CN110511869B - 细胞培养方法及能产生可变脉冲电场的细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

本发明为一种细胞培养方法及能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，一箱体，在箱体的一侧侧壁设有加热管和O₃通入孔，在箱体对应加热管的另一侧壁设有降温管和CO₂通入孔，在箱体后壁装有温度传感器，CO₂传感器和O₃传感器，在箱体顶部装有电极装置及步进电机、以及照明用的LED灯；在箱体内电极装置的下方设有可固定培养皿的载物台，载物台上装有位置传感器用于检测电极装置与载物台之间的距离；设置控制系统包括一上位机对一主控模块进行参数设置，通过主控模块对脉冲、温度、CO₂浓度、O₃浓度和以及电极装置与载物台之间的距离进行控制。实现对脉冲电场的电场强度、电场频率、电场极性、作用时间可调，弥补了传统装置只能进行外界细胞处理的局限。

Description

细胞培养方法及能产生可变脉冲电场的细胞培养装置

技术领域

本发明细胞培养领域，具体地来讲为一种细胞培养方法及能产生可变脉冲电场的细胞培养装置。

背景技术

癌症是危害人类健康的主要疾病。肿瘤的传统疗法以及新近发展起来的以微创消融为特征的热消融物理疗法，由于受适应症、禁忌症、治疗副作用、热效应等因素的限制，使得其临床应用存在一定的局限性。

近年来，随着脉冲生物电学作用机理及其相关技术的不断研究和发展，脉冲电场以其独特的非热生物医学效应引起了世界各国研究人员的广泛关注，并逐渐应用到肿瘤的治疗中，在临床应用中也取得了较为满意的治疗效果。

电穿孔是指在外加电场的作用下，利用微秒、纳秒甚至皮秒级电脉冲使细胞膜通透性发生改变，而形成纳米级的细小孔道的过程，利用直流脉冲发生器提供。它可以独立地改变脉冲振幅，长度，输送脉冲数和输送的频率。研究已经证明，随着振幅的增加，细胞膜被通透化的面积也随之增加。随着跨膜电位的改变，脂质双层结构被破坏，并且创建细小的，暂时性的疏水性或亲水性的孔道，以允许微分子和大分子进出细胞，而当电场撤离后，细胞重新恢复自然状态，被称为可逆电穿孔。使用更强的电场可引起细胞膜永久通透，从而导致细胞死亡，这个过程被称为不可逆电穿孔。这种技术早在18世纪50年代已被发现，在过去的30年，电穿孔技术已被实际应用在食品加工处理，药物制剂及医学领域。基于可逆电穿孔理论应用于医疗领域主要在于电化学疗法和基因电转染。2005年不可逆电穿孔作为一种新的肿瘤组织消融技术被引入，不同于其它消融方法，不可逆电穿孔不受作用周围血管血流的影响，因此对大血管边缘的细胞仍有消融作用，并且治疗后的炎症反应可减少疤痕的形成。不可逆电穿孔对实体瘤的消融作用已被Lee等学者证实。目前在欧洲国家已应用于临床，如胰腺癌，前列腺癌等疾病的临床治疗。

然而目前不可逆电穿孔对细胞的作用机制的研究仍较为初步，相关知识了解还十分有限，对于电场处理后细胞不同转归结局的原因、电场的最佳处理条件、以及体内外实验可能引起的治疗效果的差异等尚不明确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种细胞培养方法及能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，能够产生可变的脉冲电场，通过计算机控制，实现对脉冲电场的电场强度、电场频率、电场极性、作用时间可调，弥补了传统装置只能进行外界细胞处理的局限。

本发明是这样实现的，

一种能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，该装置包括：一箱体，在所述箱体的一侧侧壁设有加热管和O₃通入孔，

在箱体对应加热管的另一侧壁设有降温管和CO₂通入孔，

在箱体后壁装有温度传感器，CO₂传感器和O₃传感器分别用于检测温度、CO₂气体浓度和O₃气体浓度，

在箱体顶部装有电极装置及步进电机、以及照明用的LED灯，所述电极装置为具备多个电极针的阵列式电极，通过选择不同的电极针实现电极间距的控制，通过所述步进电机调节电极装置的位置；

