７３−９６、９０−１１４およ
び１０９−１３４に相当するアミノ酸配列を有する。別
の実施例で、本発明はＰ１の免疫優勢Ｔ細胞エピトープ
として同定されたペプチドからなる。これらのペプチド
は、ＰＲＰの自己由来担体として、または自己由来また
は非相同性Ｂ細胞エピトープの担体として使用すること
ができる。これらのペプチドは、例えば、以下の表１に
規定するように、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ１タン
パク（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２、６、１０お
よび１３または１４）または免疫原性を保持しているあ
らゆるタンパクまたはその変異体のそれぞれアミノ酸配
列３６−６４、２２６−２５３、３３９−３７０および
４００−４３７に相当するアミノ酸配列を有する。別の
実施例で、本発明はＰ２の免疫優勢Ｔ細胞エピトープと
して同定されたペプチドからなる。これらのペプチド
は、ＰＲＰの自己由来担体として、または自己由来また
は非相同性Ｂ細胞エピトープの担体として使用すること
ができる。これらのペプチドは、例えば、以下の表２に
規定するように、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ２タン
パク（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６、２７および
２８）または免疫原性を保持しているあらゆるタンパク
またはその変異体のそれぞれアミノ酸配列１２５−１５
０、１９３−２１９、２１９−２４４および２４１−２
６５に相当するアミノ酸配列を有する。別の実施例で、
本発明はＰ６の免疫優勢Ｔ細胞エピトープとして同定さ
れたペプチドからなる。これらのペプチドは、ＰＲＰの
自己由来担体として、または自己由来または非相同性Ｂ
細胞エピトープの担体として使用することができる。こ
れらのペプチドは、例えば、以下の表３に規定するよう
に、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ６タンパク（それぞ
れＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３６、３７、３９および４１）
または免疫原性を保持しているあらゆるタンパクまたは
その変異体のそれぞれアミノ酸配列１９−４１、３５−
５８、７３−９６および１０９−１３４に相当するアミ
ノ酸配列を有する。したがって、本発明は、別の側面に
おいて、少なくとも１つの合成Ｂ細胞エピトープにリン
クしたインフルエンザ菌の少なくとも１種類のタンパク
の少なくとも１つの免疫優勢Ｔ細胞エピトープに相当す
るアミノ酸配列を有する合成ペプチドからなる免疫原抱
合体を提供する。本発明は、別の側面において、合成Ｐ
ＲＰオリゴマーのきわめて効率の高い化学合成プロセス
を提供する。このプロセスは固体担体としてポリエチレ
ン グリコール モノメチルエーテル（ＰＥＧ）を用い
る固相／液相合成を組合せたものである。固相担体は、
従来の担体が所定のポアー数のガラス等の化学反応性官
能基をｇあたり約３０〜３５μｍｏｌしか含んでいない
のに対して、約２００〜５００μｍｏｌ／ｇの反応性官
能基を含んでいる。従来の固相合成ではモル数で５〜１
０倍過剰であるのに対して、各共役サイクルにおける合
成ＰＲＰ反復ユニットの量は化学量論的な量である。さ
らに、本発明の新規なプロセスは反応速度が速く、コス
ト効果が高く、営業生産にスケールアップする場合にも
簡単である。それに対して、液相合成は手間がかかり、
高価であり、長時間を要する。本発明のこのプロセスか
ら得られる製品は、以下の式で現される化学反応性ＰＲ
Ｐオリゴ糖類からなる。
【化７】 ここで、ｎは望ましくは３〜２０の整数、Ｒは−ＣＨ２
−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ（ただし、ｍは３〜５の整数、Ｘは
−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＨまたはアミノ反応基、ハ
ロゲン、メタンスルフォニル、トリフルオロメタンスル
フォニルまたは、トルエンスルフォニル等の化学反応性
官能基、またはフェニルアジド、ニトロフェニル、ベン
ジルフェニル等の光反応基）で規定されるリンカーフラ
グメントである。反応基は合成ＰＲＰを別の分子とリン
クさせる。本発明は、別の側面で、少なくとも１つの合
成Ｔ細胞エピトープにリンクした合成炭水化物抗原から
なる免疫原性抱合体を提供する。炭水化物抗原は、細菌
から得てもよいが、特に合成リボセリビトール リン酸
（ＰＲＰ）オリゴマーである。別の実施例において、本
発明は哺乳動物において高力価の抗ＰＲＰ抗体を誘導す
ることができる免疫原性合成ＰＲＰペプチド抱合体ワク
チンを提供する。合成ＰＲＰ担体抱合体ワクチンは、以
下の式で現される分子を含む。
【化８】 ここで、ｎおよびｍは上記の規定と同じであり、Ｒ’は
ＨＩＶ−１ｇａｇタンパクｐ２４からのアミノ酸配列Ｇ
ＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫ（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５
０）を含む少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトー
プ、例えばヒトＴ細胞エピトープまたはＨｉ ＯＭＰか
らのＴ細胞エピトープを有する合成ペプチドである。担
体は、ＴヘルパーおよびＢ細胞エピトープを含むペプチ
ドであってもよい。別の実施例において、本発明は所定
の長さの合成ＰＲＰオリゴマーとＴ−および、またはＴ
−Ｂエピトープを含むＨｉｂ Ｐ１ペプチドの免疫原性
合成配糖体からなる。合成ＰＲＰオリゴマーの大きさ
は、少なくともＰＲＰの３反復単位であるが、好ましく
は６反復単位である。ペプチドは、例えば、下表１に規
定したそれぞれＨｉｂ ＭｉｎｎＡ株のＰ１タンパク
（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２、４、５、６、１
０および１３または１４）または免疫原性を保持したあ
らゆるタンパクまたはその変異体のアミノ酸配列３９−
６４、１６５−１９３、１８９−２１８、２２６−２５
３、３３９−３７０および４００−４３７に相当するア
ミノ酸配列を有することができる。別の実施例におい
て、本発明は所定の長さの合成ＰＲＰオリゴマーとＴ−
および、またはＴ−Ｂエピトープを含むＰ２ペプチドの
免疫原性合成配糖体からなる。合成ＰＲＰオリゴマーの
大きさは、少なくともＰＲＰの３反復単位であるが、好
ましくは６反復単位である。ペプチドは、例えば、下表
２に規定したそれぞれＨｉｂ ＭｉｎｎＡ株のＰ２タン
パク（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２３、２６、２７
および２８）または免疫原性を保持したあらゆるタンパ
クまたはその変異体のアミノ酸配列１２５−１５０、１
９３−２１９、２１９−２４４および２４１−２６５に
相当するアミノ酸配列を有することができる。 別の実
施例において、本発明は所定の長さの合成ＰＲＰオリゴ
マーとＴ−および、またはＴ−Ｂエピトープを含むＰ６
ペプチドの免疫原性合成配糖体からなる。合成ＰＲＰオ
リゴマーの大きさは、少なくともＰＲＰの３反復単位で
あるが、好ましくは６反復単位である。ペプチドは、例
えば、下表３に規定したそれぞれＨｉｂ ＭｉｎｎＡ株
のＰ６タンパク（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３６、
３７、３９および４１）または免疫原性を保持したあら
ゆるタンパクまたはその変異体のアミノ酸配列１９−４
１、３５−５８、７３−９６および１０９−１３４に相
当するアミノ酸配列を有することができる。別の実施例
において、本発明は合成ペプチド配糖体内での炭水化物
密度を増すために、担体として機能性Ｔヘルパー細胞エ
ピトープを含む多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）を用いる
ことにより炭水化物抗原、例えば合成ＰＲＰの免疫原性
が向上するという概念を提供する。ＭＡＰは、Ｈｉｂ
ＭｉｎｎＡ株のＰ２タンパクまたはそのあらゆるタンパ
クのアミノ酸配列１９３−２１９に相当する配列、例え
ば（図１）ＤＩＶＡＫＩＡＹＧＲＴＮＹＫＹＮＥＳＤＥ
ＨＫＱＱＬＮＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６）を含んで
いてもよい。別の実施例において、本発明は哺乳動物に
おいて細胞仲介およびホルモン性免疫反応を誘導する合
成ＰＲＰリポペプチド（または合成ＰＲＰリポペプチド
の混合物）からなる。リポペプチドは、例えばＨｉｂ
ＭｉｎｎＡ株のＰ１タンパクまたはそのあらゆるタンパ
クのアミノ酸配列１６５−１９３に相当する配列トリパ
ルミチルＣＳＳＹＡＫＡＱＶＥＲＮＡＧＬＩＡＤＳＶＫ
ＤＮＱＩＴＳＡＬＳＴＱＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４
３）を含んでいてもよい。別の実施例において、本発明
はＨｉｂのＰ１、Ｐ２またはＰ６のいずれかの同定され
たＴ−Ｂエピトープからなり、Ｈｉ感染に対する免疫を
哺乳動物に賦与するために使用される免疫原性キメラペ
プチドワクチンを提供する。ペプチドは、例えばＶＫＴ
ＩＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＣＡＲＴＲＴＴＥＴＧＫＧＶＫ
