JP3613931B2 - 核酸結合ポリペプチド、その製造方法及びその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸結合ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで遺伝子組換え操作で作製してきたタンパク質は目的とする特異的な立体構造を如何に維持しかつ抗原抗体反応に適合するかを意図して研究が行われてきた。その際に精製過程において変性操作が加わるため、天然型の構造を保ったまま精製し、それを免疫学的測定系に供与できない場合があった。また各種アッセイ系特有の反応に影響する因子が存在することもあり、しばしば期待通りの反応が起こらないことも知られている。
【０００３】
例えば、免疫測定方法の１つとしていわゆる凝集法が知られている。この方法により例えば、あるタンパク抗原に対する抗体を測定する場合には、該抗原をラテックス粒子のような粒子に固定化した粒子と抗体を反応させ、抗体が存在すれば粒子が凝集するので吸光度測定等により凝集の程度を測定すれば試料中の該抗体を定量することが可能になる。ところが、この抗原として、遺伝子工学的手法により生産したタンパク質を用いると、生産されたタンパク質は、測定すべき抗体との反応性を有しているにもかかわらず、これを粒子に固定化して凝集法による免疫測定を行うと、試料中に抗体が存在する場合でも凝集が起きないことがしばしばある。
【０００４】
このような場合、これまでは生産されたタンパク質を後から修飾したり、融合タンパク質の形で発現したりして少しでも反応性を改善するように努力がなされてきた。しかし、抗原性（すなわち抗体との反応性）を維持したまま所望の性質を付与できるようにタンパク質を修飾することは困難であった。
【０００５】
また、遺伝子工学的手法によりタンパク質を生産した場合、タンパク質はしばしば不溶性タンパク質として生産される。これを精製する場合には、可溶化処理がなされるが、可溶化処理の間にタンパク質が変性し、本来の抗原性を喪失することもしばしばある。従って、遺伝子工学的手法によりタンパク質を生産する場合に、可溶性タンパク質として生産されることが好ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、遺伝子工学的手法によりポリペプチドを生産する場合に、生産されたポリペプチドが可溶化画分中に得られるようにするポリペプチドの生産方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ポリペプチドに核酸を結合することにより、ポリペプチドの抗原性を変化させることなくその性質を変化させることができることを見出し、また、核酸結合ポリペプチドを抗原として用いることにより、従来では不可能であった免疫測定が可能になる場合があることを見出した。また、遺伝子工学的手法により生産されるポリペプチドに核酸を結合することにより、生産されたポリペプチドが可溶化画分中に得られることも見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ポリペプチドをコードする遺伝子と、核酸結合モチーフをコードする遺伝子との融合遺伝子を遺伝子工学的手法により発現させ、前記ポリペプチドに結合した核酸結合モチーフを介して核酸が結合した核酸結合ポリペプチドを生産し、生じた前記核酸結合ポリペプチドを可溶性画分から精製することを特徴とする核酸結合ポリペプチドの生産方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸結合ポリペプチドは、上述のように、ポリペプチドに核酸を結合させることにより、ポリペプチドの抗原性を変化させずにポリペプチドの性質を変化させたものである。ここで、「ポリペプチド」とは、単独で抗原性を発揮できるものであればいかなるものでもよく、従って、それを構成するアミノ酸残基の数は６以上であればよく、好ましくは８以上である。また、「ポリペプチド」には、アミノ酸のみから成るものだけでなく、糖タンパク質、リポタンパク質等、ポリペプチドと糖や脂質等の他の成分との複合体も包含される。
【００１０】
ポリペプチドに結合される核酸のサイズは特に限定されるものではなく、ポリペプチドの性質を変化させることができるサイズであればよい。通常、塩基数で１００ｂ〜１０Ｋｂ、好ましくは１Ｋｂ〜５Ｋｂ程度である。また、ポリペプチドに結合される核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、結合される核酸の塩基配列は何ら限定されるものではなく、いかなる配列でも構わない。
【００１１】
核酸は、前記ポリペプチドに結合した核酸結合モチーフを介して前記ポリペプチドに結合されている。
【００１２】
発現させようとするポリペプチドの遺伝子情報に核酸を結合することで知られる核酸結合モチーフの遺伝子情報を含めて発現させると、核酸結合モチーフのついたポリペプチドが発現し、発現直後に宿主の核酸が自動的に結合し、核酸結合ポリペプチドとして精製できる。また、発現時に自動的に核酸が結合し得なかった場合でも発現後の核酸結合モチーフが結合したポリペプチドと核酸とを混合しておくと、ポリペプチドが再構成し、核酸結合ポリペプチドを得ることができる。核酸結合モチーフは種々知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＨＢｃ蛋白配列に存在する核酸結合モチーフ（Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６４， ３３１９−３３３０（１９９０））、マウスの核酸結合蛋白であるプロタミン（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ９５０， ４５−５３（１９８８）） 等、適宜用いることができる。なお、ＨＢＶの核酸結合モチーフの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に、マウスプロタミン１の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１５及び１６に示す。
【００１３】
本発明の核酸結合ポリペプチドは、ポリペプチドの抗原性を変化させずにポリペプチドの性質を変化させるたものであり得る。変化させるポリペプチドの性質としては、等電点、分子量、ポリペプチドの三次構造等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】
本願発明者らは、上記本発明の核酸結合ポリペプチドを、免疫測定方法の抗原として用いることにより、驚くべきことに、従来測定が不可能であった免疫測定方法においても免疫測定が可能になることを見出した。例えば、抗原を粒子に結合し、これを検体と反応させ、粒子の凝集を測定することにより検体中の抗体を測定する、凝集法と呼ばれる免疫測定方法において、粒子に結合する抗原として遺伝子工学的手法により生産されたポリペプチドを用いた場合に、該ポリペプチドは対応抗体に対する反応性を有しているにもかかわらず、実際に凝集法により測定を行うと、検体中に抗体が存在しているにもかかわらず凝集が起きないことがある。ところが、粒子に結合する抗原として、本発明の核酸を結合したポリペプチドを用いると、検体中の抗体量に依存して粒子の凝集が起きる。本発明の免疫測定方法としては、凝集法に限らず、ＥＬＩＳＡ法等従来より公知のいずれの方法であってもよい。また、既知量の核酸結合ポリペプチドを検体に添加して競合法を行うことにより、検体中の該ポリペプチド抗原の測定を行うこともできる。本発明の免疫測定方法は、抗原として上記した、ポリペプチドに核酸が結合されたものを用いることを除き、従来より周知の方法により行うことができる。凝集法による免疫測定方法の詳細な一例が下記実施例に記載されている。
【００１５】
ポリペプチドを遺伝子工学的手法で生産する場合、生産されたポリペプチドは多くの場合不溶性画分に得られる。このポリペプチドを回収して用いる場合にはポリペプチドの可溶化処理を行わなければならず、この可溶化処理によってポリペプチドの抗原性が変化する場合もしばしばある。従って、遺伝子工学的手法により生産されるポリペプチドが可溶性画分に回収されることが望ましい。遺伝子工学的手法によるポリペプチドの生産方法に本発明の方法を適用し、生産されたポリペプチドが自動的に宿主細胞中の核酸と結合するようにすると、得られる核酸結合ポリペプチドが可溶性画分に回収される。例えば、下記実施例に記載するように、発現させるポリペプチドを、ＨＢｃの核酸結合モチーフとの融合ポリペプチドとして発現させると、発現と同時に核酸結合モチーフに核酸が結合し、得られた核酸結合ポリペプチドは可溶性画分に回収される。従って、本発明はまた、ポリペプチドを遺伝子工学的方法により生産し、生産されたポリペプチドに核酸を結合させ、生じた核酸結合ポリペプチドを可溶性画分から精製することを特徴とする、ポリペプチドの生産方法をも提供する。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本願発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
参考例１ ＨＣＶコア蛋白質（１〜１２０ａａ）の発現
配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を作製した。このプラスミドを用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、ＨＣＶコアポリペプチド１２０を発現するアンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を得、ＨＣＶコア蛋白質（１〜１２０ａａ）を発現させた。以下、本明細書中では、この発現蛋白質を１２０と記載する。１２０の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
【００１８】
実施例１ プラスミドの作製
