JPH10508593A - 抗体クラス特異的干渉除去剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される組成物に関し、該組成物は、免疫グロブリンクラスＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥの一つまたはいくつかから抗体をクラス特異的に検出するための免疫学的方法において干渉を少なくするための試薬として適する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体クラス特異的干渉除去剤 本発明は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成され る組成物に関し、これは、免疫グロブリンクラスＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥの一つ またはいくつかから抗体をクラス特異的に検出するための免疫学的方法における 干渉を減少させるための試薬として適する。 哺乳類生物は、抗原に対して防御するために免疫系のＢ細胞によって形成され る種々のクラスの抗体を含む。抗体分子は、各々、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖 から成り、互いにジスルフィド架橋によって連結している、４本のポリペプチド 鎖の１組または数組で構成されている。 抗体は一般に、Ｇ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥのクラスに分類される。これら５つの 免疫グロブリンクラスは、そのＨ鎖が異なり、それぞれγ、μ、α、δおよびε 鎖とよぶ。さらに、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの場合は免疫グロブリンサブク ラスもある。 ＩｇＧクラスの抗体は、正常なヒト血清の全免疫グロブリンの70〜75%（８〜1 6mg/mlに相当）を構成し、主に、感染に対する生物の二次免疫応答として形成さ れる。 ＩｇＭクラスの抗体は、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約10%を構成し 、五量体構造を有する。この抗体は、感染後、非常に早く出現するので、その測 定は、病気の初期検出に重要である。 ＩｇＡの免疫グロブリンは、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約15〜20% を形成し、唾液、乳および尿生殖領域の分泌物における最も重要な分泌免疫グロ ブリンである。 ＩｇＤクラスの抗体は、循環しているＢ細胞の膜上に位置し、自己免疫疾患に おいて役割を果たしていると考えられる。 ＩｇＥクラスの抗体は、血清中に極少量でのみ存在するが、喘息および枯草熱 などの多くのアレルギー反応において重要な役割を有する。 免疫グロブリンのクラス特異的測定、すなわち、特定の抗原に結合する選択さ れた一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスまたはサブクラスの抗体の、同 じ抗原に結合する他の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス抗体の存在下での 選択的測定は、急性感染と治癒した感染との区別をし、予後を明確にするための 、特定の病気の検出、例えば感染の初期診断に対して特に重要である。 免疫グロブリンのクラス特異的測定法は、公知である。これに対しては、選択 された抗体クラス、例えば、ヒトＩｇＭのμ鎖に対する抗体に対して特異的な免 疫成分を固体担体に結合し、抗原に特異的な免疫グロブリン成分を、直接または 間接的に標識した抗原との反応によって検出することができる。この種の方法の 欠点は、各々の選択された免疫グロブリンクラスの抗原に非特異的な免疫グロブ リンが、固相抗体に対して、抗原に特異的な分子と競合するということである。 この結果、この量の割合に応じて、結果の歪曲が生じ得る。 従来の方法のさらに別の欠点は、サンプルを免疫成分と固体担体上でインキュ ベートした後および抗原に特異的な免疫成分との反応の前に洗浄工程が必要であ ることである。これは、誤差の原因となり得るものであり、試験時間をかなり増 加させる。 欧州特許出願公告公報第0292810号は、サンプル液体中の免疫グロブリンクラ スＭ、Ａ、ＤおよびＥの一つに由来する、抗原に特異的な抗体の測定法を開示し ており、該方法では、抗−ヒトＩｇＧ、集合性ヒトもしくは動物ＩｇＧ、または γ−Ｆｃフラグメントから選択されるＩｇＧクラスの抗体による干渉を避けるた めに、干渉除去剤が添加される。干渉除去剤は、サンプルに存在する特異的Ｉｇ Ｇ抗体の抗原結合を除去し、リウマチ因子の活性を抑制するためのものである。 しかし、干渉を除去するための欧州特許出願公告公報第0292810号による試薬 にはいくつかの欠点がある。すなわち、不溶性免疫複合体が生じてサンプルを混 濁させ、測定を妨害する可能性がある。特に、開示された試薬は、ＩｇＧの抗原 結合部位を遮蔽しないので、たとえ沈降が生じても、抗原結合はまだ存在し、従 って試験はさらに歪曲され得る。