ＴＥＫＥＫＳＶＧＶＧＬＲＶＹＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：４２）、ＶＫＴＩＧＤＫＮＴＬＴＬＮＴＦＧＤＧＦ
ＹＡＱＧＹＬＥＴＲＦＶＴＫＡＳＥＮＧＳＮＦＧＤＣ
（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：４３）、ＶＫＴＩＧＤＫＮＴＬＴ
ＬＮＴＣＧＡＮＹＬＬＡＱＫＲＥＧＡＫＧＥＮＫＲＰＮ
ＤＫＡＧＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４４）、ＶＫＴＩ
ＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＤＩＶＡＫＩＡＹＧＲＴＮＹＫＹ
ＮＥＳＤＥＨＫＱＱＬＮＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４
５）、ＶＫＴＩＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＹＡＫＴＫＮＹＫ
ＩＫＨＥＫＲＹＦＶＳＰＧＦＱＹＥＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：４６）、ＧＹＬＥＴＲＦＶＴＫＡＳＥＮＧＳＤ
ＦＫＥＶＫＴＩＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡ
ＨＡＮＬＹＧＬＮＬＮＹＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４
７）、ＡＫＧＥＮＫＲＰＮＤＫＡＧＥＶＦＫＥＶＫＴＩ
ＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡＨＡＮＬＹＧＬ
ＮＬＮＹＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４８）およびＡＲ
ＴＲＴＴＥＴＧＫＧＶＫＴＥＫＦＫＥＶＫＴＩＧＤＫＲ
ＴＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡＨＡＮＬＹＧＬＮＬＮＹ
ＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４９）の配列を有するか、
その免疫原性を有する変異体の一部であってもよい。本
発明のペプチドはＨｉ分離体のＭｉｎｎＡ以外の相同性
領域に相当する配列を有していてもよい。新規な合成ペ
プチドおよびここに提供される抱合体は病原体、、特に
インフルエンザ菌によって起こる疾病に対するワクチン
として、上記の少なくとも１つの合成ペプチドかつ、ま
たは少なくとも１つの合成抱合体と、そのための生理学
的に許容される担体を含む製品に製剤化することができ
る。ワクチンは、ワクチンの有効量を宿主に投与するこ
とによって、病原性疾病に対する免疫を宿主に賦与する
ために使用することができる。ワクチンは、さらに少な
くとも１種類の別の免疫原および／または免疫刺激性分
子からなる。また本発明は、ワクチンの有効量を宿主に
投与することによって、Ｈｉ感染に対する免疫を宿主に
賦与する方法を含む。本発明に記載したペプチドは、さ
らに脂質でリポペプチドに修飾するか、または合成リポ
ペプチド配糖体として合成ＰＲＰにリンクさせ（かつ／
または重合化させ）て別のワクチンとすることもでき
る。ワクチンは、例えば筋肉内注射または非経口的経路
によって哺乳動物に投与したとき、または微粒子、カプ
セルリポソームおよび毒素および抗体等の標的分子を用
いて粘膜表面に運搬したとき、Ｈｉに対する免疫を賦与
するために使用することができる。さらに本発明は、こ
こに提供されるいずれかの合成ペプチドのアミノ酸配列
をコード化した遺伝子を含む抗原運搬用の生ベクターを
含む。生ベクターは、ポックスウイルス、アデノウイル
ス、ポリオウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス
性ベクターであってもよい。生ベクターは、サルモネラ
菌およびマイコバクテリア等の細菌性ベクターであって
もよい。生ベクターは、それと生理学的に許容される担
体とからなるワクチンに組み込んでもよい。前記のよう
に、ここに提供される合成ペプチドは、インフルエンザ
菌による感染を検出するための診断試薬としても使用す
ることができる。ここに記載した合成ペプチドおよび抱
合体のいずれかに対する抗体も、本発明に含まれる。図
１は、ここに報告した合成ＰＲＰペプチド抱合体試験に
使用したペプチド担体のアミノ酸配列を示す。 図２及び３は、従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭ
Ｐ Ｐ１の推定構造を示す。親水性プロットはホップ
（Ｈｏｐｐ）の方法（参考文献３０）によって測定し
た。値はヘプタペプチドウンドーの平均から求め、各セ
グメントの中点にプロットした。図４〜６は、それぞれ
従来の構造解析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ２および
Ｐ６の推定構造を示す。上のパネルは、チョウら（Ｃｈ
ｏｕ ＆ Ｆａｓｍａｎ）（参考文献２９）にしたがっ
て行なった局所平均α−螺旋構造およびβ−回転ポテン
シャルの二次構造解析を示す。下のパネルは、ホップら
（Ｈｏｐｐ ＆Ｗｏｏｄｓ）（参考文献３０）の方法に
より推定した親水性プロットである。値はヘプタペプチ
ドウインドーの平均から求め、各セグメントの中点にプ
ロットした。図７は、Ｈｉｂ ＯＭＰ Ｐ１の免疫優勢
ＢおよびＴ細胞エピトープの模式図である。図８は、Ｈ
ｉｂ ＯＭＰ Ｐ２の免疫優勢ＢおよびＴ細胞エピトー
プの模式図である。図９は、Ｈｉｂ ＯＭＰ Ｐ６の免
疫優勢ＢおよびＴ細胞エピトープの模式図である。図１
０〜１２は、モルモット、ラットおよびウサギの抗Ｐ６
抗血清とＰ６ペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示す。図１
３は、３種類のヒト回復期血清とＰ１ペプチドのＥＬＩ
ＳＡ反応性を示す。図１４は、３種類のヒト回復期血清
とＰ２ペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示す。図１５〜７
は、免疫優勢Ｔ細胞エピトープ（星印で示した）を有す
るＰ１ペプチドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞培養株
の増殖反応を示す。図１８〜２０は、免疫優勢Ｔ細胞エ
ピトープ（星印で示した）を有するＰ１ペプチドに対す
るＰ１特異性マウスＴ細胞培養株の増殖反応を示す。図
２１、２２は、固体担体としてＰＥＧを用いたＰＲＰ合
成の１フローチャートを示す。図２３〜２５は、ＰＲＰ
中間体の合成フローチャートを示す。Ｂｚはベンジル、
Ａｃはアセチル、ＥＴＳはエチルチオ、Ｍｅはメチル、
Ａｌｌｙｌはアリル、ＤＭＴは４，４’−ジメトキシト
リチル、ＮＣＥはシアノエチル、ＭＭＴは４−メトキシ
トリチルを現す。図２６は、破傷風トキソイドと抱合体
を形成させた合成ＰＲＰ二量体および三量体に対するウ
サギの免疫反応を示す。図２７は、各種ＰＲＰ担体抱合
体に対するウサギの免疫反応を示す。図２８は、Ｈｉｂ
Ｐｉ−４およびＯＭＰのＭＡＰの各種合成ペンタマーお
よびヘキサマーに対するウサギの免疫反応を示す。本発
明は、Ｈｉｂ ＯＭＰの免疫原性エピトープの同定、新
規な合成ＰＲＰペプチド抱合体およびこれらからなるワ
クチンに関する。これらの新規免疫原は、Ｈｉｂ ＯＭ
ＰのＰ１、Ｐ２およびＰ６と抗原性決定因子を共有する
化学合成ペプチドにより調製する。ペプチドまたはリポ
ペプチドは、単独または合成ＰＲＰオリゴマーにリンク
させ、ワクチンとして使用する。これらのワクチンは、
例えば筋肉内または非経口経路で哺乳動物に投与し、ま
たは微粒子、カプセル、リポソームならびに毒素および
抗体等の標的分子を用いて粘膜表面に運搬させて、Ｈｉ
感染に対する免疫の賦与に使用する。次に、実施例を参
照して本発明の原理を詳細に説明する。開示を明快にす
るため、本発明は以下の項に分けて詳細に説明するが、
それによって制限されるものではない。 （ｉ）エピトープの推定およびペプチドの合成 （ｉｉ）合成ペプチドを用いたＨｉ ＯＭＰ Ｐ１、Ｐ
２およびＰ６の免疫優勢Ｂ細胞エピトープの同定および
特性 （ｉｉｉ）合成ペプチドを用いたＨｉ ＯＭＰ Ｐ１、
Ｐ２およびＰ６の免疫優勢Ｔ細胞エピトープの同定およ
び特性 （ｉｖ）Ｈｉｂ ＯＭＰペプチドの免疫原性 （ｖ）担体としてＰＥＧを用いたＰＲＰオリゴマーの固
相炭水化物合成 （ｖｉ）合成ＰＲＰオリゴマーとＨｉｂ ＯＭＰペプチ
ドの抱合化および配糖体の免疫特性 （ｖｉｉ）Ｈｉ合成ＰＲＰペプチド抱合体ワクチンの利
用エピトープの推定およびペプチドの合成 Ｈｉ ＯＭＰの免疫優勢Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープ
をマップを作成するために、実施例１２で詳細に記載す
るようにｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成法を用い、Ｐ１、
Ｐ２およびＰ６タンパク配列のほとんどを網羅するそれ
ぞれ１３、１２および７種類の重複合成ペプチド（下表
１、２および３）を合成した。ペプチドの長さは、従来
のアルゴリズム（参考文献２９〜３１）を用いた二次構
造推定によって推定した高指数の親水性β回転に基づい
て選択した（図２〜６）。このようなペプチドは、表面
が露出し、免疫原性を有すると思われる。ファン レゲ
ンモルテル（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｔｅｌ）（参考文
