JPH1118770A - 細胞電気穿孔法及び回路 - Google Patents

細胞電気穿孔法及び回路

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JPH1118770A
JPH1118770A JP10095411A JP9541198A JPH1118770A JP H1118770 A JPH1118770 A JP H1118770A JP 10095411 A JP10095411 A JP 10095411A JP 9541198 A JP9541198 A JP 9541198A JP H1118770 A JPH1118770 A JP H1118770A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞電気穿孔法において、与える電界強度が
意図する電界強度と異なったものとならず、制御が確実
な方法を提供する。 【解決手段】 電位又は電流により所定の時間間隔にお
いて少なくとも２つの電極間で実施する細胞電気穿孔法
であって、(1) 前記時間間隔で消耗し尽くさない電圧も
しくは電流源を、調整器として作用する制御可能な電力
半導体を介して、前記電極に接続することと、(2) 前記
時間間隔における電位もしくは電流の態様を、態様の選
択可能な曲線を発生させる設定値変換器により決定し、
且つ、それを電力半導体の駆動ステップの前に接続され
ているコントローラに入力することと、(3) 前記コント
ローラが、電極に掛けられた実際の電位もしくは電流に
対応する値を瞬間値の形で受信することと、(4) 前記時
間間隔が数百ｎｓ〜数分までの時間範囲を有するもの。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特許請求の範囲の
請求項１の前文に記載した細胞電気穿孔のための方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、例えば動物細胞での遺伝子操作に
おいて、検出、発現、標識化、構造分類、富化又は強
化、分離、アプトシス（aptosis ）、遺伝子調節、遺伝
子療法、変形、細胞間相互作用等の処理を目的として、
分子や粒子を細胞に導入することが知られている。この
ためには、細胞内部や細胞生存能力について極端に妥協
することなく、細胞膜に一時的に透過性を持たせること
が必要となる。そのため、現在選択し得る方法として
は、リポフェクション法（lipofection ）や、電気穿孔
（electroporation ）もしくは電気透過法（electroper
meation ）等の方法があり、電気穿孔の場合、細胞に電
界強度が比較的高く、持続時間の比較的短い電界を掛
け、パラメーターを正しく選択することにより、細胞膜
に、電気泳動により特定サイズまで拡張可能な１個の微
小開口が形成でき、この開口を介して細胞内部に分子や
粒子を移入させることが可能となる。この場合の分子と
しては例えば、Ｘ線撮影や、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、
超音波試験、電子顕微鏡による観察などの対象となる、
核酸、タンパク質、酵素、調節タンパク質、リガンド、
レセプター、抗体、造影剤などが考えられる。また、粒
子は、例えば、モノクロゾーム、ウイルス、オルガネラ
若しくは細胞、磁性粒子、金、カーボン等である。
【０００３】ここでいう電気穿孔法は、生体外及び生体
内ともに実施可能である。生体外式の場合、細胞を適当
な懸濁液に入れ、これを試料容器（キュベット）に入れ
る。この試料容器には電極板（平板コンデンサ）を備え
ている。また、生体内式の電気穿孔式の場合は、例え
ば、針状に形成した電極を身体部分に導入する。なお、
本発明は概略、電気穿孔法に基づくものである。
【０００４】なお、英国特許公報ＧＢ２２２７３８０号
や、ドイツ特許公報ＤＥ３７１８９４１号からは、試料
容器の電極に対し、所定の持続時間と波高を持った方形
衝撃波の形態で電圧を加えることが知られている。この
場合、電流は１００アンペアより高く、電圧は約３００
０ボルトであり、電圧源として試料容器の電極に対しパ
ワースイッチにより切替えられるコンデンサが用いられ
ている。また、パワースイッチとして、並列に設けられ
