JPH11243956A - ポリエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ポリエステル重合酵素遺伝子を含むプラスミド
ベクターにより形質転換した大腸菌を用いて、熱安定性
や成形性に優れた生分解性ポリエステルを安価に生産す
る方法を提供することを目的とする。 【解決手段】ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換え
ベクターにより大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体を油脂関連物質により脂肪酸資化能を誘導し、その脂
肪酸資化能誘導株を油脂関連物質を炭素源とする培地で
培養し、得られる培養物からポリエステルを採取するこ
とを特徴とするポリエステルの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリエステル重合
酵素遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された
大腸菌を用いたポリエステルの製造方法に関する。さら
に詳しくは、自然環境（土中、河川、海中）の下で、微
生物の作用を受けて分解するポリエステルの製造方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】現在までに数多くの微生物において、エ
ネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積す
ることが知られている。その代表例として、土壌より単
離されたアエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）
を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油
脂から発酵生産した、３−ハイドロキシ酪酸（以下、３
ＨＢと略す）と３−ハイドロキシヘキサン酸（以下、３
ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ
（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）等の３−ヒドロキシ
アルカン酸の共重合体が知られている（特開平５−９３
０４９号公報及び特開平７−２６５０６５号公報）。３
−ヒドロキシアルカン酸の共重合体は、３ＨＨ分率の増
加と共に結晶化度が低下するために、柔軟な高分子材料
となり、熱安定性や成形性に優れるため、糸やフィルム
を加工するのに好ましいことが知られている（Y. Doi,
S. Kitamura, H. Abe, Macromolecules 28, 4822-4823
(1995)）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記従
来技術に鑑みてなされたものであり、３−ヒドロキシア
ルカン酸の共重合体をより効率よく製造するため、前記
アエロモナス・キャビエより、ポリエステル重合酵素の
遺伝子のクローニングを行い、該遺伝子を含むプラスミ
ドベクターによりアルカリゲネス・ユートロファスを形
質転換した形質転換体を得、この形質転換体の培養によ
りポリエステルの製造を行い、特許出願を行った（特願
平８−２１４５０９号）。さらに、本発明者らは、より
増殖が早く、工業的に有利な大腸菌を形質転換体として
用いて、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体等のポリ
エステルを生産したという例がない点に着目し、鋭意検
討した。即ち、本発明は、ポリエステル重合酵素遺伝子
を含むプラスミドベクターにより形質転換した大腸菌を
用いて、熱安定性や成形性に優れた生分解性ポリエステ
ルを安価に生産する方法を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターによ
り大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を油脂関連
物質により脂肪酸資化能を誘導し、その脂肪酸資化能誘
導株を油脂関連物質を炭素源とする培地で培養し、得ら
れる培養物からポリエステルを採取することを特徴とす
るポリエステルの製造方法に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の詳細を説明す
る。

【０００６】１．形質転換体の取得方法 本発明のポリエステルとしては、例えば、一般式
（Ｉ）：

【０００７】

【化２】

【０００８】（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３の
アルキル基を示す）で表される３−ヒドロキシアルカン
酸の共重合体が挙げられ、その中では、Ｐ（３ＨＢ−ｃ
ｏ−３ＨＨ）が好ましい。

【０００９】前記ポリエステルを生合成するポリエステ
ル重合酵素の遺伝子は、その由来については、特に限定
されないが、特願平８−２１４５０９号に記載の方法に
より、アエロモナス属に属する微生物から分離して得る
ことができる。本発明で用いるポリエステル重合酵素遺
伝子には、具体的にはアエロモナス・キャビエから分離
したＤＮＡが挙げられ、（Ａ）配列番号：１に示される
塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示され
る塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿
入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｃ）
（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列にストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、から
なる群より選ばれるＤＮＡであって、ポリエステル重合
酵素をコードするＤＮＡが使用される。

【００１０】前記（Ａ）に規定される、配列番号：１に
示される塩基配列は、前記のようにアエロモナス属に属
する微生物中のＤＮＡに見出される。また、（Ｂ）に規
定されるような、配列番号：１に示される塩基配列にお
いて、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加され
た塩基配列からなるＤＮＡも本発明の遺伝子に包含され
る。本明細書における「１個以上」とは、１個又は数個
若しくはそれ以上の個数をいう。

