CN1324398A - 在处理过程中可控制温度的电打孔仪 - Google Patents
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Abstract
一种电打孔方法和电打孔仪器,可根据用户指定的脉冲和温度模式,产生和施加电场。该仪器包括带有构成电极结构一部分的帕耳帖(Peltier)装置的试管固定器,所述电极结构也是固定器的一部分。具有优势的是,这样一种脉冲,包括第一持续时间的低压脉冲,紧接着是第二持续时间高压脉冲,其后立即是第三持续时间的低压脉冲。低压电打孔的电场将分子积聚在细胞表面,适当的高压电场使细胞开孔,并且最终的低压电场将分子移送进细胞。分子可以是DNA、DNA片段、化学制剂等;接收细胞可以是卵细胞、血小板、人体细胞、红细胞、哺乳动物细胞、植物的原生质体、植物花粉、脂质体、细菌、真菌、酵母、精子和其他合适的细胞。分子置于细胞的附近,或在细胞周围组织的间隙中、或含有细胞的液体介质中。
Description
本发明所属技术领域
本发明主要与电-细胞操作有关。特别是，本发明论述产生电场并将电场应用于物质的电打孔仪和电打孔法。同时使用帕耳帖(Peltier)装置控制流程温度，以便使分子有效引入细胞并将细胞组织损坏减少到最低程度。
与本发明相关的背景技术
细胞具有一种天然抗分子通过其细胞膜进入细胞质的能力，70年代，科学家首次发现“电打孔”术，其电场被用于在细胞中形成孔，而不会引起永久损坏。为了能借助于细胞中临时形成的孔，将多种分子引入细胞质，进一步发展了此项“打孔”技术。
电打孔法被用于将物质导入各种不同类型的细胞。所述的细胞包括卵细胞、血小板、人体细胞、红细胞、哺乳动物细胞、植物的原生质体、植物花粉、脂质体、细菌、真菌、酵母和精子等。此外，电打孔技术还可以用于导入各种不同的物质，在此称之为“导入物质“、“导入分子”、“导入制剂”等。这些物质包括DNA、基因以及各种化学制剂等。
电打孔术已应用于试管内和体内程序，以将外界物质引入活细胞中。在采用试管的情况下，活细胞的试样首先与导入制剂进行混合，并且放置在电极之间，比如平板电极。然后，电极将电场施加于细胞/导入混合剂。使用试管电打孔技术系统的例子，包括电-细胞操纵仪ECM600产品、方波电打孔仪T820，两者皆由加州圣迭戈的Genetronics公司的BTX分部制造的。
已知的试管内及体内应用的电打孔术，可将瞬时高压脉冲施加于位于实施区域周围的电极上。电极之间产生的电场会使细胞膜瞬时变成多孔的，于是所引入制剂分子进入该细胞。在已知电打孔应用中，这类电场包括1000V/cm的单个方波，脉宽大约100μs。可以生成此类脉冲的设备，举例说，有Genetronics公司生产的方波电打孔仪T820。
美国专利5,442,272号，讲述了电打孔技术的快速连接抽吸电极组件，其包括有温度调节元件。然而，没有将温度控制与电打孔控制组合在一起进行实用、有效地导入物质的建议。
美国5,185,071专利讲述了使用附加在缓冲室一侧的温控帕耳帖装置的可编程电泳仪。该专利仅披露电泳应用问题。
尽管已知的电打孔方法可适用于有关的应用，其在某种情况下，电场实际上可能损坏电打孔细胞。比如，不受控制的电场和产生的热，会通过在细胞壁形成永久的孔，因而可能会损坏细胞。在极端情况下，由于电打孔过程造成的过热，可使电场完全破坏细胞。
这样，目前的电打孔系统，由于在电打孔过程中对导入物质和宿主细胞不能精确控制温度，而不适用于某些应用。此外，在对导入物质同时进行温度控制时，现有的很多电打孔系统对电场脉冲的参数，比如幅度、幅宽、此过程中的脉冲数，缺乏充分控制。
发明简述
概括地说，本发明涉及一种电打孔法和电打孔仪，用来产生和施加电场，同时根据用户规定的控制方案，可对温度进行控制。一种典型的电打孔温度控制贮器装置包括试管、固定器、用以控制温度的帕耳帖(Peltier)装置，贮器装置可配置于静态或流动条件。本发明还适合于对电打孔的电场进行集中控制，以便将分子移入细胞中，同时控制导入剂和宿主细胞物质的温度。导入剂分子的物质可以是基因或药剂，如DNA、DNA片段、化学制剂或任何其他分子等。分子物质放置在含有细胞的液体介质中，紧邻该细胞。
因此，本发明的一个方面，是根据用户规定的温度控制方案与电打孔脉冲模式，论及电场的生成和应用，以便更有效地使导入剂移入细胞，并且将对细胞物质的损坏减到最低程度。
本发明具有一系列明显优点。一般来说，本发明对将导入剂的分子引入细胞很有用，且效果明显增加。比如，导入剂可以包括治疗癌症、卡波济(Kaposis)肉瘤以及其他一系列疾病和病况的用药。
此外，通过使用电打孔技术打开细胞，以便导入分子。本发明提高了导入剂的功效。因此，只需要少量的导入剂，从而更为经济。本发明还具有一系列其他好处，将在下面作更详细的讨论。
附图简要描述
对于本领域的技术人员来说，在结合附图研究了以下详细说明之后，本发明的特征、目的及优点将更为清楚，其中：
图1A、1B、1C、1D、1E和1F介绍了一种电打孔试管和径流室固定器的各种特点，包括电打孔过程中对容纳的或径流条件下的物质，用帕耳帖装置进行温度控制。
图2A和2B根据发明以透视图和方框图形式示出了电打孔和温度控制硬件和贮器的固定器的互相连接。
图3为现有技术的电打孔波形图。
图4为根据本发明的一个方面介绍电打孔脉冲控制器和发生器子系统的典型硬件组件和内部接线图。
图5为根据本发明的一个方面的典型制造成品图，构成一种数据存储介质。
图6为根据本发明的一个方面介绍典型方法步骤顺序的流程图。
图7为根据根本发明介绍电打孔脉冲图。
图8～11为根据本发明介绍带有温控的电打孔脉冲模式；以及
图12为根据本发明的一个实施例介绍典型方法步骤顺序的流程图。
优选实施例的详细描述
硬件部件及内部接线