在箱体内电极装置的下方设有可固定培养皿的载物台，载物台上装有位置传感器用于检测电极装置与载物台之间的距离；

设置有CO₂发生装置以及O₃发生装置分别通过管线与CO₂通入孔和O₃通入孔分别向培养装置内通入CO₂、O₃；

设置控制系统包括一上位机对一主控模块进行参数设置，并通过主控模块接收温度传感器、CO₂传感器、O₃传感器、位置传感器检测的信号，通过主控模块对脉冲、温度、CO₂浓度、O₃浓度和以及电极装置与载物台之间的距离进行控制。

进一步地，所述控制系统还包括通过主控模块控制的：

脉冲产生模块，与电极装置连接产生脉冲信号；

温度控制模块，驱动加热管与降温管的内水流的循环；

CO₂浓度调节模块，给箱体通入浓度为5%的CO₂并维持培养环境；

O₃浓度调节模块，为装置及进行电场处理前后杀菌消毒。

进一步地，所述脉冲产生模块包括：PWM脉冲控制单元、电脉冲驱动单元、脉冲测量单元以及大功率可调高压直流电源，其中所述PWM脉冲控制单元产生电脉冲信号，大功率可调高压直流电源包括电源模块3、MOSFET开关和电极装置，大功率可调高压直流电源为电极装置提供高压电源，由PWM脉冲控制单元产生的脉冲信号，经电脉冲驱动单元通过控制MOSFET开关的开通与关断在电极装置上产生高压脉冲信号，同时将输出的脉冲电场信号通过脉冲测量单元反馈至主控模块通过上位机存储及显示，所述上位机通过操作控制界面可选择电极装置的电极针编号，调整电场间距。

进一步地，所述主控模块通过读取放置在箱体体内部温度传感器的温度数据，并与设定温度比较后，通过一双路选择开关，选择温度控制模块的工作状态，当温度低于设定值时，通过外部控制电路会启动加热管对箱体内进行升温操作；当温度高于设定值时，通过外部控制电路会启动水泵，水流通过水泵开关进入降温管，吸收箱体内的热量，对装置内进行降温操作。

进一步地，主控模块通过放置在箱体内的CO₂传感器读取箱体内的CO₂浓度值，在与设定值进行比较后，通过CO₂浓度调节模块控制CO₂阀门，通过CO₂通入孔使箱体内的CO₂浓度基本维持在恒定值，当箱体内CO₂浓度高于设定值时，关闭CO₂阀门，停止CO₂通入孔对箱体输入CO₂，使得箱体内的CO₂浓度下降；当箱体内CO₂浓度低于设定值时，开启CO₂阀门，通过CO₂通入孔对箱体输入CO_2，使得箱体内的CO₂浓度上升。

进一步地，主控模块通过放置在箱体内的O₃传感器读取箱体内的O₃浓度值，在与设定值进行比较后，控制O₃阀门，通过O₃通入孔使箱体内的O₃浓度基本维持在恒定值。当箱体内O₃浓度高于设定值时，关闭O₃阀门，停止O₃通入孔对箱体输入O₃，使得箱体内的O₃浓度下降；当箱体内O₃浓度低于设定值时，开启O₃阀门，通过O₃通入孔25对箱体输入O_3，使得箱体内的O₃浓度上升。

进一步地，主控模块通过放置在箱体内内的位置传感器读取电极装置与载物台间距离，在与设定值进行比较后，控制步进电机，使电极装置与载物台距离到达设定值，伸缩至放置于载外物台上的培养皿中。当距离达到设定值时，LED灯点亮，电脉冲驱动单元导通，将电脉冲信号输出至电极装置，完成脉冲电场处理实验。

一种细胞培养方法，该方法包括：

通过上位机发送信号给主控模块，设定O₃浓度为15～30ppm，杀菌时间为20～30分钟，开启O₃浓度调节模块，对箱体内载物台、电极装置及其余空间杀菌：通过O₃传感器，实时检测箱体内O₃的浓度，并与设定的O₃浓度值进行比较，通过控制O₃浓度调节模块中的O₃阀门实现对箱体内的O₃浓度控制，使箱体内O₃浓度与设定值间误差不超过1ppm，直至设定杀菌时间结束；