【００１１】塩基配列において、１個以上の塩基の欠
失、置換、挿入又は付加を行う手段としては、部位特異
的変異技術のような自体常套の手段（Nucleic Acid Res
earchVol 10, pp6487-6500, 1982)等の種々の遺伝子工
学的手法が挙げられる。

【００１２】さらに、（Ｃ）で規定されるＤＮＡも本発
明の遺伝子に包含される。本発明において「ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる
ＤＮＡ」とは、プローブとともに０．５％ＳＤＳ、０．
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニ
ルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％
変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０を示す。）中、６８℃にて１２〜２０時
間インキュベートした後に、プローブとハイブリダイズ
しているＤＮＡをいう。

【００１３】また、本発明において、ベクターの構築に
際しては、特願平８−２１４５０９号に記載されている
遺伝子発現カセットを用いてもよい。該遺伝子発現カセ
ットとして、例えば、発現制御領域、ポリエステル重合
酵素遺伝子（配列番号：１）、ポリエステル重合酵素遺
伝子の上流に位置するオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ１）及び下流に位置するＯＲＦ（ＯＲＦ３）を
含むＤＮＡ断片（ＥＥ３２）、あるいは該ＤＮＡ断片
（ＥＥ３２）からＯＲＦ１又はＯＲＦ３のいずれか一方
又は両方を欠失させたＤＮＡ断片等が使用される。な
お、ＯＲＦ１の塩基配列を配列番号：２、ＯＲＦ３の塩
基配列を配列番号：３に示す。

【００１４】このように、遺伝子発現カセットのＤＮＡ
断片を、ＤＮＡ断片を切断した制限酵素と同じ制限酵素
で切断したベクターと連結させることにより組換えベク
ターを作製することができる。

【００１５】ベクターには、大腸菌の中で自律的に増殖
し得るプラスミドベクターが用いられる。プラスミドベ
クターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２等
が挙げられる。

【００１６】前記ＤＮＡ断片とベクターを連結させるに
は、公知のＤＮＡリガーゼを用いることができる。ＤＮ
Ａリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等が
挙げられ、具体的には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが用いられ
ている市販のライゲーションキット（宝酒造（株）製）
等を使用することができる。

【００１７】前記のようにして得られた組換えベクター
を大腸菌に導入するには、例えば、カルシウム法（Lede
rberg, E. M. et al., J. Bacteriol. 119.1072 (197
4)）やエレクトロポレーション法（Current Protocols
in Molecular Biology, １巻，1.8.4 頁, 1994年) 等の
公知の方法を用いることができる。

【００１８】本発明に使用する大腸菌には、特に制限が
なく、ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の一般に市販され
ている菌株を用いることができる。

【００１９】かくして、本発明に使用する形質転換体で
ある大腸菌を得ることができる。

【００２０】２．ポリエステルの製造方法 ポリエステルの製造は、本発明の形質転換体を油脂関連
物質により脂肪酸資化能を誘導した後に、油脂関連物質
を炭素源とする培地で培養することにより、ポリエステ
ルを菌体内に蓄積させて、該培養菌体及び培養物からポ
リエステルを回収することにより行うことができる。

【００２１】本発明においては、前記油脂関連物質によ
り、まず脂肪酸資化能を誘導することに、一つの大きな
特徴がある。かかる脂肪酸資化能を誘導することによ
り、培養時間に対する培養菌体の量が増加し、さらに、
菌体内に蓄積されるポリエステルの量が増加するという
効果が発現される。

【００２２】脂肪酸資化能の誘導は、油脂関連物質を本
発明の形質転換体を含む培地に添加することにより行う
ことができる。ここで用いられる培地としては、特に限
定がなく、後述する本培養に用いられる培地であればよ
い。

【００２３】油脂関連物質としては、例えば、カプロン
酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン
酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン
酸等の脂肪酸、これら脂肪酸の塩及びこれら脂肪酸のエ
ステル等が挙げられる。これらの中では、炭素数が４以
上の脂肪酸が好ましい。

【００２４】油脂関連物質の使用量としては、特に制限
はなく、例えば、培地中において終濃度１ｍＭ以上、好
ましくは５ｍＭ以上であることが望ましく、培地中にお
いて終濃度５０ｍＭ以下、好ましくは２０ｍＭ以下であ
ることが望ましい。また、脂肪酸資化能を誘導する際の
温度としては、特に制限はなく、例えば２０〜４０℃程
度であればよく、誘導する時間としては、特に制限はな
く、例えば、１〜３日間程度であればよい。