正如上面所介绍的，本发明的一个方面涉及一种电打孔仪及方法，用以将导入剂导入细胞，对此类物质生成并施加电场，同时根据用户选择的温度控制方案，在处理过程中控制温度，以便有效地、实际地引用这些物质，将对细胞组织的损坏减少到最低程度。借助组合式帕耳帖装置和使用处理控制器的电打孔仪可为处理过程提供精确的温度控制。贮器(receptacle)
图1A介绍了本发明一个最佳典型实施例，展示试管5的剖面，所述试管是进行电打孔的宿主细胞和导入物质的贮器。图1B介绍了使用径流式试管5a的可供选择的示范性实施例，其包括透明塑料矩形外壳，带有盖9，其上端有圆形开口。与此相似的形式在美国专利5,676,646题为《流通式打孔仪》中有说明(引作参考文献)。这两种容器都能制成可替换件形式。试管5的例子为BTX牌试管，640型号为美国加利福尼亚州圣迭戈的Genetronics公司制造。试管5为便携式，可插入试管固定器10中。试管固定器10为平台型，可支持试管5，进行电打孔处理，并且是与电打孔和温度控制器100之间的电路接口。
所述开口是用推入式塑料盖9进行闭合。管130合适地通过盖9中间的孔延伸进小室的一端。管132通过外壳2下端的孔延伸进来，由接口件6密封。外壳2最好和一对装入的与延伸电极7和8模注在一起，所述固定器电极7和8是与固定器电极40、42连接的，后者从电打孔和温度控制组件100传输电信号。电极7和8被均匀间隔开，实际上在容器5a整个长度范围内平行延展，使液体在进出口之间从电极间隙流过。电极(7和8)和(40和42)可用任意的合适的导电材料制作，比如不锈钢或铝，也可以是镀金的材料。贮器固定器
示范型的固定器10(图1A)，是一个电绝缘平台，带有端子，用来连接至少两个独立导线11和13，为电打孔脉冲提供电能，同时也为帕耳帖装置44提供电能，使该装置从贮器和固定器组件20转移热能，或向其提供热能。固定器装置10典型地是采用聚甲醛树酯(delrin)或其他绝缘材料制成，带有将试管5或5a安放在固定器10所用的螺钉夹紧构件。电极7和8最好和固定在固定器10的一对电极40、42连接，但是，如果需要的话，也可以结合成一个独立单元。在不带调节温度组件的情况下，这一类试管固定器的例子是BTX牌安全架，型号为630-B，由加利福尼亚州圣迭戈的Genetronics公司制造。这类固定器还可以包括结合在机罩中的电气安全联锁功能部件，防止人员在操作时的电击危险。
固定器10最好使用板型电极40、42，装有帕耳帖装置44，以便快速加热或冷却试管中的宿主和导入物质。帕耳帖装置44包含在电极40、42中，控制进行电打孔物质的温度。固定器最好包括一个温度传感器58(图2B)，最好安装到或装在经历电打孔的物质的附近。特别是温度传感器58可安装到固定器10上，以便在处理过程中保持接近试管，对处理过程的温度提供实时闭环控制。比如，温度传感器可以是安装在固定器10的机罩构件的红外线温度传感器，这样，当机罩关闭时，可以获得对经历电打孔物质的准确温度测量。
在开始电打孔之前，贮器接受用细胞和导入的材料用来做体外导入，所述材料是细胞和导入剂材料，可以放入试管5或5a中。必要的操作是要求技术人员使用自动仪器配送这些材料，用倒入方法、滴入方法或其他引入法，将液体导入剂注入试管。径流式贮器
图1C是另一个贮器装置实施例，采用径流室54形式。此贮器装置出现于美国5,676,646号题为“径流电打孔仪”的专利中，但不带对物质的温度控制装置。径流室54贮器装置接收体外导入用的细胞物质和导入物质，采用从储存器或人体抽取的方法，用来进行传输过程中的处理。径流式贮器和固定器单元20包括矩形外壳57，罩住长条形径流室54。它包括一对均匀排布分开的长条形电极，由圆柱形管57和与其同心安装的圆柱形导电棒55构成，确定了电极表面平行。优选的是导电棒55和管57用不锈钢制成，如果需要可以镀金。由导电棒55和管57构成的电极表面端部，安装在绝缘塑料材料制成的空心块59和61中，并且用高温弹性密封圈63进行密封。密封圈安放在组块59和61内部的圆形凹槽机构内。它们最好用耐高温材料制作，如市售的VITON牌材料。
组块59和61钻有圆柱形孔，以安装棒55和管57端部。组块59和61分别有进口和出口65和67，这样，血液和液体介质混合物可以按箭头所示方向(图1C)流过相向的电极之间的径流室。在65和67的进出口的螺纹壁中，拧入式装配接口件71和72(图2A)，用来连接此处的管74和76。管74和76将在机箱52范围内延伸，并依次连接到安装在机箱面板上的接口件78和80。管130和132分别连接到接口件78和80上。
自电打孔和温度子系统100起的电缆136和138(图2A)备有可拆卸的插头，其将连接到径流室单元机箱面板上的插孔82和84上。这些插孔依次连接到电线86和88，其将连接到车有螺纹的轴和螺母电极组件40和42(图1C)，一个电极连接到容器57周围的固定器上，另一个作为径流室54的电极。电极螺母组件40和42提供圆棒电极55的电气接线，同时组件42提供至容器电极57的电气接线。帕耳帖装置44安装到螺母电极结构40和42的外端。
图1D示出了另一种径流室贮器固定器101的状况，它可以和带有输入接受管110的蠕动泵(peristaltic pump)(未示出)一起使用。这可以从美国5,676,646专利中了解到，但其中没有对进行电打孔物质控制温度的组件。此径流室式电打孔贮器包括一个安全架116，有一个总的U形结构，其配有一槽118，用来在相对面之间或传热板120和122之间放置可置换型(径流)室。侧板122配有上槽和下槽124和126，用来接收液体，或者说接到径流室的管110和128。