配列表の配列番号５及び配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチド１５０及び１２０をコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片４７０ｂｐ及び３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０及びｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を作製した。
【００１９】
一方、配列表の配列番号１に示すＨＢｃ核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ４５８７ （１９９０） ）を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩで水解した。次いで２％アガロースゲル電気泳動により核酸結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０及びｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０のＢａｍＨＩ部位に挿入した後、これらを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０ＮＡ及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡを得た。本明細書中では、この形質転換体が発現する核酸結合モチーフが結合した蛋白質を１５０ＮＡ及び１２０ＮＡと記載する。１５０ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号９及び１０に、１２０ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号７及び８に示す。
【００２０】
実施例２ 組換え蛋白質（１５０ＮＡ及び１２０ＮＡ）の発現
実施例１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行い、更に２時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とする。
【００２１】
菌体試料８μｌに３倍濃度のＳＤＳポリアクリルアミド緩衝液（０．１５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ６．８、６％ ＳＤＳ、２４％グリセロール、６ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ ２−メルカプトエタノール、０．００３％ブロモフェノールブルー）４μｌを加え十分撹拌した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターにウエスタンブロットを行って転写を行い、１％ＢＳＡによりブロッキング後、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で２００倍に希釈したＨＣＶコア抗体陽性人血清を反応させた。更にペルオキシダーゼ酵素標識された抗ヒトＩｇＧウサギポリクロナール抗体（ダコ社製）を反応させ、洗浄後１０ｍｌの基質発色液（０．０１％過酸化水素水、０．６ｍｇ／ｍｌ ４−クロロ−１−ナフトール）を添加し、発色させた。結果を図２に示す。図２に示したように大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０ＮＡ及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡの菌体試料はＨＣＶコア陽性ヒト血清で陽性反応を示した。
【００２２】
実施例３ 可溶性核酸結合１２０ＮＡ（１２０ＮＡ（＋））の精製
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤ約０．７の濃度にしたのち、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心操作を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％オクチルチオグルコシド（以下本明細書中ではＯＴＧと記載する）を１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分の核酸結合１２０ＮＡ（以下本明細書中では１２０ＮＡ（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％の緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに１２０ＮＡ（＋）を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４０％ショ糖濃度に１２０ＮＡ（＋）を回収した。
【００２３】
この１２０ＮＡ（＋）第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ミリスチルスルフォベタイン（ＳＢ３−１４、シグマ社製）５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００〜１０００ＫＤに１２０ＮＡ（＋）を回収した。ついでこの１２０ＮＡ（＋）回収画分を、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００２４】
参考例２ 不溶性１２０ＮＡの精製
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心操作を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、不溶性画分の１２０ＮＡを回収した。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．７で可溶化し、遠心操作を行い上清画分を回収した。
【００２５】
この上清を、６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラム（ファルマシア社製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところ、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ＮＡを回収した。ついでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素−０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約２２ＫＤの部分に精製１２０ＮＡを回収した。
【００２６】
実施例４ １２０ＮＡ及び１２０ＮＡ（＋）の物性確認
実施例３で精製した１２０ＮＡ（＋）のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比を測定したところ、約２．０であり、１２０ＮＡのＯＤ２６０／２８０ｎｍ比よりも大きくなっていることから核酸と共存していると判断した。また、１２０ＮＡがショ糖密度勾配超遠心において、ほとんどショ糖濃度０％に回収されるのに対して、１２０ＮＡ（＋）は、約３０％〜４０％のショ糖濃度に回収された。このことにより１２０ＮＡ（＋）は、密度も変化しているものと考えられる。１２０ＮＡ（＋）を、ＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素にて酵素処理を行ったところ、ＲＮＡ分解酵素により１２０ＮＡ（＋）に含まれる核酸がすべて分解された。よって、１２０ＮＡ（＋）の構成核酸はＲＮＡと考えられた。等電点電気泳動を行ったところ、１２０ＮＡ（＋）の等電点はｐＩ３．５〜５．０にかけて広く分布し、参考例２で精製した１２０ＮＡのｐＩ１２．８４とは大きく異なっていた。３％アガロース３％ポリアクリルアミドゲルを用いたＮａｔｉｖｅ電気泳動を行ったところ、エチジュウムブロマイド染色による発光から、１２０ＮＡ（＋）に核酸が含まれることを確認した。このエチジュウムブロマイド染色に用いたゲルを用いて、ウエスタンブロット及びクマシーブリリアントブルー染色を行ったところ、エチジュウムブロマイド染色で発光した部分と同位置に、ウエスタンブロットでは抗ＨＣＶコア抗体との反応性を認め、クマシーブリリアントブルー染色では蛋白の存在が確認できた。一方、参考例２で精製した１２０ＮＡの等電点はｐＩ１２．８４と強い陽電荷を帯び、上記と同じＮａｔｉｖｅ電気泳動では、ウエスタンブロット及びクマシーブリリアントブルー染色による１２０ＮＡのゲルの中への移動が確認できなかった。
【００２７】
よって１２０ＮＡ（＋）は、核酸と結合することにより見かけの分子量の巨大化、密度の変化、電荷の変化と１２０ＮＡとは物性が大きく変化しており、ウエスタンブロット及び凝集反応に変化が無いことにより、抗原活性は保持されていると考えられる。
【００２８】
参考例３ リジン結合１２０（１２０Ｋ１０）の発現
実施例１と同様に、塩基性アミノ酸であるリジンを連続で１０残基結合させる遺伝子操作をｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０に対して行い、ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０Ｋ１０を作成した。これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコアＫ１０を得た。以下、本明細書中ではこの形質転換体が発現する蛋白質を、１２０Ｋ１０と記載する。
【００２９】