さらに、抗−ヒトＩｇＧ抗体を使用する場合は 、試薬の濃度を正確に調整しなければならない。なぜならば、過剰にあると、沈 殿の溶解が生じ得るからである。 本発明の目的は、従来の欠点を少なくとも実質的に回避することである。 この目的は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成さ れる組成物を提供することによって達成され、該組成物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ ｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥクラスの一つまたはいくつかの免疫グロブリンのＨ鎖 のＦｄ部分に対して特異的であり、これらの免疫グロブリンの抗原結合能を少な くとも実質的に遮蔽する。 抗−Ｆｄ試薬は、抗原結合部位とヒンジ部との間（Ｖ_H領域およびＣ_H ¹ドメイ ン；図１参照）にある、免疫グロブリンのＨ鎖の遮蔽すべき領域に結合する。結 合部位は、好ましくは、免疫グロブリンのＣ_H ¹ドメインの定常部、すなわちＣ_{α H} ¹ 、Ｃ_δH ¹、Ｃ_εH ¹、Ｃ_γH ¹およびＣ_μH ¹領域にある（”Kurzes Lehrbuch der Immunologie”，I.M．Roitt; Thieme Verlag，Stuttgart，New York(1987),chap ter 5:”Antikorper: Strukture und Funktion”，p.49 ff参照）。これらのド メインのアミノ酸配列は、例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immuno logical Interest，第５版（1992），US Department of Health and Human Serv ices，USAに記載されている。 本発明に係る組成物の作用は、特に、Ｈ鎖のＦｄ部分の種々の領域に結合する いくつかの異なる抗体または抗体フラグメントの存在により、関与する抗体の抗 原結合の可能性を強く遮蔽して、もはや特異的結合相手、すなわち抗原を認識す ることができないようにすることである。 組成物は、Ｈ鎖のＦｄ部分に対して特異的である。すなわち、Ｌ鎖、すなわち κまたはλ鎖のＦｄ部分と反応することができる成分を実質的に含まない。免疫 グロブリンのＬ鎖との最大交差反応性は、Ｈ鎖との反応性に対して好ましくは10^-1 、特に好ましくは10^-2である。 本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、抗原結合能が好 ましくは少なくとも50%、特に好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なく とも99%阻害されるように遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰に添加する ことができる。 本発明に従って使用される組成物は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、 ＩｇＤおよびＩｇＥクラスから選択される第一の免疫グロブリンクラスに対して 特異的であり、別の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が第一の免疫グロ ブリンクラスに対する反応性に対して10^-2、特に好ましくは10^-3である。 本発明の好ましい態様では、抗体および／または抗体フラグメント組成物は、 特にヒト免疫グロブリンＧにおける免疫グロブリンＧのＨ鎖のＦｄ部分に対して 特異的である。この組成物は、ＩｇＧクラスの抗体の存在下、ＩｇＭ、ＩｇＡ、 ＩｇＤおよびＩｇＥクラスの一つまたはいくつかに由来する抗体のクラス特異的 測定に適する。そのような組成物は、好ましくは、ＩｇＭなどの他の免疫グロブ リンクラスとの最大交差反応性が、ＩｇＧに対する反応性に対して10^-2、特に好 ましくは10^-3である。 本発明の別の好ましい態様は、ＩｇＭクラスの免疫グロブリンのＨ鎖のＦｄ部 分に対して特異的である組成物であり、例えば、ＩｇＧクラスの抗体の選択的な クラス特異的測定に対して使用することができる。 いくつかの用途に対しては、組成物がヒト免疫グロブリンに対して種特異的で あり、ヒト以外の免疫グロブリンとの最大交差反応性が、ヒト免疫グロブリンに 対する反応性に対して10^-2、特に好ましくは10^-3であるのが好ましい。 本発明に従って使用する組成物は、抗体および／または抗体フラグメントで構 成される。組成物は、好ましくは、一価の抗体フラグメント、例えば、抗体のパ パインによる酵素分解および分解産物のその後の分別によって得られるＦａｂフ ラグメントで構成される。一価の抗体フラグメントで構成される組成物を使用す ると、遮蔽された抗体の沈降が回避される。 本発明に係る組成物は、各々、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｄ部分の異なる領域 に対して特異的であるいくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで 構成される。