JPH1052270A - 固定化モノクローナル抗体による蛋白質のリフォールディング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子組換え技術で生産した不活性な蛋白質
を変性させ後、凝集を抑えて生理条件下で活性を回復さ
せること。 【解決手段】 変性蛋白質に結合できるモノクローナル
抗体を担体に固定したのち、変性蛋白質が凝集しにく
く、かつ抗原抗体反応が起こるｐＨ値にて変性蛋白質を
同担体に抗体を介して結合させる。次いで同担体を生理
条件下に置いて、酸化型及び還元型のグルタチオン存在
下でインキュベートする。最後に同担体から蛋白質を溶
出させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学的に生
産した生理活性を有する蛋白質の活性を回復させ、ある
いは、より活性にするためのリフォールディングの方法
を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体に存在する微量な生理活性物質が遺
伝子工学的に生産されている。しかし、生産された蛋白
質が不活性であったり、また天然のものに比べ活性が低
いことがしばしば起こる。これは、不完全な折畳みやＳ
−Ｓ結合の掛け違いが生じた蛋白質が生産されるためで
ある。遺伝子工学的に生産された蛋白質の活性を回復さ
せ、あるいは、向上させる方法の一つとして下記の方法
が知られている。

【０００３】まず塩酸グアニジンや尿素などの変性剤で
蛋白質を可溶化して、さらにジチオトレイトールやメル
カプトエタノールなどでＳ−Ｓ結合を解離した変性蛋白
質を調製する。次いで希釈操作や透析操作で該変性剤濃
度を下げて、さらに酸化型及び還元型グルタチオン存在
下でＳＨ基を酸化することでリフォールディングを行
う。

【０００４】このような手法で活性化を効果的に行うた
めには、変性剤の使用量を抑制することが要求される。
一方、変性剤の使用量を減らすと、蛋白質が凝集しやす
くなる為、これを抑制しなければならない。この凝集
は、蛋白質分子相互の疎水結合、イオン結合及び水素結
合などにより生じることから、再生操作時に尿素、塩化
カリウム、塩化リチウムやエチレングリコールなどを添
加するなどして試行錯誤により最適条件を決めているの
が現状である（生物物理、３３巻、生物物理学会第３１
回年会講予稿集、ページS155の2J0945及び1000、1993年9
月)。

【０００５】この他に、活性をさらに向上させるため
に、目的蛋白質がリガンドを有する場合は、リガンドを
添加することが試みられている。あるいはリガンドと同
じような効果を狙って、希釈した変性蛋白質にモノクロ
ーナル抗体を結合させてリフォールディングさせる方法
で活性を向上できることが報告されている（BIO/TECHNO
LOGY Vol.10、 pp86-91,1992)。

【０００６】さらに、蛋白質を担体に直接固定して変性
した後にリフォールディング操作を行い、活性を向上で
きることが報告されている（生物物理、３３巻、生物物
理学会第３１回年会講予稿集、ページS155の2J1015、199
3年9月)。また、他のリフォールディング操作の手法と
して、以下の方法も提案されている。すなわち、遺伝子
工学的に蛋白質のＮ末端あるいはＣ末端に６個のアルギ
ニン残基で構成されるペプチドを結合させた融合蛋白質
を合成し、この融合蛋白質を変性させた状態でアルギニ
ン残基の陽性イオンを利用して、陰イオン担体に非共有
結合で固定させる。次いで担体上に固定させたまま、変
性剤を除いてリフォールディングさせる(Nature Biotec
hnology, Volume 14, pp329-334, 1996)。

【０００７】この他、生体内で蛋白質の構造形成やミス
フォールドした蛋白質の分解や消化に係るヒートショツ
ク蛋白質であるシャペロニンを再生操作で添加する方法
も検討されている（生物物理、３３巻、生物物理学会第
３１回年会講予稿集、ページS155の2J0930、1993年9
月）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】蛋白質の凝集性は、蛋
白質表面の疎水性領域の割合や電荷分布などの特性に依
存するが、高濃度蛋白質溶液では蛋白質分子の会合の頻
度が高くなるために、より凝集し易くなる。このため従
来は、蛋白質の凝集を抑えるために希釈操作を行ってい
るが、蛋白質同志の会合を高濃度蛋白質溶液でも抑える
ことができれば、希釈操作は不要となるので、容積効率
が高くできるとともに、操作手順も減らすことのできる
方法を提供することができる。

