JPH1112194A - 組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの溶解性及び安定
性を大幅に増大させたｔ- ＰＡ医薬品製剤を提供する。 【解決手段】ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ含有溶媒系
に、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含有させる。ま
た、必要に応じて、クエン酸緩衝液を併用する。ｔ- Ｐ
Ａ含有医薬組成物は、例えば、凍結乾燥製剤の形態であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（以下、ｔ- ＰＡとも称する）含有医
薬組成物に関する。より詳細には、ｔ- ＰＡ又はその改
変型組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、改変型ｔ
- ＰＡとも称する）及びニコチン酸アミド又はその誘導
体を配合したことを特徴とする、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ
- ＰＡ含有医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ｔ- Ｐ
Ａは、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、該プ
ラスミンが血栓の蛋白質基質の主成分であるフィブリン
を溶解する。心筋梗塞や、脳梗塞の原因となる血栓症に
対する血栓溶解療法において、より血栓選択的な血栓溶
解剤としてｔ- ＰＡ製剤が開発された。また、天然型ｔ
- ＰＡに比較してフィブリン親和性及び血中半減期を高
める目的で、種々の改変型ｔ- ＰＡが遺伝子工学的に製
造されてきた。その際、原核生物からの改変型ｔ- ＰＡ
は、天然型ｔ- ＰＡとは対照的に非グリコシル型で生産
される。一般的にｔ- ＰＡは水に極めて難溶性の蛋白質
であるが、とりわけ当該改変型ｔ- ＰＡは、前述のフィ
ブリン親和性の増加、血中半減期の延長等種々の長所を
有するものの、水に対して、天然型ｔ- ＰＡよりも難溶
であり、調製時の困難性は、言うに及ばず、水に溶解し
て投与する注射剤等としての製剤化を極めて困難なもの
にしている。

【０００３】ところで、最近の急性心筋梗塞の治療で基
本になっている考えは、冠動脈の閉塞が生じた場合、可
及的速やかに血流を回復し、心臓の受ける障害を最小限
に抑えることである。この考えに沿えば、高濃度且つ短
時間で安全に投与できる薬剤が好ましい。従って、種々
の長所を有する改変型ｔ- ＰＡの適用において早期の冠
動脈再開通及び梗塞領域の拡大防止を期待する場合に
は、ｔ- ＰＡ高濃度製剤の単回急速投与が好適である。
そのため、ｔ- ＰＡ、特に非グリコシル化ｔ- ＰＡは前
述のごとく水に対して難溶性且つ蛋白構造的に不安定で
あるにも拘らず、臨床的使用においては水溶性の高めら
れたより高濃度且つ蛋白構造的に安定なｔ- ＰＡ製剤の
開発が望まれている。また、ｔ- ＰＡは一般に熱に不安
定であり、改変型ｔ- ＰＡもまた例外ではない。このよ
うな物質を医薬品として開発するためには安定化の技術
が不可欠である。

【０００４】ｔ- ＰＡを可溶化させるための従来の技術
としては、アルギニン塩酸塩又はその塩を添加し、中性
〜弱アルカリ性においてｔ- ＰＡを溶解安定化する技術
が公知である（特公平6-72105 号及び特公平6-99324 号
公報）。しかしながら、この技術の欠点は、中性〜弱ア
ルカリ性条件下では、高濃度ｔ- ＰＡの蛋白構造的な安
定性が低下することにある。更に、溶解性においても非
グリコシル化ｔ- ＰＡ及び改変型非グリコシル化ｔ- Ｐ
Ａにおいては、その溶解特性が天然型ｔ- ＰＡと異な
り、自己会合したｔ- ＰＡを当該方法により再溶解させ
ることは困難であった。また、溶液の液性をｐＨ２〜５
に調整して、ｔ- ＰＡを可溶化する方法が知られている
（特公昭63-38327号及び特公平3-69332 号公報）が、凍
結乾燥状態及び溶液状態において速やかに分解し、失活
するため、製剤化にはなお克服すべき問題を伴ってい
た。