組成物は、好ましくは、ポリクローナル抗体および／または抗体フ ラグメントで構成されるが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、特に 好ましくは少なくとも４つの異なるモノクローナル抗体および／または抗体フラ グメントの混合物で構成することもできる。 本発明に係るポリクローナル抗体および／または抗体フラグメント組成物は、 （ａ）実験動物を第一の免疫グロブリンクラスからの免疫グロブリンのＨ鎖のＦ ｄ部分を含む免疫原で免疫感作し； （ｂ）ポリクローナル抗血清を実験動物から得て； （ｃ）ポリクローナル抗血清を必要により、分解によって一価の抗体フラグメン トに変換し； （ｄ）抗血清または一価の抗体フラグメントを、第一の免疫グロブリンクラスの Ｈ鎖のＦｄ部分に対して特異的である抗体および／または抗体フラグメントの選 択を可能にする一工程または数工程の免疫収着(immunosorption)に供し；そして （ｅ）第一の免疫グロブリンクラスのＦｄ部分に対する特異性を有する抗体また は抗体フラグメント組成物を単離する； 方法によって得ることができる。 適する免疫原の使用を適する免疫収着工程の実行と組み合わせると、一つまた はいくつかの選択された免疫グロブリンクラスのＨ鎖のＦｄ部分に対して特異的 であり、好ましくは、他の免疫グロブリンクラスまたは選択されたクラスと全く 異なる種に由来する免疫グロブリンとの交差反応性を本質的に持たない、抗体ま たは抗体フラグメント組成物を単離することができる。免疫原としては、例えば 、全抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ）’₂のような酵素分解により生 じる抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントなどの抗体フラグメント、 ペプチドエピトープあるいはそれらの混合物を使用することができる。抗体Ｆｃ 成分を含まない免疫原の使用が好ましい。こうして、実験動物、例えばヒツジ、 ウサギまたはマウスにおける抗−Ｆｃ抗体の生成を実質的に回避することができ る。 本発明に係る方法の免疫収着工程は、好ましくは、（ｉ）第一の免疫グロブリ ンクラスのＨ鎖のＦｄ部分を含む抗原に対する少なくとも一つの正の(positive) 免疫収着、および第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のＦｄ部分を特異的に認識 する組成物の結合成分の単離を含む。免疫グロブリンＧのＨ鎖のＦｄ部分、例え ばＦａｂフラグメントを含む免疫原を使用する場合は、抗血清または抗体フラグ メントを、免疫グロブリンＧまたはＦｄ部分を含むそのフラグメントに対する正 の免疫収着に供する。全免疫グロブリンを免疫原として使用した場合は、Ｆｃを 含まない抗原、例えばＦａｂフラグメントを正の免疫収着に使用するのが好まし い。 免疫収着工程は、好ましくは、さらに、（ii）第一の免疫グロブリンクラスと は異なる免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少な くとも一つの負の(negative)免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む 。この負の免疫収着は、実質的に、組成物の、Ｌ鎖のＦｄ部分との交差反応性お よび他の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のＦｄ部分との交差反応性を減少させる。 免疫グロブリンＧのＦｄ部分に対して特異的な組成物を作製するために、ＩｇＭ 、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび／またはＩｇＡあるいはそれらの成分に対して負の免疫 収着を行うことができる。ＩｇＧの存在下でのＩｇＭの選択的測定のための干渉 除去剤を作製しようとする場合は、ＩｇＭまたはその成分に対して一工程または いくつかの工程の免疫収着を行う。 必要により、免疫収着工程はさらに、（iii）正の免疫収着工程（ｉ）におけ る免疫グロブリンの種とは異なる種の第一の免疫グロブリンクラスから選択され る抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の 非結合成分の単離を含むことができる。この工程は、免疫グロブリンクラスは同 じであるが、別の種に由来する検出抗体を使用するイムノアッセイにおいて組成 物を後で使用すべき場合に行うと好ましい。好ましくは、正の免疫収着（ｉ）を ヒト免疫グロブリンに対して行い、負の免疫収着（iii）をヒト以外の種、例え ばマウスの免疫グロブリンに対して行う。ヒト免疫グロブリンＧのＦｄ部分に対 して特異的である組成物を作製する場合、負の免疫収着工程(iii)は、ヒト以外 の種の免疫グロブリンＧに対して行う。 免疫収着工程は、好ましくは、各ケースで使用する抗原を固定化したカラム上 での吸着クロマトグラフィーにより行う。精製した抗原調製物を得る方法および 抗体または抗体フラグメントを担体物質上に固定化する方法は、当業者には周知 である（例えば、欧州特許出願公開公報第0394819号の特に実施例７参照）。 