图1E示有径流室，进行电打孔的物质流过此室。其包括有中央基本上是矩形的棒体构件128，象图1D中所示的那样，有一长条形中心布置的贯通槽130。在棒形构件128的相对面一侧，使用一对棒形电极40和42将槽130封闭。中心体构件128最好由绝缘材料制作，而棒状电极40和42最好由易于镀金，至少沿着表面镀金的导电材料制作，与槽的两侧相通。电极134备有上下管子连接件，以便安装管110和128，使其与槽130上端和下端分别直接相通。径流室贮器和带有帕耳帖装置44的电极40和42组装在一起，同时与棒128的相反侧密闭接合，同时封闭槽130。电极最好使用合适的方法与中心棒构件相对侧封接。然后将组装好的径流室滑进一对对置弹簧触点136和138之间的安全座的敞开槽中。这些触点是由合适的导电材料，比如铜合金制作，并且安装在导电固定器140和142中，其依次接到导电电缆上。
图1F在顶视图中示出电缆144和146，从开孔166通过或延伸，在后板152中有一垫圈168。一对导电电缆144和146，包括连接的导线148和150，分别焊接到对应的固定件140和142上。弹簧触点136和138可具有任意合适的结构，但是最好制造成具有合适天窗配置，以便散热。如果需要的话，还可以配置鼓风机装置。
多种试管可以采用同心圆环电极结构，其中，中心电极位于试管中心，外电极在试管的表面。各种固定器10应包括有经顶部中心和试管中心安装的电极，该试管带有外电极接口，并装有帕耳帖装置44。至少一个帕耳帖装置应装配在试管5或5a，并对应固定器10。最好，电极40、42在每个电极中都使用组合帕耳帖装置进行热流控制。电打孔和温控子系统
如上所述，一个电脉冲场贯穿电极40、42之间的物质，如上述关于贮器和固定器组件的讨论。上述实施例中的电极结构40、42从单独电源控制装置201(图2B)接受电输入。采用了低电阻电线连接电极40、42。当自子系统100可控制性地接通电源，在贮器范围内，电极40、42之间形成电场，为进行电打孔的物质提供脉冲电场。借助电场改变脉冲的幅度和宽度，以控制电打孔脉冲方式，改善基因物质的转染。最理想的电打孔脉冲方式在美国专利申请08/709,615题为《电打孔用户配置脉冲方式》(Electroporation UserConfigured Pulsing Scheme)中已有介绍，在本文中该文用作参考文献。
除了提供用户可编程的电脉冲方式外，本发明还提供了对进行电打孔的物质的温度控制，当施加电场时，贮器中的物质被自然地加热或冷却。贮器和固定器组件20装备有帕耳帖装置44，以便在电打孔过程中进行温控。帕耳帖装置44在电极40、42处进行以电和热的结合。帕耳帖装置44从外部接受电流，反馈调节电源供电，构成子系统100的一部分。帕耳帖装置44将温度控制在＜±0.1℃范围内。在电打孔仪处理电脉冲过程中，控制物质的温度可提高物质的产出率。
图2A示出了与蠕动泵(未示出)一起使用的仪器，以及喷射泵(未示出)，径流式贮器室的贮器组件89，以及电打孔和温控子系统100的示范性应用情况。除了控制物质温度外，这与美国专利5,676,646题为《径流式电打孔仪》中所述相似。该仪器包括一对用于子系统100和径流式贮器组件89耦合的电缆。
图2B为一方框图，示意控制脉冲幅度、脉冲宽度、试管固定器10带贮器装置的温度控制。在着手进行温度控制时，帕耳帖装置44构成了电极结构的一部分，用来接收自温度控制模块56的电输入。在自温度控制模块56接受电流时，帕耳帖装置将贮器内的物质邻近的热转移到组件20的外表面。可用一个温度传感器与进行电打孔的物质联系，向温度控制装置56提供反馈信号。温度传感器58可以是红外线式传感器，接受来自电打孔试管固定器装置10中的物质的温度读数，并且将准确信号传递至温度控制模块56，温度控制模块56回应适当的电信号至帕耳帖装置44。
温度控制模块56的作用是，根据温度传感器输入值回应输出电信号至装置44的。温度传感器58的输出值被输入放大器。该放大器可以安装在温度控制器56的模拟器部分。另外，在温度控制器56中装有比较仪，接收放大信号，并且具有将该信号与执行机构初始值，或参考信号比较的作用，参考信号是通过数字模拟转换器送到比较仪的。当温度高于参考值时，比较装置的输出值使功率晶体管偏离值小于100安培和100伏，该晶体管与帕耳帖装置44串联，从而冷却试管或径流式贮器中的物质。相反，借助连接到电极结构中的对称连接式电路，向帕耳帖装置44提供反向电流，会产生发热现象。为了给控制面板提供信息，一个来自温度传感器58的放大信号将送到模拟-数字转换器，用于报告信息。该信号也可以用于通过用户的程序进行控制。温度控制装置56是通过数字式控制板60来进行调节的。控制板60通过模拟/数字转换器62和数字模拟转换器64(图2B)连接到以模拟式控制系统56上。
控制板60起控制进行电打孔物质温度的作用。控制板60接受控制器66的程序，一旦输入该程序，键盘和计算机就不再需要了。如果用个人计算机对控制器编程，可以使用计算机语言，如C语言或BASIC语言(注册商标)；如果微处理器用于控制器66的编程，则采用汇编语言。在控制器66中根据用户规定的温度控制进行编程。
控制器66可包括计算机、数字或模拟处理装置、可编程的逻辑系统、硬连线的逻辑电路、一种特定用途集成电路(ASIC)或其他合适装置。在一个示范实施例中，根据需要，控制器66可包括配有合适的RAM(随机存取存储器)和ROM(只读存储器)存储体的微处理器。控制器66可与用户接口50耦合，用于与用户进行数据交换。在图例中，用户可操作用户接口50，输入所需脉冲图形和相应的温度图形，用于电极40、42和帕耳帖装置44。电压极性控制热迁移的方向，从贮器装置带出热量，或向贮器装置供给热量，并控制电流输出至帕耳帖装置44，即可以对幅度进行调节，也可以对脉冲宽度进行调节，以精确控制热迁移。