献３２）によって提案されているように、天然のエピト
ープをよく模倣するものとして２５残基を超える長さの
ペプチドを選んだ。場合によっては、部位特異的抱合化
を目的として、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にさらに
システインを追加した。合成ペプチドを用いたＨｉ ＯＭＰ Ｐ１，Ｐ２および
Ｐ６の免疫優勢Ｂ細胞エピトープを同定および特性 Ｈｉｂ ＯＭＰの免疫優勢Ｂ細胞エピトープを同定する
ため、異なったハプロタイプ（Ｈ−２、Ｈ−２、Ｈ−
２、Ｈ−２、およびＨ−２）のウサギ、モルモットおよ
びマウスにフロイントのアジュバントとともに精製Ｐ
１、Ｐ２またはＰ６タンパクを免疫投与した。一次およ
び二次免疫投与後、Ｐ１、Ｐ２およびＰ６特異性ＥＬＩ
ＳＡで判定したところ（表４、５および６）、いずれの
動物も強く、特異的な抗ＯＭＰ抗体反応を示した。グラ
ノフら（Ｇｒａｎｏｆｆ ＆ Ｍｕｎｓｏｎ）によって
すでに報告されているように（参考文献６）、ウサギの
抗Ｐ１、抗Ｐ２および抗Ｐ６抗血清は、生Ｈｉｂ誘発投
与に対して長期間ラット仔動物を防御した。モルモット
の抗Ｐ２抗血清も、このモデルで有効であった。Ｈｉｂ
ＯＭＰの直線性Ｂ細胞エピトープのマップを作成する
ため、Ｐ１、Ｐ２およびＰ６の配列のほとんどを網羅す
る重複合成ペプチドをそれぞれＥＬＩＳＡプレート上に
コーティングし、実施例１７で記載するように各種抗Ｐ
１、抗Ｐ２および抗Ｐ６抗血清でプローブした。結果は
図７〜９に要約する。Ｐ１の免疫優勢直線性Ｂ細胞エピ
トープは、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成句Ｐ１タンパクの
アミノ酸配列３９−６４、１０３−１３７、１６５−１
９３、２４８−２８３、３０７−３３１、４００−４３
７および１７９−２１８に相当するペプチド配列の範囲
内に位置していることが明らかとなった（下表１参
照）。免疫優勢Ｂ細胞エピトープを含むＰ２ペプチド
は、Ｈｉｂ ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ２タンパクの残基５
３−８１，１４８−１７４、２４１−２６５および３１
４−３４２として同定した（下表２参照）。同様に、免
疫優勢Ｂ細胞エピトープを含むＰ６ペプチドは、Ｈｉｂ
ＭｉｎｎＡ株の成熟Ｐ６タンパクの残基７３−９６、
９０−１１４および１０９−１３４であった（下表３参
照）（図１０〜１２）。興味あることに、３種類のヒト
回復期血清も、上記のＰ１およびＰ２免疫優勢エピトー
プと強く反応した（図１３および１４）。さらに、株特
異的Ｐ１防御性Ｂ細胞エピトープは、Ｐ１タンパクの残
基１６５−１９３に相当する領域にマップした。これら
の結果は、上記のＢ細胞エピトープが生物液体中の抗Ｈ
ｉ抗体の有無を検出するための診断キットにおける標的
抗原として使用できることを示している。合成ペプチドを用いたＨｉ ＯＭＰ Ｐ１、Ｐ２および
Ｐ６の免疫優勢Ｔ細胞エピトープの同定および特定 Ｈｉｂ ＯＭＰ特異性Ｔ細胞エピトープは、天然ＯＭＰ
で免疫を与えた各種系統のマウスから得たＰ１、Ｐ２お
よびＰ６ペプチドならびにＴ細胞培養株を用いて測定し
た。重複Ｐ１ペプチド（１３種類）、Ｐ２ペプチド（１
７種類）およびＰ６ペプチド（７種類）に対するＯＭＰ
特異性Ｔ細胞培養株のリンパ球増殖反応は、実施例１９
に記載する従来の増殖検定法を用いて測定した。結果
（図１５〜１７および１８〜２０、下表７）から、ある
種の合成ペプチドのみが増殖反応を誘発し、Ｔ細胞エピ
トープの識別はＭＨＣにより制限を受けることが認めら
れた。Ｐ１の残基３９−６４、２２６−２５３、３３９
−３７０および４００−４３７、Ｐ２の残基１２５−１
５０、１９３−２１９、２１９−２４４および２４１−
２６４、Ｐ６の残基１９−４１、３５−５８、７３−９
６および１０９−１３４は、適当なマウスＭＨＣコンテ
キストが存在する場合、それぞれ相当するＯＭＰ特異性
マウスＴ細胞培養株に対して高い刺激を示した。したが
って、これら免疫優勢Ｔ細胞エピトープは、それらの免
疫原性を向上させるために、ＰＲＰかつ／またはＯＭＰ
Ｂ細胞エピトープの自己由来担体として使用すること
ができる。Ｈｉｂ ＯＭＰペプチドの免疫原性 合成ＯＭＰペプチドがワクチンとして使用できるか否か
を調べるために、遊離のペプチドおよびペプチドＫＬＨ
抱合体について、それぞれ免疫原性を検定した。ウサギ
の抗ペプチド抗血清を用い、免疫ペプチドおよびそれら
の親ペプチドとの反応性をＥＬＩＳＡおよび免疫プロッ
トによって測定した。下表８に示すように、ＨＩＢＰＩ
−８およびＨＩＢＰ１−８−ＫＬＨ抱合体を除く全ての
抗Ｐ１ペプチド抗血清が、ＥＬＩＳＡでそれぞれ相当す
る免疫ペプチドに対して特異的であることが認められ
た。遊離のペプチドにより高力価のペプチド特異性Ｉｇ
Ｇ抗体が誘導されたことから、ペプチドは機能Ｔヘルパ
ー決定因子とＢ細胞エピトープとからなっていると考え
られる。さらに、使用した全ての検定で抗ＨＩＢＰ１−
４、抗ＨＩＢＰ１−５、抗ＨＩＢＰ１−７、抗ＨＩＰＢ
１−９、抗ＨＩＢＰ１−１０、抗ＨＩＢＰ１−１１およ
び抗ＨＩＢＰ１−１４抗血清がＰ１を識別したことか
ら、これらの領域は抗原性を有し、抗体と反応できるよ
うに遊離の状態にあることを示している。これらのペプ
チドはウサギにおける強力なＩｇＧ抗体反応によって誘
導されたタンパクＴヘルパー決定因子およびペプチドＫ
ＬＨ抱合体を含んでいることから、これらはワクチン調
製物中で抗原として作用することは明らかである。Ｈｉ
ｂ Ｐ１ペプチド特異性抗血清がインフルエンザ菌のい
ずれの型にも属さない株の天然Ｐ１と交差反応を示すか
否かを測定することは興味のあることであった。ＨＩＢ
Ｐ１−１、ＨＩＢＰ１−３、ＨＩＢＰ１−５、ＨＩＢＰ
１−６、ＨＩＢＰ１−７、ＨＩＰＢ１−９、抗ＨＩＢＰ
１−１２およびＨＩＢＰ１−１３合成ペプチドに対する
ウサギの抗血清は、分類可能およびいずれの型にも属さ
ない分離株からのＰ１タンパクを識別した。これらの結
果は、成熟Ｐ１タンパクの残基１−２９、３９−６４、
１０３−１３７、１８９−２１８、２２６−２５３、２
４８−２８３、３０７−３３１および４９９−４３７に
相当するペプチドが、インフルエンザ菌の分類可能およ
びいずれの型にも属さない株に高度に保持されているエ
ピトープを含んでいることを示している。Ｐ２ペプチド
ＫＬＨ抱合体に対するウサギの抗血清について、天然Ｐ
２に対する反応性をＰ２特異性ＥＬＩＳＡおよび免疫ブ
ロット分析により検定した。ＨＩＢＰ２−２６−ＫＬＨ
およびＯＭＰ２−１３−ＫＬＨ抱合体を除くすべてのペ
プチド特異性抗血清が免疫ブロットでＰ２を識別した
が、Ｐｏｒｉｎ−１、ＯＭＰ２−５、７、８、１０、１
２、ＣＨＩＢＰ２ペプチドＫＬＨ抱合体のみが、Ｐ２特
異性ＥＬＩＳＡで天然Ｐ２と交差反応を示す抗体を誘導
することが認められた（下表９）。フロイントの完全ア
ジュバントに乳化させた非抱合体ペプチドは、免疫ブロ
ットでＰｏｒｉｎ−１およびＨＩＢＰ２−２６を除き、
全てきわめて強力なＰ２に対するペプチド特異性抗体反
応を誘導した（下表９）。さらに、非抱合体ペプチドＯ
ＭＰ２−４、８、１０、１１、１２および１３に対する
抗血清は、Ｐ２特異性ＥＬＩＳＡで精製Ｐ２と強く反応
した。これらのデータは、これらのペプチドが強い機能
性Ｔヘルパー細胞エピトープと免疫原性Ｂ細胞エピトー
プを含んでいることを暗示している。さらに、３種類の
いずれの型にも属さないん分離株ＳＢ３０、ＳＢ３２お
よびＳＢ３３から精製したＰ２を、免疫ブロットの標的
抗原として用いた。ウサギの抗Ｐｏｒｉｎ−１０、ＭＰ
２−５、８、１０、１１、１２および１３抗血清は３種
リーチング全ての株からのＰ２と強く反応した。これら
の結果は、残基１−１９、１２５−１５０、１８３−２
１９、２４１−２６５、２６３−２８９、２８５−３０
６および３０２−３１９に相当するペプチドはインフル
エンザ菌の分類可能およびいずれの型にも属さない株に
保存されているエピトープを含んでいることを暗示して
いる。Ｐ６特異性ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット分析を
用いて、Ｐ６ペプチドに対するウサギの抗血清のＰ６に
対する反応性を検定した。Ｐ６−４に対する抗血清を除
くすべてのペプチド特異性抗血清がＰ６−ＥＬＩＳＡで
天然Ｐ６を識別し、免疫ブロットで分類可能およびいず
れの型にも属さないＰ６と交差反応を示すことが認めら
れた（下表１０）。これらの結果は、Ｐ６ペプチドが強
力な機能性Ｔヘルパー細胞エピトープと免疫原性Ｂ細胞
エピトープを含んでいることを暗示している。さらに、
これらの結果は、Ｐ６タンパクがインフルエンザ菌の分
類可能およびいずれの型にも属さない株に保持されてい
ることを暗示している。したがって、保持されているこ
れらのＰ１，Ｐ２およびＰ６エピトープは交差反応性
（Ｈｉの分類可能およびいずれの型にも属さない株）合
成ワクチンの調製に単独または混合して使用することが
できる。上記のペプチドは、さらに別のワクチンを製造
するために、重合化し、または脂質で修飾してリポペプ
チドとし、または合成ＰＲＰにリンクさせて合成糖ペプ
チドまたはリポ糖ペプチド抱合体として使用することも
できる。これらのワクチンは、例えば筋肉内または非経
口的に哺乳動物に投与し、または微粒子、カプセルおよ
び毒素および抗体等の標的分子を用いて粘膜表面に運搬
すことによって、Ｈｉ感染に対する免疫賦与に使用する
ことができる。さらに、Ｐ１、Ｐ２およびＰ６から同定
した免疫優勢ＴおよびＢ細胞エピトープからなり、タン
デムにリンクした合成キメラペプチドが、Ｈｉ感染に対
して強い防御抗体反応を誘導するか否かを測定するた
め、実験を行なった。 アミノ酸配列ＶＫＴＩＧＤＫＲ