通过上位机发送信号给主控模块，设定箱体内温度为36～37℃，开启温度控制模块，通过温度传感器，实时检测箱体内的温度，并与设定的温度值进行比较，通过温度控制模块的双路开关启动加热管或降温管使箱体温度与设定值误差不超过±0.5℃，维持细胞培养环境；

通过上位机发送信号给主控模块，设定箱体内CO₂百分浓度为5%，开启CO₂浓度调节模块，通过CO₂传感器，实时检测箱体内CO₂的浓度，并与设定的CO₂浓度值进行比较，通过控制CO₂浓度调节模块中的CO₂阀门实现对箱体内的CO₂浓度控制，使箱体内CO₂浓度与设定值间误差不超过0.5%，维持细胞培养环境；

将细胞培养皿放于载物台上，通过上位机操作，选择电极装置中电极针编号及电极针间距，开启电极驱动模块，通过位置传感器，实时检测电极装置与载物台间距离，并与设定值进行比较，通过控制步进电机使电极装置移动，使电极装置与载物台间距离与设定值误差不超过1mm；

通过上位机设定当前脉冲电场参数，脉冲电场输出波形选择方波或三角波，输出电压幅值在±100～±4000V，脉冲宽度为0.1～100μs，脉冲频率为1～10Hz，脉冲串个数10～1000个，脉冲电场处理时间1min～2h。细胞培养时间1h～48h；

设定脉冲电场处理时间结束后，主控模块驱动步进电机，使电极装置上移，回归原位。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：

本发明能够产生可变的脉冲电场，通过计算机控制，实现对脉冲电场的电场强度、电场频率、电场极性、作用时间可调，弥补了传统装置只能进行外界细胞处理的局限，为探索不同参数电场对体外培养的肿瘤细胞存活、分子功能、细胞内信号转导网络，以及细胞转归结局，确立用于治疗肿瘤细胞的最佳电场参数提供一种可靠的装备和方法。

附图说明

图1为能产生可变脉冲电场的细胞培养装置结构图；

图2为能产生可变脉冲电场的细胞培养装置结构框图；

图3位附图2中脉冲产生模块4的结构框图；

图4为附图2中温度控制模块5的结构框图；

图5为附图2中CO₂浓度调节模块6的结构框图；

图6为附图2中O3浓度调节模块7的结构框图；

图7为附图2中电极驱动模块8的结构框图：

1主控模块，2上位机，3大功率可调高压直流电源，4脉冲产生模块，5温度控制模块，6 CO₂浓度调节模块，7 O₃浓度调节模块，8电极驱动模块，9 PWM脉冲控制单元，10脉冲测量单元，11电极装置，12温度传感器，13 CO₂传感器，14 O₃传感器，15位置传感器，16双路开关，17水泵，18加热管，19降温管，20 CO₂发生装置，21 CO₂阀门，22 CO₂通入孔，23 O₃发生装置，24 O₃阀门，25 O₃通入孔，26步进电机，27 LED灯，28载物台，29电脉冲驱动单元。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，一种能产生可变脉冲电场的细胞培养装置包括一箱体，在箱体侧壁设有加热管18和O₃通入孔25，在其对面侧壁设有降温管19、CO₂通入孔22，箱体后壁装有温度传感器12，CO₂传感器13和O₃传感器14。箱体顶部装有电极装置11及步进电机26、LED灯27，电极装置11为具备多个电极针的阵列式电极。在装置内设有可固定培养皿的载物台28，载物台28上装有位置传感器15，CO₂发生装置20、O₃发生装置23通过管线和CO₂通入孔22、O₃通入孔25分别向培养装置内通入CO₂、O₃，上位机2经主控模块1分别连接温度传感器12、CO₂传感器13、O₃传感器14、位置传感器15，用于接收检测的信号，并通过输出端与脉冲产生模块4、温度控制模块5、CO₂浓度调节模块6、O₃浓度调节模块7和电极驱动模块8连接，用于根据检测的信号对脉冲、温度、气体浓度进行调节，温度控制模块5通过双路开关16分别连接水泵17、加热管18和降温管19构成，电极驱动模块8分别连接电极装置11、步进电机26和LED灯27构成。