本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、好ましくは、他 のクラスの抗体によって引き起こされる干渉を抑制するために、ＩｇＧ、ＩｇＭ 、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥクラスの抗体の選択的クラス特異的測定 のためのイムノアッセイで使用することができる。これに対しては、特定の抗原 、例えばウイルスまたは細菌の抗原に対する特定の免疫グロブリンクラス（例え ば、ＩｇＭ）の抗体のクラス特異的定量を行うために測定すべきヒト血清または 血漿サンプルを、例えば、本発明に係るＩｇＧ−特異的組成物と、好ましくは前 希釈 工程の後に混合すると、サンプルに存在する特異的および非特異的ＩｇＧが本質 的に完全に遮蔽され、続く免疫学的検出において、サンプル中のＩｇＧではなく ＩｇＭのみが検出される。こうすると、別の抗体クラスの特異的部分による干渉 を受けることなく、特定の抗体クラスの特異的部分の示差的定量が可能になる。 本発明に係る組成物の使用により、洗浄工程を含まない一工程試験法が可能とな る。 すなわち、本発明の目的は、また、他の免疫グロブリンクラスも含むサンプル 液の選択された一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗 体の免疫学的検出法であり、該方法は、他の免疫グロブリンクラスによって引き 起こされる干渉を抑制するためにサンプル液を本発明組成物とインキュベートし 、次いで、サンプル液中の検出すべき選択されたクラスの抗体の有無および／ま たは量を測定することを特徴とする。組成物は、好ましくは、サンプル液中に存 在する他の免疫グロブリンクラス、すなわち選択されていない免疫グロブリンク ラスの抗体と比較して活性成分が少なくとも５倍モル過剰である量で添加する。 組成物は、好ましくは、10〜1000倍モル過剰に添加する。前インキュベーション の時間は、好ましくは5〜60分、特に好ましくは10〜30分である。 特異的抗体の測定のための免疫学的試験法は、反応性固相ならびに検出すべき 抗体に結合可能な二つのレセプターＲ₁およびＲ₂（Ｒ₁は、固相に結合し、また は固相に結合可能であり、Ｒ₂は、間接的または直接的に標識されている。）の 存在下、不均一イムノアッセイの原理に従って行うと特に好ましい。検出すべき 抗体は、次いで、必要により固相およびインキュベーション液を分離した後、固 相および／またはインキュベーション液中の標識を測定することにより測定する ことができる。 検出すべき抗体と特異的に反応する抗原と固相結合基とのコンジュゲートは、 固相レセプターＲ₁として使用することができる。この場合、レセプターＲ₂は、 検出すべき抗体と特異的に反応する抗原または選択した抗体クラスを認識する抗 体、例えば抗−ＩｇＭ抗体もしくは適切な抗体フラグメントのどちらであっても よい。レセプターＲ₂は、直接的または間接的に標識することができる。すなわ ち、標識基に結合させることもできるし、標識基を有するさらに別のレセプター に結合させることもできる。 また、選択した抗体クラスを認識する抗体または適切な抗体フラグメントと固 相結合基とのコンジュゲートを固相レセプターＲ₁として使用することもできる 。この場合は、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原を、標識したレセプター Ｒ₂として使用する。 好ましくは、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相およびこの固 相に結合し得るビオチニル化レセプターＲ₁を使用する。発色団物質、放射性同 位体、酵素、ＮＭＲ−標識またはその分野で現在知られている他のあらゆる標識 を標識として使用することができる。好ましくは発光金属複合体が使用され、標 識は、電気化学発光によって測定することができる。発光金属複合体ならびに電 気化学発光測定の方法および装置は、欧州特許出願公開公報第0199804号、欧州 特許出願公開公報第0580979号、国際公開公報第87/06706号、国際公開公報第90/ 05301号、国際公開公報第90/11511号および国際公開公報第92/14138号に記載さ れており、それらの開示は本明細書で引用する。酵素（例えば、ペルオキシダー ゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）は別の好ましい標識 であり、標識は、各々の酵素反応の検出によって測定することができる。 本発明のさらに別の目的は、本発明の組成物を含む一つまたはいくつかの選択 した免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗体の選択的免疫学的検出のための 試薬である。 本発明は、下記実施例および図面によってさらに説明する。 図１は、Ｈ鎖のＦｄ部分に対するＦａｂフラグメント（＜ｈ−Ｆｄγ＞Ｆａｂ ）のヒトＩｇＧ（ｈ−ＩｇＧ）への結合を示す。 図２は、実施例４で行った電気化学発光による抗−ＨＢｃ ＩｇＭのクラス特 異的検出の試験原理を示す。 図３は、抗−ＨＢｃ ＩｇＭの電気化学発光によるクラス特異的検出の別の試 験原理を示す。