ＴＬＴＬＮＴＣＡＲＴＲＴＴＥＴＧＫＧＶＫＴＥＫＥＫ
ＳＶＧＶＧＬＲＶＹＦ、ＶＫＴＩＧＤＫＮＴＬＴＬＮＴ
ＦＧＤＧＦＹＡＱＧＹＬＥＴＲＦＶＴＫＡＳＥＮＧＳＮ
ＦＧＤＣ、ＶＫＴＩＧＤＫＮＴＬＴＬＮＴＣＧＡＮＹＬ
ＬＡＱＫＲＥＧＡＫＧＥＮＫＲＰＮＤＫＡＧＥＶ、ＶＫ
ＴＩＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＤＩＶＡＫＩＡＹＧＲＴＮＹ
ＫＹＮＥＳＤＥＨＫＱＱＬＮＧＣ、ＶＫＴＩＧＤＫＲＴ
ＬＴＬＮＴＹＡＫＴＫＮＹＫＩＫＨＥＫＲＹＦＶＳＰＧ
ＦＱＹＥＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４６）、ＧＹＬＥ
ＴＲＦＶＴＫＡＳＥＮＧＳＤＦＫＥＶＫＴＩＧＤＫＲＴ
ＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡＨＡＮＬＹＧＬＮＬＮＹＳ
Ｆ、ＡＫＧＥＮＫＲＰＮＤＫＡＧＥＶＦＫＥＶＫＴＩＧ
ＤＫＲＴＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡＨＡＮＬＹＧＬＮ
ＬＮＹＳＦおよびＡＲＴＲＴＴＥＴＧＫＧＶＫＴＥＫＦ
ＫＥＶＫＴＩＧＤＫＲＴＬＴＬＮＴＴＡＮＹＴＳＱＡＨ
ＡＮＬＹＧＬＮＬＮＹＳＦを有するペプチドを合成し、
精製し、ＣＦＡまたはミョウバンの存在下でウサギに免
疫投与した。結果を下表１１に要約する。いずれの抗ペ
プチド抗血清も相当する免疫ペプチドと強く反応した
が、キメラペプチドは必ずしも全てが天然ＯＭＰに対す
る抗体を誘導するとは限らなかった。もっとも優れた免
疫原はペプチド１Ｐ１３−２Ｐ８および２６−１１３で
あり、これらのペプチドはミョウバンの存在下で投与し
た場合、天然Ｐ１およびＰ２タンパクを識別する抗体を
誘導した。これらのペプチドはＨｉ株に保持されている
エピトープを含んでいるので、追加免疫原として、また
はリポペプチドに修飾して、またはワクチンとして合成
ＰＲＰオリゴマーにリンクさせて使用することができ
る。これらのワクチンは、例えば筋肉内投与または非経
口的経路によって哺乳動物に投与することによって、ま
たは微粒子、カプセル、リポソームならびに毒素および
抗体等の標的分子を用いて粘膜表面に運搬させることに
よって、Ｈｉ感染に対する免疫を賦与することができ
る。担体としてＰＥＧを用いたＰＲＰオリゴマーの固相炭水
化物合成 図２１〜２５に概略を示したように、固相／液相合成と
きわめて効率的なリンアミド化法を組合せて、合成ＰＲ
Ｐを調製した。この方法は新規なプロセスであり、固体
担体としてポリエチレン グリコール モノメチルエー
テル（ＰＥＧ）を使用する。従来の所定ポアー数のガラ
ス等の担体が約３０〜３５μｍｏｌ／ｇの反応基を持っ
ているのに対して、この固相担体は約２００〜５００μ
ｍｏｌ／ｇの範囲にある多くの化学的反応性の官能基を
有している。この合成法では各共役サイクルでわずか化
学量論的量の合成ＰＲＰ反復ユニットを使用するのに対
して、従来の固相合成ではモル数で５〜１０倍も過剰が
使用される。さらに、ＰＥＧは反応溶媒に可溶性であ
り、各共役サイクルにおける共役効率は約９５〜９８％
である。サイクルの終点でＰＥＧ結合合成ＰＲＰをエー
テルで沈殿させ、副生物を除去する。合成ＰＲＰヘキセ
マーの場合、最終収率は約７０％であった。したがっ
て、本発明に係わる合成プロセスはきわめて速く、コス
ト効果が高く、営業生産のためにスケールアップする場
合にも簡単であるのに対して、液相合成は人件費がかか
り、高価であり、時間がかかる。以下に、本合成プロセ
スをさらに詳細に説明する。オリゴマーの出発物質であ
るＰＲＰ反復ユニットは、以下の式で現される。
【化９】 ここで、ＢｎおよびＤＭＴは、それぞれベンジルおよび
ジメチトキシトリチル基である。この反復ユニットを実
施例１０に記載するようにＰＥＧに共役させ、トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）で脱トリチル化し、ついで別のＰＲＰ
反復ユニットと共役させて、次式で現されるように長い
結合鎖の化合物とする。
【化１０】 得られた化合物を、つぎにＴＣＡで脱トリチル化する。
各サイクルで、脱トリチル化した鎖を触媒、望ましくは
テトラゾールの存在下で共役させることによって鎖の延
長を行なう。各共役工程の終了時に、酸化剤、望ましく
はｔ−ブチル ヒドロパーオキシドを用いて、リンの酸
化を行なう。望ましい長さのオリゴマーが得られるま
で、この合成サイクル（脱トリチル化、共役、および酸
化）を繰り返す。以下の式で現されるチェーンターミネ
ーターを用いて、ＰＲＰオリゴマー化を終了する。
【化１１】 ここで、ｍは望ましくは４〜６の整数であり、ＭＭＴは
モノメトキシトリチルである。重合化終了後、望ましく
はアンモロリーシスによって、得られたＰＥＧ保持オリ
ゴマー（本発明の目的の１つである）を固体担体から解
離させる。回収される物質は、次式によって現される。
【化１２】 ここで、ｎは望ましくは３〜２０の整数、ｍは望ましく
は４〜６の整数、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴはモノメトキ
シトリチルである。この化合物は対イオンを有する。こ
のイオンは、上記のようにアンモニアまたは置換アンモ
ニアであることが望ましい。実施例１０に記載するよう
に水／酢酸／ｔ−ブタノールの存在下で、活性炭にコー
チングしたパラジウムによって水素化して、側鎖を保護
している置換基を除去する。得られたオリゴマーを常
法、望ましくはゲルおよび陰イオン交換クロマトグラフ
ィーの組合せによって精製してもよい。上記のように、
重合化終了前の最後の段階で化合物Ｘ６を共役させるこ
とによって（図２３〜２５）、合成ＰＲＰオリゴマーを
変換し、以下の式で現される化学反応性官能基を持たせ
るのが容易となる。
【化１３】 ここで、ｎは望ましくは３〜２０の整数であり、Ｒは−
ＣＨ２−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ（ただし、ｍは望ましくは３
〜５の整数、Ｘは−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＨ等の化
学反応性官能基、またはハロゲン、メタンスルフォニ
ル、トリフルオロメタンスルフォニルまたはトルエンス
ルフォニル等のアミノ反応基、またはフェニルアジド、
ニトロフェニル、ベンジルフェニル等の光励起性反応基
である）で現されるリンカーフラグメントである。官能
基を有する化合物は、本発明における最も好ましい実施
例においては、下記の式で現される抱合体を形成してい
る。
【化１４】 ここで、ｎは望ましくは３〜２０の整数、ｍは望ましく
は３〜５の整数、Ｒ’は−（ＣＨ２−担体）（ただし、
Ｙはリンカー分子であり、ｍ−マレイミジベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドであってもよく、担体は
ＨｉペプチドまたはそのＭＡＰ系）である。抱合体は対
イオンを伴っている。その対イオンは、図にしめしたよ
うにＮａ＋、であることが望ましい。合成ＰＲＰの調製
法には多くの方法があることは明らかである。これらの
公知の技術、例えばヨーロッパ特許公報０ ３２０ ９
４２（参考文献２８）および０ ２７６ ５１６（参考
文献２７）、ならびに本発明に関連して使用される技術
は、本発明の範囲に含まれる。合成ＰＲＰオリゴマーとＴヘルパー細胞エピトープペプ
チドの抱合化および配糖体の免疫特性 本発明にしたがって利用されるペプチドは、若い哺乳動
物に投与したとき安全で、免疫学的に有効なＴ細胞エピ
トープ、例えば非−１ 画タンパクｐ２４からのヒトＴ
細胞エピトープ、Ｐ２４Ｅとして利用できるあらゆるペ
プチドを含む。特定の実施例では、Ｈｉｂの外膜タンパ
クからのペプチドを用い、その抱合化の技術は実施例１
１および１３に詳しく記載する。抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体
反応を誘導するに必要な最低反復ユニット数を測定する
ために、合成ＰＲＰオリゴマー（二量体および三量体）
を破傷風トキソイドに共役させ、ミョウバンの存在下で
配糖体をウサギに注射した。図１５に示した結果から、
免疫を誘導するためには合成ＰＲＰオリゴマーが少なく
とも３反復単位必要であると思われる。本発明にしたが
って、完全合成ＰＲＰペプチド抱合体ワクチンを調製し
た。すなわち、十分に特性の明らかな合成Ｔ細胞エピト
ープ、例えばＨｉｂ特異性保護エピトープと少なくとも
１つの機能性Ｔヘルパー細胞エピトープを有するＨＩＢ
Ｐ１−４ペプチド（Ｐ１タンパクの残基１６５−１９
３）に、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にいずれかに附
加したシステインを介して合成ＰＲＰオリゴマーを共役
させた。効果的な合成ＰＲＰペプチド抱合体ワクチンを
調製するために、炭水化物抗原の免疫原性に影響すると
思われるいくつかの要因を注意深く検査する必要があ
る。これらの要因は、（ｉ）オリゴ糖類の側鎖の長さ、
（ｉｉ）Ｔ細胞エピトープに対する糖の抱合部位、（ｉ
ｉｉ）ペプチド上の炭水化物抗原の密度、（ｉｖ）配糖
体の安定性に影響する抱合化条件、（ｖ）抗原賦与およ
び処理を最適化するために、炭水化物部分と担体ペプチ
ドとの間にリンカーまたはスペサーが必要かどうか等で
ある。最後に、１対のペプチド、すなわち、それぞれＣ
末端（ＨＩＢＰ１−４：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５１）お
よびＮ末端（ＣＨＩＢＰ１−４：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