この形質転換体をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤ約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分及び不溶性画分の両方に、発現した１２０Ｋ１０を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０，２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、３０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに１２０Ｋ１０を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いてショ糖密度勾配超遠心を行った。しかし１２０Ｋ１０は５０％、３０％、２０％ショ糖画分には回収されず上層に回収された。一方、不溶性画分を参考例２と同様にＳＦＦ陽イオン交換カラム（ファルマシア社製）及びゲル濾過により精製を行い、分子量約２０ＫＤの部分に精製１２０Ｋ１０を回収した。
【００３０】
参考例４ ＨＣＶコア抗原陽性血清の測定
市販のＨＣＶ抗体測定試薬リバアッセイ（カイロン社製）を用いて、ＨＣＶ抗体陽性血清の反応性を調べた。結果を表１に示す。ＨＣＶ抗原ｃ１００（アミノ酸番号１５６９〜１９３１）、ｃ３３ｃ（アミノ酸番号１１９２〜１４５７）、コア抗原ｃ２２（アミノ酸番号２〜１２０）及びＮＳ５（アミノ酸番号２０５４〜２９９５）を用いて調べたところ、陽性血清１及び２共、コア抗原を含めて、全ての抗原領域に対し抗体を持つ血清であった。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例５ ＨＣＶポリペプチド抗原の免疫反応性試験
参考例１、２、３及び実施例３で得られたＨＣＶ蛋白質抗原を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でゼラチン粒子（富士レビオ社製）に０．１５Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．１にて固定し、参考例４で確認した陽性血清と、ＨＣＶコア抗原ｃ２２を免疫して得られたモノクローナル抗体＃２−７を用いて、感作抗原の免疫反応性を検討した。
【００３３】
リン酸緩衝液に１％濃度で懸濁した感作ゼラチン粒子２５μｌと陽性血清または＃２−７ ２５μｌとをマイクロタイタープレート（富士レビオ社製）中で２時間反応させ凝集像を判定した。結果を表２に示す。表２では、反応性を２ｎ 希釈倍率で示し、４以上の結果を陽性と判定した。ＨＣＶコア抗原を免疫して作製したモノクローナル抗体＃２−７はどのＨＣＶコア抗原とも反応したが、実際の陽性血清が反応したのは１２０ＮＡ（＋）感作粒子のみであった。
【００３４】
【表２】
【００３５】
実施例６ １２０ＮＡから１２０ＮＡ（＋）の再構成
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡを用い、参考例２と同様に不溶性画分からＨＣＶコア１２０ＮＡを精製した。１２０ＮＡの分子量は約２２ＫＤ、ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７であった。これに、ｐＷ６Ａ由来の環状プラスミドＤＮＡ（４．７Ｋｂｐ）、６Ｍ尿素、２０％ショ糖を加え、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０％ショ糖に対して透析を行い、１２０ＮＡから１２０ＮＡ（＋）への再構成を行った。透析後再構成された１２０ＮＡ（＋）を、スパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ＮＡ（＋）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに回収した１２０ＮＡ（＋）を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて、ショ糖密度勾配超遠心を行った。約４０％〜５０％ショ糖濃度に再構成した１２０ＮＡ（＋）を回収した。
【００３６】
再構成を行った１２０ＮＡ（＋）は、ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比が再構成前の約０．７から約１．７に変化しており ゲル濾過による分子量及びショ糖密度勾配超遠心による比重のの値がほとんど実施例３で精製した可溶性１２０ＮＡ（＋）と同じ数値を示すので、１２０ＮＡ（＋）に再構成されたと考えられる。
【００３７】
実施例７ １２０結合１２０ＮＡ（１２０ＮＡ１２０）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）を作製した。
【００３８】
次いで、配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０−１２０を作製した。
【００３９】
さらに、配列表の配列番号１に示すＨＢｃ核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで水解した。次いで、２％アガロースゲル電気泳動により核配結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０−１２０のＥｃｏＲＩ部位に挿入した後、これを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、１２０結合１２０ＮＡ（以下、本明細書中では１２０ＮＡ１２０と記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０を得た。
【００４０】
実施例８ 不溶性１２０ＮＡ１２０の精製
参考例２と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現した１２０ＮＡ１２０は、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で可溶化し、遠心を行い上清画分を回収した。
【００４１】
この上清を、６Ｍ尿素グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところ、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ＮＡ１２０を回収した。次いでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量４０ＫＤに精製１２０ＮＡ１２０を回収した。１２０ＮＡ１２０の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１１及び１２に示す。
【００４２】
実施例９ 可溶性核酸結合１２０ＮＡ１２０（１２０ＮＡ１２０（＋））の精製
実施例３と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分の核酸結合１２０ＮＡ１２０（以下、本明細書中では１２０ＮＡ１２０（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに１２０ＮＡ１２０（＋）を含む可溶性画分を積層し、１０００００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４０％ショ糖濃度に１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。
【００４３】
この１２０ＮＡ１２０（＋）第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧ、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０． ０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００〜１０００ＫＤに１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。次いでこの１２０ＮＡ１２０（＋）回収画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００４４】
実施例１０ １２０ＮＡ１２０から１２０ＮＡ１２０（＋）の再構成
実施例９で精製した１２０ＮＡ１２０のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３で十分に切断した子牛胸腺から精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、１２０ＮＡ１２０から１２０ＮＡ１２０（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となった１２０ＮＡ１２０（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７から約１．８に変化していた。
【００４５】
実施例１１ 核酸結合ＴＰ４７（ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号１３に示したＴＰ由来４７ＫＤ抗原をコードするＤＮＡ断片を、ＴＰ４７ＫＤ抗原領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＴＰ４７ＫＤ抗原領域を含むＤＮＡ断片１．３Ｋｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）を作製した。
【００４６】
一方、配列表の配列番号１に示すＨＢＶコア核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで水解した。次いで、２％アガロースゲル電気泳動により核酸結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した後、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、核酸結合ＴＰ４７（以下、本明細書中ではＴＰ４７Ｃ２ＮＡと記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６Ａ４７Ｃ２ＮＡを得た。
【００４７】
実施例１２ 不溶性ＴＰ４７Ｃ２ＮＡの精製