【０００９】高濃度蛋白質溶液で蛋白質分子同志の凝集
を抑えるには、蛋白質分子同志を離れた位置に固定し
て、蛋白質分子の運動を抑制して物理的に会合し難くす
ればよい。この考え方の提案の一つが、前記のNature B
iotechnologyの報告であり、変性蛋白質を担体に固定し
て、固定状態で蛋白質をリフォールディングしている。
しかし、同法ではイオン結合による固定のため、アンカ
ーペプチド以外の部位が非特異的に結合することによる
不均一性やアンカーペプチドによるリフォールディング
への影響が考えられる。固定した変性蛋白質を均一にリ
フォールディングするためには、結合状態がランダムと
なる化学的反応やイオン結合による固定は好ましくない
と考えられる。

【００１０】ところで、前記BIO/TECHNOLOGYには、モノ
クローナル抗体を変性蛋白質に結合した状態でリフォー
ルディングして蛋白質の活性を回復できることが報告さ
れている。しかし、同法は希釈操作後に抗体を結合させ
ているので、変性蛋白質を高濃度条件下で抗体と結合で
きるか否かはわからない。また、どの様な特性の抗体を
利用するのが良いのかについての具体的な提案はない。

【００１１】

【課題を解決するための手段】発明者らは、組換え大腸
菌が不溶性顆粒として生産した蛋白質の凝集特性及び活
性回復のためのリフォールディングの検討のために、一
連の抗体を作製して、高濃度条件下で変性蛋白質の凝集
を抑えて固定する条件及びリフォールディングに与える
抗体の特性を検討したところ、ｐＨ値及び抗体の結合定
数を適当に選定することで、凝集を抑えながら変性蛋白
質をリフォールディングできることを発見した。

【００１２】ところで、本発明の対象とする蛋白質は、
天然型のアミノ酸配列で構成されるもの、あるいは異質
なペプチドまたは異質な蛋白質がそのＮ末端あるいはＣ
末端に付加された融合蛋白質である。したがって、本発
明の要件である抗体は、目的蛋白質に対するものあるい
は付加部位に結合するもので、モノクローナル抗体（以
下モノクローナル抗体を単に抗体と略す）でかつ変性型
の目的蛋白質あるいは変性型の付加ペプチドや付加蛋白
質に結合できることが必須である。

【００１３】

【発明の実施の形態】最初に、抗体の作製について説明
する。まず、蛋白質あるいはそのアミノ酸配列の一部か
らなるペプチドを免疫原としてマウスあるいはラットを
免疫して、その免疫細胞とミエローマ細胞とを細胞融合
して変性型蛋白質あるいは変性型付加領域に結合する抗
体を産生するハイブリドーマ細胞株を樹立する。そし
て、該細胞株を培養して精製することで抗体が得られ
る。また、該免疫細胞の抗体遺伝子から遺伝子操作技術
により抗体分子あるいは抗原結合部位を有する分子をフ
ァージや組換え微生物により作製して、該変性蛋白質あ
るいは変性型付加領域に結合するものを選定しても良
い。

【００１４】蛋白質を免疫原とする場合、生体から精製
したものあるいは組換え微生物で調製したもののいずれ
でも良い。免疫に用いる蛋白質は、天然型あるいは変性
型のどちらでも良い。また、ペプチドを免疫原とする場
合は、ペプチドのアミノ酸残基の数は６個以上として、
蛋白質の高次構造が解明されている場合は、そのアミノ
酸配列を蛋白質構造に於いて表面に露出した領域を選定
する。また、高次構造の不明な蛋白質では親水性領域を
選定すれば良い。

【００１５】ペプチドのキャリア蛋白質は、アルブミ
ン、ミオグロビン、ヘモシアニンなどを用いれば良い。

【００１６】抗体のスクリーニングでは、抗体のクラス
は特に限定するものでなく、変性型蛋白質に結合する抗
体を先ず選定して、次いで本発明による工程に従いリフ
ォールディングを行った蛋白質の生理活性を測定して、
生理活性を回復できた蛋白質に結合した抗体を選定すれ
ば良い。好ましくは、天然型と変性型の蛋白質に対する
親和性定数を測定して、変性型に対する親和性定数が天
然型の３倍以上であるものを選定すると良い。

