JPH11225798A - 変異を抑制する方法 - Google Patents
変異を抑制する方法Info
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- JPH11225798A JPH11225798A JP10032738A JP3273898A JPH11225798A JP H11225798 A JPH11225798 A JP H11225798A JP 10032738 A JP10032738 A JP 10032738A JP 3273898 A JP3273898 A JP 3273898A JP H11225798 A JPH11225798 A JP H11225798A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸伸長または増幅反応において、変異を誘発
するヌクレオチドによる変異を抑制する方法を提供す
る。 【解決手段】ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ存
在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤＮＡ鎖を伸
長する反応において、変異を誘発するヌクレオチドを含
む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発ヌクレオ
チド除去蛋白質、例えばサーマスサーモフィラス由来の
ＭｕｔＭまたはＭｕｔＴ蛋白質により、該ヌクレオチド
を取り除くことを特徴とする変異を抑制する方法ならび
に核酸増幅方法およびそのための試薬。
するヌクレオチドによる変異を抑制する方法を提供す
る。 【解決手段】ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ存
在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤＮＡ鎖を伸
長する反応において、変異を誘発するヌクレオチドを含
む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発ヌクレオ
チド除去蛋白質、例えばサーマスサーモフィラス由来の
ＭｕｔＭまたはＭｕｔＴ蛋白質により、該ヌクレオチド
を取り除くことを特徴とする変異を抑制する方法ならび
に核酸増幅方法およびそのための試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸伸長反応また
は核酸増幅反応において、変異を誘発するヌクレオチド
を含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、該ヌクレオチ
ドを取り除くことにより、該ＤＮＡ鎖を鋳型としたＤＮ
Ａ伸長または増幅反応の際に起こりうる変異を抑制する
方法ならびに該試薬に関する。
は核酸増幅反応において、変異を誘発するヌクレオチド
を含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、該ヌクレオチ
ドを取り除くことにより、該ＤＮＡ鎖を鋳型としたＤＮ
Ａ伸長または増幅反応の際に起こりうる変異を抑制する
方法ならびに該試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼが、鋳型であるＤＮ
Ａに鎖相補的にＤＮＡを合成していく過程に、ある頻度
で複製エラーを起こすことがよく知られている。これら
のエラーは、間違ったヌクレオチドを取り込む挿入、ヌ
クレオチドの欠失または付加からなる。ＤＮＡ増幅反応
によく用いられるｐｏｌＩファミリーに属するＤＮＡポ
リメラーゼにおける、これらの複製誤りの頻度が、Math
urらによって測定され開示された(Gene 108,1-6 (199
1)) 。これによれば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでは、
約100,000 塩基対を合成する度に、１．４〜２．５回の
割合で複製エラーが起こることが示されている。また、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディ
ング活性）をもつＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼでは、これよりも頻度が低く、約1,00
0,000 塩基対を合成する度に、１．２〜２．０回の割合
で複製エラーが起こるとされている。
Ａに鎖相補的にＤＮＡを合成していく過程に、ある頻度
で複製エラーを起こすことがよく知られている。これら
のエラーは、間違ったヌクレオチドを取り込む挿入、ヌ
クレオチドの欠失または付加からなる。ＤＮＡ増幅反応
によく用いられるｐｏｌＩファミリーに属するＤＮＡポ
リメラーゼにおける、これらの複製誤りの頻度が、Math
urらによって測定され開示された(Gene 108,1-6 (199
1)) 。これによれば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでは、
約100,000 塩基対を合成する度に、１．４〜２．５回の
割合で複製エラーが起こることが示されている。また、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディ
ング活性）をもつＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼでは、これよりも頻度が低く、約1,00
0,000 塩基対を合成する度に、１．２〜２．０回の割合
で複製エラーが起こるとされている。
【０００３】最近、これらの複製エラーに加えて、修飾
されたヌクレオチドによるワトソン−クリック対合以外
の対合の形成による変異が指摘されている。ここでいう
ワトソン−クリック対合とは、グアニン−シトシン、ア
デニン−チミンの対合である。
されたヌクレオチドによるワトソン−クリック対合以外
の対合の形成による変異が指摘されている。ここでいう
ワトソン−クリック対合とは、グアニン−シトシン、ア
デニン−チミンの対合である。
【０００４】８−オキソグアニン（化１）はグアニンが
酸化的攻撃を受けたときに生じる産物で、シトシンの他
に、アデニンと対合することができる。従って、これを
鋳型として、ＤＮＡが複製された場合、新生鎖には、シ
トシンの代わりにアデニンが取り込まれ、結果として、
Ｇ→Ｔトランスバージョンが引き起こされる(J.Biol.Ch
em. 267,166-172 1992) 。その他にも、例えば、２−オ
キソ−ｄＡは、Ｃと対合し、Ａ→Ｇトランジションを、
５−ＣＨＯ−ｄＵは、Ｇと対合することにより、Ｔ→Ｃ
トランジションを誘発することが知られている。本発明
ではこのようなヌクレオチドを変異誘発ヌクレオチドと
いう。
酸化的攻撃を受けたときに生じる産物で、シトシンの他
に、アデニンと対合することができる。従って、これを
鋳型として、ＤＮＡが複製された場合、新生鎖には、シ
トシンの代わりにアデニンが取り込まれ、結果として、
Ｇ→Ｔトランスバージョンが引き起こされる(J.Biol.Ch
em. 267,166-172 1992) 。その他にも、例えば、２−オ
キソ−ｄＡは、Ｃと対合し、Ａ→Ｇトランジションを、
５−ＣＨＯ−ｄＵは、Ｇと対合することにより、Ｔ→Ｃ
トランジションを誘発することが知られている。本発明
ではこのようなヌクレオチドを変異誘発ヌクレオチドと
いう。
【０００５】
【化１】 式中、ＲがＨの時、８−オキソグアニンを示し、Ｒが糖
の時、８−オキソグアニンヌクレオチドを示す。
の時、８−オキソグアニンヌクレオチドを示す。
【０００６】従って、核酸増幅反応を行う際、加えたヌ
クレオチドプール中に含まれる、あるいは増幅反応中に
酸化的攻撃を受けて生じた、これらの変異を誘発するヌ
クレオチドが伸長反応で取り込まれた場合、あるいはＤ
ＮＡ鎖中で酸化的攻撃を受けて、これらの変異を誘発す
るヌクレオチドが生じた場合、変異の原因となる。増幅
反応では、複製の誤りが起こった断片を鋳型として、さ
らに増幅が進むため、得られた増幅産物には鋳型とは異
なる配列をもつ断片が多数存在することになる。従っ
て、得られたＤＮＡ断片を取得し、解析しようとする場
合、その信頼性が常に問題となっていた。上記のような
ＤＮＡポリメラーゼの誤りに起因する複製エラーについ
ては、本発明者らが既にミスマッチに特異的に結合する
蛋白質ＭｕｔＳを用いた複製エラーを含むＤＮＡ増幅断
片を分離する方法を考案した（特願平8-337026号）。
クレオチドプール中に含まれる、あるいは増幅反応中に
酸化的攻撃を受けて生じた、これらの変異を誘発するヌ
クレオチドが伸長反応で取り込まれた場合、あるいはＤ
ＮＡ鎖中で酸化的攻撃を受けて、これらの変異を誘発す
るヌクレオチドが生じた場合、変異の原因となる。増幅
反応では、複製の誤りが起こった断片を鋳型として、さ