作为一个例子，用户接口50可包括字母数字键盘、触摸屏、计算机鼠标、按钮和/或拨动开关或其他适合接受人类用户输入指示的部件。用户接口50还可以包括CRT(阴极射线管)视屏、LED(发光二极管)视屏、LCD(液晶显示器)视屏、液晶显示、打印机、显示板、音频扬声器或其他可将数据传给人类用户的合适组件。控制器66被用于将信号输入和输出到控制板60，所用的可以是任一类具有RS-232或RS-485接口的ASCII终端。接受计算机输入、并产生输出的控制面板可包括：8052-AH-BASIC微处理器(8KbBASIC ROM，一种可编程脉冲发生器，使用EEPROM和EPROM的内置算法)、8Kb的RAM、8Kb的电池供电的RAM、电池供电的实时时钟及具有0.005秒分辨率的计时器、8Kb的ROM指令外延、8Kb EEPROM、24比特可编程数字输入-输出装置及带有可编程波特率的RS/232打印机端口。
控制板60具有接受控制器66输入值的功能，并且被电源70驱动。电源70为切换型，具有下列典型输出方式：供给帕耳帖装置44、RS-232或RS-485端口、数字-模拟转换器62和64，以及温控模块56的12伏最高20安培的输出。电源70还可以为RS-232端口和温控模块提供12伏、0.25安培的供电。此外，电源70可为控制板60和温控装置56提供5伏、1安培的电。电打孔脉冲子系统
图3(现有技术)示出了本项技术已知的电打孔用的脉冲模式。为了生成此脉冲，事先电打孔电源采用了电动机械式继电器来连续提供第一脉冲和第二脉冲，见S.1 Sukharev等著的《生物物理学)》(Biophys.J.)第63卷，1992年11月出版，1320-1327页。特别是Sukharev采用了一种电场脉冲101。脉冲模式101包括(1)第一脉冲，短持续时间的高压脉冲102；(2)Δt的延时103，在此过程中无脉冲生成；然后是(3)长持续时间的低电压脉冲104。第一脉冲102用于给细胞膜打孔，而第二脉冲104用于使DNA电泳进入细胞质。Sukharev认识到延时103不得过长。
尽管Sukharev系统在某些应用中可提供令人满意的效果，但此系统不一定完全适合于其他特定用途。比如，用户会发现，Sukharev的电打孔技术不能有效地将导入剂的足够分子转移到靶细胞中。本发明者认为，这是由于Sukharev第一脉冲102和第二脉冲104之间的延时103过长引起的。电打孔技术形成的细胞孔在有限时间中是敞开的，这在很大程度上取决于细胞的温度。这样，在第一脉冲和第二脉冲之间的延时过程中，第一脉冲的影响开始明显衰减(在此期间细胞孔隙被关闭)。在某些应用中，这在发生第二脉冲时可能会使第一脉冲对细胞的影响变为零。结果是，在某种情况下，Sukharev电打孔的效用不够。此外，在缺少有效的第一脉冲时，Sukharev系统的第二脉冲可能需要增加到引起细胞永久性破坏的程度。
上述的延时对于Sukharev系统来说，是由于采用了电动机械继电器。Sukharev采用独立的脉冲发生器，其输出值可通过继电器，有选择地与输出电极相耦合。然而，正如本项技术中已知的，电动机械继电器需要花费足够的时间，有时甚至50～100毫秒。因此，Sukharev实现的导入剂的效用，对于某些应用来说，可能太低。电打孔电源
图4为脉冲电打孔电源子系统200，该系统接受电源203输送的输入电压，比如110伏或220伏的交流电。该子系统200最好配备可比较装置，这在美国的题为《电打孔用户配置脉冲模式》的申请专利08/709,615中已有所披露。子系统200具有电打孔电源202和驱动控制装置204，其将控制或变换电压幅度、通或断、变换电压极性或将电源202的电压脉冲供到电极40、42。控制板60控制装置的信号将提供所需的电压或电流输出。电源202借助电打孔电源控制装置201，提供所需的可靠电压电源。比如，这样的电源的实例可从Genertonics公司的BTX分厂制造的方波电打孔仪T820中获得，不论是独立于电源70，还是与电源70有关，都指电打孔电源202，其可产生足够的电压范围，最好达500伏。分压器204将输入电压转换成多重标称电压。在图示说明中，500伏(直流)基准电压用在分压器输出线204a～204b上。
这些电压将分别供到第一和第二晶体管206～207的集电极206b～207b上，选通晶体管206～207将输入电压施加于跃迁电压节点208-209上。晶体管206-207的选通是借助有关的比较器212～213执行的，当跃迁电压节点208～209降到跃迁电压线216～217的电压以下时，将触发晶体管206～207的控制极206a～207a。例如，当比较器212确定跃迁电压节点208的电压低于预设输入线216上的电压时，比较装置212将激活晶体管206的控制极206a，引起晶体管206将分压器204的输入电压直接连接到分压节点208。这样，晶体管206～207将分别根据跃迁电压输入线216～217，在有关的跃迁电压节点208～209上保持相当恒定的电压。贮能器
子系统200还配有连接到有关跃迁电压节点208～209的贮能器220～221。典型的贮能器220～221可包括电容器。比如3200μF,500V电解电容器。这些电容器适合于208-209处最大跃迁电压500伏(直流)。变压器
子系统200还配置有变压器224，该变压器包括初级绕组224a和次级绕组224b。该变压器224最好设计有低泄漏电感特性，以提供快速脉冲上升时间，即若干微秒。优选的是，变压器224具有低电感特性，约为几μH左右。这类特性可通过将变压器224绕组12根双绞线电缆，其中6根与初级侧并联，6根与次级侧串联来实现。它具有1∶6的升压比。此外，可使用铁芯周围的单独的低压直流偏压绕组，以充分利用变压器铁心励磁作用。比如，变压器可使用由铁叠片制造的铁芯。
如果脉冲长度超过规定的最大值，变压器224可以较好地构成饱和态，从而保护患者免于接触多余的电能。变压器224在饱和态之前最好能够承受0.3V秒(3000×100微秒)。变压器224的另一个优点是其输出是浮动的，而且如果患者接地的话，实际上没有的电流流过。次级绕组224b接到输出连接节点230～231上，最好接到试管固定器装置10上。
电极40、42之间的负载表现为，试管固定器10内的体外导入剂和宿主物质，其可能含有血小板、人体细胞、红血球、哺乳动物细胞、植物的原生植体、植物的花粉、脂质体、细菌、真菌、酵母、精子或其他细胞。