参考例２と同様に、実施例１１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＴＰ４７Ｃ２ＮＡをＬＢ培地３７℃下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノールを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現したＴＰ４７Ｃ２ＮＡは、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で可溶化し遠心を行い上清画分を回収した。この上清を、８Ｍ尿素、酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところで約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分にＴＰ４７Ｃ２ＮＡを回収した。濃縮後このＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量１００ＫＤに精製ＴＰ４７Ｃ２ＮＡを回収した。ＴＰ４７Ｃ２ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１５及び１６に示す。
【００４８】
実施例１３ 可溶性核酸結合ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）） の精製
実施例３と同様に、実施例１１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＴＰ４７Ｃ２ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分に核酸結合ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（以下、本明細書中ではＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブにＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４５％ショ糖濃度にＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。
【００４９】
このＴＰ４７Ｃ２ＮＡ第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００−１０００ＫＤにＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。次いでこのＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）回収画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００５０】
実施例１４ ＴＰ４７Ｃ２ＮＡからＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）の再構成
実施例１２で精製したＴＰ４７Ｃ２ＮＡのＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．６であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３により十分に切断した子牛胸腺より精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、ＴＰ４７Ｃ２ＮＡからＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となったＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分にＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．６から約１．８に変化していた。
【００５１】
実施例１５ プロタミン１結合１２０（１２０ｐｒｏ１）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号１７に示したマウスプロタミン１をコードするＤＮＡ断片を単離した。マウスプロタミン１ｃＤＮＡを鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりマウスプロタミン１領域を含むＤＮＡ断片１６０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を実施例１で作製したプラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した後、これを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、マウスプロタミン１結合１２０（以下、本明細書中では１２０ｐｒｏ１と記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ｐｒｏ１を得た。
【００５２】
実施例１６ １２０ｐｒｏ１の精製
参考例２と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ｐｒｏ１をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現した１２０ｐｒｏ１は、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で可溶化し、遠心を行い上清画分を回収した。
【００５３】
この上清を、６Ｍ尿素グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところで、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ｐｒｏ１を回収した。次いでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量２２ＫＤに精製１２０ｐｒｏ１を回収した。１２０ｐｒｏ１の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１９及び２０に示す。
【００５４】
実施例１７ １２０ｐｒｏ１から１２０ｐｒｏ１（＋）の再構成
実施例１６で精製した１２０ｐｒｏ１のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は、約０．７であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３により十分に切断した子牛胸腺から精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、１２０ｐｒｏ１から１２０ｐｒｏ１（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となった１２０ｐｒｏ１（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ｐｒｏ１（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７から約１．７に変化していた。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、ポリペプチドの抗原性に変化を与えずにポリペプチドの種々の性質を変化させた核酸結合ポリペプチドが初めて提供された。また、本発明により、従来不可能であった免疫測定も可能になった。さらに、本発明により、従来不溶性画分中に回収されていた、遺伝子工学的手法により生産される遺伝子産物を可溶性画分中に回収する方法が初めて提供された。従って、本発明は、遺伝子工学や免疫測定の分野に大いに貢献するものと期待される。
【００５６】
【配列表】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例においてＨＣＶコアタンパクの発現に用いたクローニングベクターｐＷ６Ａの遺伝子地図である。
【図２】本発明の実施例において遺伝子工学的手法により作製したＨＣＶコア蛋白と、ＨＣＶコア陽性ヒト血清との反応性を示すウェスタンブロットの結果を示す模式図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸結合ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで遺伝子組換え操作で作製してきたタンパク質は目的とする特異的な立体構造を如何に維持しかつ抗原抗体反応に適合するかを意図して研究が行われてきた。その際に精製過程において変性操作が加わるため、天然型の構造を保ったまま精製し、それを免疫学的測定系に供与できない場合があった。また各種アッセイ系特有の反応に影響する因子が存在することもあり、しばしば期待通りの反応が起こらないことも知られている。
【０００３】
例えば、免疫測定方法の１つとしていわゆる凝集法が知られている。この方法により例えば、あるタンパク抗原に対する抗体を測定する場合には、該抗原をラテックス粒子のような粒子に固定化した粒子と抗体を反応させ、抗体が存在すれば粒子が凝集するので吸光度測定等により凝集の程度を測定すれば試料中の該抗体を定量することが可能になる。ところが、この抗原として、遺伝子工学的手法により生産したタンパク質を用いると、生産されたタンパク質は、測定すべき抗体との反応性を有しているにもかかわらず、これを粒子に固定化して凝集法による免疫測定を行うと、試料中に抗体が存在する場合でも凝集が起きないことがしばしばある。
【０００４】
このような場合、これまでは生産されたタンパク質を後から修飾したり、融合タンパク質の形で発現したりして少しでも反応性を改善するように努力がなされてきた。しかし、抗原性（すなわち抗体との反応性）を維持したまま所望の性質を付与できるようにタンパク質を修飾することは困難であった。
【０００５】