５２）に附加した追加システイン残基のみが異なるＨＩ
ＢＰ１−４およびＣＨＩＢＰ１−４（図１）を合成し、
精製し、Ｔ細胞エピトープとして使用して、Ｔ細胞エピ
トープに対する糖の配位が構成物の免疫原性に及ぼす影
響を調べた。炭水化物抗原として、合成ＰＲＰ三量体を
用いた。２種類のＰＲＰペプチド抱合体（ＰＲＰ−ＣＨ
ＩＢＰ１−４およびＨＩＢＰ１−４−ＰＲＰ）を調製
し、アルムの存在下でウサギに注射した。３回免疫投与
したのち、ウサギの抗血清の抗ＰＲＰおよび抗ペプチド
ＩｇＧ抗体力価を検定した。いずれの抱合体も強い抗ペ
プチドおよび抗Ｐ１抗体反応を誘導したが、合成ＨＩＢ
Ｐ１−４−ＰＲＰのみが抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体反応を誘
導した。これらの結果は、Ｔ細胞エピトープに対する糖
の配位が、炭水化物抗原に対する宿主の免疫反応に著し
い影響を及ぼすことを暗示している。機能性Ｔ細胞エピ
トープを含む全てのペプチドが免疫系に合成ＰＲＰオリ
ゴマーを効果的に賦与するか否かを検討するため、機能
性Ｔ細胞エピトープを有することが知られている別のペ
プチド２種類（ＣＯＭＰ２−８：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
５３およびＰ２４ＥＣ：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５６）を
合成ＰＲＰ三量体と抱合体を形成させた。配糖体をミョ
ウバンに吸収させ、ウサギに免疫投与した。結果を下表
１２に要約する。両配糖体（ＣＯＭＰ２−８−ＰＲＰお
よびＰ２４ＥＣ−ＰＲＰ）とも、抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体
反応を誘導した。合成配糖体ワクチンの免疫原性に対す
る炭水化物密度の影響を測定するために、合成ＰＲＰ二
量体と８側鎖ＯＭＰ２−８ペプチド（Ｐ２タンパクの残
基１９３−２１９）（図１：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５
４）を含む多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）を抱合化させ
た。抱合体化のために９つのシステイン残基が用意され
ていたにもかかわらず、ＭＡＰ１分子中にわずか５分子
のＰＲＰ三量体が共役結合しているに過ぎなかった。し
かし、５０μｇの合成配糖体をミョウバンの存在下で３
回注射すると、２匹のウサギとも強い抗ＰＲＰＩｇＧ抗
体反応を獲得した。抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体力価は、直線
性ペプチドＰＲＰ抱合体と比較して約４倍も高かった
（下表１２）。さらに、抗ペプチドおよび抗Ｐ２抗体反
応は、直線性ペプチドＰＲＰ抱合体に比較して１〜２桁
高かった。さらに図２７に示した結果を分析すると、Ｈ
ｉｂ ＭＡＰと合成ＰＲＰオリゴマーの抱合体はワクチ
ンとして優れ、ジフテリア トキソイドまたはＰ１また
はＰ２タンパクと共役した天然ＰＲＰとほぼ同等の高い
抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体力価を誘導することが認められ
た。炭水化物反復ユニットの長さが配糖体中の炭水化物
抗原の免疫原性に影響するか否かを調べるため、合成Ｐ
ＲＰの二量体、三量体、五量体、六量体および天然ＰＲ
Ｐ（分子量３０ｋＤａ）をそれぞれ直線性ペプチドＨＩ
ＢＰ１−４およびＯＭＰ２−８ ＭＡＰのいずれかと共
役させた。驚くべきことに、天然ＰＲＰと抱合体を形成
させたペプチドは両方とも抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体反応を
誘導しなかった。それに対して、直線性ペプチドＨＩＢ
Ｐ１−４と抱合体を形成させたＰＲＰの五量体および六
量体とも強く、一定した抗ＰＲＰ ＩｇＧ抗体反応を誘
導した（図２８）。合成ＰＲＰ六量体と抱合体を形成さ
せたＯＭＰ２−８ ＭＡＰも高い免疫原性を示した。合成グリコペプチド抱合技術の利用 本発明の選択実施例において、配糖体技術は一般的に病
原性外膜性バクテリアに対する抱合ワクチンの製造に利
用することができる。このように、本発明の配糖体技術
は、インフルエンザ、肺炎球菌、大腸菌、髄膜炎菌、チ
フス菌、ミュータンス連鎖球菌、クリプトコッカス ネ
オフォルマンス、クレブシェラ、黄色ブドウ球菌、およ
び緑膿菌を含む細菌により表現される保護多糖類による
感染に対して防御作用を表すワクチンに利用することが
できる。特定の実施例において、本合成配糖体技術はタ
ンパクまたはオリゴ糖類に対する抗体を誘導するワクチ
ンの製造に利用することができる。このようなワクチン
は、治療剤または生物活性物質と共約させて、例えば腫
瘍細胞に対する免疫誘導、または抗腫瘍抗体の誘導に用
することができる。本発明に係わる方法の応用は当該分
野の専門家にとっては容易に理解できる。本発明の製品
の例およびその製造法および利用を、以下の実施例で説
明する。上記のペプチドのあらゆる変異体、または機能
的に同等な変異体は、本発明の範囲に含まれる。上記
の”変異”または”機能的に同等な変異”という用語
は、その程度は問わず、インフルエンザ菌分離株のＰ
１、Ｐ２およびＰ６ペプチドと同様に作用する限り、ペ
プチドがアミノ酸残基の１つまたはそれ以上を付加、切
除、または誘導体化によって修飾された場合を意味し、
その場合本発明の範囲内に含まれるものである。これら
のペプチド（表１〜３および１１）および同様なペプチ
ドのアミノ酸配列が明らかになると、これらのペプチド
は市販のペプチド合成装置、例えばアプライド・バイオ
システムス モデル４３０Ａ等を用いるか、ＤＮＡ組換
え技術によって容易に合成することができる。合成ＰＲ
Ｐ二量体は免疫原性を有さず、すでに報告されている結
果と一致した。上記の開示は、本発明を一般的に記載し
たものである。さらに完全な理解は、以下の実施例を参
照することによって得られる。これらの実施例は、説明
のためにのみ記載したもので、本発明を限定するための
ものではない。態様の変更、相当するものとの置換は容
易に推定できるものであり、本発明の範囲と考えられ
る。ここでは特定の用語を使用したが、このような用語
は記述を目的としたものであり、制限を目的としたもの
ではない。この開示では免疫学的方法が明瞭に記載され
ていないかも知れないが、当該技術分野の専門家には自
明の事実である。
【実施例】実施例１ ２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−Ｏ−［２，５−
ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−リボフラノシル］−５−Ｏ
−（４，４−ジメトキシトリチル）−Ｄ−リビト−ル
（化合物１４、図２３−２５）の調製 室温において、すでに記載されている（参考文献３３〜
３６）ように１２の中間体を経由してＤ−リボ−スから
調製した２，５−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−リボフラ
ノシル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リビト
ール（化合物１３、図２３〜２５）１０．２ｇ、ピリジ
ン（３．４ｍｌ）および４−ジメチルアミノピリジン
（８６０ｍｇ）を含むジクロロメタン溶液２００ｍｌに
４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（６．２ｇ）
を添加した。１８〜２４時間撹拌したのち、反応混合液
を重炭酸ナトリウム飽和液に注いだ。水層をジクロロメ
タンで抽出し、乾燥させ、溶媒を留去した。生成物をシ
リカゲルクロマトグラフィーで精製し、ＮＭＲによって
その構造を確認した。 実施例２ ２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−Ｏ−［２，５−
ジ−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−サクシニル−β−Ｄ−リボ
フラノシル］−５−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチ
ル）−Ｄ−リビトール（化合物１６、図２１、２２）の
調製 実施例１から得られた生成物１．３４ｇを含む乾燥ピリ
ジン溶液（４．５ｍｌ）に、無水コハク酸（３９０ｍ
ｇ）と４−ジメチルアミノピリジン（２４０ｍｇ）を添
加した。反応混合液を５０〜８０℃の水浴中で３〜１０
時間撹拌した。水（２．０ｍｌ）を添加したのち、反応
混合液をロータリーエバポレーターで濃縮した。ジクロ
ロメタン：メタノール：トリエチルアミン（９５：５：
２．５，ｖ／ｖ／ｖ）でシリゲルクロマトグラフィーを
行なってトリエチルアミン塩を得て、その構造をＮＭＲ
で確認した。 実施例３ リボシルリビトール ホスフォロアミデートの調製 化合物１６の溶液（乾燥ジオキサン５ｍｌ中１．２ｇ）
に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．４ｍ
ｌ）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
クロロホスフォロアミデート（６４０μｌ）を添加し
た。１〜３時間撹拌したのち、さらにＮ，Ｎ−ジイソプ
ロピルエチルアミン（４３０μｌ）および２−シアノエ
チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスフォロアミデ
ート（２５０μｌ）を添加した。反応混合液をジクロロ
メタンで３倍に希釈し、等量のＩＭ重炭酸トリエチルア
ンモニウム液、ブライン液で抽出し、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥した。生成物をシリカゲルで精製し、その構造
をＮＭＲで確認した。 実施例４ １−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−６−シアノ−ヘ
キサン（化合物Ｘ２，図２３−２５）の調製 ジメチルスルフォキシドに溶解した青酸ナトリウム
（１．２ｇ）を９０℃で３０分間加熱した。すでに報告
されている方法（参考文献３７）にしたがって調製した
固体の１−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−６−ブロ
モヘキサン（５．８ｇ，化合物Ｘ１）を青酸ナトリウム
溶液に添加した。１２０〜１３０℃で２０〜１８０分間
加熱したのち、反応混合液を氷冷水中に注ぎ、水層をエ
ーテルで抽出し、ブライン液で洗浄し、乾燥したのち濃
縮した。 （ｖｉｉ）Ｈｉ合成ＰＲＰペプチド抱合体ワクチンの利
用 生成物を０．５トール、１０７℃で蒸留して無色油状物
を得た。高解像質量分析で、Ｃ１２Ｈ２４ＯＮＳｉの理
論値２２６．１６２７に対して実測値２２６．１６２４
が得られた。 実施例５ ７−アミノ−１−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−ヘ
プタン（化合物Ｘ３、図１４）の調製 水酸化リチウムアルミニウム（６００ｍｇ、アルドリ
チ）のエーテル溶液（５０ｍｌ）に、実施例４で得られ
た生成物のエーテル溶液（５０ｍｌ）を滴下した。１−
３時間後に、反応混合液を水に注ぎ、３０分間撹拌し
た。水酸化アルミニウムの沈殿を濾過して除き、水層を
エーテルで３回抽出した。エーテル抽出液をブライン液
で洗い、乾燥して、濃縮した。粗生成物を０．２５トー
ル、８２℃で蒸留した。高解像質量分析で、Ｃ１３Ｈ
３１ＯＮＳｉの理論値２４５．２１７５に対して実測値
２４５．２１５９が得られた。 実施例６ （Ｎ−モノメトキシトリチル）−７−アミノ−１−ｔ−
ブチルジメチルシリルオキシーヘプタン（化合物Ｘ４、
図２３〜２５）の調製 実施例５で得られた生成物（２．３ｇ）のジクロロメタ
ン溶液（４０ｍｌ）に、モノ、メトキシトリチルクロラ
イド（３．７ｇ、アルドリッチ）を添加した。室温で１
０〜２４時間撹拌したのち、溶液を飽和重炭酸ナトリウ
ム溶液中に注いだ。水層をジクロロメタンで抽出した。
ジクロロメタン抽出液をブライン液で洗い、乾燥した。
溶液を濃縮し、生成物をシリカゲルクロマトグラフィー
で精製した。精製した製品を高解像質量分析し、Ｃ３３
Ｈ４７Ｏ２ＮＳｉの理論値５１７．３３７６に対して実
測値５１７．３３５５が得られた。 実施例７ Ｎ−モノメトキシトリチル−７−アミノヘプタノール
（化合物Ｘ５、図２３〜２５）の調製 テトラブチルアンモニウムフルオライドのＩＭ溶液（２
５．８ｍｌ）を化合物Ｘ４（４．３）のテトラヒドロフ
ラン溶液（４６ｍｌ）に徐々に滴下した。室温で４〜１
８時間撹拌したのち、溶液を１００ｍｌの水に注ぎ、さ
らに３０分間撹拌した。有機層をブライン液で抽出し、
乾燥した。粗生成物をシリカゲルで精製した。精製した
製品を高解像質量分析し、Ｃ２７Ｈ３３Ｏ２Ｎの理論値
４０３．２５１１に対して実測値４０３．２５１４が得
られた。 実施例８ Ｎ−モノメトキシトリチル−７−アミノヘプチル（２−
シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチルホスフォロアミデー
ト（化合物Ｘ６、図２３〜２５）の調製 化合物Ｘ５（２４０ｍｇ）のジオキサン溶液（１０ｍ
ｌ）に、ジイソプロピルエチルアミン（８４０μｌ）と
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホフ
ォロアミデート（２７０μｌ）を添加した。１時間撹拌
したのち、反応混合液をジクロロメタンで希釈し、重炭
酸トリエチルアンモニウムのＩＭ溶液で洗い、さらにブ
ライン液で洗った。乾燥し、濃縮したのち、残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィーで精製した。生成物を高解像
質量分析した。Ｃ３６Ｈ５０Ｎ３Ｏ３Ｐの理論値６０
３．３６２０に対して実測値６０３．３６２０が得られ
た。生成物の構造は、さらにＮＭＲ分析で確認した。 実施例９ サクシニルリボシルリビトール−ＰＥＧ（図２３〜２
５）の調製 化合物１６（１．８ｇ）のジクロロメタン溶液（１８ｍ
ｌ）にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２９５ｍ
ｇ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（４５０ｍｇ）
を添加した。反応混合液を室温で撹拌した。２〜８時間
後に、ジシクロヘキシルウレアを濾過して除いた。濾
液、Ｎ−メチルイミダゾール（５２２μｌ）およびジイ
ソプロピルエチルアミン（６００μｌ）をポリエチレン
グリコールモノメチルエーテル、ＰＥＧ（平均モル重
量５０００、２．１ｇ、フルカ）に加えた。混合物を、
アルゴン下、室温で一夜撹拌した。機能化したＰＥＧを
冷エーテルで沈殿させ、濾過した。付加容量はゲイトら
（Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．）（参考文献３６）の方法に
したがって分光分析で測定したところ、約２００μｍｏ
ｌ／ｇであった。室温、１〜３時間で、遊離のヒドロキ
シル基を２０％無水酢酸／ピリジンのジクロロメタン溶
液で被覆した。ついで、担体を冷エーテルで沈殿させ、
濾過し、冷エーテルで洗浄した。 実施例１０ 可溶性重合担体（図２１、２２）を用いた合成ＰＲＰの
調製 １ｇのＰＥＧ−ＰＲＰ−ＤＭＴ（実施例９の生成物）を
ピリジンとともに２回蒸留し、アルゴン下でアセトニト
リルに溶解した。ＰＲＰオリゴ糖を４段階のサイクルで
重合させた。各段階で、まず機能化ＰＥＧを冷エーテル
で沈殿させて副成物を除去し、ジクロロメタン／エーテ
ル中で再結晶させた。合成の第１段階で、クロロフォル
ム／メタノール酸中３％トルエンスルフォン酸を用いて
ジメトキシトリチル基を除去し、ついでテトラゾールの
存在下で、実施例９で得られたリボシルリビトールホス
フォロアミデートと共役させた（１８０分間）。共役効
率は９５％であった。７０％ｔ−ブチルヒドロパーオキ
サイド溶液を用いて酸化（工程３）を行い（１２０分
間）、最後に２０％無水酢酸／ピリジンのジクロロメタ
ン溶液で被覆した（工程４）。２サイクルの合成を行
い、ついで実施例８から得たスペーサーのホスフォロア
ミデート生成物を共役させる。次に、樹脂を濃アンモニ
アテトラヒドロフラン水溶液とともに、５０〜１００℃
で１７〜２４時間加熱した。混合物を濾過してＰＥＧを
除去し、洗浄し、溶媒を留去した。加圧水素化装置を用
い、ｔ−ブタノール／水／酢酸（４：３：１）中の１０
％Ｐｄ／活性炭の存在下、４０ｐｓｉで生成物の水素分
解を行い、濾過して均一な生成物を得た。生成物を凍結
乾燥し、０．０１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム、
ｐＨ７、中のセファデックスＧ−２５カラムを用いたゲ
ル濾過を組合せて精製し、水を用いたセファデックスＣ
−２５でイオン交換クロマトグラフィーを行なって精製
した。適当な画分を凍結乾燥し、固体を得、その構造を
ＮＭＲで分析した。リボシルリビトールホスフェート三
量体のスペクトルを測定し、フーガーホウトら（Ｈｏｏ
ｇｅｒｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．）によって報告されてい
るもの［ジャーナル カーボハイドレート ケミストリ
ー（Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．）７．３９
９，１９８８）と同じであることを認めた。 実施例１１ 合成（ＰＲＰ）３のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミドによる修飾 テトラヒドロフラン（１ｍｌ）に溶解したｍ−マレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（２０ｍ
ｇ：６３．６μｍｏｌ）溶液を、０．１Ｍリン酸緩衝液
（１ｍｌ）に溶解した合成（ＰＲＰ）３溶液（５．２ｍ
ｇ；４．３μｍｏｌ）に添加した。溶液をアルゴン下、
室温で３０分間撹拌し、反応混合液をエーテル（４ｘ５
ｍｌ）で抽出し、得られた水層を０．１Ｍトリエチルア
ンモニウム酢酸緩衝液、ｐＨ ７．２、で平衡させたセ
ファデックスＧ−２５（ファーマシア）カラム（２ｘ３
０ｃｍ）に載せ、同じ緩衝液で溶出した。溶出液は２５
４ｎｍで分光光学的に追跡した。最初に溶出したピーク
を凍結乾燥した。（ＰＲＰ）３中に取り込まれたマレイ
ミド基の量を改良エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）法（参考文
献３９）によって測定したところ、取込率は９０％であ
った。 実施例１２ ペプチドの合成 ＡＢＩ ４３０Ａペプチド合成装置を用い、製造業者に
よって記載されている最適ｔ−Ｂｏｃ条件下で、ＯＭＰ
Ｐ１、Ｐ２およびＰ６（表１〜３）からペプチドを合
成し、フ化水素（ＨＦ）により樹脂から解裂させた。バ
イダックＣ４セミプレパラティブカラム（１ｘ３０ｃ
ｍ）および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中１５