【０００５】一方で、ｔ- ＰＡを安定化させるための従
来の技術として、アルブミンを添加する方法（特公平3-
29390 号公報）、アルブミン分解物を添加する方法（特
開平1-221325号公報）及び酸処理ゼラチンを添加する方
法（特公平5-27607 号公報）が知られている。しかしな
がら、これらの方法では、高濃度ｔ- ＰＡにおける効果
が不充分であり、特にアルブミン添加によりクエン酸緩
衝液中のｔ- ＰＡの溶解性が低下することが確認されて
いる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本願発明の課題は、溶
解性及び安定性の低いｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ
組成物の溶解性を増加させる方法を提供すること、並び
に該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを臨床使用に適し
た濃度の溶液で含有し且つ製剤学的に充分に安定化され
たｔ- ＰＡ医薬品製剤を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記課
題を解決すべく鋭意検討した結果、先ずｔ- ＰＡ及び改
変型ｔ- ＰＡの溶解性について、驚くべきことに、ニコ
チン酸アミド又はその誘導体を含有する製剤組成におい
て著しく溶解度が向上することを見出した。一方、凍結
乾燥状態及び液状においても、ニコチン酸アミドを含有
する製剤によってｔ- ＰＡの安定性が大幅に向上するこ
とを発見し、これら知見に基づき、ｔ-ＰＡもしくは改
変型ｔ- ＰＡの溶解性を増加させるための新規な溶解方
法、及び該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡと、ニコチ
ン酸アミドもしくはその誘導体とを含有するｔ- ＰＡ組
成物を提供する本願発明を完成させるに至った。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、詳細に説
明する。本願発明で使用されるｔ- ＰＡとしては、ヒト
由来の天然型ｔ- ＰＡだけでなく、遺伝子工学的手法に
より得られたグリコシル化、非グリコシル化ｔ- ＰＡ等
各種のｔ- ＰＡを使用することができる。本願発明で使
用される改変型ｔ- ＰＡは、ｔ- ＰＡをポイントミュー
テーション法などにより改良し、あるいはｔ- ＰＡの有
する生物学的活性等を高めるために改変されたｔ- ＰＡ
であり、本願発明の溶解性増加効果及び安定化効果を達
成するものであればいずれの改変型ｔ- ＰＡであっても
よい。例えば、このような改変型ｔ- ＰＡとしては、特
開昭61-243024 号、特開昭62-24 号、特開昭63-133988
号、特表昭63-501335 号、特表平2-504102号及び特表平
3-500843号等公報に示された改変型ｔ- ＰＡ等が好適に
挙げられる。

【０００９】具体的には、本願発明で使用される改変型
ｔ- ＰＡとしては、例えば、以下の改変ｔ- ＰＡを挙げ
ることができる。 （1) ｔ- ＰＡの２４５位のＶａｌがＭｅｔに置換され
た変異ｔ- ＰＡ、（2) ｔ- ＰＡの８４位のＣｙｓがＳ
ｅｒに置換された変異ｔ- ＰＡ、（3) ｔ- ＰＡのＦ領
域及びＧ領域の一部が欠失し、１１７位のＡｓｎがＧｌ
ｕに置換された変異ｔ- ＰＡ、（4) ｔ- ＰＡのＫ１領
域が欠落し、２７５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された変
異ｔ- ＰＡ、及び（5) ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及び
Ｋ１領域が欠落した変異ｔ- ＰＡ。ｔ- ＰＡ又は改変型
ｔ- ＰＡは、本願発明の医薬組成物の重量に基づいて、
例えば、0.005 〜１重量％、好ましくは、0.01〜0.5 重
量％、特に好ましくは、0.1 〜0.2 重量％の量で配合す
ることが適当である。