実施例１ 本発明に係る試薬の調製 １．１ 免疫原の作製 免疫グロブリンＧ画分を標準的常法によってヒト血清から精製する。この精製 は、例えば、アエロシル脱脂、硫酸アンモニウムによる沈殿、ＤＥＡＥ−セファ ロースＦＦによるクロマトグラフィーおよび必要により固定化ＩｇＧ−特異的ポ リクローナル抗体上での免疫収着によって行うことができる。 このようにして精製した免疫グロブリン画分は、パパインによってＦａｂおよ びＦｃフラグメントに分解する。分解は、好ましくは、ｐＨ７、37℃で、ＩｇＧ 濃度を10mg/mlとし、40mU/mlのパパイン、７および10ミリモル/lのシステインに より行う。Ｆａｂ部分は、Ｆｃ部分をＤＥＡＥ−セファロースＦＦクロマトグラ フィーおよびゲルクロマトグラフィー（例えば、セファクリルTSK S200およびS3 00）により除去して精製する。Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、免疫反応を 高めるために、担体タンパク質、例えばマレイミド−活性化キーホールリンペッ トヘモシアニン（Boehringer Mannheim，Biochemica カタログ、注文No..137643 8）に結合させる。この場合、Ｆａｂフラグメントは、最初に、１：６のモル比 でＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）により 活性化する。担体タンパク質は、活性化Ｆａｂフラグメントと１：１のモル比で 結合させる。 他の免疫グロブリンクラスのＦａｂフラグメント（例えば、Ｆａｂμ）は、対 応する方法で作製することができる。 １．２ ヒツジの免疫感作 ヒツジを、実施例１で作製した免疫原を使用して、標準的方法により免疫感作 する。これらのヒツジは、免疫反応において、ヒトＦａｂに対するポリクローナ ル抗体を形成し、これはヒトＦａｂのＬ鎖部分およびＨ鎖部分に結合するもので ある。 免疫感作したヒツジから粗血清を取り出し、これからＩｇＧ画分をすでに記載 されている方法により単離する。 １．３ Ｆｄ−特異的試薬の作製 ヒツジの免疫グロブリンＧ画分を、パパインによってタンパク質分解的に分解 する。Ｆａｂフラグメントを他の分解産物から、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマト グラフィーにより分離する。 Ｈ鎖のＦｄ部分に結合する成分を、いくつかの免疫収着工程によって、ヒツジ の全Ｆａｂ画分から精製する。 ヒトＩｇＧのＬ鎖（κまたはλ）に対して特異的に結合する成分は、ＩｇＧお よびＩｇＭのＬ鎖の定常部が相同であるので、その上にヒトＩｇＭを固定化した 免疫吸着剤に必要により数回通すことにより除去することができる。Ｌ鎖に結合 する成分はカラムに吸着されるが、Ｈ鎖のＦｄ部分に結合する成分はカラム溶離 液中にある。ポリクローナルＩｇＭを結合させたスフェロシルカラムをカラムと して使用する。使用する緩衝液は、例えば、ＰＢＳ／アジド（50ミリモル/lのリ ン酸カリウム、ｐＨ7.5；150ミリモル/lのＮａＣｌ；0.1%のアジ化ナトリウム） である。 ＩｇＭカラムからの非結合画分をプールし、ヒトＩｇＧを固定化した別の免疫 吸着剤に、必要により数回繰り返して通した。抗−ＦｄヒツジＦａｂの特異的画 分を、非特異的ヒツジＦａｂ画分からこのカラム上で分離することができる。Ｆ ｄ−特異的ヒツジＦａｂはこのカラムに結合し、溶離緩衝液、例えば１モル/lの プロピオン酸によって溶離することができる。他の成分は結合しないで、適する 緩衝液（例えば、ＰＢＳ／アジド）によるカラムの洗浄により除去される。 さらに、免疫学的試験で結合相手として通常使用されるマウス抗体との干渉交 差反応性は、固定化マウスＩｇＧを含む免疫吸着剤にさらに通すことにより除く ことができる。調製物の所望成分は、カラム溶離液中にある。 ヒトＦｄγに対して特異的なＦａｂフラグメント（＜ｈ−Ｆｄγ＞Ｆａｂ）の ヒトＩｇＧ（ｈ−ＩｇＧ）への結合を図１に図式的に示す。各ケースでのｈ−Ｉ ｇＧの抗原結合部位は矢印で示す。実施例２ 試薬の純度の試験 Nunc Co.製のマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を、固相または捕獲抗体と してのヒツジＦａｂ−特異的ウサギＩｇＧで被覆した（10μg/mlのウサギＩｇＧ 、炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ9.6、ＰＢＳ緩衝液に溶解した１％のウシ血清ア ル ブミンで再被覆）。分析すべき試薬を、精製したヒトＦａｂγフラグメントまた はヒトＦａｂμフラグメントの調製物の各ケースで濃度を増加（例えば、０〜１ ０μg/ml）させるサンプルとして前インキュベートし、次いで、被覆ＭＴＰに移 した（サンプル体積200μl、室温で２時間インキュベート、緩衝液は１%のウシ 血清アルブミンを含むＰＢＳ）。 ヒトＦｄγに対して特異的であるサンプルのヒツジＦａｂ成分は、存在する可 能性のある不純物と同様に、固相に結合する。それらは、免疫グロブリンのＬ鎖 に結合し、精製中に完全に分離されなかったと考えられる。非結合成分は、ＰＢ Ｓ緩衝液で３回洗浄することにより除去される。 