また、遺伝子工学的手法によりタンパク質を生産した場合、タンパク質はしばしば不溶性タンパク質として生産される。これを精製する場合には、可溶化処理がなされるが、可溶化処理の間にタンパク質が変性し、本来の抗原性を喪失することもしばしばある。従って、遺伝子工学的手法によりタンパク質を生産する場合に、可溶性タンパク質として生産されることが好ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、遺伝子工学的手法によりポリペプチドを生産する場合に、生産されたポリペプチドが可溶化画分中に得られるようにするポリペプチドの生産方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ポリペプチドに核酸を結合することにより、ポリペプチドの抗原性を変化させることなくその性質を変化させることができることを見出し、また、核酸結合ポリペプチドを抗原として用いることにより、従来では不可能であった免疫測定が可能になる場合があることを見出した。また、遺伝子工学的手法により生産されるポリペプチドに核酸を結合することにより、生産されたポリペプチドが可溶化画分中に得られることも見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ポリペプチドをコードする遺伝子と、核酸結合モチーフをコードする遺伝子との融合遺伝子を遺伝子工学的手法により発現させ、前記ポリペプチドに結合した核酸結合モチーフを介して核酸が結合した核酸結合ポリペプチドを生産し、生じた前記核酸結合ポリペプチドを可溶性画分から精製することを特徴とする核酸結合ポリペプチドの生産方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸結合ポリペプチドは、上述のように、ポリペプチドに核酸を結合させることにより、ポリペプチドの抗原性を変化させずにポリペプチドの性質を変化させたものである。ここで、「ポリペプチド」とは、単独で抗原性を発揮できるものであればいかなるものでもよく、従って、それを構成するアミノ酸残基の数は６以上であればよく、好ましくは８以上である。また、「ポリペプチド」には、アミノ酸のみから成るものだけでなく、糖タンパク質、リポタンパク質等、ポリペプチドと糖や脂質等の他の成分との複合体も包含される。
【００１０】
ポリペプチドに結合される核酸のサイズは特に限定されるものではなく、ポリペプチドの性質を変化させることができるサイズであればよい。通常、塩基数で１００ｂ〜１０Ｋｂ、好ましくは１Ｋｂ〜５Ｋｂ程度である。また、ポリペプチドに結合される核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、結合される核酸の塩基配列は何ら限定されるものではなく、いかなる配列でも構わない。
【００１１】
核酸は、前記ポリペプチドに結合した核酸結合モチーフを介して前記ポリペプチドに結合されている。
【００１２】
発現させようとするポリペプチドの遺伝子情報に核酸を結合することで知られる核酸結合モチーフの遺伝子情報を含めて発現させると、核酸結合モチーフのついたポリペプチドが発現し、発現直後に宿主の核酸が自動的に結合し、核酸結合ポリペプチドとして精製できる。また、発現時に自動的に核酸が結合し得なかった場合でも発現後の核酸結合モチーフが結合したポリペプチドと核酸とを混合しておくと、ポリペプチドが再構成し、核酸結合ポリペプチドを得ることができる。核酸結合モチーフは種々知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＨＢｃ蛋白配列に存在する核酸結合モチーフ（Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６４， ３３１９−３３３０（１９９０））、マウスの核酸結合蛋白であるプロタミン（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ９５０， ４５−５３（１９８８）） 等、適宜用いることができる。なお、ＨＢＶの核酸結合モチーフの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に、マウスプロタミン１の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１５及び１６に示す。
【００１３】
本発明の核酸結合ポリペプチドは、ポリペプチドの抗原性を変化させずにポリペプチドの性質を変化させるたものであり得る。変化させるポリペプチドの性質としては、等電点、分子量、ポリペプチドの三次構造等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】
本願発明者らは、上記本発明の核酸結合ポリペプチドを、免疫測定方法の抗原として用いることにより、驚くべきことに、従来測定が不可能であった免疫測定方法においても免疫測定が可能になることを見出した。例えば、抗原を粒子に結合し、これを検体と反応させ、粒子の凝集を測定することにより検体中の抗体を測定する、凝集法と呼ばれる免疫測定方法において、粒子に結合する抗原として遺伝子工学的手法により生産されたポリペプチドを用いた場合に、該ポリペプチドは対応抗体に対する反応性を有しているにもかかわらず、実際に凝集法により測定を行うと、検体中に抗体が存在しているにもかかわらず凝集が起きないことがある。ところが、粒子に結合する抗原として、本発明の核酸を結合したポリペプチドを用いると、検体中の抗体量に依存して粒子の凝集が起きる。本発明の免疫測定方法としては、凝集法に限らず、ＥＬＩＳＡ法等従来より公知のいずれの方法であってもよい。また、既知量の核酸結合ポリペプチドを検体に添加して競合法を行うことにより、検体中の該ポリペプチド抗原の測定を行うこともできる。本発明の免疫測定方法は、抗原として上記した、ポリペプチドに核酸が結合されたものを用いることを除き、従来より周知の方法により行うことができる。凝集法による免疫測定方法の詳細な一例が下記実施例に記載されている。
【００１５】
ポリペプチドを遺伝子工学的手法で生産する場合、生産されたポリペプチドは多くの場合不溶性画分に得られる。このポリペプチドを回収して用いる場合にはポリペプチドの可溶化処理を行わなければならず、この可溶化処理によってポリペプチドの抗原性が変化する場合もしばしばある。従って、遺伝子工学的手法により生産されるポリペプチドが可溶性画分に回収されることが望ましい。遺伝子工学的手法によるポリペプチドの生産方法に本発明の方法を適用し、生産されたポリペプチドが自動的に宿主細胞中の核酸と結合するようにすると、得られる核酸結合ポリペプチドが可溶性画分に回収される。例えば、下記実施例に記載するように、発現させるポリペプチドを、ＨＢｃの核酸結合モチーフとの融合ポリペプチドとして発現させると、発現と同時に核酸結合モチーフに核酸が結合し、得られた核酸結合ポリペプチドは可溶性画分に回収される。従って、本発明はまた、ポリペプチドを遺伝子工学的方法により生産し、生産されたポリペプチドに核酸を結合させ、生じた核酸結合ポリペプチドを可溶性画分から精製することを特徴とする、ポリペプチドの生産方法をも提供する。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本願発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
参考例１ ＨＣＶコア蛋白質（１〜１２０ａａ）の発現
配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を作製した。このプラスミドを用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、ＨＣＶコアポリペプチド１２０を発現するアンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を得、ＨＣＶコア蛋白質（１〜１２０ａａ）を発現させた。以下、本明細書中では、この発現蛋白質を１２０と記載する。１２０の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
【００１８】
実施例１ プラスミドの作製
配列表の配列番号５及び配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチド１５０及び１２０をコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片４７０ｂｐ及び３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０及びｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０を作製した。
【００１９】
一方、配列表の配列番号１に示すＨＢｃ核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ４５８７ （１９９０） ）を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩで水解した。次いで２％アガロースゲル電気泳動により核酸結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０及びｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０のＢａｍＨＩ部位に挿入した後、これらを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０ＮＡ及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡを得た。本明細書中では、この形質転換体が発現する核酸結合モチーフが結合した蛋白質を１５０ＮＡ及び１２０ＮＡと記載する。１５０ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号９及び１０に、１２０ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号７及び８に示す。