【００２５】かかる方法で、脂肪酸資化能を誘導した形
質転換体は、グリセロールストックにして保存すること
ができる。

【００２６】次に、脂肪酸資化能を誘導した形質転換体
を、油脂関連物質を炭素源とする培地で培養する。

【００２７】本発明においては、油脂関連物質を炭素源
とする培地を用いることに一つの大きな特徴がある。か
かる油脂関連物質を炭素源とすることにより、グルコー
スとプロピオン酸を炭素源とする、大腸菌を用いて共重
合体を発酵合成する方法（Slater. S.C. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 58. 1089 (1992)) に比べて、設
備等の面から、ポリエステルを安価に製造することがで
きるという効果が発現される。

【００２８】前記油脂関連物質としては、脂肪酸資化能
を誘導した形質転換体を調製した際に用いたものと同様
のものであればよい。本発明では、炭素源として、前記
のように油脂関連物質を用いることを特徴とし、炭素源
中、好ましくは油脂関連物質を１０〜１００％使用する
のがよく、特に好ましくは、油脂関連物質を唯一の炭素
源とする場合である。

【００２９】また、培養に用いられる培地には、炭素源
以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄
養源を含む培地であればよく、特に限定はないが、例え
ば、Ｍ９最小培地（０．６％リン酸水素二ナトリウム・
１２水、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化
アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸
マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．００１
％サイアミン）に増殖に最小限必要なビタミンとミネラ
ルを添加したものを基本培地とし、炭素源をグルコース
から油脂関連物質に置き換えた培地等が好ましく用いら
れる。

【００３０】窒素源としては、例えばアンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス
等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられ
る。

【００３１】その他の有機栄養源としては、例えば、グ
リシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等の
アミノ酸、ビタミンＢ₁ 、ビタミンＢ₁₂、ビタミンＣ等
のビタミン等が挙げられる。

【００３２】かかる成分を含有する培地のｐＨは、中性
又は微アルカリ性であればよい。

【００３３】前記培地を用いた形質転換体の培養方法と
しては、通常の大腸菌の培養方法であればよく、例え
ば、培養温度は２５〜３７℃の範囲であればよく、好気
的に１〜５日培養する方法が挙げられる。また、培養中
はカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の
抗生物質を適宜添加してもよい。

【００３４】また、難溶性の油脂関連物質を可溶化する
ために界面活性剤を培地に添加してもよい。界面活性剤
としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ８
０等が挙げられる。

【００３５】かかる方法で培養した菌体からのポリエス
テルの回収は、常法により行うことができる。例えば、
培養終了後、菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄
した後、乾燥させる。この乾燥菌体をクロロホルム等の
有機溶媒を用いて該有機溶媒中にポリエステルを抽出
し、有機溶媒から濾過等によって菌体成分を除去した
後、その濾液にメタノール等を加えてポリエステルを沈
澱させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した
後、ポリエステルを乾燥して回収する。得られたポリエ
ステルの組成の確認は、例えば、ガスクロマトグラフ法
や核磁気共鳴法などにより行う。

【００３６】かくして形質転換した大腸菌を用いて、ポ
リエステルを製造することができる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術
範囲を限定するものではない。

【００３８】製造例１〔形質転換体の取得〕 アエロモナス・キャビエ由来のポリエステル重合酵素遺
伝子は特願平８−２１４５０９号に記載の方法により分
離し、配列番号：１のＤＮＡを含む遺伝子発現カセット
ＥＥ３２（３．２ｋｂのEcoRI-EcoRI 断片；この配列を
配列番号：４に示す) を用いた。この遺伝子断片を制限
酵素EcoRI 処理、アルカリフォスファターゼ処理したｐ
ＵＣ１８とライゲーションキット（宝酒造（株）より購
入）を用いてライゲーションし、組換えプラスミドを構
築した。これを用いて塩化カルシウム法により、コンピ
テントセル化した大腸菌ＤＨ５α（東洋紡より購入）を
形質転換した。以下、得られた形質転換体をＤＨ５α−
ＥＥ３２株と呼ぶ。