【００１７】親和性定数の測定方法は特に限定するもの
でなく、例えば、次のような方法を利用できる。蛋白質
と抗体との結合反応に於いて、平衡条件下でゲル濾過、
超遠心あるいは選択的沈殿などの物理的方法で遊離した
蛋白質の量と、抗体と結合した蛋白質を抗体から分離し
た蛋白質の量とから親和性定数を計算する方法、また、
オプチカルバイオセンサで蛋白質をプリズムの表面に固
定して、抗体濃度を変化させる条件下で抗体の結合量を
経時的に測定して結合定数と解離定数を求め親和性定数
を計算する方法、あるいは、エンザイムイムノアツセイ
に於いて抗原濃度を一定にして抗体濃度を変化させる条
件で、最大結合量の５０％で結合する抗体の濃度を親和
性の指標としても良い。

【００１８】以下、工程順に従って、操作を具体的に説
明するが、以下の説明はＳ−Ｓ結合を持つ蛋白質を対象
としたものである。

【００１９】第１工程：蛋白質を変性剤で可溶化した後
に変性蛋白質が凝集しにくいｐＨ条件下で同変性剤を除
去した変性蛋白質溶液を調製する。

【００２０】本発明の対象蛋白質は、精製したものある
いは粗精製した夾雑物が含まれたものでも良い。そして
蛋白質の変性剤は、蛋白質の高次構造に作用してポリペ
プチド鎖をほどく性質を持ったものであればなんでも良
いが、例えば、塩酸グアニジンや尿素を用いると良い。
塩酸グアニジンや尿素を用いる場合はその濃度は特に限
定しないが、好ましくは前者は６Ｍ程度で後者は８Ｍ程
度で行うのが良い。また、変性剤で溶解した溶液を脱酸
素した条件でジチオトレイオトールやメルカプトエタノ
ールなどのチオール化合物を過剰添加してＳ−Ｓ結合を
切断する。例えば、６Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭＥ
ＤＴＡを含むｐＨ値８．０程度のトリス緩衝液で蛋白質
を可溶化する。遠心分離により不溶化分を除去した後、
窒素ガスを通じて脱酸素する。そして蛋白質に含まれる
Ｓ−Ｓ基の５０倍量のジチオトレイオトールを添加し
て、窒素雰囲気下でインキュベートする。可溶化した蛋
白質溶液から変性剤を透析や限外濾過により除去する。
透析外液あるいは限外濾過の溶出液のｐＨ値は、２．０
から６．６の範囲とするが、好ましくは予め変性蛋白質
の凝集試験を行って最も凝集しにくい値を選定すると良
い。その方法は、前記２．０から６．６のｐＨ値の範囲
で行った透析内液あるいは限外濾過の溶出液を２０，０
００×ｇ程度で遠心分離してその上清液の蛋白質濃度を
測定して、操作前の蛋白質濃度との差が最小となるｐＨ
値を選ぶものである。

【００２１】第２工程：抗体を固定した担体上に変性蛋
白質を固定する。

【００２２】担体の材質は、特に限定しないが、単位体
積当りの表面積が大きなものが良い。また、抗体は、２
本の重鎖と２本の軽鎖で構成される天然型の抗体分子あ
るいはペプシンやパパイン処理で得られるＦ(ａｂ)₂や
Ｆａｂフラグメントを用い、さらには遺伝子組換え微生
物やファージなどで生産した抗原結合部位を持つフラグ
メントでも良い。そして抗体構成蛋白質のＮＨ₂基やＣ
ＯＯＨ基あるいはＳＨ基と反応する官能基を介して担体
と化学的結合する、あるいはプロテインＧあるいはプロ
テインＡを介して、さらにはアビジンービオチン結合反
応を利用して固定する。

【００２３】次いで、変性蛋白質溶液と担体とを混合し
て、あるいは担体を充填したカラムに変性蛋白質溶液を
通液して、変性蛋白質を担体上に結合させる。この結合
反応のｐＨ値は、変性蛋白質が凝集し難くかつ抗原抗体
反応が起こる値を選定するが、２．０から６．６の範囲
にあれば良いが、好ましくは４．８から６．６の範囲が
良い。この時の固定抗体量は変性蛋白質を十分に結合で
きる量とし、その反応温度は４℃から３７℃の範囲であ
れば良い。カラムを用いない場合の担体の洗浄は、ガラ
スフィルターで濾過した後にリン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）に懸濁する。この操作を数回繰返して、未結合蛋白
質を除去する。カラムではＰＢＳを充填担体容積の４か
ら５倍量を通液すれば良い。これらの操作は脱酸素条件
下で行うが、この場合、ＰＢＳは予め窒素ガスの通気で
脱酸素したものとする。