如图2所示，本发明通过上位机2对系统的运行状态及工作模式进行控制：主控模块1通过脉冲产生模块4产生电极驱动模块8的脉冲信号，从而达到用户需要的脉冲电场；通过温度控制模块5，使箱体内温度基本维持恒定；通过CO₂浓度调节模块6，给箱体通入浓度为5%的CO₂并维持培养环境，为细胞存活提供有利条件；通过O₃浓度调节模块7，为细胞培养装置及进行电场处理前后杀菌消毒。上位机2通过串口线与主控模块1连接，使系统按照设定的参数工作；上位机2操作界面设置有显示模块及操作控制界面，实时显示系统当前工作状态并存储，用户可通过操作控制界面对主控模块系统进行控制。

主控模块1由ARM微处理器和FPGA芯片联合组成，ARM微处理器连接上位机2、温度传感器12、CO₂传感器13、O₃传感器14、位置传感器15及FPGA芯片。上位机2操作设置脉冲电场参数，经由ARM微处理器传至FPGA芯片，通过FPGA芯片进行电压控制、触发控制经由光纤隔离将信号传至脉冲产生模块4并传至电极驱动模块8。

如图3所示，本发明中主控模块1通过PWM脉冲控制单元9产生电脉冲信号，大功率可调高压直流电源3包括电源模块、MOSFET开关和电极装置11，大功率可调高压直流电源为电极装置11提供高压电源，由PWM脉冲控制单元9产生的脉冲信号，经电脉冲驱动单元29，通过控制MOSFET开关的开通与关断在电极装置上产生高压脉冲信号。同时将输出的脉冲电场信号通过脉冲测量单元10反馈至主控模块1通过上位机2存储及显示。上位机2通过操作控制界面可选择电极装置11中的电极针编号，调整电场间距。

如图4所示，本发明中主控模块1通过读取放置在箱体内部温度传感器12的温度数据，并与设定温度比较后，通过双路选择开关17，选择温度控制模块5的工作状态。当温度低于设定值时，外部控制电路会启动U型加热管18对箱体内进行升温操作；当温度高于设定值时，外部控制电路会启动水泵，水流通过水泵开关17进入U型降温管（铜管）19，通过这种方法，吸收箱体内的热量，对箱体内进行降温操作。

如图5所示。本发明中主控模块1通过放置在箱体内的CO₂传感器13读取箱体内的CO₂浓度值，在与设定值进行比较后，控制CO₂阀门21，通过CO₂通入孔22使箱体内的CO₂浓度基本维持在恒定值。当箱体内CO₂浓度高于设定值时，关闭CO₂阀门21，停止CO₂通入孔22对箱体输入CO₂，使得箱体内的CO₂浓度下降；当箱体内CO₂浓度低于设定值时，开启CO₂阀门21，，通过CO₂通入孔22对箱体输入CO_2，使得箱体内的CO₂浓度上升。

如图6所示。本发明中主控模块1通过放置在箱体内的O₃传感器14读取箱体内的O₃浓度值，在与设定值进行比较后，控制O₃阀门24，通过O₃通入孔25使箱体内的O₃浓度基本维持在恒定值。当箱体内O₃浓度高于设定值时，关闭O₃阀门24，停止O₃通入孔25对箱体输入O₃，使得箱体内的O₃浓度下降；当箱体内O₃浓度低于设定值时，开启O₃阀门24，通过O₃通入孔25对箱体输入O_3，使得箱体内的O₃浓度上升。

如图7所示，本发明中主控模块1通过放置在箱体内的位置传感器15读取电极装置11与载物台28间距离，在与设定值进行比较后，控制步进电机26，使电极装置11与载物台28距离到达设定值，伸缩至放置于载外物台28上的培养皿中。当距离达到设定值时，LED灯27作为一个保护显示开关点亮，电脉冲驱动单元29导通，将电脉冲信号输出至电极装置11，完成脉冲电场处理实验。