【００１０】なお、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの安全
性については、これまでの臨床的な使用実績により問題
はない。本願発明で使用されるニコチン酸アミドは、水
溶性ビタミンＢ₂ 複合体の一因子であって、一般成人一
日当り１０〜２０ｍｇ以上の摂取が必要とされている。
ニコチン酸アミドは、日本薬局方に収載されており、臨
床的にはニコチン酸欠乏症の予防及び治療に用いられ
る。ニコチン酸アミドの毒性に関しては、致死量はマウ
スに対して２〜３ｇ／ｋｇ、ヒトには１日５００ｍｇを
連日非経口投与しても毒性は認められず、大量投与する
ことができることが報告されている。ｔ- ＰＡそのもの
の安全性はこれまでの臨床的な使用実績により問題はな
く、従って、ニコチン酸アミドを含有した該製剤組成は
極めて安全性の高いｔ- ＰＡ製剤であると考えられる。
また、これまで知られているニコチン酸アミドの薬理作
用は殆どはニコチン酸と同等であるが、ニコチン酸のよ
うに血管透過性を亢進させることはない。従って、これ
まで知られているニコチン酸アミドの薬理作用において
は、ニコチン酸アミドの血液系に及ぼす影響は殆どな
く、ｔ- ＰＡの薬理作用に対して相互作用を及ぼすこと
のない理想的な医薬品添加剤であると考えられる。

【００１１】本願発明に用いられるニコチン酸アミド
は、その誘導体であってもよく、例えばＮ- メチルニコ
チン酸アミドや、Ｎ, Ｎ−ジエチルニコチン酸アミド等
のN-アルキル置換ニコチン酸アミド（例えば、置換アル
キル基は、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の直
鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができる）
や、１- メチルニコチン酸アミド等の環置換アルキル基
を有するニコチン酸アミドの誘導体（アルキル基として
は、例えば、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の
直鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができ
る）、イソニコチン酸アミドなどを用いることができ
る。なお、日本薬局方に収載されているニコチン酸アミ
ドが最適な態様である。ニコチン酸アミド又はその誘導
体は、本願発明の医薬組成物に基づいて、通常、0.1 〜
50％（ｗ／ｖ％、以下の％表示も同様である）、好まし
くは0.3 〜５％、実用上更に好ましくは、１〜３％が適
当である。この範囲内で、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ
の溶解性を増加させることができる。

【００１２】本願発明の医薬組成物には、ｔ- ＰＡ又は
改変型ｔ- ＰＡ及びニコチン酸アミド又はその誘導体と
ともに、必要に応じて、更に、塩化ナトリウムや、塩化
カリウム等の等張化剤や、マンニトールや、アルブミン
などの賦形剤、安定化剤、ポリソルベート８０（Ｔｗｅ
ｅｎ８０（商品名））などの非イオン性界面活性剤など
の、医薬品製剤化において通常使用される添加剤を随時
配合することができる。本願発明の医薬組成物は、固形
組成物や、水性組成物として、更には、例えば、用時調
製注射剤としてｔ- ＰＡ含有凍結乾燥バイアルと、ニコ
チン酸アミド又はその誘導体とを含有する溶解液バイア
ルの組み合せのようなｔ- ＰＡ並びにニコチン酸アミド
又はその誘導体が別個に包装された形態として使用して
もよい。

【００１３】本願発明の医薬組成物は、各種の方法によ
って製造することができる。例えば、本願発明の医薬組
成物は、適当な媒体中において、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ
- ＰＡにニコチン酸アミド又はその誘導体を添加するこ
とによって製造することができる。このような媒体とし
ては、好適には、各種の緩衝液を使用することができ
る。このような緩衝液としては、例えば、トリス塩酸
や、リン酸、炭酸、ホウ酸、クエン酸、酢酸、酒石酸、
コハク酸、アミノ酸などを含有する緩衝液を用いること
ができる。本願発明の医薬組成物においては、特に、媒
体として、クエン酸を含有するクエン酸緩衝液が、相乗
的にニコチン酸アミド又はその誘導体の可溶化効果を改
善することができるので好適である。