【００２４】第３工程：生理条件下で担体をインキュベ
ートする。

【００２５】洗浄された担体をＰＢＳに浸漬して一定時
間インキュベーションする。反応温度は４℃から３７℃
の範囲で、そのインキュベーションの時間は、予め経過
時間毎にサンプリングを行って、担体から固定蛋白質を
溶出して、その活性を測定して回復率が一定となる時間
を決める。また、ＳＨ基を酸化させる。酸化させる方法
は特に限定しないが、好ましくは生理条件下で還元型グ
ルタチオン（ＧＳＨ）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳ
Ｇ）を用いると良い。担体をＧＳＨ及びＧＳＳＧを含有
する脱酸素ＰＢＳに浸漬して一定時間インキュベーショ
ンする。これによりＳＨ基を酸化して分子内Ｓ−Ｓ結合
を形成させる。ＧＳＨとＧＳＳＧとのモル比率は１：１
から２０：１程度で良いが、特には限定しない。また、
蛋白質のＳＨ基に対するＧＳＨのモル比も特に限定しな
いが、過剰量を添加すると良い。添加の量が少ないとＳ
−Ｓ結合の形成に要する時間が長くなる。反応終了後、
担体をＰＢＳで十分に洗浄してＧＳＨとＧＳＳＧを除去
する。

【００２６】ところで、目的蛋白質が融合蛋白質でかつ
目的蛋白質に結合する抗体を使用した場合は、上記操作
終了後に該付加ペプチドあるいは付加蛋白質を切断する
工程を設ける。例えば、ファクターＸａプロテアーゼに
より切断されるペプチド（−ＩＥＧＲ−）を介して付加
されたペプチドをＮ末端にもつ融合蛋白質では、担体と
ファクターＸａプロテアーゼ溶液とを接触させて付加領
域を切断する。そして担体を洗浄後、第４工程に入る。
また、付加領域に結合する抗体を使用している場合は、
上記操作後に付加領域を切断して目的の蛋白質を回収す
る。そして第４工程に入り付加領域を抗体より分離す
る。

【００２７】第４工程：洗浄担体より蛋白質を溶出させ
て蛋白質を回収する。

【００２８】溶出剤としてはｐＨ値２程度の酸あるいは
ｐＨ値１１程度のアルカリを用いると良い。溶出液はリ
ン酸緩衝液などで溶出処理後直ちに中和する。また、溶
出率が悪い場合は、前記溶出剤に代えて、カオトロピッ
クイオンあるいは塩酸グアニジンや尿素などの変性剤を
用いても良い。この場合、溶出液から直ちに限外濾過や
透析によりカオトロピックイオンあるいは変性剤を除去
する。

【００２９】本発明は、以上４工程によりＳ−Ｓ結合の
掛け違いが生じた蛋白質を変性させた後、生理条件下で
活性を回復させることを提案するものである。

【００３０】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説
明するが、本実施例に限定されるものではない。本実施
例は、組換え大腸菌の生産した融合型脳由来神経栄養因
子（ＢＤＮＦ）のリフォールディングを行ったものであ
る。

【００３１】（１）大腸菌によるＢＤＮＦの調製 大腸菌のトリプトファンオペロンのリーダポリペプチド
のＮ末端側８個のアミノ酸配列とファクターＸａの認識
配列を結合したＭＫＡＩＦＶＥＦＩＥＧＲ−をコードす
る塩基配列の下流にＢＤＮＦをコードするＤＮＡを結合
したベクター（ｐＴＲＬＸＢＤＮＦ）をもつ大腸菌ＨＢ
１０１（特願平６−１３３３０で開示されている大腸菌
ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＸＢＤＮＦ］（工技院生命工学工
業技術研究所菌寄第１４０９０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
０９０）として寄託済）を１０ｍｌのＭ９培地（トリプ
トファン含有）に接種して、３７℃で一晩培養した。ト
リプトファンを含有しない２倍濃度のＭ９培地２５ｍｌ
と滅菌水２０ｍｌとを混合した培地に前記大腸菌ＨＢ１
０１の培養液５ｍｌを接種して、３７℃で２４時間培養
した。その後、培養液を遠心分離して菌体を回収し、５
０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ値７．５）で２回洗浄
した。そして菌体を５ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリ
ス塩酸塩緩衝液に懸濁して、氷冷での超音波処理により
菌体を破壊した。さらに２，０００×ｇで１５分間遠心
分離を行い未破砕の菌体を分離した後、その上清を１
０，０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、不溶性顆粒
を得た。