一种利用能产生可变脉冲电场的细胞培养装置的细胞培养方法，包括以下顺序和步骤：

a、启动培养装置，通过上位机2发送信号给主控模块1，设定O₃浓度为15ppm，杀菌时间为20分钟，开启O₃浓度调节模块7，对箱体内载物台28、电极装置11及其余空间杀菌：通过O₃传感器13，实时检测箱体内O₃的浓度，并与设定的O₃浓度值进行比较，通过控制O₃浓度调节模块7中的O₃阀门24实现对箱体内的O₃浓度控制，使箱体内O₃浓度与设定值间误差不超过1ppm，直至设定杀菌时间结束；

b、通过上位机2发送信号给主控模块1，设定箱体内温度为37℃，开启温度控制模块5，通过温度传感器12，实时检测箱体内的温度，并与设定的温度值进行比较，通过温度控制模块5的双路开关16启动加热管18或降温管19使箱体温度与设定值误差不超过±0.5℃，维持细胞培养环境；

c、通过上位机2发送信号给主控模块1，设定箱体内CO₂百分浓度为5%，开启CO₂浓度调节模块6，通过CO₂传感器13，实时检测箱体内CO₂的浓度，并与设定的CO₂浓度值进行比较，通过控制CO₂浓度调节模块6中的CO₂阀门21实现对箱体内的CO₂浓度控制，使箱体内CO₂浓度与设定值间误差不超过0.5%，维持细胞培养环境；

d、将细胞培养皿放于培养装置内的载物台28上，通过上位机2操作，选择电极装置11中电极针编号及电极针间距，开启电极驱动模块8，通过位置传感器15，实时检测电极装置11与载物台28间距离，并与设定值进行比较，通过控制步进电机26使电极装置11移动，使电极装置11与载物台28间距离与设定值误差不超过1mm；

e、通过上位机2设定当前脉冲电场参数，脉冲电场输出波形可选择方波或三角波，输出电压幅值在±100～±4000V，脉冲宽度为0.1～100μs，脉冲频率为1～10Hz，脉冲串个数10～1000个，脉冲电场处理时间1min～2h。细胞培养时间1h～48h；

f、设定脉冲电场处理时间结束后，主控模块1驱动步进电机26，使电极装置11上移，回归原位；

g、设定参数完成后，装置自动停止运行。

实施例1

能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，该装置是一箱体，在箱体侧壁设有加热管18和O₃通入孔25，在其对面侧壁设有降温管19、CO₂通入孔22，箱体后壁装有温度传感器12，CO₂传感器13和O₃传感器14。箱体顶部装有电极装置11及步进电机26、LED灯27，电极装置11为具备多个电极针的阵列式电极。在装置内设有可固定培养皿的载物台28，载物台28上装有位置传感器15，CO₂发生装置20、O₃发生装置23通过管线和CO₂通入孔22、O₃通入孔25分别向培养装置内通入CO₂、O₃，上位机2经主控模块1分别连接温度传感器12、CO₂传感器13、O₃传感器14、位置传感器15、脉冲产生模块4、温度控制模块5、CO₂浓度调节模块6、O₃浓度调节模块7和电极驱动模块8，温度控制模块5通过双路开关16分别连接水泵17、加热管18和降温管19构成，电极驱动模块8分别连接电极装置11、步进电机26和LED灯27构成。

上位机2通过串口线与主控模块1连接。上位机2设置脉冲电场的场强大小、脉冲宽度、脉冲频率、作用时间等参数，经由主控模块1发送命令至脉冲产生模块4产生脉冲电场。主控模块1通过位置传感器15检测电极装置11与载物台28上培养装置间距离，经由主控模块1发送命令驱动步进电机26。脉冲产生模块4通过大功率可调高压直流电源3改变脉冲电场极性、放大脉冲电场传至电极驱动模块8中的电极装置11，同时将所产生的脉冲电场经由脉冲测量单元10反馈至主控模块1并一路传送至上位机2存储并显示。

