JPH10509330A

JPH10509330A - Ｄｎａ増幅およびアッセイのための装置および方法

Info

Publication number: JPH10509330A
Application number: JP9512117A
Authority: JP
Inventors: コッティンガム，ヒュー・ブイ
Original assignee: ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Priority date: 1995-09-12
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 1998-09-14
Also published as: CA2205057A1; EP0790861A1; AU7238396A; MX9703495A; US5948673A; EP1291441A2; KR970706902A; WO1997010056A3; CA2205057C; WO1997010056A2; EP1291441A3; BR9606634A

Abstract

(57)【要約】多数の分離した試料セルを含む平坦な”カード”形式のＤＮＡ増幅反応および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置が提供され、各々の試料セルにはＤＮＡ増幅反応および均質ＤＮＡプローブアッセイの両方に必要な試薬が含まれている。本装置は蛍光偏光ＤＮＡプローブアッセイに特に適しており、関連する測定装置においての偏光要素に対する要求を避けるために組み込まれた偏光子が好適に提供される。試料セルの大きさおよび幾何学的配列はＤＮＡ増幅反応の”ホットスタート”を可能にし、それにより増幅反応の誤った開始を避けている。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ増幅およびアッセイのための装置および方法技術分野本発明は一般的に液体生物試料に対して生物学的過程を実施するための装置および方法に関しており、特に単一のＤＮＡ増幅および蛍光偏光アッセイに適し、分離しシールされた試料セルに多数の液体生物試料を収容することが可能な均質なＤＮＡプローブアッセイ装置に関している。背景技術核酸（ＤＮＡ）増幅および続いての核酸プローブアッセイの方法はよく知られており、種々の様式で要求を満たしている。これらの様式は非常に効果的ではあるが、臨床研究室で実施するには幾分困難である。一般に、ＤＮＡ増幅およびアッセイ反応はアッセイされるべき試料に対して連続的に実施される；即ち、最初にＤＮＡ増幅反応が完了するまで行われ、続いて十分に増幅された試料に対してＤＮＡアッセイが実施される。これは終末点アッセイと称されている。終末点アッセイの一つの問題点は、ＤＮＡ増幅反応で増幅されたＤＮＡ（アンプリコン）を続いてのＤＮＡプローブアッセイへ物理的に移さなければならないことである。移しかえることによりＤＮＡアンプリコンへの実験室環境からの夾雑物の混入の可能性が存在する。さらに、試料の物理的輸送があるたびに与えられた試料の誤認識または各々の試料を取り違える一般的な危険性が増加する。試験ユニット内に試料を閉じこめ、液体生物試料に統合された核酸増幅および核酸アッセイを実施できる完備した試験ユニットの提案が以前になされている。例えば、ＰａｕｌＮ．Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙらは米国特許第５，２２９，２９７号において、試料、増幅試薬および検出試薬を含むための多数の融通性のある室ならびに試料および試薬室と検出部位および廃物室を連結する通路からなるＤＮＡ増幅および検出のためのキュベットを記載している。ローラーが試料および試薬室を所望の順序通りに圧搾または圧迫するのに使用されており、それにより試料および検出試薬が通路を通して検出部位および廃物室へ押し出される。十分な圧力がローラーにより発生されるまで、試料および試薬室を通路から隔離するために一時的なシールが使用される。この配置は増幅および検出の間、キュベット内に試料がとどまることにおいて都合がよいが、一時的シールを破壊しおよび種々の液体の室間の流れを起こすためのローラーが必要なことで望ましくない複雑さが持ち込まれ、増幅およびアッセイ法の自動化を困難にしている。１９９４年７月１９日にＨｕｇｈＨ．Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍにより出願された同時係属中の米国特許出願第０８／２７７，５５３号には、統合された核酸増幅および核酸アッセイを実施するための改良試験ユニットが開示されている。改良試験ユニットにおいて、試料および試薬の流れは比較的簡単な回転装置により加えられる遠心力により制御され、それによりローラーおよび他の複雑な機構が要求されない。これにより米国特許第５，２２９，２９７号に開示されている配置が大体は改良されるが、試験ユニット内の制御された液体運動を提供する必要性がいまだに存在し、望まれたより幾分より複雑な試験ユニットにしている。上に議論した終末点アッセイに加え、核酸アッセイの均質法も存在する。均質法では増幅した物質の別のアッセイ部位への物理的移送は必要とされず、むしろ増幅反応と同時に作用させる。既知の均質アッセイ法の例には蛍光偏光、蛍光エネルギー転移および光吸収が含まれる。特に、蛍光偏光は研究室で非常によく使われているが、ガラス試料管またはセルを必要とするという著しい欠点を持っている。これは注入形成または熱形成のようなほとんどのプラスチック加工法は完成した部品の素材に応力を作り出すという事の結果である。これらの応力は無作為な偏光効果を持っており、蛍光偏光アッセイに必要とされる偏光した光の透過を妨害する。よく知られているように、ＤＮＡ増幅反応は所望の数のアンプリコンを産生するためにある温度範囲内で行わなければならない。もし試料が必要とされる温度に到達する前に試料およびＤＮＡ増幅試薬を反応させたら、”誤開始”として知られている現象が起こりうる。これは終末点アッセイおよび均質アッセイの両方においてアッセイ結果の有効性に影響を及ぼすことができる。以上の観点から、統合されたＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイを最少の複雑性で実施することができ、および望ましくは試験ユニットそれ自身内での液体の移動を起こすことを必要としない装置または試験ユニットに対する要求がある。