ヒトＦａｂγに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（200μl、50mU /ml）を検出試薬として使用する。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、結合したペ ルオキシダーゼコンジュゲートの酵素活性を、室温で１時間、基質ＡＢＴＳ（登 録商標）とともにインキュベートすることにより引き出し、次いで、405nmで光 度測定により測定した。予め固相に結合させたサンプルのヒツジＦａｂ成分のう ち、ヒトＦａｂに結合する成分のみが酵素マーカーコンジュゲートにより検出さ れる。その結果、ＦａｂμおよびＦａｂγを添加していない対照において、1000 〜3000mAの正の信号が得られる。これは、試験すべき調製物中に存在する、ヒト Ｆａｂに結合するヒツジＦａｂの総量に相当する。ヒトＦａｂγの添加量を多く していったサンプルでは、Ｆｄγ−特異的ヒツジＦａｂの遮蔽により、コンジュ ゲートの排除が増加し、従って、測定される信号曲線は、０またはブランク値に 向かう傾向を有する。これに対して、増加する量のヒトＦａｂμを混合したサン プルでは、Ｌ鎖に結合するヒツジＦａｂ成分のみが遮蔽されるので、この場合、 信号の減少は、所望でない成分がヒツジＦａｂ調製物になおも存在している場合 にのみ起こる。後者の場合は、二つの排除曲線の相違が、調製物中のＦｄγ−特 異的ヒツジＦａｂの実際の量に相当する。 ヒトＦａｂμまたはＦａｂγを添加していないサンプルの測定により、1600mA の吸光度が得られる。サンプル＋Ｆａｂμでは、1500mAの吸光度が得られる。サ ンプル＋Ｆａｂγでは、150mAの吸光度が得られる。実施例３ 酵素イムノアッセイにおけるＦｄ−特異的干渉除去剤の使用 実施例１で調製した抗−Ｆｄγ抗体フラグメント調製物の機能性を調べるため に、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（ＨＢｃ抗原）に結合する抗体（＜ＨＢｃ＞） を含むヒト血清サンプルに抗−Ｆｄγを添加した。次いで、ＨＢｃ抗原を添加し 、インキュベートした。抗−ＨＢｃ−特異的ＩｇＧは、このとき、抗−Ｆｄγに よって遮蔽されていないならば、この抗原と反応し得る。次いで、過剰のＩｇＧ （ＨＢｃ抗原に対して特異的および非特異的）を洗浄により分離した。ＨＢｃ抗 原に結合したＩｇＧは、このとき、ＩｇＧのＦｃγ部分に結合する、ペルオキシ ダーゼ標識抗−ＩｇＧによって検出され得る。 試験手順は次の通りであった。 抗−ＨＢｃ ＩｇＧを含むサンプルを種々の量の抗−Ｆｄγと混合し、室温で 30分間インキュベートした。次いで、サンプルを40ミリモル/lのリン酸塩緩衝液 、ｐＨ7.4でさらに1:100に希釈した。 ストレプトアビジンで被覆した試験容器において、20μlの希釈サンプルを５0 0μlのビオチニル化ＨＢｃ抗原溶液（Enzymuntest（登録商標）抗−ＨＢｃの10 μg/ml）に添加し、10分間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼと抗 −ＩｇＧ抗体との500μlのコンジュゲート（Enzymuntest（登録商標）抗−ＨＣ Ｖの50mU/ml）を添加し、60分間インキュベートして、洗浄した。次いで、1000 μlの基質溶液（Ｈ₂Ｏ₂（過ホウ素酸ナトリウム）、Enzymuntest（登録商標）抗 −ＨＣＶの3.2ミリモル/l）を添加し、60分間インキュベートした。最後に、ES6 00分析機（Boehringer Mannheim GmbH）で吸光度を測定した。 この実験の結果を表１に示す。明らかに、本発明の抗−Ｆｄγ組成物は、Ｉｇ Ｇの抗原結合能を、もはや結合できない程度に変えることが分かる。 実施例４ 電気化学発光による抗−ＨＢｃ ＩｇＭのクラス特異的検出 装置は、国際公開公報第90/05302号に記載された測定に対するものを使用した 。試験原理は、図２に示すが、ヒトＩｇＧに特異的なビオチニル化抗体（＜Ｈ− ＩｇＭ＞Ｂｉ）およびルテニウム複合体で直接標識したＨＢｃ抗原（ＨＢｃ−Ｒ ｕ）の使用に基づく。あるいは、（ルテニル化抗−ＨＢｃ抗体を結合させること により）間接的に標識したＨＢｃ抗原の使用も可能である。ＨＢｃ抗原または抗 体に結合するために使用されるルテニウム複合体および技術は、欧州特許出願公 開公報第0199804号に記載されている。 さらに別の試験原理を図３に示す。それは、ビオチニル化ＨＢｃ抗原（ＨＢｃ −Ｂｉ）およびルテニウム標識化ＨＢｃ抗原（ＨＢｃ−Ｒｕ）の使用に基づく。 手順は次の通りであった。 1000μg/mlの抗−Ｆｄγを含む、または含まない非特異的ヒトＩｇＭ（11μg/ ml）の溶液90μlを10μlの1:100に前希釈したサンプルまたは標準物質と混合し 、37℃で９分間インキュベートした。 次いで、ルテニウム標識化ＨＢｃ抗原およびビオチニル化抗−ヒトＩｇＭ抗体 （ＩｇＧ）を含む100μlの溶液、ならびに50μlのストレプトアビジン−被覆磁 気粒子（Dynal Co．）を添加した。次いで、その混合物を37℃でさらに９分間イ ンキュベートした後、アッセイ緩衝液（200ミリモル/lのリン酸塩、ｐＨ6.8、0. 