【００１４】本願発明の医薬組成物において、クエン酸
緩衝液を配合する場合には、好ましくは、クエン酸（ク
エン酸又はクエン酸塩としてのクエン酸の全量）の含有
量（濃度）は、10〜500 mM、実際上、特に好ましくは、
10〜50mMが好適である。本願発明における医薬組成物に
おいて、通常、ｐＨ４〜6.5 、好ましくはｐＨ５〜６が
適当である。特に、ｐＨ５〜６においては、ｔ- ＰＡ及
び改変型ｔ- ＰＡの安定性が向上し、加熱やエージング
(aging) によるアミノ酸レベルでの修飾を受けにくいこ
とが判明している。本願発明の製剤組成物は、具体的に
は、クロマトグラフィーで溶出したｔ- ＰＡ含有画分
を、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、例え
ば、クエン酸緩衝液で置換する方法や、ｔ- ＰＡ含有画
分を水に対して透析し、ｔ- ＰＡの沈殿を生ぜしめた
後、これをニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、
例えばクエン酸緩衝液で再溶解する方法などを採用する
ことができる。いずれの方法においても、最終的にニコ
チン酸アミド又はその誘導体、及び必要により添加され
るその他のクエン酸緩衝液等の製剤用基剤を配合し、こ
れを、無菌的に所望のｔ- ＰＡ濃度に調製した液剤とす
るか、あるいはこの液体の凍結乾燥品を製造することも
可能である。特に、本願発明によれば、ｔ- ＰＡもしく
は改変型ｔ- ＰＡを臨床使用するのに適した濃度で含有
し、且つ製剤学的に十分に安定したｔ- ＰＡ凍結乾燥製
剤が容易に得られる。

【００１５】このような凍結乾燥製剤を製造する場合に
は、上記のｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ含有溶液
は、次いで、常法により凍結乾燥する。例えば、当該溶
液を濾過滅菌等により滅菌し、次いで、アンプル又はバ
イアルのような無菌ガラス容器に所望の容量で分注す
る。これらを、例えば、−50〜−10℃の温度で冷凍し、
冷凍溶液は、真空乾燥を開始するまで適当な温度（例え
ば、−50℃）で保持される。冷凍溶液の真空乾燥は、適
宜に実施でき、例えば、通常、0.01〜0.1 トールで実質
的に全ての冷凍液の除去が達成されるまで充分な時間、
部分的真空又は完全真空下に乾燥させる。真空乾燥を行
なう温度は、通常、溶液が実質的に又は完全に凍結した
形態で維持されるように、処理の開始時点で、通常、−
40〜０℃である。処理が進行し、水分が除去されるにつ
れて、温度は室温に達するまで次第に上昇することがあ
る。最後の痕跡量の水分をできるだけ除去するために、
処理の終了時点において室温又はそのすぐ上の温度で約
0.01トールの実質的真空下に真空乾燥を行なうことが好
ましい。得られるｔ- ＰＡ凍結乾燥製剤の水分含有量
（含湿度）は、好ましくは2.5 ％以下である。真空乾燥
が完了したならば、凍結乾燥させたｔ- ＰＡ製剤を含有
する無菌のガラス容器を減圧状態のままあるいは窒素ガ
ス充填の後に密封する。

【００１６】本願発明によって、高濃度でｔ- ＰＡもし
くは改変型ｔ- ＰＡを含有する凍結乾燥医薬製剤を好適
に得ることができる。投与用のｔ- ＰＡ含有溶液を調製
するには、本願発明のｔ- ＰＡ凍結乾燥医薬製剤を中性
又は酸性のｐＨを有する水で再構成する。ｔ- ＰＡ凍結
乾燥医薬製剤が得られる水溶液が実質的に等張である場
合には、再構成用の水は、実質的に等張であることが好
ましい。