また、蛍光偏光法を用いる均質ＤＮＡプローブアッセイの実施に使用でき、しかも偏光光を適切に透過させるのにガラスを使用することを必要としない試験ユニットに対する要望も存在している。最後に、統合されたＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイを単純で有効的な様式で実施するのに使用でき、その間増幅反応の不注意な誤開始が防止されている試験ユニットに対する必要性が存在している。本発明はこれらの目的の実現に関している。臨床研究室全員で便利に取り扱うことができ、および適した試験装置に収容することができる”カード”形式のＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのが本発明の目的である。多数の試料セルからなり、各々の試料セルがＤＮＡ増幅反応および均質ＤＮＡプローブアッセイに必要とされる要素および試薬を含んでいる単−ＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのも本発明の目的である。液体生物試料の添加が増幅およびアッセイ法の実施に必要とされる唯一のことであるように、装置内にＤＮＡ増幅反応およびＤＮＡプローブアッセイの両方に必要とされるすべての試薬が乾燥した形で含まれている単一ＤＮＡ増幅反応およびＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのも本発明のさらなる目的である。ＤＮＡ増幅反応の”ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）”を実行し、それにより増幅反応の誤開始による価値のないアッセイ結果を避ける試験ユニットおよび方法を提供するのも本発明のさらなる目的である。蛍光偏光アッセイに必要な光学的性質を持っているが、ガラスではなく安価なプラスチック材料で制作することができる試験ユニットを提供するのも本発明のさらなる目的である。従来の終末点測定というよりむしろＤＮＡアンプリコンの動力学的または動的測定による即時のＤＮＡプローブアッセイデータを得る試験ユニットおよび方法を提供するのも本発明のさらなる目的である。共焦点偏光法の使用を可能にする組み込まれた偏光子を含む蛍光偏光ＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのも本発明のさらなる目的である。実験室環境からのアンプリコン夾雑を避けるため、液体生物試料の導入後は永久的に封をできる統合されたＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのも本発明のさらなる目的である。分離した試料セルに多数の液体生物試料を収容でき、ＤＮＡプローブアッセイデータを数分のうちに提供できる統合されたＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイ装置を提供するのも本発明のさらなる目的である。発明の要約本発明の好適な態様に従うと、平坦な”カード”形式で多数の分離した試料セルを含み、各々の試料セルがＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイの両方に必要な試薬を含んでいるＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置を提供することにより従来の技術の欠点および制限が実質的に避けられる。本装置は特に、蛍光偏光ＤＮＡプローブアッセイに適しており、関連する測定装置における偏光要素の必要性をなくすために望ましくは組み込まれた偏光子を備えて提供される。試料セルの大きさと幾何学的配列はＤＮＡ増幅反応の”ホットスタート”を可能にし、それにより増幅反応の不注意な誤開始を避けている。一つの態様において、本発明は液体生物試料について核酸増幅および均質核酸アッセイを実施するための装置に関している。本装置は液体生物試料を受け入れるための試料セルを含んでいる。試料セルには試料室および試料室内へ液体生物試料を加えるための試料入り口が含まれている。乾燥核酸増幅試薬および乾燥均質核酸アッセイ試薬が液体生物試料と反応するために試料室の内部に接着されている。液体生物試料が試料室へ加えられた後、試料入り口をシールするためにシーリング部材が試料セルに付けられるであろう。均質核酸アッセイ試薬は蛍光偏光アッセイ試薬を含んでいるであろうし、その場合には試料セルの一部は液体生物試料中の蛍光偏光反応を外部から検出することを可能にするように透明に作られているであろう。シーリング部材は試料室の透明部分にも結合可能であり、関連する測定装置における偏光要素の必要性を避けるために透明な光偏光物質から作られている。他の態様において、本発明は液体生物試料に対して生物学的過程を実施するための装置に関している。本装置は液体生物試料を受け入れるための少なくとも一つの試料セルを持つ実質的に平坦なカード様部材を含んでいる。試料セルは試料室、試料室内に液体生物試料加えるための試料入り口、試料室内に液体生物試料加える時に試料室から空気を逃がすための通気孔、および液体生物試料と反応させるために試料室の内部表面に接着された乾燥試薬を含んでいる。シーリング部材は好適には感圧接着剤を含む柔軟な物質の層の形で、液体生物試料が試料室に加えられた後に試料入り口および通気孔を塞ぐためにカード様部材に結合可能なものである。他の態様において、本発明は液体生物試料に核酸蛍光偏光アッセイを実施するための装置に関している。本装置は液体生物試料を受け入れるための試料セルを含んでいる。試料セルは試料室および試料室内に液体生物試料加えるための試料入り口を持っている。本装置はまた液体生物試料と反応させるため、試料室の内部表面へ接着された乾燥核酸蛍光偏光試薬も含んでいる。試料セルの少なくとも一部は関連する測定装置における偏光要素の必要性をなくし液体生物試料中の蛍光偏光反応の外部からの検出を容易にするため光透過性の光偏光物質から作られている。さらに別の態様において、本発明は液体生物試料に対して統合された核酸増幅および均質核酸蛍光偏光アッセイを実施する方法に関している。