た多数のサイリスタが用いられている。サイリスタの切
替え時間がモニターされ、所定時間に達すると、サイリ
スタが遮断される。
【０００５】また、米国特許５２７３５２５号若しくは
５４３９４４０号に開示された生体内式電気穿孔法にお
いては、フランクが指数関数的に減衰するパルスや、方
形パルス、単極性もしくは双極性の振動パルスなどの各
種の形状のパルスを電極に掛けることにより、電極間に
０．２〜２０ｋｖ／ｃｍの電界強度を発生させる。ま
た、１００個までの、パルスを、１０〜１００ｍｓのパ
ルス長で、次々に発生させることができる。なお、これ
ら米国特許には更に、電気穿孔法のパラメーターを選択
することが述べられており、その選択に基づいて各種条
件が整い、細胞をどの程度自然状態に保つかが決まる。
また、パラメーターの選択に応じて、パルスの電界強度
並びにパルス持続時間も、変更する必要があり、これに
より所望のパラメーターが達成されるとともに、細胞を
損なうことを避けることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、使用す
る液や、細胞のタイプ並びに性質に関する実際の条件の
下での電界強度が、電圧入力や電極の形状寸法、配置に
基づいて意図された電界強度とは異なってしまう（即
ち、これら２つの場合における電界強度は、既知の通
り、試料容器における各種媒介物の比誘電率に依存し、
また、その特性の大半が正確には再生的誘発が不可能な
媒介物の導電能に依存する）。このことから、一連の電
圧もしくは電流を試料容器の電極に入力するだけでは、
ジェネレーターを適宜の方法で制御するという点からみ
て、不十分であることが確認されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記の問題に鑑み、本発
明の目的は、効果的に作用するとともに細胞の生存率を
継続的な形で改善し得る細胞の電気穿孔（透過）のため
の方法を提供する点にある。
【０００８】前記目的は、特許請求の範囲の請求項１の
態様により達成される。本発明方法によれば、一連の電
位もしくは電流が試料容器の電極を介して設定される。
また、一連の時間間隔もしくは持続時間は実験に基づい
て決定される。本発明の１実施例においてこの時間間隔
は１５〜５００μｓであり、他の方法に比べて短い。ま
た本発明によれば、一連の電圧もしくは電流がモニター
され、瞬間値変換器を介してコントローラに供給され
て、コントローラが電力半導体制御信号を発する。前記
電力半導体を介して、電圧源が電極に接続されている。
以上の構成から、本発明方法によれば、電力半導体がス
イッチとしてではなく、指示された時間間隔において電
極に掛けられる電圧を調整するためのサーボコンポーネ
ント乃至制御部材として用いられる。
【０００９】また、適宜の実験の結果から、有効な電気
穿孔処理法における一連の電圧の特定の形状が多数の穿
孔細胞について高い生存率を確保した場合、本発明の方
法は、その電圧形状に相応する電界強度を容易に形成し
得る立場にある。
【００１０】また、細胞電気穿孔法のための回路として
は、制御可能な半導体の駆動装置部のための調整信号を
発生させる電子制御回路を用いる。本発明の１実施例に
よれば、この半導体はパワーエレクトロニクス特にパワ
ーコンバーター技術において知られている絶縁ゲート双
極トランジスタ（ＩＧＢＴ）である。瞬間値変換器が電
極の電流もしくは電圧を捕捉して、これに対応する瞬間
値を前記の電子制御回路に送る。そして、曲線を描写す
る設定値変換器からは、所定の時間間隔における電圧も
しくは電流の形状が入力される。
【００１１】電圧乃至電流源は、従来技術の公知のコン
デンサにより形成してよいが、本発明においては、コン
デンサの静電容量を、時間間隔に対しコンデンサが消滅
仕切ることのないタイプの源として使用しうるように、
適当に大きい容量とすることが必須である。また、電極
に掛けられるパルスの形状は設定値変換器により単独で
決定される。この設定値変換器は、本発明の別の実施例
によれば、デジタル・アナログコンバータを介して電子
制御回路に連続的な出力信号を送るコンピュータにより
形成できる。コンピュータ出力信号が段階的に出力され
ることにより、このステップ信号のアナログ信号への変