【００３２】（２）抗ＢＤＮＦ抗体の調製 ＢＤＮＦのアミノ酸配列の一部で構成したペプチド（−
ＬＥＫＶＰＶＳＫＧＱＬＫ−）に対するモノクローナル
抗体を作製した。

【００３３】ペプチドは、Ｆｍｏｃ法により合成して、
逆相クロマトグラフィーにより純度８０〜９０％に精製
した。該ペプチドをそれぞれＢＳＡに結合させて、供試
抗原とした。以下にその方法を示す。

【００３４】ペプチド５ｍｇを３５０ｍｌのＰＢＳに溶
解して、これをぺプチドとＢＳＡの重量比が３：１０と
なるように５０ｍｌのＢＳＡ溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）と
混合した。そして１５ｍｇのＥＤＣＩ(1-ethyl-3-(3-di
methylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride)を
混合溶解させた後、室温、暗条件下で一晩静置した。反
応液を１０００ｍlのＰＢＳで４回透析した後、遠心分
離（１０，０００×ｇ、５分）により凝集物を除去し
た。上清を抗原として採取し、−８０℃で保存した。

【００３５】抗原を２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、４
週齢）にアジュバント(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-is
oglutamine)とともに腹腔に２週間間隔で注射して免疫
した。１回目は、抗原量１００μｇとアジュバント１５
μｇをＰＢＳに混合した液０．５ｍｌを、２回目以降
は、抗原量２０μｇとアジュバント１５μｇの混合液
を、血清の抗体価が１０⁵以上に上昇するまで注射し
た。その結果、６回目の免疫で抗体価が１０⁵以上にな
った。そこでマウスから脾臓細胞を摘出して細胞融合を
行った。

【００３６】脾臓細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と
を細胞数で５：１になるように混合したペレットを調製
して、分子量１５００のポリエチレングリコール５０％
溶液（７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ 社製）で常法に従い細胞融合した。
融合後、２０％ＦＢＳ（牛胎児血清）含有のＨＡＴ培地
（ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）にＨＡＴ溶液（大日本
製薬社製）を混合したもの）に脾臓細胞濃度が２ｘ１０
⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように融合細胞を懸濁して、
９６穴マイクロプレートのウエルに１００μｌずつ分注
した。そして３７℃のＣＯ₂インキュベータで培養を開
始した。その４日後に１００μｌのＨＡＴ培地を添加し
て、それ以後２日おきに培地交換（５０％）をした。

【００３７】抗体のスクーリニングは２段階とし、１次
はペプチド−ＢＳＡを抗原としたＥＬＩＳＡで、２次で
ＢＤＮＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製：組み換え大腸菌に
よる生産、純度９６％）を用いてドットブロッティング
した。クロニーングは、１次スクリーニングで陽性であ
ったハイブリドーマ細胞を限界希釈法により行った。４
週齢マウスの胸腺を摘出し、ＨＴ培地（ＥＲＤＦ培地に
ＨＴ溶液（大日本製薬社製）を混合したもの）に同細胞
を懸濁して、フィーダ細胞液（１ｘ１０⁷ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ）を調製した。そしてハイブリドーマ細胞を濃度が
２ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにフィーダ細胞
液に懸濁して、その１００μｌを９６穴マイクロプレー
トのウエルに分注して培養した。培養１０日後、顕微鏡
で単一のコロニーが出現したウエルを選定して、１００
μｌのＨＴ培地を添加した。そしてコロニーが肉眼にて
判別できる大きさになったものについて、ＥＬＩＳＡを
行い陽性のものを選定した。陽性クローンは、２４ウエ
ルプレートで培養後、ＥＬＩＳＡで再度陽性を確認して
液体窒素内に凍結保存した。

【００３８】９６穴マイクロプレート４枚でハイブリド
ーマ細胞をＨＡＴ選択して、次いでハイブリドーマ細胞
が出現したウエルの培養液についてＥＬＩＳＡを行い、
ペプチド−ＢＳＡに対して陽性でかつＢＳＡで陰性ある
いは呈色度合いがペプチド−ＢＳＡの方がＢＳＡより高
いウエルを選んだ。ハイブリドーマ細胞の出現率は平均
４０％で、次に選定ウエルのハイブリドーマ細胞をクロ
ーニングした。それぞれ１個のコロニーが出現したウエ
ルについてＥＬＩＳＡを行い、ペプチド−ＢＳＡ陽性で
かつＢＳＡで陰性のものを選定した。