本方法は光透過性部分を持つ試料ウェル内へ液体生物試料を導入し；試料セル内で液体生物試料を乾燥核酸増幅試薬および乾燥均質核酸蛍光偏光アッセイ試薬と接触させ；液体生物試料を乾燥核酸増幅試薬および乾燥均質核酸蛍光偏光アッセイ試薬と反応させるためにインキュベートし；および試料セルの光透過性部分を通して液体生物試料中の蛍光偏光反応を検出する工程を含んでいる。検出工程は試料セルの光透過性部分を通して偏光光を検出するか、または、もし試料セルの光透過性部分が光偏光物質で作られているなら試料セルの光透過性部分を通して非偏光光を検出する。さらに別の態様において、本発明は液体生物試料に対して核酸増幅反応を実施する方法に関している。本方法は乾燥核酸増幅試薬を含む試料セルを核酸増幅に適した温度に前もって加熱し；前もって加熱した試料セルに液体生物試料を導入して液体生物試料と乾燥核酸試薬を接触させ；液体生物試料の温度を前もって加熱した試料セルの温度と平衡化させ；および、平衡化が実質的に完了した後、試料セル中で核酸増幅反応を開始する工程から成っている。好適には、液体生物試料の温度を前もって加熱した試料セルの温度と平衡化させる工程は、試料セルと液体生物試料間の熱輸送を促進するため試料セル中に液体生物試料の薄層を形成させることを含んでいる。図の簡単な説明本発明の種々の目的、利点および新しい特色は、付随する図と関連させて以下の詳細な説明を読むことにより容易に評価されるであろう。図１は本発明の好適な実施態様に従って構築されたＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイカードの上面図であり、試料セル内へ液体生物試料が導入された後に個々の試料セルを封じるのに使用される別個のシーリングストリップ（ｓｅａｌｉｎｇｓｔｒｉｐ）を示している；図２は図１のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの側面図であり、その比較的小さな厚さを示している；図３は図１のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードおよびシーリングストリップの上面図であり、いくつかの試料セルは液体生物試料で満たされ、シーリングストリップを用いて封じられていることが示されている；図４は図１−３のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの一部の拡大横断面図であり、いくつかの分離した試料セルは満たされているが、乾燥増幅およびアッセイ試薬の位置を例示するために他は空のまま残されている；図５は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの上層の平面図であり、分離した試料セルに試料入り口および通気孔が提供される様式を示している；図６は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの中間層の平面図であり、分離した試料セル側壁を決定する鍵穴型の隙間を示している；図７は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの下層の平面図であり；図８は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの上、中間および下層の関係を示している分解部品配列透視図であり；図９Ａおよび９Ｂは図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの試料入り口および通気孔を封じるのに使用されたシーリングストリップの二つの異なった実施態様の上面図であり；図１０は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの分離した試料セルの一つを通した拡大断面図であり、使用されるべき共焦点法を可能にするシーリングストリップへの光偏光物質の使用の様式を示している；図１１および１２はＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡ蛍光偏光アッセイ間の蛍光強度の時間変化を示しているグラフであり；および図１３−１５は図１−４のＤＮＡ増幅およびＤＮＡプローブアッセイカードの試料セルの強度変化の測定に使用できる測定装置の例を示している。図を通して、同じ参照番号は同じ部品および構成要素を示していることが理解されるであろう。好適な実施態様の詳細な説明本発明の好適な実施態様に従って構築されたＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイ装置２０（以後”ＤＮＡカード”と称される）が図１に示されている。ＤＮＡカードの特異的寸法および幾何図形的外形は特定の応用での必要性に従って変化するであろうが、好適な態様のカード２０は約５．０２５インチの長さおよび約３．３６２インチの幅の長方形である。カードには分離された試料セル２２が長方形に配列されており、それらは縦横、均等に配置されている。各々の試料セル２２は、液体生物試料を受け取るために閉鎖された試料室２４（上部の壁は透明である）、また試料室２４と連結し開放されている試料入り口２６、および同様に試料室２４と連結している通気孔２８を含んでいる。乾燥されたＤＮＡ増幅およびアッセイ試薬は各々の試料セル２２の内部壁の上部に単一で、分離されたスポット３０に付着される。試料入り口２６は液体生物試料（図１では表示されていない）を各々の試料室２４に導入するのに（ピペッティングによるのが好ましい）使用され、また通気孔２８は液体生物試料が導入されるにつれて試料室２４の空気を入れ替える。後に説明を加えるが、各々の試料セル２２の試料室２４内に導入される液体生物試料は試料セル内の乾燥試薬スポット３０と接触して溶解させ、それにより望まれるＤＮＡ増幅およびアッセイ反応を開始する。アッセイ結果の測定は後に説明されるように、液体生物試薬が試薬セル２２内に密閉されたまま残っている間に生じる。例示した実施様態においては、ＤＮＡカード２０は６４の同一の試料セル２２を含み、８列、８カラムの長方形に配列され、およそ０．３５４インチの垂直中心および０．６２８インチの水平中心を持っている。図１を引き続き参照すると、シーリングストリップ３２（カード２０の各々のカラムの試料セル２２に対して一つ）は液体生物試薬が試料セル２２に導入された後に試料室２４の試料入り口２６と通気孔２８を密閉するために提供される。