換は、曲線を描くこととなる。従って、パルスを、例え
ば、基本的に公知の、指数関数的に減衰する形状で構成
してもよい。なお、前記出力信号のステップ信号の長さ
は、所望の曲線形状に対する近似値が最も効率よく達成
し得るよう決定される。
【００１２】また、制御用電子装置を半導体調整器の駆
動装置段階から、ガルバニ電気的に、分離することも公
知である。この目的のために、変成器（transformer)や
オプトカプラーを用いてもよい。本発明の１実施例によ
れば制御スイッチを駆動装置部へカップリングすること
により、オプトカプラーと変成器の並列接続がなされ、
この回路においてこれら各エレメントの出力信号が総和
ステップで総計される。この構成によれば、前記の２つ
のカップリングエレメントの助けにより、極端に急勾配
で上昇するフランク (flank)を持った所望長さのパルス
が伝達されるという制御速度にとって遊離な事実が利用
できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下本発明の実施の形態を示して
発明をより詳細に説明する。添付した図面には、本発明
の細胞電気穿孔法のための回路を示している。図におい
て、符号１０は試料容器に設けた電極であり、所定間隔
を持つ平板コンデンサを形成している。電極１０は、結
合ポスト１２で生じる端子電圧ＵQ へ、ＩＧＢＴ１４を
介して接続される。この場合電源としては、例えば比較
的大きな静電容量のコンデンサ（図示せず）を用いて、
これを結合ポスト１２にスイッチ（図示せず）を介して
繋ぐ。
【００１４】ＩＧＢＴ１４のための駆動装置１６は、増
幅器１８に入力を総和部２０に接続し、この総和部２０
の入力の一方を光感受性トランジスタ２２のエミッタに
つなぎ、他方を変圧器２６の二次側コイル２８に繋いで
構成される。変圧器２６に主コイル２４は、前記トラン
ジスタ２２とによりオプトカプラーを構成する発光ダイ
オード３０と並列に設ける。発光ダイオード３０と主コ
イル２８は、操作電圧ＵB に集電器があるトランジスタ
３２のエミッタに接続する。トランジスタ３２のベース
は操作増幅器３４の出力側に接続する。操作増幅器３４
のプラス側入力部は設定値変換器３６につなぎ、この変
換器３６にはデジタル・アナログ変換器３８を介してコ
ンピュータ４０が接続されている。前記操作増幅器３４
のマイナス側入力部は、抵抗４２を介してＩＧＢＴ１４
と電極１０の間の部位に接続される。抵抗４２と抵抗４
４は電極１０と並列であって、電圧分割器を構成してい
る。また、電極１０とアースの間には電極１０から流出
する電流を獲得するためのシャント４６を接続してい
る。
【００１５】また、電極１０に、指数関数的に減衰する
形状を持ち１５〜１００μｓの時間間隔の電圧を加える
ことも考えられる。この目的のためには、結合ポスト１
２に電圧源（図示せず）を接続するスイッチを閉じなけ
ればならない。この操作は、コンピュータ４０により制
御できる。同時にコンピュータ４０は、デジタル・アナ
ログコンバータ３８によって、アナログ信号に変換され
る時、所望の曲線に大きく近づくようなステップ状のコ
ースをとる曲線を入力することにより公称関数を発生さ
せる。そしてこの信号は、アナログ設定値変換器３６に
より操作増幅器３４に入力される。これにより、トラン
ジスタ３２と、駆動装置部１６への前述のカップリング
とにより、電極１０で減衰する電圧に所望の態様形状と
サイズを有せしめるよう設定信号に従ってＩＧＢＴをト
リガーする駆動装置部１６のための調整信号を発生させ
る。なお、この操作は自動的に、先に述べた操作につな
がっていくわけではないので、電圧を電圧分割器４２、
４４を介して操作増幅器３４の入力部に戻し、制御を実
行することとなる。
【００１６】更に、述べるべきことは、増幅ファクター
がフィードバックループ４２により設定されるという点
である。この場合、ＩＧＢＴ１４を、互いに並列にした
多数のＩＧＢＴから構成してよい。また、ステップ４４
が電圧オフセットを備える。
【００１７】また、損傷防止のために、電流をモニター
することが有益であり、例えば、図中４８の部位に電流
計を設けて分流させる。これにより、電流が所定値を越
えた場合、電圧源が切られる。
【００１８】また、ここで説明した電圧制御の代わり
に、電流制御を行なうことも可能である。そのために