为了保护贮能器220和电源202，在贮能器220和接线230之间可安装二极管236。同样，为了保护贮能器221和电源220，可在次级绕组224b和接线230之间安装二极管237。开关
子系统200还装有开关226～227，以便有选择地使电流分别流过初级绕组和次级绕组224a～224b。在一个典型结构中，每个开关226-227都可以包含有绝缘门电路双极晶体管(“IGBT”)，比如富士电气的IMBI400F-060型的IGBT晶体管。
开关226和贮能器221以串联方式耦合。此串联组合与绕组224a并联。在将电压施加于开关226的控制极226a时，集电极226b和发射极226c导通。这样，贮能器221有效地与初级绕组224a并联。这将允许电流由贮能器221流至初级绕组224a。
同样，开关227和贮能器220被串联耦合。此串联组合与次级绕组224b并联。在将电压施加于开关227的控制极227a时，集电极227b和发射极227c导通。这样，贮能器220有效地与次级绕组224b并联。这使从贮能器220流出的电流流经电极40、42。
很有利的是，贮能器220～221或开关226～227之中没有一个能使绕组224a～224b接地。因此，绕组224a～224b是浮动的。因此，实际没有电流流过患者、或者连接到另一个接地或接地电压的其他负载234。电打孔脉冲控制器
子系统200的实施例中的另一个部件是电源控制装置201，管理开关226～227的运行。大致来说，控制器66(图2)根据规定的程序调节开关226～227的通电时间和断电时间，从而在电极40、42间产生预定的脉冲模式。在控制器装置201触发开关227时，贮能器220的电压施加于电极40、42。当控制装置201触发了开关226时，贮能器220的电压施加于变压器224，在此，该电压被提升6倍，并施加于接线230～231上。控制器66(图2B)也可以触发两个开关226～227，以便将附加电压，包括跃升电压208～209的总和施加于电极结构40、42上。优选设计参数
电气要求可从场强度中推导出来，该场强度是通过肿瘤和药物有效应性体外实验中确定的，一般为1200～1300V/cm，脉冲长度约为100微秒。发生器的最大电压可从所使用的最大腔体尺寸推导。
比如，物质的电阻率假定低至100欧姆x厘米，在电极面积为3cm×3cm=9cm2的情况下，电阻为22欧姆。发生器的内部阻抗至少是一个因子10，低于22欧姆；这样，在充电电压和输送电压之间，不会发生明显的电压降。在最大电压为3000伏、负载阻抗为22欧姆的情况下，电容器部分放电生成方波脉冲的转换要求高达400KW。
所需的最大渗透脉冲长度为100微秒；这导致每个脉冲产生40焦耳的能量。用于收集和电泳脉冲的参数，可采用最高500伏电压和最长200毫秒的脉冲宽度。
最大负载电流约为136A，其将转换成通过开关通-断的，6×136=816A的初级电流。开关226～227最好能将800A的连续电流保持一毫秒。最大电压为600伏。对于10％的安全系数来说，瞬间尖峰值限制为最大550伏。这要求低电感机械组件，以降低瞬间值，并且尽可能安全可行地接近IGBT的最大电压极限值。
22欧姆的负载阻抗转换成初级的：22/6×6-0.61欧姆。在变压器的初级侧总共0.055欧姆的内部阻抗，在变压器的次级侧为1.98欧姆的等值阻抗。在产生电弧或短路情况下，如此低的阻抗会导致过大的电流，毁坏昂贵的开关IGBT。IGBT可配置限制电流特征，在产生电弧或短路，造成过大负载电流的情况下，能使开关在几微秒内切断电流。通过在次级侧引弧，我们测量到，一旦初级电流超过约900A时，对应次级侧为150A,IGBT在5微秒内切断。
从5％的负载两端的最大允许电压降，可估算出电容器的必要规格。一次脉冲中所进行的充电为100μS×816A-0.08Cb。如果此值为电容器组的5％，该电容器组需要保持20×0.08=1.6Cb。在最大500伏的情况下，所需的容量为C=Q/V=1.6/500=0.0032F或3200μF。贮存在这些电容中的能量为400焦耳。
对于收集和电泳脉冲，第二电容器放电电路在无脉冲变压器的情况下，输送较宽幅度的脉冲(若干100毫秒)和低电压(500伏)。低电压电路和高电压电路借助二极管组237和236相互退耦。
除了以上各种硬件实施例描述外，本发明在各方面广泛论述了产生用户指定的电场脉冲波形，以改进电打孔的方法。数据存储介质
此方法比如可通过操作控制器66实施，以便执行机器可读指令的程序。这些指令可驻留在各类数据存储介质中。在这一方面，本发明的一个方面是涉及一种成品，包括数据存储介质、配备机器可读指令程序，借助数字数据处理器执行该方法的步骤，生成用户规定的电场脉冲，改善电打孔效果。
此数据存储介质可以包括，比如控制器66中所包括的RAM。另一方面，这些指令可以包括在另外的数据存储介质中，比如数据存储磁盘(图5)。不论是包括在控制器66中或是别的某个地方，该指令可存储在另一类数据存储介质中，比如DASD存储器(例如，的“硬驱动装置”或RAID阵列)、磁带、电子只读存储器(例如ROM)、光存储装置(例如WORM)、“冲孔”纸卡或其他数据存储介质。操作步骤
如上所述，本发明的其中一个方面，概括性地涉及生成用户规定的电场脉冲波型以改善电打孔的方法。图6示出了方法步骤400的流程，以图示方法介绍了本发明在这一方面的实施例。此为便于说明，而非限制性描述，图6描述的是上文中介绍的子系统200。
在以任务402起动步骤400之后，任务404中的控制器66接受用户输入的指定的一个或多个输出脉冲波形。如一个实施例中，此用户输入可能由用户接口50接收。另外，用户输入也可由其他的电子装置，或从预存储记录接收。