好適には、ストリップ３２は個々に使用できる切片を決めるために、また必要ならばいくつかの試料セル２２を密閉し、その他はそのままにするためにスコアライン３４に沿って分割される。例示した様態においては、シーリングストリップ３２は幅がおよそ０．６２８インチで、長さがおよそ３．３６２インチである。各シーリングストリップ３２は八つの試料セルのカラムを密閉し、八つのストリップ３２が６４すべての試料セルの密閉に使用される。個々の切片または各々のシーリングストリップ３２のシール３６は、試料セル２２自身のように同一の垂直中心（即ち、およそ０．３５４インチ離れている）にある。シーリングストリップ３２は好ましくは、厚さ０．０１５インチであり、それらの下面の感圧接着剤とともに提供される（図１では見ることができない）。実施において、シーリングストリップス３２は粘着テープの様に働き、試料入り口２６および通気孔２８を覆うことによって、試料セル２２を永久的に密封する。シーリングストリップ３２は一般的に都合よいように全体のまま使用されるが、必要ならばスコアライン３４にそって副分割される。シーリングストリップ３２を用いての試料セル２２のシーリングはいくつかの利点がある。第一に、シーリングストリップ３２はＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡプローブアッセイを行っている間に液体生物試料が蒸発するのを防ぐ。液体生物試料の容量が典型的にはとても少なく（およそ２０μＬ）また増幅およびアッセイ反応が通例高い温度（７５℃ぐらいまで）である場合、このような蒸発は液体生物試料の重大な損失につながる事になりえる。シーリングストリップ３２の第二の利点は、ＤＮＡアンプリコンが試料セル２２から失われるのを防ぐことで、それにより実験室の環境の混入を防ぐ。最後に、本発明で特に好ましい様態に従うと、シーリングストリップ３２は透過性の光偏光物質より作られており、検出または測定工程においては偏光要素として働く。これにより、関連する測定装置に別々の偏光要素を提供する必要がない。以下の説明は、全ての試料セル２２およびシール３６は同一であると想定され、また、一つの試料セル２２またはシール３６の記述は全てに当てはまるものとする。これは好適な実施様態において正しいが、本発明がこの配置に制限されるとみなしてはならない。異なった試薬、異なった寸法、異なった容量および異なった光学的性質を含む（これらに制限されるわけではない）次のものと異なる試料セル２２および／またはシール３６を提供することも本発明の範囲内である。試薬はＤＮＡ増幅またはＤＮＡプローブアッセイのどちらか、または両方に対して異なってもよく、例えば、均質ＤＮＡプローブアッセイ法には蛍光偏光反応、蛍光エネルギー転移反応および光吸収反応が含まれる。任意のまたはすべての前記の相違は単一のカード２０内でおよび／または次の一つのカード２０で存在してもよい。従って、例えば、そのようなカードが一般的なまたは機能的類似性のみを保持しているなら（例えば、測定機器の同一型と適合するために必要な程度）、異なった型のＤＮＡカード２０が異なった型のアッセイに実施に提供できる。図２はＤＮＡカード２０の側面またはエッジオン図であり、好適な実施提要では一般的に平坦な平面外形を持っている。図２から明らかになるであろうように、ＤＮＡカード２０は望まれるなら非常に薄く作製することができる。好適な実施態様において、ＤＮＡカード２０の厚さは約０．０４７インチである。図３は実際に使用中と思われるようなＤＮＡカード２０を示しており、１４の試料セル２２が液体生物試料３８で満たされている。これらの満たされた試料セル２２において、図１の乾燥試薬スポット３０はすでに溶解されている。満たされた試料セル２２はシーリングストリップ３２の各々の切片またはシール３６で被覆されている。一つの完全なシーリングストリップ３２が試料セル２２の左側のカラムに応用されており、第二のシーリングストリップ３２が一つのスコアライン３４に沿って、第二のカラムの上部六つの試料セル２２に応用されている第一の部分３２Ａおよび将来の使用に保持されている第二の部分３２Ｂに副分割されている。未使用部分３２ＢはＤＮＡカード２０の続いての使用で第二のカラムの二つの最も低い試料セル２２を封じるために使用できる。典型的には図３に示された種々の液体生物試料３８は血液試料または異なった患者からの他の体液試料から構成されるであろうし、そのすべては同一の増幅およびアッセイ試薬３０により同じ病原体が試験されている。しかしながら、一つ以上の液体生物試料３８が同じ患者から取り出された、および試薬３０が一つの試料セル２２と次のセルで異なっている実施態様が可能なことが理解されるであろう。図４は図３の線４−４に沿ってとられたＤＮＡカード２０の部分断面図である。この図において、好適な実施態様のＤＮＡカード２０の薄板化構築物が容易に理解できる。ＤＮＡカード２０は下層４０、中間層４２および上層４４から作製されている。シーリングストリップ３２のシール３６は上層４４の上面４６に接着されている。層４０、４２および４４の各々は好適には約０．０１５インチの厚さを持つプラスチックフィルムで作られており、シール３６は類似の材料および厚さである。層４０、４２および４４（シール３６とともに）は典型的には約０．００１インチの厚さの感圧接着剤（示されていない）により一緒に保たれている。都合がよいので図４の空の試料セル２２Ａを参照すると、試料入り口２６は好適には約０．１２５インチの直径であり、好適には約０．１２５インチの幅の試料室２４の狭い部分４８と通じている。狭い部分４８は順に約０．２５０インチの直径の試料室２４のより大きな実質的に円形の部分と通じている。乾燥試薬スポット３０は試料室２４の円形部分の上壁（ＤＮＡカードの上層４４の下面に対応している）に付着しており、円形部分のほとんど中心に位置している。試料室２４の円形部分は、約０．１２５インチの直径の試料室の別の狭い部分５２と通じている。部分５２は順に試料入り口２６に対して試料セル２２Ａの反対の末端に位置している通気孔２８と通じている。通気孔２８は好適には約０．０４０インチの直径である。試料室２４の内部の高さはＤＮＡカード２０の中間層４２の厚さ、およびこの層の両面の接着剤の厚さにより決定される。この結果、試料室２４の内部は約０．０１７インチの全高である。引き続き図４を参照すると、試料セル２２Ｂは使用中と思われるように示されている。