【００３９】実施例１〔Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の
製造〕 １．脂肪酸資化能の誘導 ＤＨ５α−ＥＥ３２株をＭ９液体培地（０．６％リン酸
水素二ナトリウム・１２水、０．３％リン酸二水素カリ
ウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナト
リウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カル
シウム、０．００１％サイアミン）に炭素源としてラウ
リン酸ナトリウムを１％添加した培地に接種し、３７℃
で１日間培養し、脂肪酸資化能を誘導した。この脂肪酸
資化能を誘導した株をグリセロールストックにして保存
し、以下の実験に用いた。

【００４０】２．大腸菌形質転換体によるポリエステル
合成 ＤＨ５α−ＥＥ３２株のグリセロールストックより前培
養培地（炭素源としてラウリン酸を最終濃度が１０ｍＭ
になるように添加したＭ９液体培地）に接種し一晩３０
℃で培養した。これを本培養培地（前培養と同じ培地）
に植菌し、坂口フラスコ中で、３７℃で２４時間及び７
２時間、連続培養した。培地には５０ｍｇ／ｌの濃度で
アンピシリンを含有させた。遠心分離によって菌体を回
収し、メタノール、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥し、乾燥
菌体の重量を測定した。

【００４１】得られた乾燥菌体３０ｍｇに２ｍｌの硫酸
−メタノール混液（硫酸：メタノール＝１５：８５（混
合比））と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１
００℃で１４０分間加熱することで菌体内のポリエステ
ル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに蒸留
水１ｍｌを添加し、激しく攪拌した。静置して混合液を
二層に分離させた後、下層の有機層を取り出し、その組
成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し
た。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１４Ａ、キ
ャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ
ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍ
ｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温
度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。その結果を
表１に示す。なお、表中の３ＨＢは、ヒドロキシ酪酸、
３ＨＨｘは３−ヒドロキシヘキサン酸を示す。

【００４２】比較例１ 脂肪酸資化能を誘導したＤＨ５α−ＥＥ３２株のかわり
に、脂肪酸資化能を誘導していないＤＨ５α−ＥＥ３２
株を用いた以外は、実施例１と同様にして、菌体重量、
ポリエステル含量及びポリエステル組成を調べた。その
結果を表１に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】表１の結果から、脂肪酸資化能を誘導した
ＤＨ５α−ＥＥ３２株を用いた場合には、脂肪酸資化能
を誘導していないＤＨ５α−ＥＥ３２株を用いた場合よ
り、２４時間及び７２時間の本培養ではいずれも、菌体
重量、ポリエステル含量がともに大きく、効率的にポリ
エステルを得ることができることがわかる。