【００２０】
実施例２ 組換え蛋白質（１５０ＮＡ及び１２０ＮＡ）の発現
実施例１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行い、更に２時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とする。
【００２１】
菌体試料８μｌに３倍濃度のＳＤＳポリアクリルアミド緩衝液（０．１５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ６．８、６％ ＳＤＳ、２４％グリセロール、６ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ ２−メルカプトエタノール、０．００３％ブロモフェノールブルー）４μｌを加え十分撹拌した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターにウエスタンブロットを行って転写を行い、１％ＢＳＡによりブロッキング後、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で２００倍に希釈したＨＣＶコア抗体陽性人血清を反応させた。更にペルオキシダーゼ酵素標識された抗ヒトＩｇＧウサギポリクロナール抗体（ダコ社製）を反応させ、洗浄後１０ｍｌの基質発色液（０．０１％過酸化水素水、０．６ｍｇ／ｍｌ ４−クロロ−１−ナフトール）を添加し、発色させた。結果を図２に示す。図２に示したように大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１５０ＮＡ及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡの菌体試料はＨＣＶコア陽性ヒト血清で陽性反応を示した。
【００２２】
実施例３ 可溶性核酸結合１２０ＮＡ（１２０ＮＡ（＋））の精製
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤ約０．７の濃度にしたのち、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心操作を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％オクチルチオグルコシド（以下本明細書中ではＯＴＧと記載する）を１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分の核酸結合１２０ＮＡ（以下本明細書中では１２０ＮＡ（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％の緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに１２０ＮＡ（＋）を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４０％ショ糖濃度に１２０ＮＡ（＋）を回収した。
【００２３】
この１２０ＮＡ（＋）第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ミリスチルスルフォベタイン（ＳＢ３−１４、シグマ社製）５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００〜１０００ＫＤに１２０ＮＡ（＋）を回収した。ついでこの１２０ＮＡ（＋）回収画分を、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００２４】
参考例２ 不溶性１２０ＮＡの精製
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心操作を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、不溶性画分の１２０ＮＡを回収した。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．７で可溶化し、遠心操作を行い上清画分を回収した。
【００２５】
この上清を、６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラム（ファルマシア社製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところ、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ＮＡを回収した。ついでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素−０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約２２ＫＤの部分に精製１２０ＮＡを回収した。
【００２６】
実施例４ １２０ＮＡ及び１２０ＮＡ（＋）の物性確認
実施例３で精製した１２０ＮＡ（＋）のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比を測定したところ、約２．０であり、１２０ＮＡのＯＤ２６０／２８０ｎｍ比よりも大きくなっていることから核酸と共存していると判断した。また、１２０ＮＡがショ糖密度勾配超遠心において、ほとんどショ糖濃度０％に回収されるのに対して、１２０ＮＡ（＋）は、約３０％〜４０％のショ糖濃度に回収された。このことにより１２０ＮＡ（＋）は、密度も変化しているものと考えられる。１２０ＮＡ（＋）を、ＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素にて酵素処理を行ったところ、ＲＮＡ分解酵素により１２０ＮＡ（＋）に含まれる核酸がすべて分解された。よって、１２０ＮＡ（＋）の構成核酸はＲＮＡと考えられた。等電点電気泳動を行ったところ、１２０ＮＡ（＋）の等電点はｐＩ３．５〜５．０にかけて広く分布し、参考例２で精製した１２０ＮＡのｐＩ１２．８４とは大きく異なっていた。３％アガロース３％ポリアクリルアミドゲルを用いたＮａｔｉｖｅ電気泳動を行ったところ、エチジュウムブロマイド染色による発光から、１２０ＮＡ（＋）に核酸が含まれることを確認した。このエチジュウムブロマイド染色に用いたゲルを用いて、ウエスタンブロット及びクマシーブリリアントブルー染色を行ったところ、エチジュウムブロマイド染色で発光した部分と同位置に、ウエスタンブロットでは抗ＨＣＶコア抗体との反応性を認め、クマシーブリリアントブルー染色では蛋白の存在が確認できた。一方、参考例２で精製した１２０ＮＡの等電点はｐＩ１２．８４と強い陽電荷を帯び、上記と同じＮａｔｉｖｅ電気泳動では、ウエスタンブロット及びクマシーブリリアントブルー染色による１２０ＮＡのゲルの中への移動が確認できなかった。
【００２７】
よって１２０ＮＡ（＋）は、核酸と結合することにより見かけの分子量の巨大化、密度の変化、電荷の変化と１２０ＮＡとは物性が大きく変化しており、ウエスタンブロット及び凝集反応に変化が無いことにより、抗原活性は保持されていると考えられる。
【００２８】
参考例３ リジン結合１２０（１２０Ｋ１０）の発現
実施例１と同様に、塩基性アミノ酸であるリジンを連続で１０残基結合させる遺伝子操作をｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０に対して行い、ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０Ｋ１０を作成した。これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコアＫ１０を得た。以下、本明細書中ではこの形質転換体が発現する蛋白質を、１２０Ｋ１０と記載する。
【００２９】
この形質転換体をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤ約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分及び不溶性画分の両方に、発現した１２０Ｋ１０を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０，２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、３０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに１２０Ｋ１０を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いてショ糖密度勾配超遠心を行った。しかし１２０Ｋ１０は５０％、３０％、２０％ショ糖画分には回収されず上層に回収された。一方、不溶性画分を参考例２と同様にＳＦＦ陽イオン交換カラム（ファルマシア社製）及びゲル濾過により精製を行い、分子量約２０ＫＤの部分に精製１２０Ｋ１０を回収した。
【００３０】
参考例４ ＨＣＶコア抗原陽性血清の測定
市販のＨＣＶ抗体測定試薬リバアッセイ（カイロン社製）を用いて、ＨＣＶ抗体陽性血清の反応性を調べた。結果を表１に示す。ＨＣＶ抗原ｃ１００（アミノ酸番号１５６９〜１９３１）、ｃ３３ｃ（アミノ酸番号１１９２〜１４５７）、コア抗原ｃ２２（アミノ酸番号２〜１２０）及びＮＳ５（アミノ酸番号２０５４〜２９９５）を用いて調べたところ、陽性血清１及び２共、コア抗原を含めて、全ての抗原領域に対し抗体を持つ血清であった。
【００３１】
【表１】
実施例５ ＨＣＶポリペプチド抗原の免疫反応性試験
参考例１、２、３及び実施例３で得られたＨＣＶ蛋白質抗原を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でゼラチン粒子（富士レビオ社製）に０．１５Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．１にて固定し、参考例４で確認した陽性血清と、ＨＣＶコア抗原ｃ２２を免疫して得られたモノクローナル抗体＃２−７を用いて、感作抗原の免疫反応性を検討した。