【００１７】

【実施例】以下、本願発明について、調製例や、実施例
等を参照しながら、更に詳細に説明するが、本願発明の
範囲は、これらの調製例や実施例等によって何ら限定さ
れるものではない。調製例１（改変型ｔ- ＰＡの調製） ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及びＫ１領域が欠失し、２７
５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された精製改変型ｔ- ＰＡ
を、Biotechnology Progress, 10(5): 472-479(1994)
に記載されている方法に従い調製した。当該精製改変型
ｔ- ＰＡは精製水に対して透析し、遠心処理した後得ら
れた沈澱を−８０℃にて保存した。調製例２（天然型ｔ- ＰＡの調製） 組換えＣＨＯ細胞に由来する完全分子からなる天然型ｔ
- ＰＡ（田辺製薬製「グルトパ」）を準備した。この天
然型ｔ- ＰＡは、精製水に対して透析し、遠心処理した
後、沈殿を−８０℃で保存した。用時は、約８mg／mlの
濃度で所定の濃度のニコチン酸アミド又はその誘導体と
ともに使用した。試験例１（溶解性試験１） 調製例１に示した改変型ｔ- ＰＡを約８ｍｇ試験管に取
り、以下の表１に示す各組成の緩衝液を添加し、撹拌し
た後、遠心して得られた上清中のｔ- ＰＡが、プラスミ
ノーゲンを活性化し、生成したプラスミンに特異的な合
成基質（Ｓ- ２２８８）の水解活性により、ｔ- ＰＡ活
性を測定し、濃度既知のｔ- ＰＡ標準品によりｔ- ＰＡ
の溶解度を求めた。結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】 表１試料番号 溶解緩衝液の組成 溶解度（μg/ml) １ 0.2MArg/0.01%Tween80/50mM リン酸緩衝液(pH7.2) １５１ ２ 100mＭクエン酸酸緩衝液(pH5.6) １８６ ３ 5%ニコチン酸アミド/0.01%Tween80/ 100mＭクエン酸緩衝液(pH5.6) ７２８０ ４ 10% ニコチン酸アミド/0.01%Tween80/ 100mＭクエン酸緩衝液(pH5.6) ８４１７ 上記表１から、ニコチン酸アミドを含有した医薬組成物
において、アルギニン（Ａｒｇ）含有医薬組成物より
も、約５０倍以上可溶化することが分かる。従って、本
願発明の医薬組成物により、ニコチン酸アミドが改変型
ｔ- ＰＡの溶解度を著しく高める効果を有することが明
らかとなった。同様に、クエン酸緩衝液におけるクエン
酸の濃度を40mMとしたことを除いて、上記と同様に溶解
性試験１を行ったところ、上記と同様の結果が得られ
た。

【００１９】試験例２（溶解性試験２） 上記溶解性試験１において、試料３及び４のニコチン酸
アミドの濃度を、以下の表２に示すように変化させたこ
とを除いて、上記溶解性試験１を繰り返すことにより、
ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を表２に示す。

【００２０】

【表２】 表２ ニコチン酸アミド濃度（％） ｔ- ＰＡ溶解度（μg/ml) ０ ２４７ ０．３ ４２４ １ １０６５ ２．５ ３８１６ ３ ４３９２ ４ ６８７１ ５ ＞７３７０ 上記表２の結果から、本願発明の医薬組成物において、
ニコチン酸アミド濃度の上昇に伴い、改変型ｔ- ＰＡの
溶解度が増大することが明らかとなった。また、この結
果から、ニコチン酸アミドを、溶液中に実用上0.3 ％以
上の濃度で共存させることにより、臨床的使用を充分満
足するｔ- ＰＡの溶解度が達成されることが明らかとな
った。

【００２１】試験例３（溶解性試験） ５％ニコチン酸アミド、１％マンニトール及び0.01％Ｔ
ween８０を含有した緩衝液において、併用する緩衝液の
種類を変えることによって、試験例１と同様に、改変型
ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を以下の表３に示
す。

【００２２】

【表３】試料番号 溶解緩衝液の組成 溶解度（μg/ml) ５ 5%ニコチン酸アミド/0.01%Tween80/ 1%マンニトール/40mＭクエン酸緩衝液(pH5.6) ＞８４０７ ６ 5%ニコチン酸アミド/0.01%Tween80/ 1%マンニトール/200mM酢酸緩衝液(pH5.7) ５４０３ ７ 5%ニコチン酸アミド/0.01%Tween80/ 1%マンニトール/100mMリン酸緩衝液(pH6.0) ２１５３ 上記表３の結果から、クエン酸緩衝液を使用すると、そ
れ以外の緩衝液を使用する場合に比べて、ｔ- ＰＡの溶
解度が大幅に増強されることが明らかである。

【００２３】試験例４（溶解性試験４） ｔ- ＰＡ溶解緩衝液（2.5 ％ニコチン酸アミド／１％マ
ンニトール／0.01％Ｔween８０／クエン酸緩衝液、ｐＨ
5.6 ）で使用されるクエン酸緩衝液のクエン酸の濃度を
変化させて、試験例１と同様にｔ- ＰＡの溶解度を求め
た。その結果を以下の表４及び図１に示す。