【００３９】このようにして得られたハイブリドーマ細
胞株４ＡＢ２、４ＢＥ１及び４Ｈ１１株（それぞれ特願
平７−２０２０１１で開示されているハイブリドーマ４
ＡＢ２（工技院生命工学工業技術研究所菌寄第１５０７
７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０７７）として寄託済）、ハ
イブリドーマ４ＢＥ１（同菌寄第１５０７８号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５０７８）として寄託済）及びハイブリドー
マ４Ｈ１１（同菌寄第１５０７９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５０７９）として寄託済）を血清培地から無血清培地へ
馴化（約２週間かけて血清濃度を１０％から０％に順次
低下させて継代培養）した。そして、これらハイブリド
ーマ細胞について容量４００ｍｌのタッピングフラスコ
（仕込量８０ｍｌ）で浮遊培養した。培養上清液を限外
濾過膜（分画分子量：２００ｋＤａ、東洋アドバンテッ
ク社製）により約１０倍に濃縮して飽和硫安で塩析した
後、透析を行い抗体を得た。

【００４０】抗体の天然型及び変性型ＢＤＮＦに対する
親和性定数をＦｉｓｏｎｓ社製のＩＡｓｙｓ装置を利用
して測定した。測定結果を表１に示す。これは、前述し
たオプチカルバイオセンサで蛋白質をプリズムの表面に
固定して、抗体濃度を変化させる条件下で抗体の結合量
を経時的に測定して結合定数と解離定数を求め親和性定
数を計算する方法によるものである。

【００４１】

【表１】

【００４２】（３）変性Ｘａ−ＢＤＮＦの調製 不溶性顆粒を１０ｍｌの０．２Ｍトリス塩緩衝液（０．
０１ＭＥＤＴＡ含有、ｐＨ値８．０）に懸濁した後、濃
度が６Ｍとなるように塩酸グアニジンを混合して３７℃
で１時間加温し該不溶性顆粒を可溶化した。３５６，０
００×ｇ、３０分間で遠心分離して不溶性成分を除い
た。上清にジチオトレイトール（ＤＴＴ）をモル比でＳ
Ｈ基の５０倍になるように混合して室温で窒素雰囲気下
で一晩反応させて、Ｓ−Ｓ結合を切断した。そしてセフ
ァデックスＧ−２５（ファルマシアバイオテク社ＰＤ−
１０）を用いて１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭＨＣ
ｌ溶液により塩酸グアニジンとＤＴＴを除去した。溶離
液を２０，０００×ｇで１５分間遠心分離をして凝集体
を除去して、その上清を得た。

【００４３】変性Ｘａ−ＢＤＮＦの凝集及び抗原抗体反
応に与えるｐＨ値の影響を調べた。凝集試験は、変性Ｘ
ａ−ＢＤＮＦの濃度を０．６ｍｇ／ｍｌでｐＨ値を２．
０から８．７の範囲で行った。各ｐＨ値における変性Ｘ
ａ−ＢＤＮＦ溶液を室温で１０分静置してから１２，０
００×ｇで１５分間遠心分離を行った後、その上清中の
蛋白質濃度を測定した。抗原抗体反応試験については同
ｐＨ値範囲にてＥＬＩＳＡを行い抗体結合量を測定し
た。

【００４４】図１に両結果を示す。凝集試験ではｐＨ値
２．０での蛋白質濃度を１００とし、抗原抗体反応試験
ではｐＨ値６．６での抗体結合量を１００として、ｐＨ
値に対するそれぞれの値をプロットした。変性Ｘａ−Ｂ
ＤＮＦは、ｐＨ値６．６以上では大部分凝集し、抗体結
合率は、ｐＨ値４．８以下で減少した。この結果より、
効率よく変性Ｘａ−ＢＤＮＦと抗体とを結合させるｐＨ
の値は、４．８から６．６の範囲であることが分かっ
た。

【００４５】（４）抗体結合ゲルの調製 活性アミノ基をもつゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社：Ａｆｆｉ
−ｇｅｌ １０）とモノクローナル抗体溶液を混合させ
て、室温で軽く振盪しながら２時間反応させた。これに
よりゲルに約１２ｍｇの抗体を結合させた。未反応活性
基を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ値８．０）でブロック
した後、ＰＢＳで洗浄した。