【００３３】
リン酸緩衝液に１％濃度で懸濁した感作ゼラチン粒子２５μｌと陽性血清または＃２−７ ２５μｌとをマイクロタイタープレート（富士レビオ社製）中で２時間反応させ凝集像を判定した。結果を表２に示す。表２では、反応性を２ｎ 希釈倍率で示し、４以上の結果を陽性と判定した。ＨＣＶコア抗原を免疫して作製したモノクローナル抗体＃２−７はどのＨＣＶコア抗原とも反応したが、実際の陽性血清が反応したのは１２０ＮＡ（＋）感作粒子のみであった。
【００３４】
【表２】
実施例６ １２０ＮＡから１２０ＮＡ（＋）の再構成
実施例１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡを用い、参考例２と同様に不溶性画分からＨＣＶコア１２０ＮＡを精製した。１２０ＮＡの分子量は約２２ＫＤ、ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７であった。これに、ｐＷ６Ａ由来の環状プラスミドＤＮＡ（４．７Ｋｂｐ）、６Ｍ尿素、２０％ショ糖を加え、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０％ショ糖に対して透析を行い、１２０ＮＡから１２０ＮＡ（＋）への再構成を行った。透析後再構成された１２０ＮＡ（＋）を、スパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ＮＡ（＋）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに回収した１２０ＮＡ（＋）を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて、ショ糖密度勾配超遠心を行った。約４０％〜５０％ショ糖濃度に再構成した１２０ＮＡ（＋）を回収した。
【００３６】
再構成を行った１２０ＮＡ（＋）は、ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比が再構成前の約０．７から約１．７に変化しており ゲル濾過による分子量及びショ糖密度勾配超遠心による比重のの値がほとんど実施例３で精製した可溶性１２０ＮＡ（＋）と同じ数値を示すので、１２０ＮＡ（＋）に再構成されたと考えられる。
【００３７】
実施例７ １２０結合１２０ＮＡ（１２０ＮＡ１２０）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、ＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）を作製した。
【００３８】
次いで、配列表の配列番号３に示したＨＣＶコアポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドＣＫＳＣ１１５０を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＨＣＶコア領域を含むＤＮＡ断片３７０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０−１２０を作製した。
【００３９】
さらに、配列表の配列番号１に示すＨＢｃ核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで水解した。次いで、２％アガロースゲル電気泳動により核配結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０−１２０のＥｃｏＲＩ部位に挿入した後、これを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、１２０結合１２０ＮＡ（以下、本明細書中では１２０ＮＡ１２０と記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０を得た。
【００４０】
実施例８ 不溶性１２０ＮＡ１２０の精製
参考例２と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現した１２０ＮＡ１２０は、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で可溶化し、遠心を行い上清画分を回収した。
【００４１】
この上清を、６Ｍ尿素グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところ、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ＮＡ１２０を回収した。次いでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量４０ＫＤに精製１２０ＮＡ１２０を回収した。１２０ＮＡ１２０の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１１及び１２に示す。
【００４２】
実施例９ 可溶性核酸結合１２０ＮＡ１２０（１２０ＮＡ１２０（＋））の精製
実施例３と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ＮＡ１２０をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分の核酸結合１２０ＮＡ１２０（以下、本明細書中では１２０ＮＡ１２０（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブに１２０ＮＡ１２０（＋）を含む可溶性画分を積層し、１０００００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４０％ショ糖濃度に１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。
【００４３】
この１２０ＮＡ１２０（＋）第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧ、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０． ０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００〜１０００ＫＤに１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。次いでこの１２０ＮＡ１２０（＋）回収画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下、ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００４４】
実施例１０ １２０ＮＡ１２０から１２０ＮＡ１２０（＋）の再構成
実施例９で精製した１２０ＮＡ１２０のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３で十分に切断した子牛胸腺から精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、１２０ＮＡ１２０から１２０ＮＡ１２０（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となった１２０ＮＡ１２０（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ＮＡ１２０（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７から約１．８に変化していた。
【００４５】
実施例１１ 核酸結合ＴＰ４７（ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号１３に示したＴＰ由来４７ＫＤ抗原をコードするＤＮＡ断片を、ＴＰ４７ＫＤ抗原領域を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２を鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりＴＰ４７ＫＤ抗原領域を含むＤＮＡ断片１．３Ｋｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）を作製した。
【００４６】
一方、配列表の配列番号１に示すＨＢＶコア核酸結合モチーフをコードするＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＢＶ−１１を鋳型分子として、ＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで水解した。次いで、２％アガロースゲル電気泳動により核酸結合モチーフを含むＤＮＡ断片１１０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＷ６Ａ４７Ｃ２（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した後、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、核酸結合ＴＰ４７（以下、本明細書中ではＴＰ４７Ｃ２ＮＡと記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６Ａ４７Ｃ２ＮＡを得た。
【００４７】
実施例１２ 不溶性ＴＰ４７Ｃ２ＮＡの精製