【００４５】特に、２４時間の本培養において、その差
が顕著であった。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、熱安定性や成形性に優れ
た生分解性プラスチックであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）共重合体を安価な脂肪酸を原料にして大腸菌で生産
することが可能になった。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATGAGCCAACCATCTTATGGCCCGCTGTTCGAGGCCCTGGCCCACTACAATGACAAGCTGCTGGCCATGGCC AAGGCCCAGACAGAGCGCACCGCCCAGGCGCTGCTGCAGACCAATCTGGACGATCTGGGCCAGGTGCTGGAG CAGGGCAGCCAGCAACCCTGGCAGCTGATCCAGGCCCAGATGAACTGGTGGCAGGATCAGCTCAAGCTGATG CAGCACACCCTGCTCAAAAGCGCAGGCCAGCCGAGCGAGCCGGTGATCACCCCGGAGCGCAGCGATCGCCGC TTCAAGGCCGAGGCCTGGAGCGAACAACCCATCTATGACTACCTCAAGCAGTCCTACCTGCTCACCGCCAGG CACCTGCTGGCCTCGGTGGATGCCCTGGAGGGCGTCCCCCAGAAGAGCCGGGAGCGGCTGCGTTTCTTCACC CGCCAGTACGTCAACGCCATGGCCCCCAGCAACTTCCTGGCCACCAACCCCGAGCTGCTCAAGCTGACCCTG GAGTCCGACGGCCAGAACCTGGTGCGCGGACTGGCCCTCTTGGCCGAGGATCTGGAGCGCAGCGCCGATCAG CTCAACATCCGCCTGACCGACGAATCCGCCTTCGAGCTCGGGCGGGATCTGGCCCTGACCCCGGGCCGGGTG GTGCAGCGCACCGAGCTCTATGAGCTCATTCAGTACAGCCCGACTACCGAGACGGTGGGCAAGACACCTGTG CTGATAGTGCCGCCCTTCATCAACAAGTACTACATCATGGACATGCGGCCCCAGAACTCCCTGGTCGCCTGG CTGGTCGCCCAGGGCCAGACGGTATTCATGATCTCCTGGCGCAACCCGGGCGTGGCCCAGGCCCAAATCGAT CTCGACGACTACGTGGTGGATGGCGTCATCGCCGCCCTGGACGGCGTGGAGGCGGCCACCGGCGAGCGGGAG GTGCACGGCATCGGCTACTGCATCGGCGGCACCGCCCTGTCGCTCGCCATGGGCTGGCTGGCGGCGCGGCGC CAGAAGCAGCGGGTGCGCACCGCCACCCTGTTCACTACCCTGCTGGACTTCTCCCAGCCCGGGGAGCTTGGC ATCTTCATCCACGAGCCCATCATAGCGGCGCTCGAGGCGCAAAATGAGGCCAAGGGCATCATGGACGGGCGC CAGCTGGCGGTCTCCTTCAGCCTGCTGCGGGAGAACAGCCTCTACTGGAACTACTACATCGACAGCTACCTC AAGGGTCAGAGCCCGGTGGCCTTCGATCTGCTGCACTGGAACAGCGACAGCACCAATGTGGCGGGCAAGACC CACAACAGCCTGCTGCGCCGTCTCTACCTGGAGAACCAGCTGGTGAAGGGGGAGCTCAAGATCCGCAACACC CGCATCGATCTCGGCAAGGTGAAGACCCCTGTGCTGCTGGTGTCGGCGGTGGACGATCACATCGCCCTCTGG CAGGGCACCTGGCAGGGCATGAAGCTGTTTGGCGGGGAGCAGCGCTTCCTCCTGGCGGAGTCCGGCCACATC GCCGGCATCATCAACCCGCCGGCCGCCAACAAGTACGGCTTCTGGCACAACGGGGCCGAGGCCGAGAGCCCG GAGAGCTGGCTGGCAGGGGCGACGCACCAGGGCGGCTCCTGGTGGCCCGAGATGATGGGCTTTATCCAGAAC CGTGACGAAGGGTCAGAGCCCGTCCCCGCGCGGGTCCCGGAGGAAGGGCTGGCCCCCGCCCCCGGCCACTAT GTCAAGGTGCGGCTCAACCCCGTGTTTGCCTGCCCAACAGAGGAGGACGCCGCATGA

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：３５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATGATGAATATGGACGTGATCAAGAGCTTTACCGAGCAGATGCAAGGCTTCGCCGCCCCCCTCACCCGCTAC AACCAGCTGCTGGCCAGCAACATCGAACAGCTGACCCGGTTGCAGCTGGCCTCCGCCAACGCCTACGCCGAA CTGGGCCTCAACCAGTTGCAGGCCGTGAGCAAGGTGCAGGACACCCAGAGCCTGGCGGCCCTGGGCACAGTG CAACTGGAGACCGCCAGCCAGCTCTCCCGCCAGATGCTGGATGACATCCAGAAGCTGAGCGCCCTCGGCCAG CAGTTCAAGGAAGAGCTGGATGTCCTGACCGCAGACGGCATCAAGAAAAGCACGGGCAAGGCCTGA

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：４０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAGGCCAGAAGGCCCGTCTCAGCAAGCGGTTCGGGGCGGCGGAGGTAGCC GCCTTCGCCGCGCTCTCGGAGGACTTCAACCCCCTGCACCTGGACCCGGCCTTCGCCGCCACCACGGCGTTC GAGCGGCCCATAGTCCACGGCATGCTGCTCGCCAGCCTCTTCTCCGGGCTGCTGGGCCAGCAGTTGCCGGGC AAGGGGAGCATCTATCTGGGTCAAAGCCTCAGCTTCAAGCTGCCGGTCTTTGTCGGGGACGAGGTGACGGCC GAGGTGGAGGTGACCGCCCTTCGCGAGGACAAGCCCATCGCCACCCTGACCACCCGCATCTTCACCCAAGGC GGCGCCCTCGCCGTGACGGGGGAAGCCGTGGTCAAGCTGCCTTAA