らに増幅が進むため、得られた増幅産物には鋳型とは異
なる配列をもつ断片が多数存在することになる。従っ
て、得られたＤＮＡ断片を取得し、解析しようとする場
合、その信頼性が常に問題となっていた。上記のような
ＤＮＡポリメラーゼの誤りに起因する複製エラーについ
ては、本発明者らが既にミスマッチに特異的に結合する
蛋白質ＭｕｔＳを用いた複製エラーを含むＤＮＡ増幅断
片を分離する方法を考案した（特願平8-337026号）。
【０００７】しかしながら、変異を誘発するヌクレオチ
ドによる変異を抑制する方法は、いまだ開発されていな
い。
ドによる変異を抑制する方法は、いまだ開発されていな
い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、核酸
伸長または増幅反応において、変異を誘発するヌクレオ
チドによる変異を抑制する方法を提供することにある。
伸長または増幅反応において、変異を誘発するヌクレオ
チドによる変異を抑制する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、変異を誘発するヌクレオチドを含む１本鎖また
は２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白
質、例えばＭｕｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用
いて、該ヌクレオチドを除去することにより、該ＤＮＡ
鎖を鋳型としたＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を
抑制する方法を見いだした。
た結果、変異を誘発するヌクレオチドを含む１本鎖また
は２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白
質、例えばＭｕｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用
いて、該ヌクレオチドを除去することにより、該ＤＮＡ
鎖を鋳型としたＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を
抑制する方法を見いだした。
【００１０】また、耐熱性のＭｕｔＭおよび／またはＭ
ｕｔＹ蛋白質を用いることにより、高温下で行われる核
酸増幅反応においても、変異を誘発するようなヌクレオ
チドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、該ヌクレ
オチドを取り除き、該ＤＮＡ鎖を鋳型としたＤＮＡ伸長
反応の際に起こりうる変異を抑制し、もって、増幅反応
の正確性を高める方法を構築し、本発明に到達した。
ｕｔＹ蛋白質を用いることにより、高温下で行われる核
酸増幅反応においても、変異を誘発するようなヌクレオ
チドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、該ヌクレ
オチドを取り除き、該ＤＮＡ鎖を鋳型としたＤＮＡ伸長
反応の際に起こりうる変異を抑制し、もって、増幅反応
の正確性を高める方法を構築し、本発明に到達した。
【００１１】すなわち、本発明は、ＤＮＡを鋳型とし、
ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマ
ーによりＤＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を誘発
するヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖か
ら、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質により、該変異を
誘発するヌクレオチドを取り除くことを特徴とする変異
を抑制する方法である。
ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマ
ーによりＤＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を誘発
するヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖か
ら、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質により、該変異を
誘発するヌクレオチドを取り除くことを特徴とする変異
を抑制する方法である。
【００１２】また、本発明は、ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮ
Ａポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーに
よりＤＮＡ鎖を伸長する核酸増幅法において、変異を誘
発するヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖
から、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質により、該変異
を誘発するヌクレオチドを取り除くことを特徴とする核
酸増幅法である。
Ａポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーに
よりＤＮＡ鎖を伸長する核酸増幅法において、変異を誘
発するヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖
から、変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質により、該変異
を誘発するヌクレオチドを取り除くことを特徴とする核
酸増幅法である。
【００１３】さらに、本発明はＤＮＡポリメラーゼ、ｄ
ＮＴＰ、プライマーおよび変異誘発ヌクレオチド除去蛋
白質を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬である。
ＮＴＰ、プライマーおよび変異誘発ヌクレオチド除去蛋
白質を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬である。
【００１４】
【発明の実施態様】本発明において、変異を誘発するヌ
クレオチドとは、例えば、８−オキソグアニンヌクレオ
チド、２−オキソアデニンヌクレオチド、５−ヒドロキ
シシトシンヌクレオチド、５−ＣＨＯ−ウラシルヌクレ
オチドなどが例示される。
クレオチドとは、例えば、８−オキソグアニンヌクレオ
チド、２−オキソアデニンヌクレオチド、５−ヒドロキ
シシトシンヌクレオチド、５−ＣＨＯ−ウラシルヌクレ
オチドなどが例示される。
【００１５】８−オキソグアニンは、酸化的ストレスを
受けた細胞のＤＮＡ中に最も多くみられるグアニンの誘
導体であり、シトシンの他に、アデニンと対合すること
ができる。従って、これを鋳型としてＤＮＡが複製され
た場合、新生鎖にはシトシンの代わりにアデニンが取り
込まれ、結果としてＧ→Ｔトランスバージョンが引き起
こされ、変異を引き起こす。
受けた細胞のＤＮＡ中に最も多くみられるグアニンの誘
導体であり、シトシンの他に、アデニンと対合すること
ができる。従って、これを鋳型としてＤＮＡが複製され
た場合、新生鎖にはシトシンの代わりにアデニンが取り
込まれ、結果としてＧ→Ｔトランスバージョンが引き起
こされ、変異を引き起こす。
【００１６】また、該ヌクレオチドを含む１本鎖または
２本鎖ＤＮＡとは、ＤＮＡの鎖中またはその末端に上記
変異を誘発するヌクレオチドを含有するものであれば、
その長さを問わない。さらに、該ヌクレオチドの数は、
１または２以上である。また、本発明では、変異を誘発
するヌクレオチドは、該ヌクレオチドを含む１本鎖また
は２本鎖ＤＮＡと共存していてもよい。
２本鎖ＤＮＡとは、ＤＮＡの鎖中またはその末端に上記
変異を誘発するヌクレオチドを含有するものであれば、
その長さを問わない。さらに、該ヌクレオチドの数は、
１または２以上である。また、本発明では、変異を誘発
するヌクレオチドは、該ヌクレオチドを含む１本鎖また
は２本鎖ＤＮＡと共存していてもよい。
【００１７】本発明において鋳型とするＤＮＡとは、実
質的にＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の鋳型となり
得るものであれば、特に制限はなく、例えば、プラスミ
ドＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが例示さ
れる。
質的にＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の鋳型となり
得るものであれば、特に制限はなく、例えば、プラスミ
ドＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが例示さ
れる。