【００４６】（５）該変性Ｘａ−ＢＤＮＦの固定 変性Ｘａ−ＢＤＮＦ溶液（蛋白濃度５ｍｇ／ｍｌ）と予
め窒素ガスを通気して溶存酸素を除去した５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ値５．０）とを１：４の割合で混合させた
後、抗体結合ゲルを添加して窒素雰囲気下かつ室温で軽
く水平振盪しながら２時間インキュベートした。窒素雰
囲気下でゲルをＰＢＳ（予め窒素ガスを通気して溶存酸
素を除去した）で洗浄して、未結合のＸａ−ＢＤＮＦを
除去した。各抗体における結合率は、約９５％であっ
た。

【００４７】（５）固定化Ｘａ−ＢＤＮＦの酸化 ４ｍｌのＰＢＳにＸａ−ＢＤＮＦを固定したゲルを固定
Ｘａ−ＢＤＮＦ、酸化型グルタチオン及び還元型グルタ
チオンをそれぞれモル比で１：１００：１０となるよう
に混合した。そして窒素雰囲気下かつ室温で軽く水平振
盪しながら４２時間反応させた。窒素雰囲気下でゲルを
ＰＢＳで洗浄した。

【００４８】（６）ファクターＸａプロテアーゼ処理 ゲルを４ｍｌの５０ｍＭトリス塩緩衝液（１００ｍＭＮ
ａＣｌと１ｍＭＣａＣｌ２を含有、ｐＨ値８．０）に懸
濁して、次いでファクターＸａをＸａ−ＢＤＮＦとの重
量比が１：９０となるように添加した。そして軽く水平
振盪しながら室温で２０時間インキュベートした。その
後、ＰＢＳで洗浄してゲルを回収した。

【００４９】（７）ＢＤＮＦの溶出 ゲルを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ値７．０）に懸濁し
て、内径７ｍｍのカラムに流し込んでゲルを充填した。
同緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭＨＣｌを０．５ｍｌづ
つ添加して、０．５ｍｌづつ溶出液を回収した。各溶出
液を直ちに０．５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液と混合し
た。そして各分画の蛋白質濃度を測定して、ＢＤＮＦを
含む分画を得た。

【００５０】（８）生物活性の測定 前記の３種のハイブリドーマから得た抗体（４ＡＢ２、
４ＢＥ１及び４Ｈ１１株産生抗体）を用いて得られたＢ
ＤＮＦそれぞれについて、以下の要領で、脊髄後根神経
節（ＤＲＧ）神経細胞を用いて生物活性を調べた。

【００５１】ニワトリの８日胚よりＤＲＧを摘出して、
２．５％トリプシン溶液で組織を分散した。分散液をシ
ャーレに取りグリア細胞などの非神経細胞を接着させ
て、神経細胞を回収した。２４−ｗｅｌｌプレート（フ
ァルコン社製）の各ウエルに１０％馬血清Ｆ−１２培地
０．５ｍｌに神経細胞を約４０００個及びＢＤＮＦを分
注して、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で４８時間培養し
た。そして各ウエル内で神経線維を伸ばしている細胞数
を計数した。なお、ＢＤＮＦの濃度は、０．０１、０．
１、１．０および１０．０ｎｇ／ｍｌとした。また、天
然型ＢＤＮＦは、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製のものを使用
した。

【００５２】図２に測定結果を示す。４ＡＢ２株抗体を
用いたものが天然型ＢＤＮＦの活性の約５０％まで回復
し、次いで４ＢＥ株抗体を用いたものの活性回復率が大
きく、４Ｈ１１株抗体を用いたものが最も活性回復率が
小さかった。

【００５３】活性回復率をＢＤＮＦに対する抗体の親和
性定数Ｋ_Aを指標として評価することを検討する。前述
の三つの抗体を用いてリフォールディングしたＢＤＮＦ
および天然型のＢＤＮＦのそれぞれＢＤＮＦ濃度１ｎｇ
／ｍｌにおいて、神経細胞を３７℃、５％ＣＯ₂の条件
で４８時間培養した。その結果、リフォールディングし
たＢＤＮＦによって神経線維を伸ばした神経細胞数Ｎｒ
を、天然型のＢＤＮＦによって神経線維を伸ばした神経
細胞数Ｎｎで割った値（Ｎｒ／Ｎｎ）を、変性型ＢＤＮ
Ｆに対する抗体の親和性定数Ｋ_Aを天然型のＢＤＮＦに
対する抗体の親和性定数Ｋ_Aで割った値でプロットした
ところ、図３に示すようになった。この図より活性回復
率は抗体の親和性定数の変性型と天然型との比に依存し
ていて、その比が３．０以上で効果があることが分かっ
た。