主控模块1通过信号线与温度控制模块5连接，通过一片DS18B20温度传感器测量箱体内的温度，并与设定值进行比较后，控制开启加热管18或降温管19对箱体内温度进行升温操作或降温操作；主控模块1通过信号线与CO₂浓度调节模块6连接，通过CO₂传感器13，实时的检测箱体内CO₂的浓度，并与设定的CO₂浓度值进行比较，通过控制CO₂浓度调节模块6中的CO₂阀门21的开关实现对箱体内CO₂浓度的控制；主控模块1通过信号线与O₃浓度调节模块7连接，通过O₃传感器14，实时的检测箱体内O₃的浓度，并与设定的O₃浓度值进行比较，通过控制O₃浓度调节模块7中的O₃阀门24的开关实现对箱体内O₃浓度的控制。

细胞培养方法，包括以下顺序和步骤：

a、启动培养装置，通过上位机2发送信号给主控模块1，设定O₃浓度为15ppm，杀菌时间为20分钟，开启O₃浓度调节模块7，对箱体内载物台28、电极装置11及其余空间杀菌，培养装置自动运行，直至设定杀菌时间结束；

b、通过上位机2发送信号给主控模块1，开启温度控制模块5，开启CO₂浓度调节模块6，设定箱体内温度为37℃，设定箱体内CO₂百分浓度为5%，维持细胞培养环境；

c、将细胞培养皿放于培养装置内的载物台28上，通过上位机2操作，选择电极装置11中电极针编号及电极针间距，开启电极驱动模块8，使电极装置11与载物台28间距离达到设定大小；

d、通过上位机2设定当前脉冲电场参数，脉冲电场输出波形选择方波，输出电压幅值在1000V，脉冲宽度为10μs，脉冲频率为5Hz，脉冲串个数200个，脉冲电场处理时间5min，细胞培养时间24h；

e、设定脉冲电场处理时间结束后，主控模块1驱动步进电机26，使电极装置11上移，回归原位；

f、设定参数完成后，装置自动停止运行。

实施例2

能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，该装置是一箱体，在箱体侧壁设有加热管18和O₃通入孔25，在其对面侧壁设有降温管19、CO₂通入孔22，箱体后壁装有温度传感器12，CO₂传感器13和O₃传感器14。箱体顶部装有电极装置11及步进电机26、LED灯27，电极装置11为具备多个电极针的阵列式电极。在装置内设有可固定培养皿的载物台28，载物台28上装有位置传感器15，CO₂发生装置20、O₃发生装置23通过管线和CO₂通入孔22、O₃通入孔25分别向培养装置内通入CO₂、O₃，上位机2经主控模块1分别连接温度传感器12、CO₂传感器13、O₃传感器14、位置传感器15、脉冲产生模块4、温度控制模块5、CO₂浓度调节模块6、O₃浓度调节模块7和电极驱动模块8，温度控制模块5通过双路开关16分别连接水泵17、加热管18和降温管19构成，电极驱动模块8分别连接电极装置11、步进电机26和LED灯27构成。

上位机2通过串口线与主控模块1连接。上位机2设置脉冲电场的场强大小、脉冲宽度、脉冲频率、作用时间等参数，经由主控模块1发送命令至脉冲产生模块4产生脉冲电场。主控模块1通过位置传感器15检测电极装置11与载物台28上培养装置间距离，经由主控模块1发送命令驱动步进电机26。脉冲产生模块4通过大功率可调高压直流电源3改变脉冲电场极性、放大脉冲电场传至电极驱动模块8中的电极装置11，同时将所产生的脉冲电场经由脉冲测量单元10反馈至主控模块1并一路传送至上位机2存储并显示。