【００１８】本発明において使用する変異誘発ヌクレオ
チド除去蛋白質とは、変異を誘発するヌクレオチドをＤ
ＮＡ鎖から取り除くエンドヌクレアーゼであり、例え
ば、ＭｕｔＭおよび/ またはＭｕｔＹ蛋白質が例示され
る。これらの蛋白質は単独で、または２種以上混合して
使用することができる。
チド除去蛋白質とは、変異を誘発するヌクレオチドをＤ
ＮＡ鎖から取り除くエンドヌクレアーゼであり、例え
ば、ＭｕｔＭおよび/ またはＭｕｔＹ蛋白質が例示され
る。これらの蛋白質は単独で、または２種以上混合して
使用することができる。
【００１９】ＭｕｔＭ蛋白質とは、ＤＮＡ鎖中の８−オ
キソグアニン：シトシン塩基対を特異的に認識し、８−
オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取り除く活
性を有する蛋白質であり（図１）、大腸菌、乳酸菌、そ
の他細菌由来、また酵母由来のＯＧＧ１、ヒトＭＭＨな
どのＭｕｔＭホモローグが数多く報告されている。
キソグアニン：シトシン塩基対を特異的に認識し、８−
オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取り除く活
性を有する蛋白質であり（図１）、大腸菌、乳酸菌、そ
の他細菌由来、また酵母由来のＯＧＧ１、ヒトＭＭＨな
どのＭｕｔＭホモローグが数多く報告されている。
【００２０】大腸菌由来のＭｕｔＭ蛋白質は、ＤＮＡ鎖
中の８−オキソグアニン−シトシン塩基対を特異的に認
識し、８−オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から
取り除く(Mutation Res.,254,1-12 1991) 。その機構
は、0'Connorら (Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86,5222-5
226, 1989)あるいは Bhagwatら (Biochemistry, 35,659
-665, 1996) に示されている。すなわち、大腸菌Ｍｕｔ
Ｍ蛋白質はＤＮＡグリコシラーゼ活性およびＡＰエンド
ヌクレアーゼ活性を併せてもち、８−オキソヌクアニン
をＤＮＡグリコシラーゼ活性によって取り除いた後、生
じたＡＰ部位の５’および３’側をＡＰエンドヌクレア
ーゼ活性により切断し、ギャップを生じる。該ＭｕｔＭ
蛋白質を調製する方法は、例えば Mutation Res., 254,
1-12,1991に記載される。この作用により、ＤＮＡ鎖か
ら８−オキソグアニンヌクレオチドが排除され、変異が
抑えられる。
中の８−オキソグアニン−シトシン塩基対を特異的に認
識し、８−オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から
取り除く(Mutation Res.,254,1-12 1991) 。その機構
は、0'Connorら (Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86,5222-5
226, 1989)あるいは Bhagwatら (Biochemistry, 35,659
-665, 1996) に示されている。すなわち、大腸菌Ｍｕｔ
Ｍ蛋白質はＤＮＡグリコシラーゼ活性およびＡＰエンド
ヌクレアーゼ活性を併せてもち、８−オキソヌクアニン
をＤＮＡグリコシラーゼ活性によって取り除いた後、生
じたＡＰ部位の５’および３’側をＡＰエンドヌクレア
ーゼ活性により切断し、ギャップを生じる。該ＭｕｔＭ
蛋白質を調製する方法は、例えば Mutation Res., 254,
1-12,1991に記載される。この作用により、ＤＮＡ鎖か
ら８−オキソグアニンヌクレオチドが排除され、変異が
抑えられる。
【００２１】ＭｕｔＹ蛋白質とは、ＤＮＡ鎖中の８−オ
キソグアニン−アデニン塩基対を特異的に認識し、８−
オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取り除く作
用を有し、大腸菌由来のものなどが知られている。
キソグアニン−アデニン塩基対を特異的に認識し、８−
オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取り除く作
用を有し、大腸菌由来のものなどが知られている。
【００２２】大腸菌由来のＭｕｔＹ蛋白質は、同様に、
アデニン：８−オキソグアニン塩基対を特異的に認識
し、８−オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取
り除く性質を有する。この作用により、ＤＮＡ鎖から８
−オキソグアニンが排除され、変異が抑えられることが
示される。大腸菌由来のＭｕｔＹ蛋白質を調製する方法
は、Proc.Natl. Acad.Sci.USA,89,7022-7025 1992 に記
載される。
アデニン：８−オキソグアニン塩基対を特異的に認識
し、８−オキソグアニンヌクレオチドをＤＮＡ鎖から取
り除く性質を有する。この作用により、ＤＮＡ鎖から８
−オキソグアニンが排除され、変異が抑えられることが
示される。大腸菌由来のＭｕｔＹ蛋白質を調製する方法
は、Proc.Natl. Acad.Sci.USA,89,7022-7025 1992 に記
載される。
【００２３】さらには、大腸菌由来のＭｕｔＴ蛋白質
は、ヌクレオチドプール中に存在する８−オキソｄＧＴ
Ｐ（グアニンヌクレオチドトリリン酸）を８−オキソｄ
ＧＭＰ（グアニンヌクレオチドモノリン酸）に分解し、
もって８−オキソｄＧＴＰ（グアニンヌクレオチドトリ
リン酸）が、ＤＮＡ合成の基質となり得ないよう作用し
ている。
は、ヌクレオチドプール中に存在する８−オキソｄＧＴ
Ｐ（グアニンヌクレオチドトリリン酸）を８−オキソｄ
ＧＭＰ（グアニンヌクレオチドモノリン酸）に分解し、
もって８−オキソｄＧＴＰ（グアニンヌクレオチドトリ
リン酸）が、ＤＮＡ合成の基質となり得ないよう作用し
ている。
【００２４】大腸菌生体内では、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＹ、
ＭｕｔＴがそれぞれ協調的に作用し、ＤＮＡに対する酸
化的損傷を修復している。
ＭｕｔＴがそれぞれ協調的に作用し、ＤＮＡに対する酸
化的損傷を修復している。
【００２５】このような蛋白質としては、大腸菌、乳酸
菌、酵母の他、耐熱性細菌、例えばサーマス・サーモフ
ィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭまたは／
およびＭｕｔＹ蛋白質が例示される。
菌、酵母の他、耐熱性細菌、例えばサーマス・サーモフ
ィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭまたは／
およびＭｕｔＹ蛋白質が例示される。
【００２６】高度好熱菌、例えばサーマス・サーモフィ
ラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭ蛋白質（以
下、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質と記す）は、本発明者らに
よってクローニングされ、大量発現に成功しており、そ
の性質が解析された。その結果、３０〜６０℃において
８−オキソグアニン特異的エンドヌクレアーゼ活性が保
持されており、また、９５℃、５分間の処理後も、ほぼ
１００％の活性が残存していることから、熱安定性に優
れることが示された。この活性は、８−オキソグアニン
−シトシン塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡのみならず、８−
オキソグアニンをもつ１本鎖ＤＮＡに対しても有効に作
用する。
ラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭ蛋白質（以
下、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質と記す）は、本発明者らに
よってクローニングされ、大量発現に成功しており、そ
の性質が解析された。その結果、３０〜６０℃において
８−オキソグアニン特異的エンドヌクレアーゼ活性が保
持されており、また、９５℃、５分間の処理後も、ほぼ
１００％の活性が残存していることから、熱安定性に優
れることが示された。この活性は、８−オキソグアニン
−シトシン塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡのみならず、８−
オキソグアニンをもつ１本鎖ＤＮＡに対しても有効に作
用する。
【００２７】Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質が熱安定性に優れ
ることは、以下の点で大きな効果をもたらす。すなわ
ち、従来より使用されていた大腸菌由来のＭｕｔＭ蛋白
質は熱に不安定であったが、高度高熱菌、サーマス・サ
ーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭ蛋
白質は、ＰＣＲのような増幅反応中の高温下でも作用さ
せることが可能となる。
ることは、以下の点で大きな効果をもたらす。すなわ
ち、従来より使用されていた大腸菌由来のＭｕｔＭ蛋白
質は熱に不安定であったが、高度高熱菌、サーマス・サ
ーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＭ蛋
白質は、ＰＣＲのような増幅反応中の高温下でも作用さ
せることが可能となる。
【００２８】従って、増幅反応液に核酸増幅反応を行う
際、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を適量添加することによ
り、加えたヌクレオチドプール中に含まれる８−オキソ
ｄＧＴＰが伸長反応で取り込まれ生じた、あるいはＤＮ
Ａ鎖中のグアニンが増幅反応中に酸化的攻撃を受けて生
じた８−オキソグアニンを、8-オキソグアニン−シトシ
ン塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡあるいは８−オキソグアニ
ンをもつ１本鎖ＤＮＡの状態で、増幅反応が行われるの
と並行して分解し、以後の増幅において変異の原因とな
る鋳型を排除することができる。
際、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を適量添加することによ
り、加えたヌクレオチドプール中に含まれる８−オキソ
ｄＧＴＰが伸長反応で取り込まれ生じた、あるいはＤＮ
Ａ鎖中のグアニンが増幅反応中に酸化的攻撃を受けて生
じた８−オキソグアニンを、8-オキソグアニン−シトシ
ン塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡあるいは８−オキソグアニ
ンをもつ１本鎖ＤＮＡの状態で、増幅反応が行われるの
と並行して分解し、以後の増幅において変異の原因とな
る鋳型を排除することができる。
【００２９】また、８−オキソグアニンを含むＤＮＡ鎖
が、ＭｕｔＭ蛋白質による分解を、たまたま逃れ、その
後のＤＮＡ伸長反応の際、アデニンと対合したとして
も、アデニン−8-オキソグアニン塩基対を特異的に認識
し、８−オキソグアニン特異的エンドヌクレアーゼ活性
をもつＭｕｔＹ蛋白質を反応系に添加しておくことによ
り、このＤＮＡ鎖を排除することができ、８−オキソグ
アニンに起因する複製エラーの抑制をより一層確実なも
のとすることができるであろう。
が、ＭｕｔＭ蛋白質による分解を、たまたま逃れ、その
後のＤＮＡ伸長反応の際、アデニンと対合したとして
も、アデニン−8-オキソグアニン塩基対を特異的に認識
し、８−オキソグアニン特異的エンドヌクレアーゼ活性
をもつＭｕｔＹ蛋白質を反応系に添加しておくことによ
り、このＤＮＡ鎖を排除することができ、８−オキソグ
アニンに起因する複製エラーの抑制をより一層確実なも
のとすることができるであろう。
【００３０】本発明において使用するＤＮＡポリメラー
ゼとしては、例えば大腸菌ｐｏｌＩ、ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどの
大腸菌あるいはバクテリオファージ由来の常温ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、ＫＯ
Ｄ、ＫＯＤ ｄａｓｈなどの耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、またはその混合物、ＭＭＬＶ、ＡＭＶなどのＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つリバーストランス
クリプターゼなどが含まれる。
ゼとしては、例えば大腸菌ｐｏｌＩ、ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどの
大腸菌あるいはバクテリオファージ由来の常温ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、ＫＯ
Ｄ、ＫＯＤ ｄａｓｈなどの耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、またはその混合物、ＭＭＬＶ、ＡＭＶなどのＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つリバーストランス
クリプターゼなどが含まれる。
【００３１】本発明において使用するプライマーとして
は、標的とする核酸に対し、少なくとも１部が相補的な
配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
は、標的とする核酸に対し、少なくとも１部が相補的な
配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３２】本発明において使用するｄＮＴＰとは、好
ましくはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混
合物であるが、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、７デアザｄＧＴＰ
などを含んでいても良い。ただし、市販のｄＧＴＰ中に
は、極微量の８−オキソｄＧＴＰＧＡ含まれることが知
られている。
ましくはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混
合物であるが、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、７デアザｄＧＴＰ
などを含んでいても良い。ただし、市販のｄＧＴＰ中に
は、極微量の８−オキソｄＧＴＰＧＡ含まれることが知
られている。
【００３３】本発明は、ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリ
メラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤ
ＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を抑制する方法で
あり、該伸長反応とは、ＤＮＡ増幅反応における伸長反
応を含む。また、本発明方法の変異を抑制する方法は、
核酸増幅反応の他にも、核酸配列決定法、突出末端のfi
ll in 反応、ニックトランスレーションなどにも応用で
きる。
メラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤ
ＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を抑制する方法で
あり、該伸長反応とは、ＤＮＡ増幅反応における伸長反
応を含む。また、本発明方法の変異を抑制する方法は、
核酸増幅反応の他にも、核酸配列決定法、突出末端のfi
ll in 反応、ニックトランスレーションなどにも応用で
きる。
【００３４】ＤＮＡ増幅反応としては、例えば、ＰＣ
Ｒ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅、３ＳＲなどの増幅方法が
ある。これらの核酸増幅法はいずれもＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプラ
イマーによりＤＮＡ鎖を伸長する反応を利用する。耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅反応の場合、好まし
くは５０〜８０℃、さらに好ましくは６８〜７５℃の間
で行われる。また、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたfi
ll in 反応、大腸菌ｐｏｌＩを用いたニックトランスレ
ーション反応なども含まれる。これらの反応は好ましく
は３０〜３７℃で行われる。
Ｒ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅、３ＳＲなどの増幅方法が
ある。これらの核酸増幅法はいずれもＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプラ
イマーによりＤＮＡ鎖を伸長する反応を利用する。耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅反応の場合、好まし
くは５０〜８０℃、さらに好ましくは６８〜７５℃の間
で行われる。また、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたfi
ll in 反応、大腸菌ｐｏｌＩを用いたニックトランスレ
ーション反応なども含まれる。これらの反応は好ましく
は３０〜３７℃で行われる。