1%のポリドカノール、0.1%のOxabon A、160ミリモル/lのトリプロピルアミン） とともに、28℃に温度調節した測定セルに移し、そこで測定した。 次いで、サンプル中のＩｇＭ濃度を検量線に基づいて求めた。濃度に関する結 果を表２に示す。 表から分かるように、サンプルにおいて測定されたＩｇＭ濃度は、抗−Ｆｄγ の添加により増加し、その結果、enzymun系（洗浄工程により、ＩｇＧ干渉が生 じない場合）で測定されるＩｇＭ濃度範囲が影響を受ける。 注：サンプル１〜４は、各々、6000、12000、6900および4500U/mlのＨＢｃ− 特異的ＩｇＧを含む。すなわち、かなり過剰である。ＩｇＧによって引き起こさ れる干渉は、Ｆｄγの添加により除去される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レンツ，ヘルムート ドイツ連邦共和国 ディー−82327 チュ ーツィング，フォン−キュールマン−シュ トラーセ 14 (72)発明者 シュミット，ウルバン ドイツ連邦共和国 ディー−82386 オー バーハウゼン，ヴァルドシュトラーセ 36 (72)発明者 クレント，ヴォルカー ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム，アム フィッシャンガー ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのクラスの一つまたはいくつ かからの免疫グロブリンのＨ鎖のＦｄ部分に対して特異的であり、少なくとも実 質的に、これらの免疫グロブリンの抗原結合能を遮蔽する、いくつかの異なる抗 体および／または抗体フラグメントで構成される組成物。 ２．免疫グロブリンＧのＨ鎖のＦｄ部分に対して特異的である、請求項１に記載 の組成物。 ３．遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰で、抗体分子の抗原結合能を少な くとも50%阻害する、請求項１または２に記載の組成物。 ４．遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰で、抗体分子の抗原結合能を少な くとも90%阻害する、請求項３に記載の組成物。 ５．第一の免疫グロブリンクラスに対して特異的であり、他の免疫グロブリンク ラスとの最大交差反応性が、第一の免疫グロブリンクラスに対する反応性に対し て10^-2である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。 ６．ＩｇＧに対して特異的であり、ＩｇＭとの最大交差反応性がＩｇＧに対する 反応性に対して10^-2である、請求項５に記載の組成物。 ７．最大交差反応性が10^-3である、請求項６に記載の組成物。 ８．一価の抗体フラグメントで構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載 の組成物。 ９．Ｆａｂフラグメントで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組 成物。 10．ヒト免疫グロブリンに対して特異的であり、ヒト以外の免疫グロブリンとの 最大交差反応性がヒト免疫グロブリンに対する反応性に対して10^-2である、請求 項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。 11．ポリクローナル抗体および／または抗体フラグメントで構成される、請求項 １〜10のいずれか一項に記載の組成物。 12．（ａ）実験動物を第一の免疫グロブリンクラスからの免疫グロブリンのＨ鎖 のＦｄ部分を含む免疫原で免疫感作し； （ｂ）ポリクローナル抗血清を実験動物から得て； （ｃ）ポリクローナル抗血清を必要により、分解によって一価の抗体フラグメ ントに変換し； （ｄ）抗血清または一価の抗体フラグメントを、第一の免疫グロブリンクラス のＨ鎖のＦｄ部分に対して特異的である抗体および／または抗体フラグメントの 選択を可能にする一工程または数工程の免疫収着に供し；そして （ｅ）第一の免疫グロブリンクラスのＦｄ部分に対する特異性を有する抗体ま たは抗体フラグメント組成物を単離する、 請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物の作製方法。 13．免疫グロブリンのＦｃ成分を含まない免疫原を使用する、請求項12に記載の 方法。 14．免疫収着工程が、（ｉ）第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のＦｄ部分を含 む抗原に対する少なくとも一つの正の免疫収着、および組成物の結合成分の単離 ；ならびに （ii）第一の免疫グロブリンクラスとは異なる免疫グロブリンクラスから選択 される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成 物の非結合成分の単離； を含む、請求項12または13に記載の方法。 15．免疫収着工程がさらに、（iii）正の免疫収着工程（ｉ）における免疫グロ ブリンの種とは異なる種の第一の免疫グロブリンクラスから選択される抗原また はその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の非結合成分 の単離を含む、請求項14に記載の方法。 