従って、試料室２２Ｂは液体生物試料３８で満たされており、試料入り口２６および通気孔２８を覆っているシール３６で封じられている。図１の乾燥試薬スポット３０は液体生物試料３８によりすでに溶解されている。ＤＮＡカード２０を使用するためには適した測定装置が必要とされる。ＤＮＡカード２０が蛍光偏光反応、蛍光エネルギー転移反応または光吸収反応のためのアッセイ試薬を含んでいるかどうか、およびＤＮＡカード２０が組み込まれた偏光要素を持っているかどうか（蛍光偏光アッセイの場合）に依存して、機器はマイクロプレートフルオロメーターまたはマイクロプレートリーダーのような通常の機器であるか、または図１３−１５に関連して簡単に記載されるような型の特別の機器である。両方の場合とも、個々の試料セル２２に光学的にアドレスする手段と一緒に適した温度制御が提供されなければならない。統合されたＤＮＡ増幅反応および均質ＤＮＡ蛍光偏光アッセイを実施するためには、ＤＮＡカード２０は機器内の加熱されたキャリヤー上に置かれる。キャリヤーは加熱されたトレーであり、カードを受け取るために機器の外側に引き出すことができ、その後、蛍光偏光、蛍光強度または光吸収の望まれる読みとりを実施するために機器内へ引き込まれる。典型的には、各々の試料セル２２を個々に読むことができるようにカードをｘおよびｙの両方の方向に移動させる手段を機器は備えている。全操作の間、加熱されたキャリヤーはＤＮＡカード２０を至適温度（典型的には２５℃および７５℃の間）に維持している。最初に空ＤＮＡカード２０を機器の引き出された加熱キャリヤーに置き、キャリヤー温度と平衡化させる。この平衡化は約１分でおこる。ＤＮＡカード２０がキャリヤー温度と平衡化されたら液体生物試料３８が試料セル２２の一つまたはそれ以上の試料入り口２６内へピペットで加えられる。液体生物試料３８は静水力学および毛管力の組み合わせにより即座に試料室２４を満たす。好適な実施態様において、各々の液体生物試料のピペッティング容量は約２０μｌである。液体生物試料３８がすべての試料室２４内へピペッティングされたらすぐ、試料セル２２はシール３６を用いて封じられ、測定機器を始動させる。キャリヤーは蛍光偏光、蛍光強度または光吸収読みとりのために機器内へ引き込まれる。試料室２４が非常に薄いため、および液体生物試料３８が接触する試料室２４の表面積が大きいため、液体生物試料３８は試料セル２２内へピペッティングされて数秒以内にＤＮＡ増幅に望まれる最適温度まで加熱される。従って、ＤＮＡ増幅の”開始”を始めるために乾燥試薬スポット３０が溶解して液体生物試料３８に拡散する時間までには、試料はすでに最適温度まで上がっている。このようにしてＤＮＡカード２０はＤＮＡ増幅反応の”ホットスタート”を達成する。図５−７はＤＮＡカード２０が組み立てられているプラスチックフィルムの個々の層を示している。好適な実施態様において、各々の層は約０．０１５インチの厚さである。図５に示された上層４４は、試料入り口２６および通気孔２８を形成する穴を含んでいる。上層４４の下面は試料室２４の上壁を形成している。図６に示された中間層は試料室２４の側壁を形成する鍵穴型の隙間５４を含んでいる。中間層４２は両壁とも感圧接着剤で被覆されている（図には示されていない）。図７に示された下層４０は、ＤＮＡカード２０の底を形成する固体の長方形シートである。下層４０の上面は試料室２４の各々の下壁を形成している。図８の分解部品配列図はＤＮＡカード２０の組立時の上層４４、中間層４２および下層４０の相対的な配列を示している。実施において、上層４４および中間層４２は適した接着剤で一緒に薄板とし、乾燥試薬スポット３０を作るために上層４４の下面へ増幅およびアッセイ試薬をピペッティングおよび乾燥できるようにその部分組立物を逆さにする。図４を参照すると、カード２０の上層４４の下面に接着された乾燥試薬スポット３０を含むＤＮＡカード２０の切断端を見ることができる。乾燥試薬スポット３０が形成された後、図８に示したように下層４０と中間層４２を薄板として組立物２０を完成させる。乾燥試薬スポット３０はＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡアッセイ試薬の両方を含んでおり、後者は望ましくは蛍光偏光アッセイ試薬から成っている。適したＤＮＡ増幅およびＤＮＡ蛍光偏光アッセイ試薬の例は”核酸増幅の蛍光偏光検出”と題して１９９５年９月２３日にＧ．Ｔｅｒｒａｎｃｅらにより出願された同時係属中の米国特許出願第０８／３１１，４７４号に開示されており、該出願は本明細書において援用される。乾燥スポット３０の化学試薬はトレハロースまたは他の炭化水素のような容易に可溶化するマトリックスで運ばれる。これらの試薬は試料室２４内へ導入された水性試料に曝された場合に自発的に再懸濁するであろう。例えば、一つのスポットに増幅試薬を、および異なったスポットにアッセイ試薬を提供することで、望むなら各々の試料セル２２中に一つ以上の乾燥試薬スポット３０を提供してもよいことが理解されるであろう。しかしながら、ＤＮＡ増幅および均質ＤＮＡアッセイの場合には、試薬スポットは（もし分離していても）本質的に同時に液体生物試料３８により溶解されるように位置しているべきである。もしＤＮＡカード２０で使用されるべき均質ＤＮＡアッセイが蛍光偏光アッセイであるならば、カード２０の上層４４は偏光した光の透過を妨害しない物質で作られていなければならない。この要求を満たす物質の二つの例はセルロースアセテートブチレート（ＣＡＢ）およびトリアセテートセルロース（ＴＡＣ）である。シーリングストリップ３２の二つの別の態様が各々図９Ａおよび９Ｂに示されている。図９Ａにおいてシーリングストリップ３２は、背面に光学的に透明な感圧接着剤（ＡｄｈｅｓｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ８１５４型のような）を塗った約０．０１５インチの厚さを持つ透明なＣＡＢ、または背面に光学的に透明な感圧接着剤を塗った透明な光偏光フィルムで作られている。適切な、背面が接着性の偏光フィルムはＮｉｔｔｏＤｅｎｋｏから製品番号１２２０ＤＵのものが入手可能である。前に説明したように、スコアライン３４はシーリングストリップ３２を個々のシールまたは切片３６に分離することを可能にするために提供されており、図３に示されている。図９Ｂにおいて、改良シーリングストリップ３２’が示されており、そこでは各々の切片またはシール３６は中心に孔または隙間５６を持っている。