【００３５】
【実施例】次に、本発明を実施例を用いて説明する。参考例１ Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質の調製 (1) ＭｕｔＭ遺伝子のクローニング ６種類の生物 (Escherichia coli, Haemophilus influe
nzae, Neisseria meningitidis, Bacillus firmus, Lac
tococcus lactis, Streptococcus mutans)のＭｕｔＭ遺
伝子において、相同性の高い領域を参考にして、配列番
号３および４のプライマーを合成した。このプライマー
を用い、Thermus thermophilus HB8株のゲノミックＤＮ
Ａを鋳型として、 J,Biochem., 114, 926-929,1993に記
載される方法で、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを用いて
ＰＣＲを行った。得られた断片をプローブとして、KpnI
で消化された Thermus thermophilus HB8 株のゲノミッ
クＤＮＡに対して、サザンハイブリダイゼーションを行
ったところ、約３ｋｂの位置にシグナルが得られた。こ
の断片をｐＵＣ119(宝酒造) の KpnI 部位に挿入し、ｐ
ＭＣ１の挿入断片の塩基配列を決定し、ＭｕｔＭ遺伝子
のオープンリーディングフレーム(OFR) をもつ AfaI-Hi
ndIII 断片を切り出し、再度、ｐＵＣ119 に連結し、ｐ
ＭＣ２を得た。
nzae, Neisseria meningitidis, Bacillus firmus, Lac
tococcus lactis, Streptococcus mutans)のＭｕｔＭ遺
伝子において、相同性の高い領域を参考にして、配列番
号３および４のプライマーを合成した。このプライマー
を用い、Thermus thermophilus HB8株のゲノミックＤＮ
Ａを鋳型として、 J,Biochem., 114, 926-929,1993に記
載される方法で、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを用いて
ＰＣＲを行った。得られた断片をプローブとして、KpnI
で消化された Thermus thermophilus HB8 株のゲノミッ
クＤＮＡに対して、サザンハイブリダイゼーションを行
ったところ、約３ｋｂの位置にシグナルが得られた。こ
の断片をｐＵＣ119(宝酒造) の KpnI 部位に挿入し、ｐ
ＭＣ１の挿入断片の塩基配列を決定し、ＭｕｔＭ遺伝子
のオープンリーディングフレーム(OFR) をもつ AfaI-Hi
ndIII 断片を切り出し、再度、ｐＵＣ119 に連結し、ｐ
ＭＣ２を得た。
【００３６】次にＭｕｔＭ遺伝子の開始コドンに、NdeI
部位を作出するため、配列番号５および６のプライマー
を用い、ｐＭＣ２を鋳型として、ＰＣＲを行った。得ら
れた150bp の断片をHindIII およびBamHI で消化した
後、ｐＭＣ２のHnidIII およびBanHI で消化したものに
連結し、ｐＭＣ３を得た。ｐＭＣ３のNdeI-HindIII断片
をｐＥＴ３ａ(Novagen) に連結し、発現ベクターｐＭＴ
１を得た。
部位を作出するため、配列番号５および６のプライマー
を用い、ｐＭＣ２を鋳型として、ＰＣＲを行った。得ら
れた150bp の断片をHindIII およびBamHI で消化した
後、ｐＭＣ２のHnidIII およびBanHI で消化したものに
連結し、ｐＭＣ３を得た。ｐＭＣ３のNdeI-HindIII断片
をｐＥＴ３ａ(Novagen) に連結し、発現ベクターｐＭＴ
１を得た。
【００３７】(2) ＭｕｔＭ遺伝子の発現 pLYSE が予め導入された大腸菌HS641(DE3)に、ｐＭＴ１
を導入した。この形質転換体を50μg/mlアンピシリンお
よび25μg/mlクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、
４×１０8cell/mlに到達するまで培養した後、50μg/ml
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)
を添加し、さらに 2時間培養した。得られた菌体は遠心
分離により集菌し、-80 ℃で凍結した。
を導入した。この形質転換体を50μg/mlアンピシリンお
よび25μg/mlクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、
４×１０8cell/mlに到達するまで培養した後、50μg/ml
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)
を添加し、さらに 2時間培養した。得られた菌体は遠心
分離により集菌し、-80 ℃で凍結した。
【００３８】(3) ＭｕｔＭ蛋白質の精製 凍結した菌体10g を解凍した後、以下の組成からなるバ
ッファー1 (50mM Tris-HCl(pH7.5) 、5mM 2-メルカプト
エタノール、500mM NaCl、10% グリセロール)90mlに懸
濁した。これを超音波破砕機で破砕し、界面活性剤、Br
ij-58 を 0.5%(w/v)となるように加え、30分間攪拌し
た。次に60℃で30分間加温し、30,000g で40分間遠心分
離することにより、沈殿を分離した。得られた上清に 5
00mM EDTAを200 μl 添加した後、DEAE-Sepharose CL-6
B(Pharmacia) 50mlに通し、 1mM EDTA を含むバッファ
ー1 150ml で洗浄した液を回収した。
ッファー1 (50mM Tris-HCl(pH7.5) 、5mM 2-メルカプト
エタノール、500mM NaCl、10% グリセロール)90mlに懸
濁した。これを超音波破砕機で破砕し、界面活性剤、Br
ij-58 を 0.5%(w/v)となるように加え、30分間攪拌し
た。次に60℃で30分間加温し、30,000g で40分間遠心分
離することにより、沈殿を分離した。得られた上清に 5
00mM EDTAを200 μl 添加した後、DEAE-Sepharose CL-6
B(Pharmacia) 50mlに通し、 1mM EDTA を含むバッファ
ー1 150ml で洗浄した液を回収した。
【００３９】この液に飽和度10% となるように硫酸アン
モニウムを加え、Phenyl-Toyoperal650M カラム(20ml)
にチャージした。これを40mlの飽和度15% の硫酸アンモ
ニウムを含むバッファー2 (50mM Tris-HCl(pH7.5) 、5m
M 2-メルカプトエタノール、10% グルセロール) で洗浄
した後、硫酸アンモニウムの飽和度15〜0%のグラジェン
トバッファー2 100ml で溶出した。ＭｕｔＭ蛋白質を含
む画分を回収し、バッファー2 で 5倍希釈した後、CM-S
epharose CL06B (Pharmacia) 20ml にロードした。これ
をNaCl 0〜500mM のグラジェントバッファー2 100ml で
溶出し、ＭｕｔＭ蛋白質を含む画分を回収した。次い
で、これを Sephacryl S-200 HR カラム(450ml) にか
け、バッファー3 (20mM HEPES(pH7.7)、0.1mM DTT 、10
% グリセロール) にて溶出し、ＭｕｔＭ蛋白質を含む画
分を回収した。以上の操作で、SDS-PAGEにてほぼ単一な
バンドを示す20mgのＴｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を得た。
モニウムを加え、Phenyl-Toyoperal650M カラム(20ml)
にチャージした。これを40mlの飽和度15% の硫酸アンモ
ニウムを含むバッファー2 (50mM Tris-HCl(pH7.5) 、5m
M 2-メルカプトエタノール、10% グルセロール) で洗浄
した後、硫酸アンモニウムの飽和度15〜0%のグラジェン
トバッファー2 100ml で溶出した。ＭｕｔＭ蛋白質を含
む画分を回収し、バッファー2 で 5倍希釈した後、CM-S
epharose CL06B (Pharmacia) 20ml にロードした。これ
をNaCl 0〜500mM のグラジェントバッファー2 100ml で
溶出し、ＭｕｔＭ蛋白質を含む画分を回収した。次い
で、これを Sephacryl S-200 HR カラム(450ml) にか
け、バッファー3 (20mM HEPES(pH7.7)、0.1mM DTT 、10
% グリセロール) にて溶出し、ＭｕｔＭ蛋白質を含む画
分を回収した。以上の操作で、SDS-PAGEにてほぼ単一な
バンドを示す20mgのＴｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を得た。