〜５５％アセトニトリルグラジエントを用いた逆相高速
液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で、流速２
ｍｌ／分で４０分間展開して、生成物を精製した。生化
学的および免疫学的試験に用いた合成ペプチドは、分析
用ＨＰＬＣで測定した純度がすべて９５％以上であっ
た。ウオーターズのピコータグシステムで測定したアミ
ノ酸の組成は、理論値とよく一致した。合成ＭＡＰ（Ｏ
ＭＰ２−８）は、タムら（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．）によ
って記載されている方法（参考文献４０）にしたがっ
て、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成法を用いてマヌアルで
合成した。ＰＲＰ抱合体の形成のため、ペプチドのＮお
よびＣ末端にシステイン残基を付加した。ＭＡＰペプチ
ドは、前記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。 実施例１３ 完全合成ペプチド−（ＰＲＰ）３抱合体の調製 各合成ペプチド（ＯＭＰ２−８）およびＨＩＢＰ１−４
の１〜２ｍｇを０．５ｍｌの脱ガス水に溶解し、脱ガス
水に溶解したＭＢＳ−（ＰＲＰ）３（１．６ｍｇ）を
０．８ｍｌ添加した。得られた混合液をアルゴン下の室
温で一夜撹拌した。不溶性の沈殿を遠心分離によって除
去し、上清を０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝
液、ｐＨ ７．２、で平衡させたセファデックスＧ−５
０カラム（２ｘ３０ｃｍ）でゲル濾過クロマトグラフィ
ーにかけ、過剰のＭＢＳ−（ＰＲＰ）３を除去した。合
成ペプチド（ＰＲＰ）３抱合体を集め、逆相ＨＰＬＣ、
オルシノール検定およびアミノ酸分析により分析した。
ＰＲＰに対するペプチドのモル比は、ＨＩＢＰ１−４お
よびＭＡＰペプチド抱合体で、それぞれ約１：１および
１：５であった。ついで、合成ペプチドＰＲＰ抱合体を
アルムに吸着させ、免疫原性試験に供した。 実施例１４ 天然ＰＲＰ−ＢＳＡ抱合体の調製 過ヨード酸水溶液（４）を処理して天然ＰＲＰから調製
した過ヨード酸酸化ＰＲＰ（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ ６．０、１ｍｌ中２５ｍｇ）溶液０．５ｍｌを、
０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ ８．０、０．５ｍｌに溶
解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（１．３２ｍｇ：
０，０２μｍｏｌ）に添加し、ついでナトリウム シア
ノボロヒドライド（１４μｇ；０．２２μｍｏｌ；ＢＳ
Ａに対して１０相当量）を添加した。３７℃で５日間培
養したのち、反応混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
７．５、（４ｘ１Ｌ）に対して透析し、得られた溶液
を０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、で平衡させた分
析用スーパロース１２カラム（１５ｘ３００ｍｍ、ファ
ーマシア）に載せ、同じ緩衝液で溶出した。２３０ｎｍ
における吸光度で画分を測定した。主要なピークをプー
ルし、セントリプレップ３０（ピアース）で２．２ｍｌ
に濃縮した。タンパクはバイオラッドタンパク検定装置
で定量したところ、３００μｇ／ｍｌであった。ＰＲＰ
誘導体化は、オルシノール検定で確認した。 実施例１５ 抗ペプチドおよび抗ＯＭＰ抗血清の調製 フロイントの完全アジュバントに乳化させた天然Ｐ１、
Ｐ２またはＰ６または各ペプチド（５〜１００μｇ）を
ウサギ、マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）およびモルモットに筋
肉内注射して免疫投与し、２週間間隔で２回追加免疫
（同じ免疫原の半量をフロイントのアジュバントととも
に）投与した。抗血清を集め、上記のように保存した。 実施例１６ 抗ＰＲＰ抗血清の調製 ＡｌＰＯ４ ３ｍｇ／ｍｌと混合した各ＰＲＰ担体抱合
体（ＰＲＰ相当量で５〜５０μｇ）をウサギの筋肉内に
免疫投与し、２週間間隔で２回追加免疫（同じ免疫原の
半量）投与した。最初の注射から２週間ごとに抗血清を
集め、５６℃で加熱不活性化し、−２０℃に保存した。 実施例１７ Ｐ１，Ｐ２、Ｐ６およびペプチド特異性ＥＬＩＳＡ 精製ＯＭＰの２００ｎｇまたは各ペプチドの５００ｎｇ
をコーティング用緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３およ
び３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．６）５０μＬに
溶解し、室温で１６時間マイクロタイター プレート
ウエル（ヌンク−インミュノプレート、ヌンク、デンマ
ーク）にコーティングした。ついで、これらのプレート
を、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）で室温で３０分間ブロックした。連続希釈し
た抗血清をウエルに添加し、室温で１時間培養した。抗
血清を除去したのち、プレートを０．１％（ｗ／ｖ）ツ
イン−２０および０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで５回洗浄した。ホースラディシュパーオキシダーゼ
（ジャクソン インミュノリサーチ ラブ、ペンシルバ
ニア）に共役させたヤギ抗ウサギ、モルモット、マウス
またはヒトＩｇＧ抗体からのＦ（ａｂ’）２を洗浄用緩
衝液で希釈（１／８，０００）し、マイクロタイタープ
レートに添加した。室温で１時間培養したのち、プレー
トを洗浄用緩衝液で５回洗浄した。ついで、基質として
テトラメチルベンジリジン（ＴＭＢ）／Ｈ２Ｏ２（ＡＤ
Ｉ、トロント）をプレートに添加して、反応させた。１
ＮのＨ２ＳＯ４で反応を止め、ティトラテックマルティ
スキャンＩＩ（フロー ラブス、バージニア）を用い、
４５０ｎｍで吸光度を測定した。２種類の関連のない百
日咳毒素ペプチドＮＡＤ−Ｓ１（１９残基）およびＳ３
（１２３−１５４）（３２残基）をペプチド特異性ＥＬ
ＩＳＡの陰性対照として加えた。検定は３回行い、抗血
清の反応性力価は常に免疫投与前の血清値の２倍以上の
吸光度を示す希釈率とした。 実施例１８ 抗ＰＲＰ抗体の測定 精製ＰＲＰ−ＢＳＡの２００ｎｇをコーティング用緩衝
液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３および３５ｍＭのＮａＨＣ
Ｏ３、ｐＨ ９．６）２００μＬに溶解し、室温で１６
時間マイクロタイター プレート ウエル（ヌンク−イ
ンミュノプレート、ヌンク、デンマーク）にコーティン
グした。ついで、これらのプレートを、０．１％（ｗ／
ｖ）ＢＳＡリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で室温で３
０分間ブロックした。ＰＲＰ担体抱合体に対する抗血清
を連続希釈し、ウエルに添加し、室温で１時間培養し
た。抗血清を除去したのち、プレートを０．１％（ｗ／
ｖ）ツイン−２０および０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含
むＰＢＳで５回洗浄した。ホースラディシュパーオキシ
ダーゼ（ジャクソン インミュノリサーチ ラブ、ペン
シルバニア）に共役させたヤギ抗ウサギ、モルモット、
マウスまたはヒトＩｇＧ抗体からのＦ（ａｂ’）２を洗
浄用緩衝液で希釈（１／８，０００）し、マイクロタイ
タープレートに添加した。室温で１時間培養したのち、
プレートを洗浄用緩衝液で５回洗浄した。ついで、基質
としてテトラメチルベンジリジン（ＴＭＢ）／Ｈ２Ｏ２
（ＡＤＩ、トロント）をプレートに添加して、反応させ
た。１ＮのＨ２ＳＯ４で反応を止め、ティトラテックマ
ルティスキャンＩＩ（フロー ラブス、バージニア）を
用い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。標準抗ＰＲＰ抗
血清を陽性対照として加えた。検定は３回行い、抗血清
の反応性力価は常に免疫投与前の血清値の２倍以上の吸
光度を示す希釈率とした。 実施例１９ 合成Ｔ細胞エピトープの増殖検定 各ＯＭＰ（Ｐ１、Ｐ２またはＰ６）の５μｇをＢａ１ｂ
／ｃ，Ｃ５７Ｂ１／６およびＡ／Ｊ系マウスにプライミ
ングすることによって、Ｔ細胞エピトープのマッピング
を行なった。３週間後に脾臓を摘出し、１０％の熱不活
性化仔牛血清（ギブコ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（フ
ロー ラブ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（フロー
ラブ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（フロ
ー ラブ）、１０単位／ｍｌのｒＩＬ−２および５０μ
Ｍの２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲ
ＰＭＩ１６４０（フロー ラブ）で脾臓細胞を５〜７日
間培養した。標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定法（参考文献
４１）デ、プライムした脾臓細胞のＯＭＰペプチドに対
する増殖反応を測定した。簡単に述べると、５ｘ１０５
の放射線照射（１７００ラド）した新鮮な遺伝子的同質
脾臓細胞を抗原運搬細胞（ＡＰＣ）源として、ペプチド