シール３６が図３および４に示したように試料室２２に応用された場合、孔５６は試料室２４の円形領域の中心に配列されている。図９Ｂのシーリングストリップ３２’はその背面に感圧接着剤を運んでいることでは図９Ａのシーリングストリップ３２と同じであるが、孔５６がＤＮＡカード２０の上層４４を通しての試料室２４からの光の透過を可能にするので図９Ｂのシーリングストリップ３２’は不透明な物質（ブラックＰＶＣまたはＣＡＢのような）で作られているであろう。図９Ｂのシーリングストリップ３２’は蛍光偏光アッセイの間に液体生物試料３８により発光された光は、図９Ａの実施態様でのように上層４４およびシーリングストリップ３２を通るというより、蛍光偏光アッセイ中ＤＮＡカード２０の上層のみを通過することしか必要とされないという利点を持っている。蛍光偏光アッセイにおいて与えられた光の波長の偏光された励起ビームが蛍光性ＤＮＡプローブを励起するために使用される。与えられた波長でのこれらの励起したプローブからの蛍光発光の強度は励起偏光に平行な偏光面および励起偏光に垂直な偏光面でも測定される。蛍光性ＤＮＡプローブがＤＮＡアンプリコンへハイブリダイズした場合、励起面と平行な面の蛍光発光の強度が増加する。典型的には、平行および垂直の両方の強度が測定される。全強度の変化は次に式：Ｐ＝（Ｉ_PARA−Ｉ_PER）／（Ｉ_PARA＋Ｉ_PER）式中：Ｉ_PARA＝励起偏光の面に対して平行に偏光した面での蛍光強度Ｉ_PER＝励起偏光の面に対して垂直に偏光した面での蛍光強度を応用することにより補償される。この式から偏光比（Ｐ）と称される次元のない量が得られる。励起偏光と平行な面の偏光強度がハイブリダイゼーションの増加で増加する偏光強度であるので、励起偏光に対して平行な面での偏光の強度を時間に関して測定すると時間に関するハイブリダイゼーションの増加が示されるであろう。これは蛍光偏光の測定に対する動力学的または動的アプローチであり、蛍光エネルギー転移および光吸収アッセイでの使用にも適している。そのような動力学的または動的アプローチを用いることにより、各々の試料はそれ自身に対して測定され、従って相対的な測定であるので絶対強度への補償は幾分重要ではなくなる。従って蛍光偏光アッセイの場合、励起偏光の面に平行な偏光面でのみ蛍光強度を測定することが必要になる。上に記載した動力学的または動的アプローチは共焦点偏光法の使用を可能にし、ここで励起ビームのための偏光子もまた試料により発光された蛍光のための偏光子として使用でき、それにより必要とされる偏光要素の数が１に減少する。このことは、励起ビームおよび試料からの蛍光発光の検出に使用されるセンサーの両方のために測定機器中に別々の偏光要素が必要とされる通常の方法とは異なっている。共焦点法に必要とされる単一の偏光要素に関して、この要素はＤＮＡカード２０それ自身に提供でき（即ち、偏光シーリングストリップ３２または上層４４の形で）、従来の技術のように測定機器に備える必要がない。従って、偏光要素を含まない標準マイクロプレート蛍光光度計が本発明の蛍光偏光アッセイに使用できる。蛍光エネルギー転移アッセイの場合においても、標準マイクロプレート蛍光光度計が使用でき、および光吸収アッセイの場合は標準マイクロプレートリーダーが使用できる。図１０の断面図は蛍光偏光アッセイ間に液体生物試料３８で満たされた一つの試料セル２２の試料室２４を示している。この例において、シール３６はプラスチック偏光フィルムから作られており、アッセイの間、共焦点偏光子として働いている。ＤＮＡカード２０の上層４４は透明な非偏光ＣＡＢで作られている。操作中、非偏光ビーム５８が液体生物試料３８を含む試料セル２２に対して向けられる。非偏光ビームが偏光シール３６を通過すると、透過した光ビーム６０は単一の偏光である。液体生物試料３８中の蛍光性ＤＮＡプローブが偏光されたビーム６０で励起され、種々の偏光の光（矢印６２により示されている）を放出する。しかしながら、同一の偏光シール３６はこれらの発光を励起ビーム６０の面と平行な面に偏光し、生じる偏光ビーム６４が蛍光光度計により検出される。このようにして、蛍光光度計それ自身には偏光要素を必要とせずに共偏光法の条件が満たされる。図１１は時間に関して均質ＤＮＡ増幅およびアッセイ反応が示す典型的な関係のグラフである。この関係は蛍光偏光、蛍光エネルギー転移（蛍光強度）または光吸収に対するどのアッセイ試薬が使用されても同じである。反応が初期の対数部分６６および最後の直線部分６８を示すことをグラフは示している。図１２は図１１のグラフと同様のグラフであるが、三つの異なった濃度のゲノムに対する曲線を含んでいる。使用された濃度は単位容量当たり１０ゲノム、１００ゲノムおよび１０００ゲノムである。典型的なＤＮＡプローブアッセイが完全に増幅された試料に対して実施された（その場合それらは終末点反応である）。ＤＮＡ増幅反応は典型的には、開始ゲノム数には関係せずに最大数のアンプリコンを産生する。図１２において、１０００ゲノム曲線はその対数期７０を１００ゲノム曲線がその対数期７２を示す時間の前に示していることをみることができる。同様に１００ゲノム曲線はその対数期７２を１０ゲノム曲線がその対数期７４を示す時間の前に示している。しかしながら、ｔ（終末点）と付けられた時間では三つすべての曲線の数量は非常に類似しており、縦軸に点ａ、ｂおよびｃで示されたように１０００ゲノム、１００ゲノムおよび１０ゲノム間では小さな相違のみしか存在しなかった。ｔ（終末点）での最終読みとりを単純に採用するよりむしろ、図１２の曲線の一つにより表された全時間（即ちｔ₀およびｔ（終末点）間）の蛍光強度データを蓄積することにより、蛍光偏光アッセイの情報がより早くおよびよりよい精度で手に入れることができる。さらに、種々の異なったプロトコールが使用できる。例えば、決められた大きさ（図１２の点ｄ）までの時間を測定することにより、時間ｔ₁で１０００ゲノム曲線が最初に検出されるであろうし、１００ゲノム曲線（時間ｔ₂）からのその分割が増加されることが観察でき、時間ｔ₃での１０ゲノム曲線からの１００ゲノム曲線の分割も同様である。もしくは、全時間での三つの曲線の大きさを試験すると、三つの曲線の相違を分けるために測定をするｔ（終末点）より良好な多くの所が存在することが示される。例えば、もし時間ｔ₁をとると、ｔ（終末点）より１０００ゲノム曲線および１００ゲノム曲線間により良好な分割が存在し、時間ｔ₂では１００ゲノム曲線および１０ゲノム曲線間に類似の分割の増加が存在する。