【００４０】実施例１ Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質によるＰＣＲ産物中の８−オキ
ソグアニンの除去 プラスミドｐＭＯＬ２１（実施例２に記載）を鋳型と
し、これに特異的なプライマーＰ１（配列番号１）およ
びＰ２（配列番号２）を用い、耐熱性ポリメラーゼＫＯ
Ｄ ｄａｓｈ（東洋紡製）にて増幅反応を行った。この
際、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を０〜２００ｎｇの範囲で
反応液に添加した。
ソグアニンの除去 プラスミドｐＭＯＬ２１（実施例２に記載）を鋳型と
し、これに特異的なプライマーＰ１（配列番号１）およ
びＰ２（配列番号２）を用い、耐熱性ポリメラーゼＫＯ
Ｄ ｄａｓｈ（東洋紡製）にて増幅反応を行った。この
際、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質を０〜２００ｎｇの範囲で
反応液に添加した。
【００４１】 プラスミドｐＭＯＬ２１ ２ｎｇ （奈良先端大 真木教授より入手） 増幅プライマーＰ１（配列番号１） ２０ｐｍｏｌｅｓ 増幅プライマーＰ２（配列番号２） ２０ｐｍｏｌｅｓ ＫＯＤ ｄａｓｈ用１０Ｘバッファー（東洋紡製）１０μｌ ＫＯＤ ｄａｓｈ ポリメラーゼ（東洋紡製） ５ｕｎｉｔｓ ２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μｌ Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質M ０、２０、１００、２００ｎｇ 全量 １００μｌ
【００４２】
【００４３】得られた反応液をアガロースゲル電気泳動
に供し、目的の断片である４．３ｋｂのバンドを確認し
た後、以下の反応液を添加した。 ５ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム）１０μｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム １００μｌ イソプロパノール ２００μｌ
に供し、目的の断片である４．３ｋｂのバンドを確認し
た後、以下の反応液を添加した。 ５ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム）１０μｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム １００μｌ イソプロパノール ２００μｌ
【００４４】室温で１０分間放置した後、１５０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物を回収した。
７５％エタノール５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸
留水４５μｌに溶解した。これに１０ＸＨバッファー
（東洋紡）５μｌ、ScaI（東洋紡）２０単位を加え、３
７℃で１６時間反応した。反応終了後、フェノール抽
出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μ
ｌのＴＥバッファーに溶解した。それぞれの条件につい
て、同一の反応を１２回テストした。それぞれの条件ご
とに溶解液をまとめ、限外濾過膜、セントリコン３０
（アミコン製）を用い、１／１０に濃縮した。これに２
ｍｌのＴＥバッファーを加え、さらに、１／１０に濃縮
した。この操作を３回繰り返した。得られた液に、さら
に下記反応液を添加した。
ｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物を回収した。
７５％エタノール５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸
留水４５μｌに溶解した。これに１０ＸＨバッファー
（東洋紡）５μｌ、ScaI（東洋紡）２０単位を加え、３
７℃で１６時間反応した。反応終了後、フェノール抽
出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μ
ｌのＴＥバッファーに溶解した。それぞれの条件につい
て、同一の反応を１２回テストした。それぞれの条件ご
とに溶解液をまとめ、限外濾過膜、セントリコン３０
（アミコン製）を用い、１／１０に濃縮した。これに２
ｍｌのＴＥバッファーを加え、さらに、１／１０に濃縮
した。この操作を３回繰り返した。得られた液に、さら
に下記反応液を添加した。
【００４５】 ５ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム）１０μｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム １００μｌ イソプロパノール ２００μｌ
【００４６】室温で１０分間放置した後、１５０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物を回収した。
７５％エタノール５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸
留水５０μｌに溶解した。これにより反応液中の未反応
のプライマーおよびｄＮＴＰがほぼ除去された。それぞ
れ約１００ｕｇの反応産物を得た。この溶液に１ＭＭｇ
Ｃｌ2 １μｌ、ＤＮＡ分解酵素、ＤＮａｓｅＩ（宝酒造
製）７０単位を加え、３７℃で１時間インキュベートし
た。この溶液を８−オキソグアニン定量用ＥＬＩＳＡキ
ット（８−ＯＨｄＧ Ｃｈｅｃｋ（日本油脂製））に供
し、８−オキソグアニンの量を測定した。その結果を図
２に示す。
ｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物を回収した。
７５％エタノール５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸
留水５０μｌに溶解した。これにより反応液中の未反応
のプライマーおよびｄＮＴＰがほぼ除去された。それぞ
れ約１００ｕｇの反応産物を得た。この溶液に１ＭＭｇ
Ｃｌ2 １μｌ、ＤＮＡ分解酵素、ＤＮａｓｅＩ（宝酒造
製）７０単位を加え、３７℃で１時間インキュベートし
た。この溶液を８−オキソグアニン定量用ＥＬＩＳＡキ
ット（８−ＯＨｄＧ Ｃｈｅｃｋ（日本油脂製））に供
し、８−オキソグアニンの量を測定した。その結果を図
２に示す。
【００４７】図２に示されるように、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えていない試料に比して、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えた試料は、有意に８−オキソグアニンの量
が低下している。
蛋白質を加えていない試料に比して、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えた試料は、有意に８−オキソグアニンの量
が低下している。
【００４８】実施例２ ｒｐｓＬ遺伝子による変異率の
測定 ｐＭＯＬ２１は、その分子中にアンピシリン耐性遺伝子
及びｒｐｓＬ遺伝子をもつ（Gene,121(1992)25-33 ）。
ｒｐｓＬ遺伝子の産物は大腸菌細胞内１２ＳｒＲＮＡに
結合することにより、その細胞をストレプトマイシン感
受性とする。従って、この遺伝子に変異が生じ産物が機
能しなくなったとき、その細胞はストレプトマイシン耐
性となる。ＤＮＡ増幅産物中に含まれる複製エラーの有
無を評価するため、このプラスミドをＰＣＲにより増幅
し、自己環状化した後、大腸菌を形質転換し、ストレプ
トマイシンを含む培地または含まない培地にて形成され
たコロニー数の比をもって変異率を算出した。以下にＰ
ＣＲの条件を記す。
測定 ｐＭＯＬ２１は、その分子中にアンピシリン耐性遺伝子
及びｒｐｓＬ遺伝子をもつ（Gene,121(1992)25-33 ）。
ｒｐｓＬ遺伝子の産物は大腸菌細胞内１２ＳｒＲＮＡに
結合することにより、その細胞をストレプトマイシン感
受性とする。従って、この遺伝子に変異が生じ産物が機
能しなくなったとき、その細胞はストレプトマイシン耐
性となる。ＤＮＡ増幅産物中に含まれる複製エラーの有
無を評価するため、このプラスミドをＰＣＲにより増幅
し、自己環状化した後、大腸菌を形質転換し、ストレプ
トマイシンを含む培地または含まない培地にて形成され
たコロニー数の比をもって変異率を算出した。以下にＰ
ＣＲの条件を記す。
【００４９】 プラスミドｐＭＯＬ２１ １ｎｇ （奈良先端大 真木教授より入手） 増幅プライマーＰ１（配列番号１） １０ｐｍｏｌｅｓ 増幅プライマーＰ２（配列番号２） １０ｐｍｏｌｅｓ ＫＯＤ ｄａｓｈ用１０Ｘバッファー（東洋紡製） ５μｌ ＫＯＤ ｄａｓｈ ポリメラーゼ（東洋紡製） ５ｕｎｉｔｓ ２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μｌ Ｔｔｈ ＭｕｔＭ蛋白質 ０〜２００ｎｇ 全量 ５０μｌ