【００５４】上述の実施例では、Ｓ−Ｓ結合を有する蛋
白質について示したが、本発明の手法は、Ｓ−Ｓ結合を
持たない蛋白質についても同様に実施できることは言う
までも無かろう。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば遺伝子操作技術で生産し
た蛋白質を変性した後、生理条件下でｍｇ／ｍｌのオー
ダの高い蛋白質濃度で蛋白質の凝集を抑えて該変性蛋白
質をリフォールデングができるので、リフォールデング
操作における凝集によるロスを低減でき、また操作性、
容積効率を向上させることができる。さらに、該蛋白質
溶液に夾雑物が含まれていても選択的に目的の変性蛋白
質の活性を回復できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】可溶化している変性蛋白質及び抗原抗体反応に
於る抗体結合の比率をｐＨ値との関係の例を示す図。

【図２】天然型ＢＤＮＦ及び遺伝子工学的に生産したＢ
ＤＮＦをリフォールディングしたＢＤＮＦのそれぞれに
ついて、ニワトリ脊髄後根節神経細胞で神経線維を伸ば
した数でＢＤＮＦの生物活性を示した図。

【図３】ＢＤＮＦの生物活性を天然型と変性型のそれぞ
れに対する抗体の親和性定数Ｋ_Aの比で評価した例を示
す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の第１行程から第４行程を経て行われ
   ることを特徴とする固定化モノクローナル抗体による蛋
   白質のリフォールディング方法。 第１工程：蛋白質を変性剤で可溶化した後に変性蛋白質
   が凝集しにくいｐＨ条件下で変性剤を除去した変性蛋白
   質溶液を調製する。 第２工程：蛋白質に対するモノクローナル抗体を固定し
   た担体と該変性蛋白質溶液を変性蛋白質が凝集しにくく
   かつ抗体活性が失われないｐＨ値の範囲にて接触させ
   て、抗体と変性蛋白質を結合させ、そして未結合該蛋白
   質を洗浄により除去し、蛋白質を固定した担体を調製す
   る。 第３工程：生理条件下で担体をインキュベートしたの
   ち、担体を洗浄する。 第４工程：抗体に固定された蛋白質を担体から溶出して
   蛋白質を回収する。
2. 【請求項２】第１工程におけるｐＨ値の範囲が２．０か
   ら６．６の範囲の任意の値に選定され、第２工程におけ
   るモノクローナル抗体はそれの変性蛋白質に対する親和
   性が天然型に対する親和性の３倍以上のモノクローナル
   抗体であるとともにｐＨ値の範囲が２．０から６．６の
   範囲の任意の値に選定されている請求項１記載の蛋白質
   のリフォールディング方法。
3. 【請求項３】第１工程のｐＨ値を２．０として、第２工
   程のｐＨ値の範囲を４．８から６．６に選定した請求項
   ２記載の蛋白質のリフォールディング方法。
4. 【請求項４】第１工程においてチオール化合物存在下で
   変性操作を行い、変性剤除去とともにチオール化合物を
   除去し、第３工程におけるインキュベートに代えて生理
   条件下で担体を酸化する請求項３記載の蛋白質のリフォ
   ールディング方法。
5. 【請求項５】第３工程における酸化が還元型または酸化
   型グルタチオンにより行われる請求項４記載の蛋白質の
   リフォールディング方法。
6. 【請求項６】蛋白質がそのＮ末端あるいはＣ末端に該蛋
   白質と異質なペプチド配列あるいは異質な蛋白質を有す
   る融合蛋白質である場合に、第３工程と該第４工程との
   間に、ペプチド配列あるいは異質な蛋白質を切断する工
   程が付加された請求項４記載の蛋白質のリフォールディ
   ング方法。
7. 【請求項７】蛋白質が脳由来神経成長因子でそのＮ末端
   にＭＫＡＩＦＶＥＦＩＥＧＲ−をもつ融合蛋白質であ
   り、第２工程の抗体のエピトープが−ＬＥＫＶＰＶＳＫ
   ＧＱＬＫ−のアミノ酸配列にあるモノクローナル抗体で
   ある請求項６記載の蛋白質のリフォールディング方法。
8. 【請求項８】第２工程に使用する抗体が、蛋白質の結合
   された蛋白質と異質なペプチド配列あるいは異質な蛋白
   質の変性型に結合するモノクローナル抗体であり、第３
   工程の後にペプチド配列あるいは異質な蛋白質を切断す
   る工程で抗体からきり離された該蛋白質を回収する請求
   項７記載の蛋白質のリフォールディング方法。