のモル濃度を変えて（ＩＬ−２を含まない培地に０，０
３〜３μＭ）、１０６個の脾臓細胞を９６ウエルのミク
ロタイタープレート中で培養した。プレートは、３７℃
に保った５％ＣＯ２／空気の加湿インキュベーター中に
４０時間置いた。培養開始１６時間後に、各ウエルに
０．５μＣｉの［３Ｈ］−Ｔｄｒ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，
ＮＥＮ）を添加した。細胞をガラス繊維フィルター上に
採取し、シンチレーションカウンター（ベックマン）で
細胞ＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取込みを測定した。
結果は、各ペプチド濃度について３回測定した平均で表
示した。標準偏差は、常に１５％以下とした。３Ｈ−チ
ミジンの取込みが無関係のペプチドまたは培地の値の３
倍以上であった場合、増殖反応は陽性と判定した。 実施例２０ 免疫プロット分析 ペプチドおよびＰＲＰ担体抱合体に対する抗血清の免疫
特異性は、すでに報告されている方法（参考文献４２）
にしたがって、免疫ブロット分析で測定した。
【発明の効果】本開示を要約すると、本発明は単独でま
たはＰＲＰ抱合体としてＨｉ感染に対するワクチンとし
て有用である免疫原性合成ペプチドを提供する。本発明
の範囲内で改良が可能である。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は合成ＰＲＰペプチド接合体試験に使用し
たペプチド担体のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ
１の推定構造を示す図である。
【図３】従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ
１の推定構造を示す図である。
【図４】従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ
２、６の推定構造を示す図である。
【図５】従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ
２、６の推定構造を示す図である。
【図６】従来の構造分析アルゴリズムによるＯＭＰ Ｐ
２、６の推定構造を示す図である。
【図７】Ｈｉｂ ＯＭＰ Ｐ１の免疫の免疫優勢Ｂおよ
びＴ細胞の模式図である。
【図８】Ｈｉｂ ＯＭＰ Ｐ２の免疫の免疫優勢Ｂおよ
びＴ細胞の模式図である。
【図９】Ｈｉｂ ＯＭＰ Ｐ６の免疫の免疫優勢Ｂおよ
びＴ細胞の模式図である。
【図１０】モルモット、ラット、ウサギの抗Ｐ６抗血清
とＰ６ペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示す。
【図１１】モルモット、ラット、ウサギの抗Ｐ６抗血清
とＰ６ペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示す図である。
【図１２】モルモット、ラット、ウサギの抗Ｐ６抗血清
とＰ６ペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示す図である。
【図１３】３種類のヒト回復期血清とＰ１ペプチドのＥ
ＬＩＳＡ反応性を示す図である。
【図１４】３種類のヒト回復期血清とＰ２ペプチドのＥ
ＬＩＳＡ反応性を示す図である。
【図１５】免疫優勢Ｔ細胞エピトープを有するＰ１ペプ
チドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞培養株の増殖反応
を示す図である。
【図１６】免疫優勢Ｔ細胞エピトープを有するＰ１ペプ
チドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞培養株の増殖反応
を示す図である。
【図１７】免疫優勢Ｔ細胞エピトープ（星印で示した）
を有するＰ１ペプチドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞
培養株の増殖反応を示す図である。
【図１８】免疫優勢Ｔ細胞エピトープ（星印で示した）
を有するＰ１ペプチドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞
培養株の増殖反応を示す図である。
【図１９】免疫優勢Ｔ細胞エピトープ（星印で示した）
を有するＰ１ペプチドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞
培養株の増殖反応を示す図である。
【図２０】免疫優勢Ｔ細胞エピトープ（星印で示した）
を有するＰ１ペプチドに対するＰ１特異性マウスＴ細胞
培養株の増殖反応を示す図である。
【図２１】固体担体としてＰＥＧを用いたＰＲＰ合成の
１フローチャートを示す図である。
【図２２】固体担体としてＰＥＧを用いたＰＲＰ合成の
１フローチャートを示す図である。
【図２３】ＰＲＰ中間体の合成フローチャートを示す図
である。
【図２４】ＰＲＰ中間体の合成フローチャートを示す図
である。
【図２５】ＰＲＰ中間体の合成フローチャートを示す図
である。
【図２６】破傷風トキソイドと接合体を形成させた合成
ＰＲＰ二量体おとび三量体に対するウサギの免疫反応を
示す図である。
【図２７】各種ＰＲＰ担体接合体に対するウサギの免疫
反応を示す図である。
【図２８】ＨｉｂＰｉ−４およびＯＭＰのＭＡＰの各種
合成ペンタマーおよびヘキサマーに対するウサギの免疫
反応を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年５月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【化４】 （ここで、ｎは整数、Ｘ+は対イオン）を生成し、前記
第２および第３の保護基を除去することからなる請求項
１に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｃ 39/102 39/102 39/385 39/385 39/395 39/395 Ｄ Ｎ (72)発明者 アリ カンディル カナダ国 エム２アール １エイ１ オン タリオ州 ウィロウダール パーク ホー ム アヴェニュー 245 (72)発明者 チャールズ シーア カナダ国 エル４ジェイ ２ゼット７ オ ンタリオ州 ソーンヒル メイブリー ク レセント 27 (72)発明者 マイケル エイチ． クライン カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウィロウダール マンロー ブー ルヴァード 16

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式で示される化合物を固体ポリエ
    チレングリコールモノエチルエーテル（ＰＥＧ）担体に
    対して結合させ、 【化１】 ここで、Ｒ１は第１の保護基であり、Ｒ２は第２の保護
    基であり、前記の第１の保護基を除去し、得られた化合
    物を、以下の式で表される側鎖の延長を行うために反復
    ユニットと結合させ、 【化２】 リン原子から保護基除去し、オリゴマー反復ユニット数
    が所定の値に達するまで、前記第１保護基の除去および
    反復ユニットととの結合の工程を繰り返し、以下の式で
    表される重合停止化合物： 【化３】 （ここで、ｍは整数、Ｒ３はＰＥＧ結合保護オリゴマー
    をもたらす第３の保護基）で重合化を停止させることか
    らなるオリゴマーの製造法。
  2. 【請求項２】 前記のＰＥＧ結合保護オリゴマーが前記
    の担体から切り離されて、以下の式で表われる化合物 【化４】 （ここで、ｎは整数、Ｘ＋は対イオン）を生成し、前記
    第２および第３の保護基を除去することからなる請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ｎが３〜２０であり、ｍが４〜６である
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 Ｒ２がベンシル、Ｒ１がジメトキシトリ
    チル、Ｒ３がモノメトキシトリチルである請求項３に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 前記の対イオンがアンモニウムである請
    求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 得られたオリゴマーを、以下の式で表さ
    れる化学的反応性の官能基 【化５】 （ここで、Ｒはリンカーフラグメント）からなる合成Ｐ
    ＲＰオリゴマーに変換することを含む請求項１〜５に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 前記のリンカーフラグメントが−ＣＨ２
    （ＣＨ２）ｍ−Ｘ（ここで、ｍは整数、Ｘは化学的反応
    性官能基、アミノ反応基、または光励起反応性基）を有
    する請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記のポリエチレン グリコールが約２
    ００〜５００μｍｏｌ／ｇの負荷容量を有することを特
    徴とする請求項１〜７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 以下に式： 【化６】 （ここで、Ｒ２およびＲ３は保護基、ｍは整数）を有す
    る固体のポリエチレン グリコール モノメチルエーテ
    ル（ＰＥＧ）結合により保護された多糖類。
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