前に指摘したように、ＤＮＡカード２０が使用される測定機器の性質はＤＮＡカード２０それ自身の構築に依存して変化するであろう。偏光要素を含んでいるＤＮＡカード２０の実施態様では、適した熱制御を持つ典型的なマイクロプレート蛍光光度計が使用できる。偏光要素を含んでいないＤＮＡカード２０の実施態様では、そのような要素を含む測定機器が必要とされる。そのような機器の例が図１３−１５に示されている。最初に図１３を参照すると、測定機器８０が透視図として示されており、本機器にＤＮＡカード２０が受け入れられる様式を示すために一部が切り取られている。ＤＮＡカード２０は最初に機器の前部分８２へ引き出せた加熱されたキャリヤー８１に置かれ、続いて機器の内部の示された位置へ自動的に引き入れられる。この位置で（図１４の拡大図でより詳細に示されている）、ＤＮＡカード２０は６３０ｎｍ、６６０ｎｍおよび６９０ｎｍのような異なった波長の三つの偏光レーザーダイオード源８４の下に位置されている。モーター８６は六つの位置に偏光フィルターを持つ円盤８８を選択的に回転させて、問題とする試料セル２２上に偏光波長フィルター９０、９２、９４および９６（二つのフィルターは見ることができない）を位置させる。これらのフィルターは種々の蛍光ＤＮＡプローブの発光と一致しており、導入または源ビームの偏光面に対して平行および垂直の両方の面で光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器９８によりこれらの波長の検出および測定を可能にする。加熱されたキャリヤー８１は試料セル２２の異なったセルへアドレスするためｘおよびｙ方向へ指示される。図１５は図１３および１４のＤＮＡカード２０の正面またはエッジオン図であり、ＤＮＡカード２０の特定の試料セル２２に向けられた平行導入ビーム１００を提供する単一の源８４を示している。このビームはレーザーダイオード源により発生されている結果として単色であり、偏光されている。もし他の型のビーム源を用いるならば、偏光子および波長フィルターが必要とされる。導入ビーム１００により励起された場合、ＤＮＡカード２０の試料セル２２中の蛍光性ＤＮＡプローブは光１０２を発光する。光１０２はフィルター円盤８８の偏光子および波長フィルターを通って検出および測定のためのＰＭＴ光検出器９８まで通過する。ＤＮＡカード２０が構築されるであろういくつかの異なった方法の例が以下に提供される。これらの実施例は単に例示であり、本発明の範囲を制限するものではないことを理解しなければならない。実施例１ＤＮＡカード２０は透明な、非偏光ＣＡＢから作られた上層４４、ブラックＰＶＣから作られた中間層４２および透明な、非偏光ＣＡＢから作られた下層４０を含んでいる。シーリングストリップ３２は図９Ａに示された外形を持っており、随意の光学的に透明な感圧接着剤で一つの面が被覆されたプラスチック偏光フィルムから作られている。得られたＤＮＡカード２０は偏光要素を持たない標準マイクロプレート蛍光光度計を使用することができる。実施例２ＤＮＡカード２０はプラスチック偏光フィルムから作られた上層４４、ブラックＰＶＣから作られた中間層４２および透明な、非偏光ＣＡＢから作られた下層４０を含んでいる。シーリングストリップ３２’はブラックＰＶＣで作られ、図９Ｂに示された外形を持っている。得られたＤＮＡカード２０は偏光要素を持たない標準マイクロプレート蛍光光度計を使用することができる。実施例３ＤＮＡカード２０の上層４４、中間層４２および下層４０はすべて透明な、非偏光ＣＡＢから作られている。シーリングストリップ３２は図９Ａに示された外形を持っており、感圧接着剤をつけた透明な、非偏光ＣＡＢから作られている。蛍光偏光アッセイ試薬を持つ構築物の場合、得られたＤＮＡカード２０は例えば、図１３−１５に示したような偏光要素を含む測定機器中で使用される。もしくは、蛍光エネルギー転移アッセイ試薬の場合、この実施例は典型的なマイクロプレート蛍光光度計で測定されるＤＮＡカード２０が得られる。この実施例はまた、光吸収試薬での構築にも適しており、それは典型的なマイクロプレートリーダーで測定できる。実施例４ＤＮＡカード２０は透明な、非偏光ＣＡＢから作られた上層４４、およびブラックＣＡＢから作られた中間層４２および下層４０を含んでいる。シーリングストリップ３２は図９Ａに示された外形を持っており、感圧接着剤をつけたプラスチック偏光フィルムから作られている。得られたＤＮＡカード２０は通常のマイクロプレート蛍光光度計を使用することができる。実施例５ＤＮＡカード２０の上層４４、中間層４２および下層４０は実施例４に記載した通りである。しかしながら、シーリングストリップ３２’は図９Ｂに示された外形を持っており、感圧接着剤をつけた透明な、非偏光ＣＡＢから作られている。得られたＤＮＡカード２０は例えば、図１３−１５に示したような偏光要素を含む測定機器中で使用される。実施例６ＤＮＡカード２０の上層４４、中間層４２および下層４０は実施例３に記載した通りであり、およびシーリングストリップ３２は図９Ａに示された外形を持っている。しかしながら、シーリングストリップ３２は感圧接着剤をつけたプラスチック偏光フィルムから作られている。得られたＤＮＡカード２０は通常のマイクロプレート蛍光光度計を使用することができる。以上は本発明の例示であり、本発明に含まれる装置および方法の多くの代替物が当業者には明らかになるであろうように、本発明を制限すると解釈してはならない。従って本発明は以下の請求の範囲およびそれらに含まれる請求の範囲の均等物により定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．液体生物試料を受け入れるための試料セル、該試料セルは試料室および該液体生物試料を該試料室内へ加えるための試料入り口を持っている；および乾燥核酸増幅試薬および乾燥均質核酸アッセイ試薬、該試薬は該液体生物試料と反応させるため該試料室の内部に接着されている：を含む液体生物試料に対して均質核酸増幅および核酸アッセイを実施するための装置。２．該乾燥核酸増幅試薬および該均質核酸アッセイ試薬が該試料室の内部表面に接着された単一スポットの形で提供される請求項１に記載の装置。３．該液体生物試料が該試料室に加えられた後に該試料入り口を封じるために該試料室に付着可能なシーリング部材をさらに含む請求項１に記載の装置。４．