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：３１８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGATCTGGACCGGGGTGCTGGCCTGGGCCACGCCGGCGAGGGCCAGCGCGGAGCAACCGAGCAGCAGGGCGA GAGGTTTCATCGGGATTCCTTGGCAGTCTGAATGACGTGCCAGCCTATCAGCGCGGCGCCGGTGCGGCGAGG GCGCGCCGGACCCAGTGCGTCACCTCTCGTCTGATCCGCCTCCCTCGACGGGCGTCGCTGACAAAAAAATTC AAACAGAAATTAACATTTATGTCATTTACACCAAACCGCATTTGGTTGCAGAATGCTCAAACGTGTGTTTGA ACAGAGCAAGCAACACGTAAACAGGGATGACATGCAGTACCCGTAAGAAGGGCCGATTGGCCCACAACAACA CTGTTCTGCCGAACTGGAGACCGATGATGAATATGGACGTGATCAAGAGCTTTACCGAGCAGATGCAAGGCT TCGCCGCCCCCCTCACCCGCTACAACCAGCTGCTGGCCAGCAACATCGAACAGCTGACCCGGTTGCAGCTGG CCTCCGCCAACGCCTACGCCGAACTGGGCCTCAACCAGTTGCAGGCCGTGAGCAAGGTGCAGGACACCCAGA GCCTGGCGGCCCTGGGCACAGTGCAACTGGAGACCGCCAGCCAGCTCTCCCGCCAGATGCTGGATGACATCC AGAAGCTGAGCGCCCTCGGCCAGCAGTTCAAGGAAGAGCTGGATGTCCTGACCGCAGACGGCATCAAGAAAA GCACGGGCAAGGCCTGATAACCCCTGGCTGCCCGTTCGGGCAGCCACATCTCCCCATGACTCGACGCTACGG GCTAGTTCCCGCCTCGGGTGTGGGTGAAGGAGAGCACATGAGCCAACCATCTTATGGCCCGCTGTTCGAGGC CCTGGCCCACTACAATGACAAGCTGCTGGCCATGGCCAAGGCCCAGACAGAGCGCACCGCCCAGGCGCTGCT GCAGACCAATCTGGACGATCTGGGCCAGGTGCTGGAGCAGGGCAGCCAGCAACCCTGGCAGCTGATCCAGGC CCAGATGAACTGGTGGCAGGATCAGCTCAAGCTGATGCAGCACACCCTGCTCAAAAGCGCAGGCCAGCCGAG CGAGCCGGTGATCACCCCGGAGCGCAGCGATCGCCGCTTCAAGGCCGAGGCCTGGAGCGAACAACCCATCTA TGACTACCTCAAGCAGTCCTACCTGCTCACCGCCAGGCACCTGCTGGCCTCGGTGGATGCCCTGGAGGGCGT CCCCCAGAAGAGCCGGGAGCGGCTGCGTTTCTTCACCCGCCAGTACGTCAACGCCATGGCCCCCAGCAACTT CCTGGCCACCAACCCCGAGCTGCTCAAGCTGACCCTGGAGTCCGACGGCCAGAACCTGGTGCGCGGACTGGC CCTCTTGGCCGAGGATCTGGAGCGCAGCGCCGATCAGCTCAACATCCGCCTGACCGACGAATCCGCCTTCGA GCTCGGGCGGGATCTGGCCCTGACCCCGGGCCGGGTGGTGCAGCGCACCGAGCTCTATGAGCTCATTCAGTA CAGCCCGACTACCGAGACGGTGGGCAAGACACCTGTGCTGATAGTGCCGCCCTTCATCAACAAGTACTACAT CATGGACATGCGGCCCCAGAACTCCCTGGTCGCCTGGCTGGTCGCCCAGGGCCAGACGGTATTCATGATCTC CTGGCGCAACCCGGGCGTGGCCCAGGCCCAAATCGATCTCGACGACTACGTGGTGGATGGCGTCATCGCCGC CCTGGACGGCGTGGAGGCGGCCACCGGCGAGCGGGAGGTGCACGGCATCGGCTACTGCATCGGCGGCACCGC CCTGTCGCTCGCCATGGGCTGGCTGGCGGCGCGGCGCCAGAAGCAGCGGGTGCGCACCGCCACCCTGTTCAC TACCCTGCTGGACTTCTCCCAGCCCGGGGAGCTTGGCATCTTCATCCACGAGCCCATCATAGCGGCGCTCGA GGCGCAAAATGAGGCCAAGGGCATCATGGACGGGCGCCAGCTGGCGGTCTCCTTCAGCCTGCTGCGGGAGAA CAGCCTCTACTGGAACTACTACATCGACAGCTACCTCAAGGGTCAGAGCCCGGTGGCCTTCGATCTGCTGCA CTGGAACAGCGACAGCACCAATGTGGCGGGCAAGACCCACAACAGCCTGCTGCGCCGTCTCTACCTGGAGAA CCAGCTGGTGAAGGGGGAGCTCAAGATCCGCAACACCCGCATCGATCTCGGCAAGGTGAAGACCCCTGTGCT GCTGGTGTCGGCGGTGGACGATCACATCGCCCTCTGGCAGGGCACCTGGCAGGGCATGAAGCTGTTTGGCGG GGAGCAGCGCTTCCTCCTGGCGGAGTCCGGCCACATCGCCGGCATCATCAACCCGCCGGCCGCCAACAAGTA CGGCTTCTGGCACAACGGGGCCGAGGCCGAGAGCCCGGAGAGCTGGCTGGCAGGGGCGACGCACCAGGGCGG CTCCTGGTGGCCCGAGATGATGGGCTTTATCCAGAACCGTGACGAAGGGTCAGAGCCCGTCCCCGCGCGGGT CCCGGAGGAAGGGCTGGCCCCCGCCCCCGGCCACTATGTCAAGGTGCGGCTCAACCCCGTGTTTGCCTGCCC AACAGAGGAGGACGCCGCATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAGGCCAGAAGGCCCGTCTCAGCAAGCGGTTC GGGGCGGCGGAGGTAGCCGCCTTCGCCGCGCTCTCGGAGGACTTCAACCCCCTGCACCTGGACCCGGCCTTC GCCGCCACCACGGCGTTCGAGCGGCCCATAGTCCACGGCATGCTGCTCGCCAGCCTCTTCTCCGGGCTGCTG GGCCAGCAGTTGCCGGGCAAGGGGAGCATCTATCTGGGTCAAAGCCTCAGCTTCAAGCTGCCGGTCTTTGTC GGGGACGAGGTGACGGCCGAGGTGGAGGTGACCGCCCTTCGCGAGGACAAGCCCATCGCCACCCTGACCACC CGCATCTTCACCCAAGGCGGCGCCCTCGCCGTGACGGGGGAAGCCGTGGTCAAGCTGCCTTAAGCACCGGCG GCACGCAGGCACAATCAGCCCGGCCCCTGCCGGGCTGATTGTTCTCCCCCGCTCCGCTTGCCCCCTTTTTCG GGGCAATTTGGCCCAGGCCCTTTCCCTGCCCCGCCTAACTGCCTAAAATGGCCGCCCTGCCGTGTAGGCATT CATCCAGCTAGAGGAATTC