主控模块1通过信号线与温度控制模块5连接，通过一片DS18B20温度传感器测量箱体内的温度，并与设定值进行比较后，控制开启加热管18或降温管19对箱体内温度进行升温操作或降温操作；主控模块1通过信号线与CO₂浓度调节模块6连接，通过CO₂传感器13，实时的检测箱体内CO₂的浓度，并与设定的CO₂浓度值进行比较，通过控制CO₂浓度调节模块6中的CO₂阀门21的开关实现对箱体内CO₂浓度的控制；主控模块1通过信号线与O₃浓度调节模块7连接，通过O₃传感器14，实时的检测箱体内O₃的浓度，并与设定的O₃浓度值进行比较，通过控制O₃浓度调节模块7中的O₃阀门24的开关实现对箱体内O₃浓度的控制。

细胞培养方法，包括以下顺序和步骤：

a、启动培养装置，通过上位机2发送信号给主控模块1，设定O₃浓度为15ppm，杀菌时间为20分钟，开启O₃浓度调节模块7，对箱体内载物台28、电极装置11及其余空间杀菌，培养装置自动运行，直至设定杀菌时间结束；

b、通过上位机2发送信号给主控模块1，开启温度控制模块5，开启CO₂浓度调节模块6，设定箱体内温度为37℃，设定箱体内CO₂百分浓度为5%，维持细胞培养环境；

c、将细胞培养皿放于培养装置内的载物台28上，通过上位机2操作，选择电极装置11中电极针编号及电极针间距，开启电极驱动模块8，使电极装置11与载物台28间距离达到设定大小；

d、通过上位机2设定当前脉冲电场参数，脉冲电场输出波形选择三角波，输出电压幅值在±3000V，脉冲宽度为0.5μs，脉冲频率为10Hz，脉冲串个数500个，脉冲电场处理时间5min，细胞培养时间12h；

e、设定脉冲电场处理时间结束后，主控模块1驱动步进电机26，使电极装置11上移，回归原位；

f、设定参数完成后，装置自动停止运行。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种能产生可变脉冲电场的细胞培养装置，其特征在于，该装置包括：

一箱体，在所述箱体的一侧侧壁设有加热管和O₃通入孔，

在箱体对应加热管的另一侧壁设有降温管和CO₂通入孔，

在箱体后壁装有温度传感器，CO₂传感器和O₃传感器分别用于检测温度、CO₂气体浓度和O₃气体浓度，

在箱体顶部装有电极装置及步进电机、以及照明用的LED灯，所述电极装置为具备多个电极针的阵列式电极，通过选择不同的电极针实现电极间距的控制，通过所述步进电机调节电极装置的位置；

在箱体内电极装置的下方设有可固定培养皿的载物台，载物台上装有位置传感器用于检测电极装置与载物台之间的距离；

设置有CO₂发生装置以及O₃发生装置分别通过管线与CO₂通入孔和O₃通入孔分别向培养装置内通入CO₂、O₃；

设置控制系统包括一上位机对一主控模块进行参数设置，并通过主控模块接收温度传感器、CO₂传感器、O₃传感器、位置传感器检测的信号，通过主控模块对脉冲、温度、CO₂浓度、O₃浓度和以及电极装置与载物台之间的距离进行控制；

所述控制系统还包括通过主控模块控制的：

脉冲产生模块，与电极装置连接产生脉冲信号；

温度控制模块，驱动加热管与降温管的内水流的循环；

CO₂浓度调节模块，给箱体通入浓度为5％的CO₂并维持培养环境；

O₃浓度调节模块，为装置及进行电场处理前后杀菌消毒；

所述脉冲产生模块包括：PWM脉冲控制单元、电脉冲驱动单元、脉冲测量单元以及大功率可调高压直流电源，其中所述PWM脉冲控制单元产生电脉冲信号，大功率可调高压直流电源包括电源模块、MOSFET开关和电极装置，大功率可调高压直流电源为电极装置提供高压电源，由PWM脉冲控制单元产生的脉冲信号，经电脉冲驱动单元通过控制MOSFET开关的开通与关断在电极装置上产生高压脉冲信号，同时将输出的脉冲电场信号通过脉冲测量单元反馈至主控模块通过上位机存储及显示，所述上位机通过操作控制界面可选择电极装置的电极针编号，调整电场间距；