該均質核酸アッセイ試薬が蛍光偏光アッセイ試薬を含み、および該試料セルの少なくとも一部が該試料室の液体生物試料中で起こっている蛍光偏光反応の外部検出を可能にするように十分に光透過性である請求項１に記載の装置。５．該均質核酸アッセイ試薬が蛍光偏光アッセイ試薬を含み；該試料セルの少なくとも一部が該試料室の液体生物試料中で起こっている蛍光偏光反応の外部検出を可能にするように十分に光透過性であり；および該シーリング部材が光透過性物質で作られておりおよび該試料室の光透過性部分に付着可能である請求項１に記載の装置。６．該シーリング部材の少なくとも一つおよび該試料室の該光透過性部分が光偏光物質で作られている請求項５に記載の装置。７．該試料室がさらに該試料室内への該液体生物試料の添加の間に該試料室から置き換えられるべき空気のための通気孔を含む請求項１に記載の装置。８．該試料セルが該試料室の底壁を形成する下層、該試料室の側壁を形成する隙間を持つ中間層および該試料室の上壁を形成する上層を持つ実質的に平坦な積層カード様部材に形成され、該試料入り口は該上層に形成されており；および該試料セルが該カード様部材の長さおよび幅に渡って二次元的配列で配置された多数の実質的に同一の試料セルの一つである請求項１に記載の装置。９．液体生物試料が該試料室へ加えられた後、該試料入り口を封じるためのシーリング部材をさらに含み、該シーリング部材が柔軟な物質の層の下面に保持された感圧接着剤により該薄板の上層へ付着できる柔軟な層を含む請求項８に記載の装置。１０．液体生物試料を受け入れるための少なくとも一つの試料セルを持つ実質的に平坦なカード様部材、該試料セルは試料室、該試料室へ該液体生物試料を加えるための試料入り口、該試料室内への該液体生物試料の添加の間に該試料室から置き換えられるべき空気のための通気孔および該液体生物試料と反応させるため該試料室の内部表面に付着された乾燥試薬を持っており；および該試料室へ該液体生物試料が加えられた後、該試料入り口および該通気孔を封じるための該カード様部材に付着可能なシーリング部材から成る液体生物試料に生物学的過程を実施するための装置。１１．該カード様部材が向かい合う上および下表面を持ち、および該試料入り口および該通気孔が両方とも該カード様部材の上表面に形成されている請求項１０に記載の装置。１２．該カード様部材が該試料室の底壁を形成する下層、該試料室の側壁を形成する隙間を持つ中間層および該試料室の上壁を形成する上層を持つ積層を含み、該試料入り口および該通気孔が該上層に形成されている請求項１０に記載の装置。１３．該シーリング部材が柔軟な物質の層の下面に保持された感圧接着剤により該薄板の上層へ付着できる柔軟な層を含む請求項１２に記載の装置。１４．該乾燥試薬が該液体生物試料と反応して光学指標を産生し、および該光学指標の外部的検出を可能にするために該試料室上の領域で該シーリング部材および該上層が十分に光透過性である請求項１３に記載の装置。１５．該乾燥試薬が核酸蛍光偏光アッセイ試薬を含んでいる請求項１４に記載の装置。１６．該試料セルが一般的に該カード様部材の面に平行な方向に伸びた形を持ち、該試料入り口が該試料セルの一つの末端に位置しおよび該通気孔がその反対の末端に位置している請求項１０に記載の装置。１７．該試料セルが該カード様部材の長さおよび幅に渡って二次元的配列で配置された多数の実質的に同一の試料セルの一つである請求項１０に記載の装置。１８．液体生物試料を受け入れるための試料セル、該試料セルは試料室および該液体生物試料を該試料室内へ加えるための試料入り口を持っている；および該液体生物試料と反応させるため該試料室の内部表面に接着されている乾燥核酸蛍光偏光アッセイ試薬から成る液体生物試料に対して核酸蛍光偏光アッセイを実施するための装置であって；ここで該試料セルの少なくとも一部は該試料室の液体生物試料中で起こっている蛍光偏光反応の外部検出を容易にするために十分に光透過性の光偏光物質から作られている。１９．該試料セルの該部分が該液体生物試料が該試料室に加えられた後に該試料入り口を封じるために該試料室に付着可能なシーリング部材を含む請求項１８に記載の装置。２０．該試料セルが該試料室の底壁を形成する下層、該試料室の側壁を形成する隙間を持つ中間層および該試料室の上壁を形成する上層を持つ実質的に平坦な積層カード様部材に形成され、該試料入り口は該上層に形成されており；および該試料セルの該部分が該積層カード様部材の上層を含む請求項１８に記載の装置。２１．該試料セルが該カード様部材の長さおよび幅に渡って二次元的配列で配置された多数の実質的に同一の試料セルの一つである請求項２０に記載の装置。２２．該液体生物試料と反応させるために該試料室の内部表面に接着された乾燥核酸増幅試薬をさらに含む請求項１８に記載の装置。２３．液体生物試料を光透過性部分を持つ試料セル内へ導入し；該液体生物試料を乾燥核酸増幅試薬および均質核酸蛍光偏光アッセイ試薬と該試料セル内で接触させ；該試料セルを封じ；該液体生物試料と乾燥核酸増幅試薬および均質核酸蛍光偏光アッセイ試薬を反応させるために該試料セルをインキュベートし；そして該試料セルの該光透過性部分を通して該液体生物試料中の蛍光偏光を検出する工程からなる、液体生物試料に対する統合された核酸増幅および均質核酸蛍光偏光アッセイの実施法。２４．該液体生物試料中の蛍光偏光を検出する工程が該試料セルの該光透過性部分を通して偏光光を向けることを含む請求項２３に記載の方法。２５．該試料セルの該光透過性部分が光偏光物質で作られ、および該液体生物試料中の蛍光偏光を検出する工程が該光透過性部分を通して非偏光光を向けることを含む請求項２３に記載の方法。２６．乾燥核酸増幅試薬を含む試料セルを核酸増幅に適した温度まで前もって加熱し；該前もって加熱した試料セル内へ液体生物試料を導入して該液体生物試料と該乾燥核酸増幅試薬を接触させ；該液体生物試料の温度を該前もって加熱した試料セルの温度と平衡化し；そして該温度平衡が実質的に完了した後、該試料セルで該核酸増幅反応を開始させる工程からなる、液体生物試料に対する核酸増幅反応の実施法。２７．該液体生物試料の温度の該前もって加熱した試料セルの温度への平衡化工程が該試料セルおよび該液体生物試料間の熱輸送を促進するため該試料セル中で該液体生物試料の薄層を形成させることを含む請求項２６に記載の方法。２８．該温度平衡化が起こるのに必要とされる時間が該液体生物試料が該乾燥核酸増幅試薬を溶解させるのに必要な時間と実質的に同じである請求項２６に記載の方法。