【００５０】
【００５１】得られた反応液をアガロースゲル電気泳動
に供し、目的の断片である４．３ｋｂのバンドを切り出
して回収した。第一化薬製、ＤＮＡ抽出装置（DNA cel
l）を用いてゲルから断片を溶出した後、フェノール抽
出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿をそれぞれ常法
に従って行った。得られたＤＮＡ沈殿を７５％エタノー
ル５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸留水４５μｌに
溶解した。これに１０×Ｈバッファー（東洋紡）５μ
ｌ、ScaI（東洋紡）１０単位を加え、３７℃で１６時間
反応した。反応終了後、フェノール抽出、クロロホルム
抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌのＴＥバッファ
ーに溶解した。
に供し、目的の断片である４．３ｋｂのバンドを切り出
して回収した。第一化薬製、ＤＮＡ抽出装置（DNA cel
l）を用いてゲルから断片を溶出した後、フェノール抽
出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿をそれぞれ常法
に従って行った。得られたＤＮＡ沈殿を７５％エタノー
ル５０μｌでリンスし、乾燥した後、蒸留水４５μｌに
溶解した。これに１０×Ｈバッファー（東洋紡）５μ
ｌ、ScaI（東洋紡）１０単位を加え、３７℃で１６時間
反応した。反応終了後、フェノール抽出、クロロホルム
抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌのＴＥバッファ
ーに溶解した。
【００５２】回収した反応液のうち２μｌをとり、ＤＮ
Ａライゲーション用キット、ライゲーションハイ（東洋
紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した後、大腸菌
ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに加えた。氷
上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間保温し、直
後に、氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌを加え、
３７℃で１時間保温した。このうち１００μｌをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート上で、
他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びス
トレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレ
ート上で２０時間培養した。アンピシリンを含む培地で
形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシリン及びスト
レプトマイシンを含む培地で形成されたコロニー数（Ｃ
ｂ）をそれぞれ計数し、以下の式により変異率（ｍ．
ｆ．）を算出した。
Ａライゲーション用キット、ライゲーションハイ（東洋
紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した後、大腸菌
ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに加えた。氷
上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間保温し、直
後に、氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌを加え、
３７℃で１時間保温した。このうち１００μｌをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート上で、
他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びス
トレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレ
ート上で２０時間培養した。アンピシリンを含む培地で
形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシリン及びスト
レプトマイシンを含む培地で形成されたコロニー数（Ｃ
ｂ）をそれぞれ計数し、以下の式により変異率（ｍ．
ｆ．）を算出した。
【００５３】ｍ．ｆ．＝Ｃｂ＊１００／（Ｃａ＊９）
【００５４】図３に示されるように、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えていない試料に比べて、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えた試料は有意に変異率が低下している。
蛋白質を加えていない試料に比べて、Ｔｔｈ ＭｕｔＭ
蛋白質を加えた試料は有意に変異率が低下している。
【００５５】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮ
Ａポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーに
よりＤＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を誘発する
ヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖をＭｕ
ｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用いて、該オリゴ
ヌクレオチドを取り除くことにより、該ＤＮＡ鎖を鋳型
としたＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を抑制する
ことが可能となる。さらに、高度好熱性菌由来のＭｕｔ
Ｍおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用いることにより、
高温下で行われる核酸増幅反応において、変異を誘発す
るヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖か
ら、該ヌクレオチドを取り除き、該ＤＮＡ鎖を鋳型とし
たＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を抑制し、もっ
て増幅反応の正確性を高めることが可能となる。
Ａポリメラーゼ存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーに
よりＤＮＡ鎖を伸長する反応において、変異を誘発する
ヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖をＭｕ
ｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用いて、該オリゴ
ヌクレオチドを取り除くことにより、該ＤＮＡ鎖を鋳型
としたＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を抑制する
ことが可能となる。さらに、高度好熱性菌由来のＭｕｔ
Ｍおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質を用いることにより、
高温下で行われる核酸増幅反応において、変異を誘発す
るヌクレオチドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖か
ら、該ヌクレオチドを取り除き、該ＤＮＡ鎖を鋳型とし
たＤＮＡ伸長反応の際に起こりうる変異を抑制し、もっ
て増幅反応の正確性を高めることが可能となる。
【００５６】
配列番号１ 配列の長さ：35 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AAAAAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTAC 35
【００５７】配列番号２ 配列の長さ：34 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 AAAAAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGT 34
【００５８】配列番号３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GCCSGAGCTS CCSGARGTNG A 21
【００５９】配列番号４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 YTCGTTSGCG TADATRTTNC C 21
【００６０】配列番号５ 配列の長さ：32 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 GGTGAATTCA TATGCCCGAG CTTCCCGAGG TG 32
【００６１】配列番号６ 配列の長さ：22 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列 CACCTCCAGG ATCCGCCTCC CC 22
【図１】 ＭｕｔＭ蛋白質の作用を示す図である。
【図２】 Ｔｔｈ ＭｕｔＭの添加量によるＰＣＲ産物
中の８−オキソグアニンヌクレオチドの量を比較した図
である。
中の８−オキソグアニンヌクレオチドの量を比較した図
である。
【図３】 Ｔｔｈ ＭｕｔＭの添加量によるｒｐｓＬ遺
伝子の変異率を比較した図である。
伝子の変異率を比較した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 倉光 成紀 大阪府豊中市宮山町２丁目16−41
Claims (15)
- 【請求項１】 ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ
存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤＮＡ鎖を
伸長する反応において、変異を誘発するヌクレオチドを
含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発ヌクレ
オチド除去蛋白質により、該変異を誘発するヌクレオチ
ドを取り除くことを特徴とする変異を抑制する方法。 - 【請求項２】 変異を誘発するヌクレオチドが、８−オ
キソグアニンヌクレオチドである請求項１記載の変異を
抑制する方法。 - 【請求項３】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、Ｍ
ｕｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質である請求項１記
載の変異を抑制する方法。 - 【請求項４】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、耐
熱性細菌由来のＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白質
である請求項１記載の変異を抑制する方法。 - 【請求項５】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、サ
ーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来の
ＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白質である請求項１
記載の変異を抑制する方法。 - 【請求項６】 ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ
存在下に、ｄＮＴＰおよびプライマーによりＤＮＡ鎖を
伸長する核酸増幅法において、変異を誘発するヌクレオ
チドを含む１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鎖から、変異誘発
ヌクレオチド除去蛋白質により、該変異を誘発するヌク
レオチドを取り除くことを特徴とする核酸増幅法。 - 【請求項７】 変異を誘発するヌクレオチドが、８−オ
キソグアニンヌクレオチドである請求項６記載の核酸増
幅法。 - 【請求項８】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、Ｍ
ｕｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質である請求項６記
載の核酸増幅法。 - 【請求項９】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、耐
熱性細菌由来のＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白質
である請求項６記載の核酸増幅法。 - 【請求項１０】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来
のＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白質である請求項
６記載の核酸増幅法。 - 【請求項１１】 核酸増幅法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、
鎖置換増幅、３ＳＲよりなる群から選択される増幅法で
ある請求項６〜１０のいずれか１項記載の核酸増幅法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プラ
イマーおよび変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質を含むこ
とを特徴とする核酸増幅用試薬。 - 【請求項１３】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、
ＭｕｔＭおよび／またはＭｕｔＹ蛋白質である請求項１
２記載の核酸増幅用試薬。 - 【請求項１４】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、
耐熱性細菌由来のＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白
質である請求項１２記載の核酸増幅用試薬。 - 【請求項１５】 変異誘発ヌクレオチド除去蛋白質が、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来
のＭｕｔＭまたは／およびＭｕｔＹ蛋白質である請求項
１２記載の核酸増幅用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10032738A JPH11225798A (ja) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | 変異を抑制する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10032738A JPH11225798A (ja) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | 変異を抑制する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11225798A true JPH11225798A (ja) | 1999-08-24 |
Family
ID=12367185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10032738A Pending JPH11225798A (ja) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | 変異を抑制する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11225798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001049842A3 (en) * | 2000-01-06 | 2002-03-07 | Pioneer Hi Bred Int | Mutm orthologue and uses thereof |
-
1998
- 1998-02-16 JP JP10032738A patent/JPH11225798A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001049842A3 (en) * | 2000-01-06 | 2002-03-07 | Pioneer Hi Bred Int | Mutm orthologue and uses thereof |
| US6657107B1 (en) | 2000-01-06 | 2003-12-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polynucleotides encoding polypeptides having 8-oxoguanine DNA glycosylase activity and uses thereof |
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