优选的是，用户输入最好确定每个脉冲的宽度，同时还应确定输出电压的高低。其次，对于低预定电压的每个脉冲来说，任务404中的脉冲发生器在输出端子230和231按规定的宽度生成“低”预定电压。特别是，控制器66借助接通开关227可生成低压脉冲，从而使贮能器220通过电极40、42放电。
另外，在任务404中，通过按规定时间给初级绕组端子同时施加另一电压，在次级绕组端子处生成高压脉冲。特别是，高压脉冲涉及生成如上所述的电压，而且同时触发开关226，使贮能器221能通过初级绕组224放电。由于贮能器221的电压被变压器224提升，在电极230～231处会生成高压。此电压是存储在贮能器220～221中的附加电压总和。另外，仅通过触发开关226，而不涉及开关227就可形成较低的“高”压输出值。
因此，在任务404中可生成上述一个或多个脉冲，以便产生用户规定的脉冲图形。在任务404中，用户指定的脉冲波形生成完毕后，任务406中的常规程序400结束。使用示范性脉冲波形进行操作
如上所述，脉冲子系统200提供用户规定的脉冲波形，包括一个或多个“高”和/或“低”输出电压的脉冲。其他可构成用户指定的脉冲波形的示范性波形，可单独使用或组合使用，如上面所讨论的，在美国申请专利08/709,615中已有披露。
图8～11介绍了各种脉冲波形，可单独使用或组合使用，组成用户指定的脉冲模式，带有相关处理物质的实时温度曲线。由于脉冲是瞬间在几微秒内发生的，且根据容纳物质的贮器装置的体积以及对贮器装置实施热迁移方向的热效应设计，物质的冷却和加热是所使用装置的非固有因素，因此，时间标尺不必要是线性的。
尽管图8～11中其中每一个脉冲模式对于不同的应用都具有明显的优点，但下面的说明重点突出了模式700(图9)的特点和操作，以便以电打孔脉冲模式和实时温度控制描述本发明的运行状况。通过帕耳帖装置44的极性和电流、脉冲宽度能被调节，直接与贮器装置的温度相关。在进行电打孔物质的冷却阶段，通常最低温度约为4℃，并且可被加热至40℃左右。特殊细胞和导入剂的实时电打孔脉冲相关的所需物质温度，与所使用的细胞及导入物质类型及所需的处理结果是函数关系。这类控制可为用户规定的并且以可编程序方式存储在如图5所示的数据存储介质中，而且可使用电打孔和温度控制器100来执行。
波形700包括有“阶跃式波形”，这样，它可提供第一、第二和第三电压级702～704。如果需要的话，其中一个电压、两个电压或所有电压可以是相同的。脉冲具有第一、第二和第三脉冲宽度706～708。在本例中，第一和第三电压706、708可提供500V(直流)，而第二电压为707可提供3000伏(直流)。在另一实施例中，用户可规定所需的变压器224应施加的电场幅度，电极40、42之间的间隙测量值。在此情况下，控制器可通过计算变压器224产生的合适电压，以施加所需的电场，例如，用电场乘以间隙。在一个实施例中，间隙测量值可由用户手动输入。另外，间隙可用机械方法进行测量，用自动装置以电子方法送到控制器66中，如美国专利No.5,439.440所述，在此引作参考文献。
在电打孔处理过程中，导入剂-细胞的效率明显取决于细胞膜渗透时间，人们发现其与脉冲应用前、应用过程中和应用之后的温度直接相关。借助温度变化，细胞的渗透性是可调节的。通过提高温度，可降低细胞的渗透性。降低物质环境温度，会引起细胞物质渗透性增加。
在处理过程开始时，温度应降到冰点附近，例如4℃。在发生脉冲之后，通常需要若干分钟，物质的温度上升到40℃左右，以及封闭和复性(anneal)细胞膜。然而，某些细胞物质对温度很敏感，不能承受极端温度变化。在这种情况下，对细胞操作需要在最佳细胞生存条件下进行。
在进行电打孔的物质存在相应实时温度的曲线，并可借助帕耳帖装置44进行控制。在物质进行电打孔时，温度作用的因果关系已被研究并且证明，在变化的温度和电场下，细胞膜会产生变化。特别是，这已在Nanda等在《生物电化学和生物能》(Bioelectrochemistry and Bioenergetics),34(1994)129-134页题为《热和化学方法治疗人体红血球的电打孔研究》(Studies onElectroporation of Thermally and Chemically Treated HumanErythrocytes)的文章中已有论述。在电打孔处理细胞，如处理导入剂和红细胞过程中，温度是一个重要因素。在电打孔处理过程中，温度由4℃上升到43℃，电打孔效率会降低约50％。施加后脉冲时，红细胞处于高温下，会进一步减弱电打孔作用。
图12介绍了生成和应用阶跃式波形700，和应用波形700相应的温度控制作用所涉及的流程图2000。流程在任务1002开始后，用户接口50接受任务1004的用户输入值。在图示实施例中，用户输入包括用户所需的电打孔脉冲模式，包括每一个波形区段的宽度和电压水平，以及相应的温度控制。
和任务1004同时发生的是，电源202在输出节点208～209处生成参考电压。在目前的例子中，采用500V(直流)的参考电压208～209。任务1006中生成参考电压在任务1008中给储能器充电。
在任务1008之后，根据任务1010，操作人员将导入剂的分子放入贮器装置，以便进行处理。导入剂可以包括一种或多种DNA、基因和/或各种化学制剂。
步骤1010将导入剂置于处理处的细胞间隙之间。接着，在任务1012中，对于大多数处理应用，帕耳帖装置44使贮器装置物质冷却至接近冰点温度。然而，也可执行处理过程中的物质加热。
在任务1012之后，任务1014中控制器66选通开关227，贮能器220放电，从而给电极40、42施加“低”电压。此步骤将导入剂的分子积聚在细胞试样的细胞膜附近。正如本发明发现的，此步适于使用低压进行，因此，用贮能器220的“低”电压可实现此目的，同时避免损害试样中的细胞，节约电能。
图9展示了任务1014的电压脉冲702。如图所示，此脉冲最好是具有约10～200毫秒宽度706的方波，和约500伏(直流)电压。然而，根据不同的应用，可替换不同的参数，以确定脉冲702。对应的冷却期，可使正在进行处理的细胞物质具有更大的渗透性。