【００２４】

【表４】 表４ クエン酸濃度（％） ｔ- ＰＡ溶解度（μg/ml) ５ １５７ １０ ３０５ ５０ ３６２２ １００ ６２６５ ２００ ７１８４ ５００ ７６７７ この試験例４の結果から、ニコチン酸アミドによるｔ-
ＰＡ溶解度の増加効果は、500mM までの濃度のクエン酸
イオン源の存在により濃度依存的に高められることが明
らかとなった。

【００２５】試験例５（溶解性試験５） 上記溶解性試験１において、改変型ｔ- ＰＡの代わり
に、調製例２の天然型ｔ- ＰＡを使用し、且つ40mMのク
エン酸を含有する緩衝液を使用したことを除いて、組み
合わせるニコチン酸アミドの濃度を変化させた場合の、
天然型ｔ- ＰＡの溶解性を上記と同様にして求めた。そ
の結果を表５に示す。なお、ここで使用した基礎緩衝液
の組成は以下の通りである。 基礎緩衝液の組成：40mMクエン酸緩衝液／0.01％Tween8
0 (pH7.2) この緩衝液を、緩衝液Ａとする。

【００２６】

【表５】 表５ 試料番号 溶解緩衝液の組成 天然型ｔ- ＰＡ 改変型ｔ- ＰＡ 溶解度（μg/ml） 溶解度（μg/ml) ８ 緩衝液Ａ １２７０ ２４７ ９ 緩衝液Ａ＋0.1 ％ＮＡ １４２５ −−− 10 緩衝液Ａ＋0.3 ％ＮＡ １４６７ ４２４ 11 緩衝液Ａ＋1.0 ％ＮＡ ２４１０ １０６５ 12 緩衝液Ａ＋3.0 ％ＮＡ ６１２１ ４３９２ 13 緩衝液Ａ＋4.0 ％ＮＡ ８２２５ ６８７１ 14 緩衝液Ａ＋5.0 ％ＮＡ ＞９３０８ ７３７０ 注）ＮＡは、ニコチン酸アミドを意味する。

【００２７】上記表５の結果から、天然型ｔ- ＰＡにお
いても、ニコチン酸アミドの添加により、ｔ- ＰＡの溶
解性が向上したことが分かる。また、全体的に、改変型
ｔ-ＰＡに比べて、天然型ｔ- ＰＡの方が、溶解性が優
れていることが分かる。

【００２８】試験例６（凍結乾燥試験１） 溶解性試験例１〜５によって得られた結果に基づき、以
下の成分からなる組成物を用いて、改変型ｔ- ＰＡの凍
結乾燥製剤を調製した。凍結保存しておいた改変型ｔ-
ＰＡの沈澱を２倍濃度の組成緩衝液で溶解し、ｔ- ＰＡ
濃度を３mg／mlになるように調整し、濾過滅菌した後、
ガラス製バイアルに分注して、以下の工程で凍結乾燥し
た。 （1) 常圧で、棚温度−５０℃で２時間、引続き棚温度
−２４℃で１時間凍結の後、−５０℃で１５時間予備凍
結した。 （2) 0.1 トールの減圧下で棚温度を−５℃まで上昇さ
せ、一次乾燥を行なった。 （3) 一次乾燥後、棚温度を３０℃まで上昇させ、二次
乾燥を行なった。 （処方例） クエン酸緩衝液 100 mM ニコチン酸アミド 1.25 ％ マンニトール １％ Ｔｗｅｅｎ８０ 0.01 ％ 改変型ｔ- ＰＡ 1.5 mg／ml （ｐＨ5.6 ） 得られた凍結乾燥製剤を注射用水で溶解した。その結
果、この凍結乾燥製剤は極めて速やかに注射用水に溶解
し、透明な液となった。また、得られた注射剤では、改
変型ｔ- ＰＡの活性及び正常な蛋白構造が保持されてい
た。従って、試験例６から、高濃度の改変型ｔ- ＰＡの
凍結乾燥製剤を製造することが可能であることが示され
た。また、40mMのクエン酸緩衝液を使用したことを除い
て、上記と同様に試験を行ったが、上記と同様の効果が
得られた。