参考例２と同様に、実施例１１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＴＰ４７Ｃ２ＮＡをＬＢ培地３７℃下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノールを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現したＴＰ４７Ｃ２ＮＡは、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で可溶化し遠心を行い上清画分を回収した。この上清を、８Ｍ尿素、酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところで約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分にＴＰ４７Ｃ２ＮＡを回収した。濃縮後このＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量１００ＫＤに精製ＴＰ４７Ｃ２ＮＡを回収した。ＴＰ４７Ｃ２ＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１５及び１６に示す。
【００４８】
実施例１３ 可溶性核酸結合ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）） の精製
実施例３と同様に、実施例１１で作製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＴＰ４７Ｃ２ＮＡをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分に核酸結合ＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（以下、本明細書中ではＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）と記載する）を回収した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、それぞれショ糖濃度５０％、３０％、２０％緩衝液を作製し、これを積層した超遠心チューブにＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を含む可溶性画分を積層し、１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第一ショ糖密度勾配超遠心を行った。約３０％〜４５％ショ糖濃度にＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。
【００４９】
このＴＰ４７Ｃ２ＮＡ第一ショ糖密度勾配回収画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約７００−１０００ＫＤにＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。次いでこのＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）回収画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール緩衝液にショ糖を加え、ショ糖濃度５０％、２０％の緩衝液を積層した超遠心チューブに積層し１００，０００ｇ、１０℃、１２時間の条件下ベックマン超遠心機を用いて第二ショ糖密度勾配超遠心を行い濃縮精製を行った。
【００５０】
実施例１４ ＴＰ４７Ｃ２ＮＡからＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）の再構成
実施例１２で精製したＴＰ４７Ｃ２ＮＡのＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．６であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３により十分に切断した子牛胸腺より精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、ＴＰ４７Ｃ２ＮＡからＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となったＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分にＴＰ４７Ｃ２ＮＡ（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．６から約１．８に変化していた。
【００５１】
実施例１５ プロタミン１結合１２０（１２０ｐｒｏ１）発現用形質転換体の構築
配列表の配列番号１７に示したマウスプロタミン１をコードするＤＮＡ断片を単離した。マウスプロタミン１ｃＤＮＡを鋳型分子としてＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動によりマウスプロタミン１領域を含むＤＮＡ断片１６０ｂｐを分離した。このＤＮＡ断片を実施例１で作製したプラスミドｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した後、これを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、マウスプロタミン１結合１２０（以下、本明細書中では１２０ｐｒｏ１と記載する）を発現するアンピシリン耐性の形質転換体として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ｐｒｏ１を得た。
【００５２】
実施例１６ １２０ｐｒｏ１の精製
参考例２と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡＨＣＶコア１２０ｐｒｏ１をＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍで約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。２．５時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２０％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．３％ＯＴＧを１５０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現した１２０ｐｒｏ１は、遠心後可溶性及び不溶性画分に回収された。このうち不溶性画分を６Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で可溶化し、遠心を行い上清画分を回収した。
【００５３】
この上清を、６Ｍ尿素グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラムでイオン交換精製した。塩化ナトリウムで溶出したところで、約０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に１２０ｐｒｏ１を回収した。次いでこのＳＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製した。約分子量２２ＫＤに精製１２０ｐｒｏ１を回収した。１２０ｐｒｏ１の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列表の配列番号１９及び２０に示す。
【００５４】
実施例１７ １２０ｐｒｏ１から１２０ｐｒｏ１（＋）の再構成
実施例１６で精製した１２０ｐｒｏ１のＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は、約０．７であった。これに、制限酵素Ｈａｅ３により十分に切断した子牛胸腺から精製したＤＮＡ（シグマ社製）約１．３〜０．７Ｋｂｐと、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、１．０Ｍ塩化ナトリウムを加え、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウムに対して４℃の条件下で透析を行い、１２０ｐｒｏ１から１２０ｐｒｏ１（＋）への再構成を行った。透析後再構成され可溶性となった１２０ｐｒｏ１（＋）を、１２０ＮＡ（＋）同様スーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）にて精製し、分子量約７００〜１０００ＫＤ部分に１２０ｐｒｏ１（＋）を回収した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍ比は約０．７から約１．７に変化していた。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、ポリペプチドの抗原性に変化を与えずにポリペプチドの種々の性質を変化させた核酸結合ポリペプチドが初めて提供された。また、本発明により、従来不可能であった免疫測定も可能になった。さらに、本発明により、従来不溶性画分中に回収されていた、遺伝子工学的手法により生産される遺伝子産物を可溶性画分中に回収する方法が初めて提供された。従って、本発明は、遺伝子工学や免疫測定の分野に大いに貢献するものと期待される。
【００５６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例においてＨＣＶコアタンパクの発現に用いたクローニングベクターｐＷ６Ａの遺伝子地図である。
【図２】本発明の実施例において遺伝子工学的手法により作製したＨＣＶコア蛋白と、ＨＣＶコア陽性ヒト血清との反応性を示すウェスタンブロットの結果を示す模式図である。
Claims (1)
- ポリペプチドをコードする遺伝子と、核酸結合モチーフをコードする遺伝子との融合遺伝子を遺伝子工学的手法により発現させ、前記ポリペプチドに結合した核酸結合モチーフを介して核酸が結合した核酸結合ポリペプチドを生産し、生じた前記核酸結合ポリペプチドを可溶性画分から精製することを特徴とする核酸結合ポリペプチドの生産方法。
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| JPH1081698A (ja) | 1998-03-31 |
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