16．正の免疫収着（ｉ）を第一の免疫グロブリンクラスのヒト免疫グロブリンに 対して行い、負の免疫収着(iii)を第一の免疫グロブリンクラスのヒト以外の種 の免疫グロブリンに対して行う、請求項15に記載の方法。 17．免疫収着工程を固定化抗原を使用して行う、請求項12〜16のいずれか一項に 記載の方法。 18．免疫原は、免疫グロブリンＧのＨ鎖のＦｄ部分を含むものを使用し、正の免 疫収着（ｉ）は、免疫グロブリンＧまたはＨ鎖のＦｄ部分を含むそのフラグメ ントに対して行い、結合成分を単離する、請求項12〜17のいずれか一項に記載の 方法。 19．ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび／またはＩｇＡあるいはそれらの成分に対す る負の免疫収着（ii）を行い、非結合成分を単離する、請求項18に記載の方法。 20．負の免疫収着をＩｇＭまたはその成分に対して行う、請求項19に記載の方法 。 21．ヒト以外の免疫グロブリンＧに対する負の免疫収着（iii）を行い、非結合 成分を単離する、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。 22．ポリクローナル抗血清を、パパインによる分解によりＦａｂフラグメントに 変換する、請求項12〜21のいずれか一項に記載の方法。 23．ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥの抗体の選択的クラ ス特異的測定に対するイムノアッセイにおける、他のクラスの抗体によって引き 起こされる干渉を抑制するための、請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物 の使用。 24．一工程のイムノアッセイにおける請求項23に記載の使用。 25．他の免疫グロブリンクラスの抗体も含むサンプル液体における、一つまたは いくつかの選択した免疫グロブリンクラスからの特異的抗体の選択的免疫学的検 出方法であって、サンプル液体を請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物と 前インキュベートして、他の免疫グロブリンクラスによって引き起こされる干渉 を抑制し、次いで、サンプル液体における選択した検出すべきクラスの抗体の有 無および／または量を測定する方法。 26．組成物を、サンプル液体に存在する他の免疫グロブリンクラスの抗体に対し て活性成分が少なくとも５倍モル過剰となる量で添加する、請求項25に記載の方 法。 27．組成物を10倍〜1000倍モル過剰で添加する、請求項26に記載の方法。 28．前インキュベーションを、５〜60分間行う、請求項25〜27のいずれか一項に 記載の方法。 29．測定を、反応性固相ならびに検出すべき抗体に結合可能な２つのレセプター Ｒ₁およびＲ₂（Ｒ₁は、固相に結合しているか、固相に結合可能であり、Ｒ₂は、 直接または間接的に標識されている。）の存在下で、不均一イムノアッセイの原 理に従って行い、検出すべき抗体を、固相および／またはインキュベーション液 体中の標識を測定することにより測定する、請求項25〜28のいずれか一項に記載 の方法。 30．検出すべき抗体と特異的に反応する抗原および固相結合基のコンジュゲート をレセプターＲ₁として使用し、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原を、直 接または間接的に標識されているレセプターＲ₂として使用する、請求項29に記 載の方法。 31．検出すべき抗体と特異的に反応する抗原および固相結合基のコンジュゲート をレセプターＲ₁として使用し、選択した抗体クラスを認識し、直接または間接 的に標識されている抗体または対応する抗体フラグメントをレセプターＲ₂とし て使用する、請求項29に記載の方法。 32．選択した抗体クラスを認識する抗体または対応する抗体フラグメントおよび 固相結合基のコンジュゲートをレセプターＲ₁として使用し、直接または間接的 に標識され、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原をレセプターＲ₂として使 用する、請求項29に記載の方法。 33．ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した反応性固相およびビオチニル 化レセプターＲ₁を使用する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。 34．発光金属複合体を標識として使用し、標識を電気化学発光によって測定する 、請求項29〜33のいずれか一項に記載の方法。 35．酵素を標識として使用し、標識を酵素反応の検出によって測定する、請求項 29〜33のいずれか一項に記載の方法。 36．請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物を含む、一つまたはいくつかの 選択した免疫グロブリンクラスから特異的抗体を選択的免疫学的に検出するため の試薬。