主控模块通过放置在箱体内内的位置传感器读取电极装置与载物台间距离，在与设定值进行比较后，控制步进电机，使电极装置与载物台距离到达设定值，伸缩至放置于载外物台上的培养皿中，当距离达到设定值时，LED灯点亮，电脉冲驱动单元导通，将电脉冲信号输出至电极装置，完成脉冲电场处理实验。

2.按照权利要求1所述的装置，其特征在于，所述主控模块通过读取放置在箱体体内部温度传感器的温度数据，并与设定温度比较后，通过一双路选择开关，选择温度控制模块的工作状态，当温度低于设定值时，通过外部控制电路会启动加热管对箱体内进行升温操作；当温度高于设定值时，通过外部控制电路会启动水泵，水流通过水泵开关进入降温管，吸收箱体内的热量，对装置内进行降温操作。

3.按照权利要求1所述的装置，其特征在于，主控模块通过放置在箱体内的CO₂传感器读取箱体内的CO₂浓度值，在与设定值进行比较后，通过CO₂浓度调节模块控制CO₂阀门，通过CO₂通入孔使箱体内的CO₂浓度基本维持在恒定值，当箱体内CO₂浓度高于设定值时，关闭CO₂阀门，停止CO₂通入孔对箱体输入CO₂，使得箱体内的CO₂浓度下降；当箱体内CO₂浓度低于设定值时，开启CO₂阀门，通过CO₂通入孔对箱体输入CO₂，使得箱体内的CO₂浓度上升。

4.按照权利要求1所述的装置，其特征在于，主控模块通过放置在箱体内的O₃传感器读取箱体内的O₃浓度值，在与设定值进行比较后，控制O₃阀门，通过O₃通入孔使箱体内的O₃浓度基本维持在恒定值，当箱体内O₃浓度高于设定值时，关闭O₃阀门，停止O₃通入孔对箱体输入O₃，使得箱体内的O₃浓度下降；当箱体内O₃浓度低于设定值时，开启O₃阀门，通过O₃通入孔25对箱体输入O₃，使得箱体内的O₃浓度上升。

5.一种采用权利要求1-4任一一项所述的一种能产生可变脉冲电场的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该方法包括：

通过上位机发送信号给主控模块，设定O₃浓度为15～30ppm，杀菌时间为20～30分钟，开启O₃浓度调节模块，对箱体内载物台、电极装置及其余空间杀菌：通过O₃传感器，实时检测箱体内O₃的浓度，并与设定的O₃浓度值进行比较，通过控制O₃浓度调节模块中的O₃阀门实现对箱体内的O₃浓度控制，使箱体内O₃浓度与设定值间误差不超过1ppm，直至设定杀菌时间结束；

通过上位机发送信号给主控模块，设定箱体内温度为36～37℃，开启温度控制模块，通过温度传感器，实时检测箱体内的温度，并与设定的温度值进行比较，通过温度控制模块的双路开关启动加热管或降温管使箱体温度与设定值误差不超过±0.5℃，维持细胞培养环境；

通过上位机发送信号给主控模块，设定箱体内CO₂百分浓度为5％，开启CO₂浓度调节模块，通过CO₂传感器，实时检测箱体内CO₂的浓度，并与设定的CO₂浓度值进行比较，通过控制CO₂浓度调节模块中的CO₂阀门实现对箱体内的CO₂浓度控制，使箱体内CO₂浓度与设定值间误差不超过0.5％，维持细胞培养环境；

将细胞培养皿放于载物台上，通过上位机操作，选择电极装置中电极针编号及电极针间距，开启电极驱动模块，通过位置传感器，实时检测电极装置与载物台间距离，并与设定值进行比较，通过控制步进电机使电极装置移动，使电极装置与载物台间距离与设定值误差不超过1mm；

通过上位机设定当前脉冲电场参数，脉冲电场输出波形选择方波或三角波，输出电压幅值在±100～±4000V，脉冲宽度为0.1～100μs，脉冲频率为1～10Hz，脉冲串个数10～1000个，脉冲电场处理时间1min～2h，细胞培养时间1h～48h；

设定脉冲电场处理时间结束后，主控模块驱动步进电机，使电极装置上移，回归原位。

Images