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横溝 聡 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８階 財団法人 地球環境産業技術 研究機構内 (72)発明者 福居 俊昭 埼玉県和光市広沢２−１ 理化学研究所内 (72)発明者 土肥 義治 埼玉県和光市広沢２−１ 理化学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換
   えベクターにより大腸菌を形質転換し、得られた形質転
   換体を油脂関連物質により脂肪酸資化能を誘導し、その
   脂肪酸資化能誘導株を油脂関連物質を炭素源とする培地
   で培養し、得られる培養物からポリエステルを採取する
   ことを特徴とするポリエステルの製造方法。
2. 【請求項２】 ポリエステルが、一般式（１）： 【化１】 （式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を
   示す）で表される３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体
   である請求項１記載のポリエステルの製造方法。
3. 【請求項３】 ポリエステル重合酵素遺伝子が、アエロ
   モナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来の遺伝子で
   ある請求項１又は２記載のポリエステルの製造方法。
4. 【請求項４】 ポリエステル重合酵素遺伝子が、（Ａ）
   配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
   （Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個
   以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
   からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配
   列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩
   基配列からなるＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡ
   であって、ポリエステル重合酵素をコードするＤＮＡで
   ある請求項１〜３いずれか記載のポリエステルの製造方
   法。
5. 【請求項５】 脂肪酸資化能誘導株の培養を油脂関連物
   質を唯一の炭素源とする培地で行う請求項１〜４いずれ
   か記載のポリエステルの製造方法。