在任务1014之后，任务1016中控制器66选通开关226(同时继续选通开关227)。这将在电极40、42上形成“高”压，相当于参考电压208～209的总和。此高压足以安全地在组织试样的细胞上形成小孔。图9将中此步骤示为电压脉冲703。如图所示，此脉冲最好是具有约100微秒脉冲宽度707的方波，和约1200V/cm的电场强度。然而，根据应用，可替换不同的参数，以确定脉冲703。在处理过程中，温度保持在冷态，以保持正在处理中的细胞膜的高渗透性。
非常有意义的是，子系统200可自动限制此步中组织试样细胞的损坏。特别是在初级绕组224a的电压，使次级绕组224b达饱和时，次级绕组224b出现的电压，根据已知的变压器运行的原理，开始衰减。这样，如果施加于初级绕组224a的电压施加时间过长的话，次级绕组224b自动限制组织试样暴露于此高电压脉冲。
其后，在任务1018中，控制器66中止接通开关226，同时继续接通开关227。此步允许导入剂的分子通过细胞渗透膜，进入细胞质。
图10将此步骤展示为电压脉冲704。如图所示，此脉冲最好是具有约1～200毫秒宽度708的方波，和500伏(直流)电压。根据不同的应用，可替换不同的参数确定脉冲704。
在任务1018之后，控制器66解除开关227的接通，结束脉冲700。然后，帕耳帖装置44或加热或冷却任务1022贮器装置中的物质，并且任务程序2000在任务1024中的结束。此步骤通常需要若干分钟，或将细胞膜打开(使物质保持冷却)或密封或复性(annealing)细胞膜(使物质保持热状态)。
本发明提供的其他用处包括所有电打孔介导方法，比如电融合(electrofusion)、电插入、电化学疗法、电基因疗法和电刺激疗法。对于披露的本发明有关的优选实施例，应该明了的是，本领域技术人员可以容易地对上述实施方案进行多种修改和改进，或应用于其它领域。本发明申请包括法律允许的各种实施方案与应用。尽管本发明申请按照某些优选实施方案的内容进行描述，本发明的范围不受此限制，而是按照下面权利要求的范围。
Claims (38)
1． 一种电打孔仪，所述的仪器包括：
贮器装置，用来提供a)一个指定的输出脉冲的电压界面，和b)对其中电打孔处理的物质的温度控制；
至少两个分开排布的电极，至少其中一个电极包含有帕耳帖(Peltier)装置；
至少有一个输送物质的开孔；
用来为至少两个电极供电的能源；并且
一个控制器，用来接收用户指令，指定结合叠加的对应温度曲线的输出电打孔脉冲事件；所述的控制器向电源输出选通信号，在至少两个电极对帕耳帖装置产生指定的输出脉冲、要求的极性和幅度，凭借至少两个电极能进行温度控制和电打孔。
2． 根据权利要求1所述的仪器，所述的控制器包括微处理器，以及电打孔脉冲事件和对物质进行电打孔所要求温度的用户指令，通过将选通信号叠加至电源，用来进行电打孔和温度控制。
3． 根据权利要求1所述的仪器，进一步包括与所述的控制器耦合的用户接口，用来输入温度曲线。
4． 根据权利要求1所述的仪器，所述的电极进一步包括板式电极。
5． 根据权利要求1所述的仪器，进一步包括：
测定电极之间距离的间隙传感器，并提供一种表达电极间隙距离的输出信号。
6． 根据权利要求1所述的仪器，其中所述的用来产生用户指定的电打孔脉冲波形的控制器及能源包括：
提供第一个输出电压的第一电源；
提供第二个输出电压的第二电源，所述的第一电源和所述的第二电源为独立电源；
一个具有电磁耦合的初级和次级绕组的变压器，所述的次级绕组被接入一对端子之间。
第一开关，与第一电源和初级绕组耦合，并对第一选通信号作出响应，将第一电源的第一个输出电压施加于初级绕组；
第二开关，与第二电源和次级绕组耦合，并对第二选通信号作出响应，将所述的第二电源的所述的第二输出电压施加于所述的次级绕组；并且
控制器，用来接受输出脉冲波形的用户指定条件，并且，提供第一和第二选通信号，在所述的端子产生所述的指定的输出脉冲波形。
7． 根据权利要求5所述的仪器，所述的控制器被进一步进行编程，以便执行步骤，包括：
接受指定的所需电场的输入值；
接受指定的电极间隙的输入值；并且
计算第一电压，以便在所述的指定的电极间隙内提供所述的指定的电场。
8． 根据权利要求6所述的仪器，进一步包括：
一对电极，以电气方法连接到变压器的预定的触点；
测定电极之间距离的间隙传感器，并提供一种表达电极间隙距离的输出信号；
其中所述的控制器被进一步编程，以便执行步骤，包括：
接受所需电场的输入值；
接受电极间隙输出信号，并且
计算第一电压，以提供电极之间的所需电场的输入值。
9． 根据权利要求1所述的仪器，其中所述的控制器和在电打孔脉冲事件中生成用户规定的温度状态的能源，包括用来从所述的控制器在至少两个电源控制极性的方法，从而使用帕耳帖装置控制热流。
10．根据权利要求6所述的仪器，其中所述的控制器和所述的能源包括用来控制至少两个电极间的极性和功率大小，从而控制所述的帕耳帖装置的热传递方向；所述的控制器包括用于帕耳帖装置的闭环控制的温度传感器。
11．根据权利要求1所述的仪器，其中所述的贮器意味着包括带有连接到试管外表面的至少一个构成电极接触表面的试管；所述的至少一个试管电极，配置可滑动接触面保持在固定器装置中定位；所述的固定器装置，在辅助电极结构中至少包括一个帕耳帖装置，其与至少其中一个电极的接触面构成试管的组成部分，所述的固定器具有连接到控制器的端子。
12．根据权利要求11所述的仪器，其中所述的试管是一种无流动型包容装置。
13．根据权利要求11所述的仪器，其中所述的试管为径流型包容装置。
14．一种以组件形式用于电打孔的贮器装置和辅助固定器装置，所述的组件包括：
所述的贮器装置有至少两个电极结构，以便为规定的输出电压脉冲波型和装置中所含物质的热传递控制提供接口；
至少有一个帕耳帖装置，与至少其中一个所述的电极结构结合；