【００２９】試験例７（凍乾標品の安定性試験１） 試験例６で得られた凍結乾燥標品を所定時間６０℃中に
放置し、安定性を調べた。安定性については、合成基質
（Ｓ- ２２８８）水解活性の減衰及び、陰イオン交換
（ＤＥＡＥ）ＨＰＬＣ分析におけるメインピークの残存
率で評価を行なった。合成基質水解活性の測定は、Phar
macopeial Previews, p.1223, Ｎov.-Ｄec.,(1990) に
基づいて行なった。陰イオン交換ＨＰＬＣによる分析
は、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ- ５ＰＷ：東ソー(
株) ）に対して、２Ｍ尿素を含む10mMトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.0 ）を移動相として用い、本移動相に0.2 Ｍ塩
化ナトリウムを含有する溶離液でグラジエント溶出し
た。その結果を以下の表６に示す。

【００３０】

【表６】 表６ メインピーク 放置時間(Hrs.) 活性残存率（％) 残存率（％) 溶液状態 ０ １００. ０ １００. ０ 無色透明の液 ８６ １０１. ４ ９４. ３ 無色透明の液 １６３ １０６. ５ ９５. ３ 無色透明の液 上記表６の結果から分かるように、ニコチン酸アミド
は、ｔ- ＰＡの可溶化効果だけではなく、凍結乾燥状態
での安定性に対しても有効であり、ニコチン酸アミドを
含有した医薬組成物によって、安定性の高い製剤を製造
することが可能である。

【００３１】試験例８（液状製剤の安定性試験１） 改変型ｔ- ＰＡを、ニコチン酸アミドを含んだ緩衝液に
溶解した後、４０℃中に放置し、安定性を調べた。安定
性の評価については試験例７と同様に行なった。その結
果、以下の表７に示す。

【００３２】

【表７】 表７ メインピーク 放置時間(Hrs.) 活性残存率（％) 残存率（％) 溶液状態 ０ １００. ０ １００. ０ 無色透明の液 ８６ ８８. ０ １０１. ３ 無色透明の液 １７１ ８７. ５ ８８. ０ 無色透明の液 上記表７の結果から、ニコチン酸アミドを含んだ医薬組
成物においては、液状においても、安定的に性状が保持
されることが示された。特に、陰イオン交換ＨＰＬＣ分
析では、加熱による修飾体の増加が抑制され、メインピ
ークが保持されることが確認された。この効果は、更
に、クエン酸緩衝液を併用した場合でも、同様であっ
た。

【００３３】

【発明の効果】本願発明によれば、ｔ- ＰＡにニコチン
酸アミド又はその誘導体を併用することにより、ｔ- Ｐ
Ａの溶解度及び安定性を向上させる。従って、本願発明
は、ｔ- ＰＡの臨床上使用し得る、例えば、凍結乾燥製
剤等の製剤を提供できるものとして有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｔ- ＰＡの溶解度に対するクエン酸濃度の影
響を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 溝上 寛 熊本県菊池郡旭志村川辺 財団法人 化学 及血清療法研究所 菊池研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子と、ニ
   コチン酸アミド又はその誘導体とを配合したことを特徴
   とする組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
2. 【請求項２】 組織プラスミノーゲン活性化因子が、改
   変型組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項１に
   記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
3. 【請求項３】 ニコチン酸アミド又はその誘導体が、0.
   1 〜50％（ｗ／ｖ％）の濃度で配合されている請求項１
   又は２に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組
   成物。
4. 【請求項４】 更に、クエン酸が配合されている請求項
   １に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成
   物。
5. 【請求項５】 前記クエン酸が、10〜500 mMの濃度で含
   有される請求項４に記載の組織プラスミノーゲン活性化
   因子医薬組成物。
6. 【請求項６】 凍結乾燥製剤である請求項１に記載の組
   織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
7. 【請求項７】 組織プラスミノーゲン活性化因子の溶解
   度を増加させるために、前記組織プラスミノーゲン活性
   化因子を含有する媒体において、ニコチン酸アミド又は
   その誘導体を配合することを特徴とする組織プラスミノ
   ーゲン活性化因子の溶解方法。
8. 【請求項８】 ニコチン酸アミド又はその誘導体の配合
   量が、0.1 〜50％（ｗ／ｖ％）である請求項７に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 更に、クエン酸が配合されている請求項
   ７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記クエン酸が、10〜500 mMの濃度で
    配合される請求項９に記載の方法。