は、電流瞬間値を、電圧制御の場合と基本的に同様に構
成された電子式制御装置に入力すればよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞電気穿孔法の１回路を示す電気系
統図である。
【符号の説明】
１０ 電極 １２ 結合ポスト １４ ＩＧＢＴ １６ 駆動装置 １８ 増幅器 ２０ 総和部 ２２ 光感受性トランジスタ ２４ 二次側コイル ２６ 変圧器 ２８ 主コイル ３０ 発光ダイオード ３２ トランジスタ ３４ 操作増幅器 ３６ 設定値変換器 ３８ デジタル・アナログ変換器 ４０ コンピュータ ４２ 抵抗 ４４ 抵抗
フロントページの続き (72)発明者 ベルント・ヤークトフーベル ドイツ連邦共和国、デー・25436 ウエテ ルゼン、アム・シュタインベルク 113 アー (72)発明者 ハンス・ヨアヒム・リックレフス ドイツ連邦共和国、デー・22359 ハンブ ルク、ヒルテンカンプ 17

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】電位又は電流により所定の時間間隔におい
    て少なくとも２つの電極間で実施する細胞電気穿孔法で
    あって、(1) 前記時間間隔で消耗し尽くさない電圧もし
    くは電流源を、調整器として作用する制御可能な電力半
    導体を介して、前記電極に接続することと、(2) 前記時
    間間隔における電位もしくは電流の態様を、態様の選択
    可能な曲線を発生させる設定値変換器により決定し、且
    つ、それを電力半導体の駆動ステップの前に接続されて
    いるコントローラに入力することと、(3) 前記コントロ
    ーラが、電極に掛けられた実際の電位もしくは電流に対
    応する値を瞬間値の形で受信することと、(4) 前記時間
    間隔が数百ｎｓ〜数分までの時間範囲を有すること。
  2. 【請求項２】穿孔操作繰り返し時における操作毎の前記
    時間間隔同士の間隔が少なくとも１秒である請求項１記
    載の細胞電気穿孔法。
  3. 【請求項３】前記時間間隔が１５〜５００μｓである請
    求項１又は２記載の細胞電気穿孔法。
  4. 【請求項４】細胞電気穿孔法用の回路であって、所定の
    時間間隔の間、制御可能な半導体を介して電極に接続さ
    れる電圧乃至電流源を備え、且つ、前記制御可能半導体
    をトリガーするための装置を備えたものにおいて、電圧
    乃至電流源が調整エレメントとして作用する制御可能半
    導体１４を介して電極１０に接続され、制御可能半導体
    １４の駆動ステップ１６のための調整信号が電子制御回
    路により発生され、前記電子制御回路に対し、電位もし
    くは電流の態様を予め決定する設定値変換器と、電極１
    ０の電位もしくは電流を捕捉する瞬間値変換器とが接続
    され、電子制御回路の出力が電位分離ステージ２２、３
    ０、２６を介して駆動ステージ１６に結合されるもの。
  5. 【請求項５】制御可能な半導体１４がＩＧＢＴである請
    求項４記載の細胞電気穿孔法用回路。
  6. 【請求項６】設定値変換器がコンピュータ４０から成
    り、コンピュータ４０のステップ状出力信号がデジタル
    ・アナログ変換器３８を介して前記制御回路に入力され
    るものである請求項４又は５記載の細胞電気穿孔法用回
    路。
  7. 【請求項７】制御回路の駆動ステージ１６への接続が、
    オプトカプラー３０、２２及び変成器２６、好ましく
    は、パルス変成器を介して並列に行なわれ、且つ、オプ
    トカプラー並びに変成器からの出力信号が総和ステップ
    ２０で総和されるものである請求項４、５又は６記載の
    細胞電気穿孔法用回路。
JP09541198A 1997-03-21 1998-03-23 生体外細胞電気穿孔法及び回路 Expired - Lifetime JP4007433B2 (ja)

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EP (1) EP0866123B1 (ja)
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