用来为贮器装置提供定位稳定性，并且至少将两个电极结构连接到可连接的外部控制器的装置。
15．根据权利要求14所述的组件，所述的电极包括平板电极。
16．根据权利要求14所述的组件，进一步包括：
测定电极之间距离的间隙传感器，并提供一种表达电极间隙距离的输出信号。
17．根据权利要求14所述的组件，其中所述的贮器装置提供用于液体流过所述的贮器装置，包括：
所述的贮器装置包括一个长条形、在相对端有进口和出的径流室；并且
配置有一对长条形、分开平行排列的内置电极，并且沿液体流动的进出口之间的所述的径流室相对延伸。
18．根据权利要求17所述的组件，其中所述的贮器装置包括一个通常来说是具有矩形截面的、有一长条形中心布置、贯通两侧的槽的延伸的绝缘构件；
所述的电极为长条形扁平的导体构件，用来封闭所述的条形构件的相对侧面，同时闭合所述的槽，并且界定长条形的径流室。
19．根据权利要求18所述的组件，其中所述的进口和出口是在所述的电极之一形成的，并与所述的槽的相对端相通。
20．根据权利要求19的所述的组件，其中所述的贮器装置进一步包括由绝缘材料制成的总的U形支架，具有一对平行侧壁，并且其间带有用来可移动放置所述的径流室的开口。
21．根据权利要求20的所述的组件，其中所述的U形支架包括在一侧的开槽，以放置连接所述的进口和所述的出口的管子。
22．根据权利要求17所述的组件，其中所述的电极充分地沿所述的径流室全长延伸。
23．根据权利要求22所述的组件，其中所述的径流室包括一个延伸的、绝缘的、空心的构件；
所述的空心的构件一端的接管构成一个进口或一个出口；并且
一对长条形导电棒，沿所述的空心的构件的对侧延伸，构成所述的电极。
24．根据权利要求17所述的组件，其中所述的径流室包括一个延伸的、导电的、空心的构件，构成所述的电极之一；以及构成所述的进口和所述的出口的、在所述的空心构件两端的一对接管；并且
一个与所述的长条形构件同轴延伸的导体棒，构成另一个导体。
25．根据权利要求17所述的组件，其中所述的径流室的截面实质上为矩形。
26．根据权利要求25所述的组件，其中所述的径流室包括一个绝缘的空心构件；
所述的空心构件一端的接管构成一个所述的进口或一个所述的出口；并且；
一对长条形导电棒，沿所述的空心构件的对侧延伸，构成所述的电极。
27．一种用来调节电打孔脉冲仪的温度的方法，包括用来容纳和控制所容纳物质的温度的贮器装置，所述的贮器装置有一种电极结构包括一种帕耳帖装置：
接受用户的输入，指定有至少一个输出脉冲组成的输出脉冲模式，用来作用于电打孔的物质；用户的输入为每个脉冲指定宽度；在此，所述的脉冲模式定义为一个事件；
接受一个第二用户输入，指定一种输出脉冲模式，用来控制在所述的事件过程中所述的物质的温度。
28．根据权利要求27所述的方法，所述的物质包括取自活体的细胞。
29．使用一种试管固定器的电打孔方法，包括：
定位一对电极，含有涉及一个细胞区域的帕耳帖装置；
向所述的电极施加至少一个具有规定的极性的电压脉冲，并且
在规定温度下，给所述的细胞区域输送一种预定的导入剂；
通过向所述的电极在按二个电压、第二预定时间施加至少一个脉冲，将所述的导入剂分子转移到细胞；
在细胞处产生许多孔；
控制温度，将导入剂的分子移进所述的许多孔中。
30．根据权利要求29所述的方法，其中所述的第二预定电压的幅度在电极处提供生成的电场，范围是300～3000V/cm。
31．根据权利要求29所述的方法，进一步包括通过将所需磁场乘以电极之间的间隙测量值，计算第二预定电压幅度的步骤。
32．一种制造产品，包括数据存储介质，可行地包含一种用数字处理装置可执行的机器可读指令程序，以便执行生成电打孔脉冲仪中的电打孔脉冲模式的方法步骤，所述的仪器包括包含帕耳帖物质的电极结构；所述的方法包括：
接受用户输入，规定一个或多个输出脉冲的输出脉冲模式，所述的用户输入结合一种输出的电打孔脉冲事件对应的指定温度曲线；并且
提供选通信号，在所述的电极结构处生成所述的规定的输出脉冲。
33．根据权利要求32所述的制造产品，其中所述的数据存储介质可行地包含一种用数字处理装置可执行的机器可读指令程序，以执行电打孔和温控的方法步骤；所述的方法进一步包括：
a)一个第一预定持续时间内，以第一预定幅度的电场施加于一个细胞区域；
b)将所述的电场提升到比所述的第一预定幅度大的第二预定幅度；
c)将所述的电场降低到小于所述的第二预定幅度的第三预定幅度。
34．一种用来可编程控制一种电打孔装置的装置，包括：
用来容纳进行电打孔物质的贮器，所述的贮器包括至少两个在所述的物质置于所述的贮器时，作用于电打孔处理物质的电极；
可编程装置，用于控制电极处激励脉冲波形，以便控制连接到电极的帕耳帖装置的电场幅度和极性，用于调节贮器内和电打孔过程中的物质温度。
35．根据权利要求34所述的装置，其中所述的可编程控制装置包括：
一个控制板，电气连接到每个电极，用于控制施加于每个电极的电能的幅度、极性和持续时间。
36．根据权利要求34所述的装置，其中所述的帕耳帖装置包括，
在每个电极中具有一个内表面和外表面，所述的内表面配置用于容纳所述的物质，这里所述的内表面是一种传热板；
一种帕耳帖装置有一种内表面和外表面，其中所述的单元的内表面与每个板的外表面附着；并且
控制板电气连接到每个单元，用于将电输入到所述的每一个单元，回应电输入，所述的单元将热量自物质迁入或迁出。
37．根据权利要求34所述的装置，其中所述的控制面板是一种微处理器和带有可编程脉冲发生器的以存储器为基础的控制器。
38．用于电打孔过程的可编程控制的仪器包括：
用来容纳进行电打孔的物质的装置；
用来控制作用于所述的物质的电场幅度的可编程装置；
用来控制对物质的热流动的可控制的帕耳帖装置；并且
用来控制可编程装置、帕耳帖装置的控制装置，相互间是独立的。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |