JPH11123099A - 非抱合型ビリルビンの測定方法および測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中の非抱合型ビリルビンを、簡単な操作
で精度良くかつ検体中のアルブミンあるいは薬剤含量に
影響されることなく、特異的に分別して定量できる方法
およびそれに使用する試薬の提供。 【解決手段】 検体中の非抱合型ビリルビン量を測定す
るに際し、ビリルビンと錯体を形成し得る金属イオンお
よび界面活性剤の共存下、ビリルビン酸化能を有する酸
化剤を用いて、pＨ６.５以下で検体中の抱合型ビリルビ
ンを予め特異的に酸化消去後、検体中に存在する非抱合
型ビリルビンを測定することを特徴とする非抱合型ビリ
ルビンの測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体液中の非抱合
型ビリルビンの測定方法および測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンはテトラピロール類に属する
黄色色素であり、生体液中では大別して非抱合型ビリル
ビン、抱合型ビリルビンとして存在する。抱合型ビリル
ビンはグルクロン酸などの糖類がビリルビンのプロピオ
ン酸基に１分子または２分子結合したものである。非抱
合型ビリルビンは化学的に修飾を受けていないビリルビ
ンである。

【０００３】ところで、溶血性貧血、溶血性黄疽などの
病態では主に非抱合型ビリルビン量が増大し、また閉塞
性黄疽などの病態では、抱合型ビリルビン量が増大する
ことが知られている。従ってこれら各種のビリルビンの
分別定量は臨床診断などにおいて重要な位置を占めてい
る。

【０００４】各種のビリルビンを分別定量し得るものと
しては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなど
の酸化酵素を利用する方法などが挙げられる。このうち
ジアゾ試薬を用いる方法については、使用するジアゾ化
反応促進剤の種類と、生成するアゾビリルビンの定量方
法の違いにより、種々のものが報告されている。例えば
代表的なものとしては、マロイとエヴェリン(Ｍalloy
＆ Ｅvelyn)らによる試薬〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー(Ｊournal of Ｂiological Ｃh
emistry)第１１９巻,４８１頁(１９３７年)〕などがあ
る。高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する
方法には、逆相ＨＰＬＣカラムを使用し各種ビリルビン
をリン酸緩衝液とイソプロパノールのグラジエントによ
って溶出、分析するラウフ(Ｌauff)らの方法〔ジャーナ
ル オブ クロマトグラフィー(Ｊournal of Ｃhromato
graphy)第２２６巻,第３９１頁(１９８１年)〕などがあ
る。

【０００５】酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作
用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン
自体の持つ４５０nm付近の黄色を消失させ、反応前後の
吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。こ
の場合反応条件を種々変えることにより、各種ビリルビ
ンのみを特異的に若しくは全てのビリルビンを酸化させ
ることができる。この方法に於いて使用される試薬とし
ては、例えばビリルビンオキシダーゼを用いる試薬〔ク
リニカル ケミストリー(Ｃlinical Ｃhemistry)第２０
巻,第７８３頁(１９７４年)〕、ラッカーゼ、チロシナ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用
いる試薬(特開昭５９−１７９９９号公報)、コール酸な
どの陰イオン性界面活性剤や芳香族カルボン酸などを反
応促進剤として使用している総ビリルビン測定用試薬
(特開昭６０−２４９０６０号公報など)、pＨ、緩衝
液、界面活性剤の選定によって抱合型ビリルビンのみに
ビリルビンオキシダーゼが働く条件を設定した抱合型ビ
リルビン測定用試薬が提出されている。この抱合型ビリ
ルビン測定用試薬としては、例えばpＨ９〜１１の範囲
の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させて抱合
型ビリルビンを定量する試薬(特開昭６２−５８９９９
号公報)、陰イオン性界面活性剤を含有するpＨ５〜６の
酸性緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させて抱
合型ビリルビンを定量する試薬(特開昭６０−１５２９
５５号公報)、pＨ３.５〜４.５の緩衝液中でビリルビン
オキシダーゼを作用させて抱合型ビリルビンを定量する
試薬(特公昭６１−４４０００号公報)などがある。以上
に述べた他に、陰イオン性界面活性剤を含有するpＨ８.
０以上のアルカリ性緩衝液中で、検体中のビリルビンと
試薬中のビリルビンオキシダーゼの比をある限定された
範囲に保持することにより、非抱合型ビリルビン(遊離
ビリルビン)を定量する方法(特開昭６０−１５４１６２
号公報)も提出されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ジアゾ試薬を用いる方
法は、ジアゾ化反応の反応促進剤を含有するか否かによ
って総ビリルビンと抱合型ビリルビンを分別測定してい
るが、その分別性は実際上不十分であるという問題点を
有している。特にこの分別性の不十分さは、アルブミン
を含まない検体若しくはサリチル酸などの薬剤を含む検
体について顕著である。またこの方法の問題点として、
抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビンがアゾ化されて
生じた各種のアゾビリルビンは、吸光係数などの分光学
的性質において、それぞれ異なるため、測定値に誤差が
生じるということが挙げられる。さらに現在抱合型ビリ
ルビンの標準物質として使用されている人工基質のジタ
ウロビリルビンと、生体液中に存在する実際の抱合型ビ
リルビンは、反応性およびアゾ化したときの吸光係数等
において、大きく異なるため問題がある。

【０００７】高速液体クロマトグラフィーによって分画
定量する方法は、十分な分別性を有してはいるが、高価
で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこと、及
び多数の検体を処理できないことなどの問題点を有す
る。酸化酵素を利用した試薬による測定方法の大きな問
題点としては、ジアゾ試薬を用いる方法と同様に、現在
適切な標準物質が存在しないことが挙げられる。すなわ
ち標準物質として使用されるジタウロビリルビンもしく
は非抱合型ビリルビンは、実際の生体液中の抱合型ビリ
ルビンとは、分光学的性質(吸光係数、極大吸収波長な
ど)あるいは試薬との反応性において異なるため測定誤
差が生じ、各種ビリルビンの測定値は正確な値を示して
いない。このように一種類の標準物質を用いて、複数種
のビリルビンが含まれる生体液中の各種ビリルビンを分
別測定する場合には、必然的に測定誤差が生じる。また
ジタウロビリルビン、非抱合型ビリルビンなどを複数混
合して標準物質とする場合も生体液に応じてその最適な
混合比率の選択が不可欠であることからその調製がきわ
めて難しい等の問題点を有する。また抱合型ビリルビン
測定用試薬で設定されている分別測定条件は、検体中の
アルブミンなどの蛋白質の存在を前提として設定されて
いるため、不十分であり、新生児の血清あるいはサリチ
ル酸等の薬剤を含む血清などに見られる様な、蛋白質と
遊離した状態のビリルビンの割合が高い検体などを正確
に測定することは困難である。さらに特公昭６１−４４
０００号公報における抱合型ビリルビン測定用試薬のp
Ｈ範囲はビリルビンオキシダーゼにとって安定性、活性
の両方の面できわめて不利な条件であり、測定法として
も不都合な状況を呈している。

【０００８】非抱合型ビリルビン(遊離ビリルビン)を定
量する方法(特開昭６０−１５４１６２号公報)はビリル
ビンオキシダーゼの使用量を検体中の非抱合型ビリルビ
ンに応じて調節しなければならず、未知濃度の試料を測
定するには極めて不適当なものである。またこの方法に
よる試薬は非抱合型ビリルビンのみに作用するとされて
いるが、抱合型ビリルビンにも一部作用するため、臨床
検査に適用するのに十分な分別性を有していない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは現在行われ
ているビリルビン測定において、上記問題点を解決する
ために鋭意検討した結果、β−グルクロニダーゼなどの
脱抱合能を有する酵素を主成分として含む反応試薬をビ
リルビン含有検体に作用させて、抱合型ビリルビンを非
抱合型ビリルビンに精度良く変換でき、その後さらにビ
リルビン酸化能を有する酸化剤を作用させてこの非抱合
型ビリルビンを酸化し、それに伴う吸光度変化量を求め
れば、既知濃度の非抱合型ビリルビンのみを標準物質と
して、検体中の非抱合型ビリルビン、即ち総ビリルビン
を精度良く測定できることを見出した。またさらに、ビ
リルビン酸化能を有する酵素等の酸化剤、ビリルビンと
錯体を形成し得る金属イオン、界面活性剤、pＨ６.５以
下に緩衝能を有する緩衝剤を主成分とする試薬をビリル
ビン含有検体と作用させることにより、抱合型ビリルビ
ンのみを特異的に酸化消去して吸光度を測定した後、p
Ｈ７.０以上にするなどの方法により残存する非抱合型
ビリルビンを酸化し、それに伴う吸光度変化量を求めれ
ば、既知濃度の非抱合型ビリルビンのみを標準物質とし
て、検体中の非抱合型ビリルビンを精度良く測定できる
ことを見出し、本発明を達成するに至った。

【００１０】すなわち第一の発明は、検体中の総ビリル
ビン量を測定するに際し、脱抱合能を有する酵素を含む
試薬によって抱合型ビリルビンを予め脱抱合して非抱合
型ビリルビンとした後、検体中に存在する非抱合型ビリ
ルビンを求めることによって総ビリルビンを測定するこ
とを特徴とする総ビリルビンの測定方法を要旨とするも
のであり、第二の発明は、ビリルビン酸化能を有する酸
化剤若しくはジアゾ試薬と、脱抱合能を有する酵素とを
含有することを特徴とする総ビリルビン測定用試薬を要
旨とするものである。

【００１１】さらに、第三の発明は、検体中の非抱合型
ビリルビン量を測定するに際し、ビリルビンと錯体を形
成し得る金属イオンおよび界面活性剤の共存下、ビリル
ビン酸化能を有する酸化剤を用いて、pＨ６.５以下で検
体中の抱合型ビリルビンを予め特異的に酸化消去後、検
体中に存在する非抱合型ビリルビンを測定することを特
徴とする非抱合型ビリルビンの測定方法を要旨とするも
のであり、第四の発明は、ビリルビン酸化能を有する酸
化剤、ビリルビンと錯体を形成し得る金属イオン、界面
活性剤、pＨ６.５以下の緩衝液を含む第１試薬と、キレ
ート剤、pＨ６.５以上の緩衝液および界面活性剤のうち
から選ばれる１種以上の成分よりなる第２試薬を含有す
ることを特徴とする検体中の非抱合型ビリルビン測定用
試薬を要旨とするものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の総ビリルビン測定用試薬
は、２試薬系で構成される。第１試薬は抱合型ビリルビ
ンを非抱合型ビリルビンに変換するための脱抱合能を有
する酵素を主成分として含み、第２試薬は第１試薬によ
って生成した非抱合型ビリルビンを定量するための酸化
剤を主成分として含む。総ビリルビン測定用試薬の第１
試薬に主成分として使用する脱抱合能を有する酵素とし
ては、例えばグルクロニダーゼ、グルコシダーゼ及びガ
ラクトシダーゼなど種々の糖エステル加水分解酵素ある
いはスルファターゼがあり、これらを単独にもしくは複
数混合して用いることができる。特に検体がヒト生体液
である場合は、グルクロニダーゼ単独の使用が可能であ
る。これら脱抱合能を有する酵素は動物、植物若しくは
微生物のいずれの起源由来のものも使用することができ
るが、例えばグルクロニダーゼとしては、ウシ肝臓、カ
タツムリ若しくは大腸菌由来のもの、グルコシダーゼと
しては酵母若しくはアーモンド由来のもの、ガラクトシ
ダーゼとしては大腸菌由来のもの及びスルファターゼと
してはカタツムリ由来のものなどが使用できる。これら
の脱抱合能を有する酵素は０.０１〜１００ユニット／m
Ｌの濃度範囲で使用できる。さらに好ましくは０.０５
〜５０ユニット／mＬの濃度範囲で使用できる。０.０１
ユニット／mＬ以下だと脱抱合反応が完結するのに長時
間を要するため好ましくなく、又１００ユニット／mＬ
以上だと試薬が高価となり又高蛋白濃度のため反応が遅
くなり、更に酵素溶液中の夾雑物により抱合型ビリルビ
ンが酸化されるなどの影響が出る場合もあり好ましくな
い。

【００１３】総ビリルビン測定用試薬の第２試薬に用い
る酸化剤としては、例えばビリルビンオキシダーゼ及び
ラッカーゼなどの酸化酵素、グルコースオキシダーゼな
どの過酸化水素を生成するオキシダーゼとそれらの基質
およびペルオキシダーゼとの混合物、ビリルビン酸化能
を有する２価の銅イオン及び３価の鉄イオンなどの金属
イオン若しくはその塩、例えば硫酸銅、塩化銅、硫酸第
２鉄など、過硫酸カリウム及び過安息香酸ナトリウムな
どの過酸化物等が挙げられる。第２試薬のジアゾ試薬
は、例えばスルファニル酸と亜硝酸の塩酸溶液、２，４
−ジクロロアニリンとスルファニル酸の混液のいずれか
単独でまたは組合せが挙げられる。これらの酸化剤は、
酵素の場合０.０１〜３０ユニット／mＬ、好ましくは
０.０５〜１０ユニット/mＬ、過酸化物を用いる場合は
０.０１〜５０mＭ、好ましくは０.０５〜３０mＭ、金属
イオンおよびその塩を用いる場合は０.０１〜２０mＭ、
好ましくは、０.０５〜５mＭ、更にジアゾ試薬を用いる
場合は、０.０５〜５mＭ、好ましくは０.１〜２mＭの濃
度範囲で使用できる。これらの成分が上記範囲外の量で
存在すると、非抱合型ビリルビンに対する酸化反応の完
結に長時間を要するか、試薬の劣化が著しくなるか、或
は試薬中に沈澱を生成する可能性があるため好ましくな
い。尚、酸化酵素の給源は限定されるものではなく、種
々の起源のものが使用される。例えばラッカーゼはウル
シ由来あるいはポリポーラス属などの微生物由来、ビリ
ルビンオキシダーゼはミロセシウム属若しくはエピタケ
属由来のものが使用でき、又グルコースオキシダーゼは
アスペルギルス属由来のものなどを使用すれば良い。

【００１４】総ビリルビン測定用試薬の第１試薬及び第
２試薬には、上記の必須成分の他に、反応促進剤として
の芳香族カルボン酸、界面活性剤、緩衝液、キレート
剤、通常使用される賦活剤及び塩類を含むことができ
る。上記芳香族カルボン酸としては例えばp−トルエン
スルフォン酸、安息香酸などがあり、５〜７５mＭ、好
ましくは１０〜５０mＭの濃度範囲で使用できる。この
範囲外の濃度では反応が完結するのに長時間を要する
か、試薬中に沈澱を生じる場合もあるため好ましくな
い。また上記界面活性剤としては陰イオン性界面活性
剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び
両性界面活性剤のいずれも使用できる。例としてはドデ
シル硫酸ナトリウム、コール酸あるいはポリオキシエチ
レングリコール、トリトンＸ−１００、ツイン８０、塩
化ラウリルピリジニウム、塩化ラウリルトリメチルアン
モニウム、Ｎ−ラウリル・ミリスチル−β−アミノプロ
ピオン酸、Ｎ−ラウリル−β−イミノ−ジプロピオン酸
などがある。これらの界面活性剤は通常使用される０.
０１〜１０％、好ましくは０.０５〜２％の濃度範囲で
使用できる。１０％を越えると試薬中に沈澱を生じる可
能性がある他、試薬の流動性が悪くなるため自動分析機
などへ適用できず好ましくない。

【００１５】上記第１試薬の緩衝液としては、使用する
脱抱合能を有する酵素の至適pＨ付近に緩衝能を持つも
のを、上記第２試薬の緩衝液としては、使用する酸化剤
の作用する至適pＨ付近に緩衝能をもつものを使用すれ
ば良い。その様な第１試薬の緩衝液としては、例えば牛
肝臓由来β−グルクロニダーゼを用いた場合、フタル酸
−水酸化ナトリウム緩衝液(pＨ５.０)、コハク酸−水酸
化ナトリウム緩衝液(pＨ５.０)などがある。第２試薬の
緩衝液としては、酸化剤として例えばビリルビンオキシ
ダーゼを用いたときはリン酸緩衝液(pＨ７.０)、ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液(pＨ７.０)などがある。それら緩衝液の濃度
としては２０〜５００mＭ、好ましくは３０〜２００mＭ
使用すれば良い。２０mＭ以下だと試薬に検体を加えた
段階で設定したpＨからずれる可能性が大きく、また５
００mＭ以上であると反応に長時間を要したり、試薬中
に沈澱を生じる場合もあるため好ましくない。キレート
剤としてはエチレンジアミン四酢酸などのポリアミノカ
ルボン酸あるいはクエン酸などのオキシカルボン酸など
を０.０１〜１００mＭ、好ましくは０.０５〜５０mＭを
適宜使用することができる。

【００１６】賦活剤としてはポリエチレングリコール、
アルブミン、糖類などを使用できる。ポリエチレングリ
コールを用いる場合は０.０１〜１０％、好ましくは０.
０５〜２％、アルブミンを用いる場合は０.０１〜５０m
Ｍ、好ましくは０.０５〜１０mＭ、糖類を用いる場合は
１〜１００mＭ、好ましくは５〜５０mＭを適宜使用する
ことができる。更に、塩類としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化アンモニウム、硫酸カリウムなどを１〜５０
０mＭの範囲で、好ましくは５〜１００mＭの範囲で使用
しても良い。

【００１７】さらに本発明の総ビリルビン測定用試薬の
標準物質は、既知濃度の非抱合型ビリルビンを含むもの
である。濃度としては０.１〜８０mｇ／dＬ、好ましく
は０.５〜６０mｇ／dＬである。この非抱合型ビリルビ
ンとしては、通常市販されている非抱合型ビリルビン
(第一化学薬品社製、シグマ社製など)あるいはブタ、ウ
マ、ヒトなどの胆嚢から採取、精製したものを使用でき
る。標準物質としてはこれら非抱合型ビリルビンを単独
にまたはポリエチレングリコール、アルブミン、糖類、
キレート剤、塩類などの安定化剤あるいは賦活剤を適宜
添加して調製できる。添加する場合はポリエチレングリ
コール、アルブミン、糖類などをそれぞれ０.０１〜３
０％、０.０１〜５０mＭ、１〜３００mＭ、キレート剤
としてエチレンジアミン四酢酸などのポリアミノカルボ
ン酸あるいはクエン酸などのオキシカルボン酸などを
０.０１〜１００mＭ、塩類として塩化ナトリウム、塩化
アンモニウム、硫酸カリウムなどを１〜５００mＭの濃
度範囲で使用できる。また市販の高ビリルビンコントロ
ール標準血清を使用することもできるが、その場合非抱
合型ビリルビンのみを含みかつその含量が正確であるこ
とが望ましい。

【００１８】以上の様な第１試薬、第２試薬および標準
物質の存在形態は、溶液状態、凍結状態あるいは乾燥状
態等の何れに限られるものではなく使用時において溶液
状態であればよい。溶液状態、凍結状態、乾燥状態にす
るのは通常良く知られた方法で行なうことができる。

【００１９】次に本発明によってヒト血清中の総ビリル
ビン量を求めるのに好ましい組成例を挙げる。第１試薬
は牛肝臓由来のβ−グルクロニダーゼ０.０５〜１０ユ
ニット／mＬ、p−トルエンスルフォン酸５〜７５mＭ、
ＥＤＴＡ ０.０１〜２０mＭ、pＨ４〜６に調製されたコ
ハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液２０〜５００mＭを含
む。第２試薬はビリルビンオキシダーゼ０.０５〜１０
ユニット／mＬ、p−トルエンスルフォン酸１０〜５０m
Ｍ、ＥＤＴＡ ０.０５〜５０mＭ、pＨ５〜８に調製され
たリン酸緩衝液２０〜５００mＭを含む。検体中の総ビ
リルビンの測定方法としては、脱抱合能を有する酵素を
含む試薬によって、検体中の抱合型ビリルビン全てを非
抱合型ビリルビンに変換した後、ＨＰＬＣによってこれ
を直接測定するか、酸化剤を含む試薬若しくはジアゾ試
薬によってこれをそれぞれ酸化、アゾ化非抱合型ビリル
ビンに変換し、特定吸収波長に於ける吸光度変化量を測
定すればよい。脱抱合能を有する酵素を含む試薬として
は例えば上記の総ビリルビン測定用試薬の第１試薬があ
る。また、酸化剤を含む試薬としては上記総ビリルビン
測定用試薬の第２試薬がある。また本測定方法において
は、抱合型ビリルビンを含む検体中の全てのビリルビン
を非抱合型ビリルビンに変換することで、標準物質とし
て非抱合型ビリルビンのみを使用することが可能であ
る。

【００２０】総ビリルビンの測定方法として具体的に
は、例えば次の様にすれば良い。まず、上記の総ビリル
ビン測定用試薬の第１試薬０.６mＬを分光計のセル室内
にて予備加温後、各種ビリルビンを含む検体(血清など)
適当量を加えて１〜１０分間反応させ、検体中の抱合型
ビリルビンをすべて非抱合型ビリルビンに変換し、４６
０nmにおける吸光度を測定する。次に上記の総ビリルビ
ン測定用試薬の第２試薬０.１５mＬを添加してさらに１
〜１０分間反応させて非抱合型ビリルビンをすべて酸化
させ、４６０nmにおける吸光度を測定し、この値と先に
測定した吸光度の液量補正値とから吸光度変化量(Ａ)を
求める。次に既知濃度の非抱合型ビリルビンを含む標準
物質を同様に測定し吸光度変化量(Ｂ)を求める。検体を
作用させて求めた吸光度変化量と標準物質を作用させて
求めた吸光度変化量とから、下記の数式により検体中の
総ビリルビン含量を求めることができる。

【００２１】

【数１】 尚、予備加温温度、反応温度は２５℃、３０℃、３７℃
などが適当である。また、検体量としては０.００５〜
０.１mＬが好ましい。測定波長は４６０nmに限定される
ものでなく、４００nmから４８０nmの任意の波長を選ぶ
ことができる。また第１試薬、第２試薬、検体の液量は
適宜変化させることができる。なお本発明では検体中に
抱合型ビリルビンのみを含む場合、第２試薬を作用させ
た時の吸光度変化量は、検体中の抱合型ビリルビン量に
対応するとともに総ビリルビン量にも対応する。なお第
２試薬で非抱合型ビリルビンを酸化してその吸光度減少
より定量する代りに、ジアゾ試薬によってアゾ色素を生
成させて定量することも可能である。また第１試薬と検
体を作用させた後、ＨＰＬＣにて抱合型ビリルビンを直
接分析定量することもできる。

【００２２】本発明の非抱合型ビリルビン測定用試薬
は、２試薬系よりなる。第１試薬は検体中の非抱合型ビ
リルビンには作用せず、抱合型ビリルビンのみを酸化剤
によって作用する試薬であり、第２試薬は第１試薬を作
用させた後、残存する非抱合型ビリルビンを測定するた
めの試薬である。

【００２３】非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬
は、pＨ６.５以下の緩衝液、界面活性剤、ビリルビンと
錯体を形成し得る金属イオン、酸化剤などが主成分であ
り、非抱合型ビリルビン測定用試薬の第２試薬は、キレ
ート剤、pＨ６.５以上の緩衝液、界面活性剤のうちから
選ばれる１種以上の成分を主成分とする。上記第１試薬
にはハロゲン化物塩などの塩類を適宜添加してもよい。
また第２試薬には第１試薬の各成分を適宜含ませること
もできる。非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬に
使用される緩衝液は、pＨ６.５以下、好ましくはpＨ２.
０〜６.０までの間に緩衝能を持つものであれば良い
が、その様なものとしてはフタル酸−水酸化ナトリウム
緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、３,３−
ジメチルグルタル酸緩衝液等がある。またこれらの緩衝
液は２０〜２００mＭ、好ましくは、３０〜１００mＭで
使用すれば良い。２０mＭ以下であると検体と混合した
場合、設定pＨからずれる危険性があり、また２００mＭ
以上であると、第２試薬を加えた段階で全体のpＨを中
性付近に戻すことが困難となるため好ましくない。

【００２４】非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬
に用いる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、
非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性
界面活性剤のいずれも使用でき、例えば、ドデシル硫酸
ナトリウム、コール酸あるいはポリオキシエチレングリ
コール、トリトンＸ−１００、ツイン８０、塩化ラウリ
ルピリジニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウ
ム、Ｎ−ラウリル・ミリスチル−β−アミノプロピオン
酸、Ｎ−ラウリル−β−イミノ−ジプロピオン酸などが
挙げられるが、pＨ６.５以下で溶解度が高く、使用の容
易なものであることが好ましい。すなわち、好ましい界
面活性剤は、トリトン Ｘ−１００、ツイン８０などの
非イオン性界面活性剤あるいはラウリルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、
グリココール酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤
であり得る。前記界面活性剤の使用される濃度範囲とし
ては、０.０１〜２.０％、好ましくは０.０３〜０.５％
が適当である。この範囲より低濃度だと臨界ミセル濃度
に達せず非抱合型ビリルビンを保護せず、またこの範囲
より高濃度だと酸化剤による抱合型ビリルビンの消去に
長時間を要するため好ましくない。

【００２５】非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬
に用いるビリルビンと錯体を形成し得る金属イオンとし
ては、例えば銅イオン、鉄イオン若しくはマンガンイオ
ンなどの塩を使用できるが、銅イオンまたは鉄イオンの
塩を使用すれば、低濃度で非抱合型ビリルビンに作用し
ない条件を設定できるためにより好ましい。これらの塩
としては、一般に市販されている塩化物塩、酢酸塩、ア
ンモニウム塩などを使用すれば良い。使用濃度範囲とし
ては０.０１〜１０mＭが適当である。より好ましくは
０.０５〜５mＭが適当である。これらが０.０１〜１０m
Ｍの濃度範囲外だと上記第１試薬中で非抱合型ビリルビ
ンを酸化剤より保護することが出来ないか、又は金属塩
による沈澱が生成する可能性もあるため好ましくない。

【００２６】非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬
に使用する酸化剤としては、例えばビリルビンオキシダ
ーゼ及びラッカーゼなどの酸化酵素、グルコースオキシ
ダーゼなどの過酸化水素を生成するオキシダーゼとそれ
らの基質およびペルオキシダーゼとの混合物、ビリルビ
ン酸化能を有する２価の銅イオン及び３価の鉄イオンな
どの金属イオン若しくはその塩、例えば硫酸銅、塩化
銅、硫酸第２鉄など、過硫酸カリウム及び過安息香酸ナ
トリウムなどの過酸化物等が挙げられる。前記第１試薬
において、酸化剤として、前記酸化酵素を用いる場合は
０.０１〜３０ユニット／mＬ、好ましくは０.０５〜１
０ユニット/mＬ、前記過酸化物を用いる場合は０.０１
〜５０mＭ、好ましくは０.０５〜３０mＭ、前記金属イ
オンもしくはその塩を用いる場合は０.０１〜２０mＭ、
好ましくは、０.０５〜５mＭの濃度範囲であってよい。
これらの成分が上記範囲外の量で存在すると、非抱合型
ビリルビンに対する酸化反応の完結に長時間を要する
か、試薬の劣化が著しくなるか、或は試薬中に沈澱を生
成する可能性があるため好ましくない。尚、酸化酵素の
供給源は限定されるものではなく、種々の起源のものが
使用される。例えばラッカーゼとしてはウルシ由来ある
いはポリポーラス属などの微生物由来のものが、またビ
リルビンオキシダーゼとしてはミロセシウム属若しくは
エピタケ属由来のものが使用できる。あるいは、グルコ
ースオキシダーゼは、アスペルギルス属由来のものなど
が使用できる。特に本発明の第１試薬において、銅イオ
ン自体を酸化剤とする場合は、酸化反応を促進するため
に塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、チオ
シアン酸イオン、シアン酸イオン、シアンイオンなどを
含む塩類を添加することができる。これらの塩類のうち
促進効果が高く、毒性が低いチオシアン酸イオンを含む
塩類の使用が特に望ましい。

【００２７】さらに非抱合型ビリルビン測定用試薬の第
１試薬には、ビリルビンオキシダーゼなどの酸化酵素が
安定性および活性の点で有利となるpＨ４.７〜６.５のp
Ｈ範囲の間で使用可能にするために、塩化ナトリウム、
フッ化ナトリウムなどのハロゲン化物塩を添加すること
ができる。その濃度範囲としては１〜２００mＭ、好ま
しくは５〜５０mＭが適当である。この範囲外だと抱合
型ビリルビンを消去するのに長時間を要するため、好ま
しくない。ハロゲン化物塩のうち特にフッ化物塩を添加
すれば、低濃度でpＨ４.７〜６.５の間で第１試薬の組
成を設定できるためフッ化物塩の添加が好ましい。

【００２８】非抱合型ビリルビン測定用試薬の第２試薬
中に用いるキレート剤としてはエチレンジアミン四酢酸
などのポリアミノカルボン酸あるいはクエン酸などのオ
キシカルボン酸を０.０５〜１００mＭ好ましくは０.０
５〜５０mＭを適宜使用することができる。使用量が上
記範囲外だと第２試薬添加後の反応が不十分となり好ま
しくない。

【００２９】また非抱合型ビリルビン測定用試薬の第２
試薬中に用いるpＨ６.５以上の緩衝液としては、リン酸
緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液など種々のものを使用することができる。これ
らの緩衝液は２０〜１,０００ｍＭ、より好ましくは５
０〜５００ｍＭの範囲で使用することができる。使用量
が上記範囲外だと第２試薬添加後の反応が不十分となり
好ましくない。非抱合型ビリルビン測定用試薬の第２試
薬中に用いる界面活性剤としては、上記第１試薬に使用
できる界面活性剤がいずれも使用できる。これらの界面
活性剤は、通常、０.０１〜１０％、好ましくは０.０５
〜２％の濃度範囲で使用できる。使用量が上記範囲外だ
と第２試薬添加後の反応が不十分となり好ましくない。

【００３０】さらに非抱合型測定用試薬の第１試薬およ
び第２試薬は、上記以外の成分として、反応促進剤とし
ての芳香族カルボン酸、賦活剤としてのマニトールなど
の糖類、ポリエチレングリコールなどのポリオール類を
含有してよい。これらは、０.０１〜３００mＭ、好まし
くは０.０５〜１００mＭの濃度範囲で用いることができ
る。この範囲外の使用は、反応が遅くなるなどの問題が
生じるため好ましくない。

【００３１】また本発明の非抱合型ビリルビン測定用試
薬に用いる標準物質は、既知濃度の非抱合型ビリルビン
を含むものである。濃度としては０.１〜８０mｇ／ｄ
Ｌ、好ましくは０.５〜６０mｇ／ｄＬである。この非抱
合型ビリルビンとしては、通常市販されている非抱合型
ビリルビン(第一化学薬品社製、シグマ社製など)あるい
はブタ、ウマ、ヒトなどの胆嚢から採取、精製したもの
を使用できる。標準物質としては、これら非抱合型ビリ
ルビンを単独で、またはポリエチレングリコール、アル
ブミン、糖類、キレート剤、塩類などの安定化剤あるい
は賦活剤を適宜添加して調製できる。前記のような添加
剤を含む場合は、ポリエチレングリコール、アルブミ
ン、糖類などをそれぞれ０.０１〜３０％、０.０１〜５
０mＭ、１〜３００mＭ、キレート剤としてエチレンジア
ミン四酢酸などのポリアミノカルボン酸あるいはクエン
酸などのオキシカルボン酸などを０.０１〜１００mＭ、
塩類として塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸カ
リウムなどを１〜５００mＭの濃度範囲で使用できる。
また市販の高ビリルビンコントロール標準血清を使用す
ることもできるが、その場合非抱合型ビリルビンのみを
含みかつその含量が正確であることが望ましい。

【００３２】以上の様な第１試薬、第２試薬および標準
物質の存在形態は、溶液状態、凍結状態あるいは乾燥状
態等の何れに限られるものではなく使用時において溶液
状態であればよい。溶液状態、凍結状態、乾燥状態にす
るのは通常良く知られた方法で行なうことができる。

【００３３】次に具体的に上記非抱合型ビリルビン測定
用試薬の好ましい組成例を示す。 第１試薬は、pＨ４.７〜６.０に調製されたフタル酸
緩衝液２０〜５００mＭ、トリトンＸ−１００ ０.０２
５〜１％、硫酸銅０.０１〜１０mＭ、ビリルビンオキシ
ダーゼ０.０５〜２０ユニット／mＬ、フッ化ナトリウム
５〜５０mＭを含む。 第２試薬は、pＨ５.０〜７.０に調製されたリン酸緩
衝液、ＥＤＴＡ０.１〜５０mＭを含む。第２試薬にはビ
リルビンオキシダーゼ０.１〜５０ユニット／mＬを含ま
せても良い。

【００３４】検体中の非抱合型ビリルビンの測定方法と
しては、検体にビリルビン酸化能を有する酸化剤、ビリ
ルビンと錯体を形成し得る金属イオン、非イオン性界面
活性剤、pＨ６.５以下の緩衝液を含む試薬を作用させ
て、検体中の抱合型ビリルビンのみを酸化消去し、その
後残存する非抱合型ビリルビンを酸化剤を含む試薬、若
しくはジアゾ試薬によって消去して特定波長の吸光度変
化を測定するか、あるいは残存する非抱合型ビリルビン
を直接ＨＰＬＣなどによって測定すれば良い。抱合型ビ
リルビンを酸化消去する試薬としては、例えば、上記の
本発明の非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬など
がある。また非抱合型ビリルビンに作用する酸化剤を含
む試薬としては上記第２試薬などがある。また本測定方
法においては、標準物質として、非抱合型ビリルビンの
みを使用することが可能である。

【００３５】非抱合型ビリルビンを測定する具体的な方
法としては、例えば次の様にすればよい。まず、上記の
非抱合型ビリルビン測定用試薬の第１試薬０.６mＬを分
光計のセル室内にて予備加温後、各種ビリルビンを含む
検体（血清など）適当量を加えて１〜１０分間反応さ
せ、検体中の抱合型ビリルビンをすべて酸化消去し４６
０nmにおける吸光度を測定する。次に上記の非抱合型ビ
リルビン測定用試薬の第２試薬０.１５mＬを添加してさ
らに１〜１０分間反応させ、残存する非抱合型ビリルビ
ンをすべて酸化させた後、４６０nmにおける吸光度を測
定し、この値と先に測定した吸光度の液量補正値とから
吸光度変化量(Ａ)を求める。次に既知濃度の非抱合型ビ
リルビンを含む標準物質を同様に測定し吸光度変化量
(Ｂ)を求める。検体を作用させて求めた吸光度変化量
（Ａ）と標準物質を作用させて求めた吸光度変化量
（Ｂ）とから、下記数式により検体中の非抱合型ビリル
ビン含量を求めることができる。

【００３６】

【数２】

【００３７】尚、予備加温温度、反応温度は２５℃、３
０℃、３７℃などが適当である。また、検体量としては
０.００５〜０.１mＬが好ましい。測定波長は４６０nm
に限定されるものでなく、４００nmから４８０nmの任意
の波長を選ぶことができる。また第１試薬、第２試薬、
検体の液量は適宜変化させることができる。

【００３８】なお第２試薬で非抱合型ビリルビンを酸化
してその吸光度減少により定量する代わりに、ジアゾ試
薬によってアゾ色素を生成させて定量することも可能で
ある。ジアゾ試薬としては、当該分野において常用され
るものであってよく、例えば、スルファニル酸と亜硝酸
の塩酸溶液、２，４−ジクロロアニリンとスルファニル
酸の混液から選ばれるいずれか１種、またはそれらの組
合せを使用することができる。また、第１試薬と検体を
作用させた後、ＨＰＬＣを用いて非抱合型ビリルビンを
分析定量することもできる。

【００３９】さらに検体中に非抱合型ビリルビンと抱合
型ビリルビンが混在する場合、本発明の非抱合型ビリル
ビン測定用試薬もしくは方法によって、検体中の非抱合
型ビリルビン量を求め、さらに、総ビリルビン測定用試
薬もしくはそれを用いた方法によって、同一検体中の総
ビリルビン量を求めた後、前記総ビリルビン量から非抱
合型ビリルビン量を差し引くことにより、抱合型ビリル
ビン量を容易に求めることができる。本発明の試薬は、
検体中に実際に存在する非抱合型ビリルビンを共通の標
準物質として使用しているため、本発明によって求めた
非抱合型ビリルビン量は、極めて正確な値となる。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を用いて本発明を説明するが、
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。参考例１ 抱合型ビリルビンの一種であるグルクロナイドビリルビ
ンは、分析化学第３１巻、Ｅ６３頁(１９８２年)記載の
方法に準じて豚胆嚢中の胆汁から精製した。またこのグ
ルクロナイドビリルビン及び非抱合型ビリルビンはラウ
フ(Ｌauff)らの方法「ジャーナル オブ クロマトグラフ
ィー(Ｊournal of Ｃhromatography)第２２６巻,３９１
頁(１９８１年)」を若干改良したＨＰＬＣ法にて分析し
た。即ち、リクロソルブＲＰ−８（粒子径１０μm）カ
ラムを用いて５％のメチルセルソルブを含有するリン酸
緩衝液（pH２.０)とアセトニトリルのグラジエント溶出
を行い試料を分析した。

【００４１】参考例２ 総ビリルビン測定用試薬は次の様に調製した。第１試薬
は、牛肝臓由来の脱抱合酵素であるβ−グルクロニダー
ゼ(シグマ社製,Ｇ０２５１)０.２ユニット／mＬ、p−ト
ルエンスルフォン酸３０mＭ、ＥＤＴＡ１mＭ、トリトン
Ｘ−１００ ０.０３％及びフタル酸緩衝液(pＨ５.０)１
００mＭとなる様に、第２試薬は、酸化酵素のビリルビ
ンオキシダーゼ(シグマ社,Ｂ１５１５)４ユニット／m
Ｌ、p−トルエンスルフォン酸３０mＭ、ＥＤＴＡ１m
Ｍ、トリトンＸ−１００ ０.０３％及びリン酸緩衝液２
００mＭとなる様に、また第２試薬のpHが１０.０となる
様に調製した。第１試薬１mＬを３７℃にて２分間予備
加温し、参考例１で精製したグルクロナイドビリルビン
０.０５mＬを加え３分間同温で反応させた。さらに第２
試薬０.２５mＬを加え３７℃にて３分間反応させた。第
１試薬で反応させた後の反応混液(a)、さらに引続き第
２試薬で反応させた後の反応混液(b)中の各種ビリルビ
ンをＨＰＬＣにて分画し分析した。それぞれの結果を図
１に示す。また第１試薬からβ−グルクロニダーゼのみ
を除いて、グルクロナイドビリルビンサンプルと反応さ
せた反応混液(c)を同様にＨＰＬＣにて分析した。その
結果を図１に示す。図中の約１１分に溶出するピークは
グルクロナイドビリルビンであり、約１８分に溶出する
ピークは非抱合型ビリルビンである。第１図中(c)は脱
抱合酵素のβ−グルクロニダーゼによって変換される前
のサンプルの状態を示す。図１中、(a)と(c)を比べるこ
とで、第１試薬によってグルクロナイドビリルビンが非
抱合型ビリルビンに完全に変換されたことが明らかであ
り、図１中、(b)と(a)を比べることで、さらに第２試薬
によって非抱合型ビリルビンが酸化消去されたことが明
らかである。

【００４２】参考例３ 参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンの各種濃
度の希釈溶液を作成し、参考例２で調製した総ビリルビ
ン測定用試薬を用いてグルクロナイドビリルビン含量と
吸光度変化量の関係を求めた。第１試薬１mＬを分光計
セル室内で３７℃にて２分間予備加温した後、各種濃度
のグルクロナイドビリルビン溶液を０.０５mＬ加え、３
７℃で３分間反応させ吸光度を４６０nmにて測定した。
その後第２試薬０.２５mＬを加え３７℃にて５分間反応
させ吸光度を４６０nmにて測定した。第１試薬、第２試
薬をそれぞれ反応させた後の、液量補正した吸光度変化
量と希釈率の関係を求めた。その結果広い範囲にわたっ
て希釈率と吸光度変化量の間に良好な直線関係が成立つ
ことが分かった。

【００４３】参考例４ 参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンにヒトア
ルブミン(シグマ社製,Ａ３７８２)、サリチル酸、ＥＤ
ＴＡ及びヘモグロビンを下記表１の濃度になる様に加
え、参考例２の総ビリルビン測定用試薬を用いて参考例
３と同様の方法で定量し、各添加物による測定値への影
響について調べた。その結果を表１に示す。標準物質と
して非抱合型ビリルビン(第一化学薬品社製)をトリス−
塩酸(pＨ８.０)１００mＭ中に溶解して５mg/dＬとした
溶液を用いた。

【表１】 表１より本発明の試薬によって求めた総ビリルビン定量
値は種々の添加物によって全く影響を受けず、従来の試
薬で問題となっていた薬物などの影響に関する問題点を
解決できることを確認した。

【００４４】実施例１および２並びに比較例１〜３ 非抱合型ビリルビン(第一化学薬品社製)及び抱合型ビリ
ルビンの一種であるジタウロビリルビン〔ポルフィリン
プロダクツ インク(Ｐorphirin Ｐroducts Ｉnc.)より
市販〕を各々トリス−塩酸(pＨ８.０)１００mＭにて溶
解し、それぞれ５９mｇ／dＬ、８０mｇ／dＬの溶液を調
製した。またヒトアルブミンをトリス−塩酸(pＨ７.０)
１００mＭにて溶解し、６７.０ｇ／Ｌの溶液を調製し
た。これら非抱合型ビリルビン溶液、ジタウロビリルビ
ン溶液及びヒトアルブミン溶液を用いて次の６種のサン
プルを調製した。サンプルａは非抱合型ビリルビンのみ
を、サンプルｂはジタウロビリルビンのみを、サンプル
ｃは非抱合型ビリルビンとジタウロビリルビンを、サン
プルｄは非抱合型ビリルビンとアルブミンを、サンプル
ｅはジタウロビリルビンとアルブミンを、及びサンプル
ｆは非抱合型ビリルビンとジタウロビリルビンとアルブ
ミンとを含む。各サンプル中のジタウロビリルビンの濃
度は２０mｇ／dＬ、非抱合型ビリルビンの濃度は２０m
ｇ／dＬ、ヒトアルブミン濃度は２６.８ｇ／Ｌである。

【００４５】次にフタル酸緩衝液(pＨ５.０)６０mＭ、
ビリルビンオキシダーゼ(シグマ社Ｂ１５１５)１ユニッ
ト／mＬ、硫酸銅０.１mＭ、トリトンＸ−１００(液体シ
ンチレーション用,半井化学社製)０.０３％、p-トルエ
ンスルホン酸ナトリウム５mＭ、フッ化ナトリウム１５m
Ｍとなる様に反応試薬Ａを調製した(実施例１)。さらに
比較例として反応試薬Ａから硫酸銅を除いた反応試薬Ｂ
を調製した(比較例１)。さらに比較例として反応試薬Ａ
からトリトンＸ−１００を除いた反応試薬Ｃを調製した
(比較例２)。また反応試薬Ａのビリルビンオキシダーゼ
の代りにグルコースオキシダーゼ(東洋紡社製)０.５ユ
ニット／mＬ、ペルオキシダーゼ(東洋紡社製)０.１ユニ
ット／mＬ、グルコース１０mＭとなる様に加えた反応試
薬Ｄを調製した(実施例２)。更に特公昭６１−４４００
０号公報記載の実施例に従い次の抱合型ビリルビン測定
用試薬を調製した。即ち、クエン酸−リン酸緩衝液（p
Ｈ４.０)１００mＭ、ビリルビンオキシダーゼ０.１ユニ
ット／mＬを含む反応試薬Ｅを調製した(比較例３)。各
種反応試薬１.０mＬを３７℃でそれぞれ２分間予備加温
した後、６種のサンプルをそれぞれ０.０５mＬ添加し３
７℃で反応させ、反応開始後５分間の４６０nmに於ける
吸光度変化量を求めた。各反応試薬に各サンプルを添加
した時の吸光度変化量を表２に示す。

【００４６】

【表２】 表２より反応試薬Ａ、Ｄはジタウロビリルビンを含むサ
ンプルのみ反応し吸光度変化を生じるが、非抱合型ビリ
ルビンに対しては反応せず吸光度変化を生じないことが
分かった。反応試薬Ｂ、Ｃ、Ｅは非抱合型ビリルビン、
ジタウロビリルビンのいずれにも反応することが分かっ
た。更に、反応試薬Ａ、Ｄは分別性において反応試薬Ｅ
よりも優れており、測定誤差を顕著に改善することがで
きた。これらのことから本発明により正確に各種ビリル
ビンを分別できることが判明した。

【００４７】実施例３ 非抱合型ビリルビン測定用試薬を次の様に調製した。第
１試薬は硫酸銅０.１mＭ、トリトンＸ−１００ ０.０
３％、p−トルエンスルフォン酸５mＭ、フタル酸(pＨ
５.０)６０mＭ、フッ化ナトリウム１５mＭ及びビリルビ
ンオキシダーゼ１ユニット／mＬとなる様調製した。第
２試薬はトリトンＸ−１００ ０.０３％、p−トルエン
スルフォン酸２０mＭ、ＥＤＴＡ６mＭ、リン酸緩衝液２
００mＭ及びビリルビンオキシダーゼ１０ユニット／mＬ
となる様に、また第２試薬のpＨが１０.０となる様に調
製した。又、標準サンプルとして非抱合型ビリルビン２
０mｇ／dＬ、ジタウロビリルビン１０mｇ／dＬ、ヒトア
ルブミン２６.８ｇ／Ｌの混液を調製し、更にその希釈
系列を調製した。次に第１試薬１.０mＬを３７℃にて２
分間予備加温後、各種濃度の標準サンプル０.０５mＬを
加え３分間３７℃で反応後、４６０nmにおける各吸光度
を測定した。さらに第２試薬０.２５mＬを加え、３７℃
にて５分間反応させ４６０nmにおける各吸光度を測定し
た。第１試薬による反応後の吸光度と第２試薬による反
応後の吸光度から、液量補正して各吸光度変化量を求め
た。この吸光度変化量と非抱合型ビリルビン量との関係
を図２に示す。図２より標準サンプル中の非抱合型ビリ
ルビン量と、本実施例によって調製したビリルビン測定
用試薬によって測定した吸光度変化量の間には極めて良
好な直線関係が成立つことが分かった。

【００４８】実施例４ 参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンに非抱合
型ビリルビンを添加したサンプルを調製した。このサン
プルを実施例３で調製した非抱合型ビリルビン測定用試
薬を用いて測定した。第１試薬とサンプルを反応させた
後の反応混液(a)、第１試薬とサンプルを反応させた後
さらに第２試薬を添加し反応させた後の反応混液(b)、
第１試薬よりビリルビンオキシダーゼおよび硫酸銅を除
いた試薬とサンプルを反応させた後の反応混液(c)を参
考例１に記載のＨＰＬＣ分析法によって分析した。その
結果を図３にそれぞれ示す。ここで、図３中の実線は反
応混液(a)の分析パターンを、太破線は反応混液(b)の分
析パターンを、細破線は反応混液(c)の分析パターンを
示す。図３中の約１１分に溶出するピークはグルクロナ
イドビリルビンであり、約１８分に溶出するピークは非
抱合型ビリルビンである。図３より、本発明の非抱合型
ビリルビン測定用試薬の第１試薬は抱合型ビリルビンの
みを酸化消去できることが分かり、さらに第２試薬添加
により、第１試薬と反応させた後に残存する非抱合型ビ
リルビンを定量的に測定できることが分かった。

【００４９】実施例５ 実施例１および２で使用した非抱合型ビリルビン溶液５
９mｇ／dＬ、ジタウロビリルビン溶液８０mｇ／dＬ、ヒ
トアルブミン溶液６７g/Ｌを用いて非抱合型ビリルビン
１０mｇ／dＬ、ジタウロビリルビン１０mｇ／dＬ、ヒト
アルブミン２６.８ｇ／Ｌとなる標準物質Ａを調製し
た。また参考例１のグルクロナイドビリルビンサンプル
１mＬに非抱合型ビリルビン１０mｇ／dＬを１mＬ混合し
たサンプルＡを調製した。次に総ビリルビン測定用試薬
を以下の手順で調製した。総ビリルビン測定用試薬は次
の２試薬系から成る。第１試薬は、牛肝臓由来の脱抱合
酵素であるβ−グルクロニダーゼ(シグマ社製,Ｇ０２５
１)０.２ユニット／mＬ、p−トルエンスルフォン酸３０
mＭ、ＥＤＴＡ１mＭ、トリトンＸ−１００ ０.０３％及
びフタル酸緩衝液(pＨ５.０)１００mＭとなる様に調製
した。また、第２試薬は、酸化酵素のビリルビンオキシ
ダーゼ(シグマ社,Ｂ１５１５)４ユニット／mＬ、p−ト
ルエンスルフォン酸３０mＭ、ＥＤＴＡ１mＭ、トリトン
Ｘ−１００ ０.０３％及びリン酸緩衝液２００mＭとな
る様に、また第２試薬のpHが１０.０となる様に調製し
た。得られた総ビリルビン測定用試薬（第１および第２
試薬）を用いて標準物質Ａを反応させ、吸光度変化量を
求めた。次にサンプルＡを同様に作用させ、吸光度変化
量を求めた。これら２つの吸光度変化量よりサンプルＡ
中の抱合型ビリルビン量を求めた。その結果を表３に示
す。

【００５０】比較例４ 参考例１のＨＬＰＣ分析法により、サンプルＡおよび標
準物質Ａを分析した。各種ビリルビンのピーク面積を指
標として次の様にサンプルＡ中の総ビリルビン量、抱合
型ビリルビン量、非抱合型ビリルビン量を求めた。すな
わちサンプルＡの非抱合型ビリルビンのピーク面積と標
準物質Ａの非抱合型ビリルビンのピーク面積の比からサ
ンプルＡ中の非抱合型ビリルビン量を求め、サンプルＡ
のグルクロナイドビリルビンのピーク面積と標準物質Ａ
のジタウロビリルビンのピーク面積の比よりサンプルＡ
中の抱合型ビリルビン量を求めた。その結果を表３に示
す。

【００５１】

【表３】 なお比較例４の総ビリルビン、抱合型ビリルビン量は、
計算により非抱合型ビリルビン量に換算した(グルクロ
ナイドビリルビンはすべてジグルクロナイドビリルビン
として扱い、ジタウロビリルビンの分子量と非抱合型ビ
リルビンの分子量より計算した)。表３より、本発明に
よる非抱合型ビリルビン測定用試薬で求めた値は、ＨＬ
ＰＣ分析で求めた値とほぼ同じ値であることが判った。
これより本発明による試薬が分別性において極めて優れ
た性能を有していることが判った。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、簡単な操作で精度良く、
検体中のアルブミンあるいは薬剤含量に影響されること
なく、検体中の各種ビリルビンを特異的に分別して定量
できるようになった。これは安定で入手の容易な非抱合
型ビリルビンのみを標準物質として使用することで人工
基質の使用時に生じていた測定誤差、人工基質と血清中
のグルクロナイドビリルビンとの反応性の違い、あるい
は真に相応しい標準物質が存在しない等のビリルビン測
定における問題点を解決し、各種ビリルビンから抱合型
ビリルビンを特異的に酸化消去することで、抱合型ビリ
ルビンのみを測定することができ、測定値として極めて
正確な値を得ることができた。また、酵素を酸化剤とし
て有利な条件で使用できるという面でも、ビリルビン測
定用試薬の性能を向上させ、臨床検査の分野において従
来にはなかった有利な試薬を提供できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例２で調製した総ビリルビン測定用試薬を
参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンに作用さ
せた時のＨＰＬＣ分析パターンを示す。

【図２】実施例３で調製した非抱合型ビリルビン測定用
試薬を用いて、各種濃度の標準血清を測定した時の吸光
度変化量と非抱合型ビリルビン量の関係を示すグラフで
ある。

【図３】実施例４で調製した非抱合型ビリルビン測定用
試薬を用いて、参考例１で精製したグルクロナイドビリ
ルビンと非抱合型ビリルビンを含むサンプルに作用させ
た時のＨＰＬＣ分析パターンを示す。

フロントページの続き (72)発明者 鈴木 裕史 千葉県八千代市大和田新田1144 株式会社 ヤトロン八千代工場内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の非抱合型ビリルビン量を測定す
   るに際し、ビリルビンと錯体を形成し得る金属イオンお
   よび界面活性剤の共存下、ビリルビン酸化能を有する酸
   化剤を用いて、pＨ６.５以下で検体中の抱合型ビリルビ
   ンを予め特異的に酸化消去後、検体中に存在する非抱合
   型ビリルビンを測定することを特徴とする非抱合型ビリ
   ルビンの測定方法。
2. 【請求項２】 ビリルビン酸化能を有する酸化剤、ビリ
   ルビンと錯体を形成し得る金属イオン、界面活性剤およ
   びpＨ６.５以下の緩衝液を含む第１試薬と、キレート
   剤、pＨ６.５以上の緩衝液および界面活性剤のうちから
   選ばれる１種以上の成分よりなる第２試薬を含有すると
   からなることを特徴とする検体中の非抱合型ビリルビン
   測定用試薬。