JPH10505490A - ヒト免疫不全ウイルスの結合により誘導されたコンホメーションが変化したｃｄ４分子に結合する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＤ４⁺細胞の表面に、その細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はそのエンベロープ蛋白質（例えば、ｇｐ１２０）との接触に際して誘導されたコンホメーションの変化した形態のＣＤ４に結合するが、ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質との接触前の細胞の表面上の自然のままのＣＤ４には実質的に結合しない抗体を開示する。この発明の好適な抗体は、モノクローナルＦａｂ断片３−４７及び３−５１である。この発明の抗体を用いる製薬組成物、並びに診断、スクリーニング及び治療方法をも開示する。この発明の抗体は、細胞表面上のコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の検出、ｇｐ１２０結合に際してのこのコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の形成を阻止し又は誘導する薬剤の同定、及びＣＤ４⁺細胞のＨＩＶによる感染の阻止に有用である。ＣＤ４⁺細胞の表面に、その細胞のＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質との接触に際して誘導されるコンホメーションの変化した形態のＣＤ４上に発現された少なくとも１つのエピトープを発現する分子も又、この発明に包含される。かかる分子を用いて、この発明の抗体を生成し及び患者内の細胞のＨＩＶによる感染を阻止する抗体応答をその患者において誘導することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全ウイルスの結合により誘導された コンホメーションが変化したＣＤ４分子に結合する抗体発明の背景 ＣＤ４は、Ｔリンパ球のサブセット（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）の表面に発現される５ ５，０００〜６２，０００ダルトンの分子量を有する膜貫通糖蛋白質である。こ のＴ細胞のＣＤ４⁺サブセットは、Ｔヘルパー又はインデューサー細胞集団の正 体を確認する。抗原刺激の際に、この集団は、Ｔ細胞及びＢ細胞の増殖及び分化 を促進するサイトカインを産生し、それにより、抗体産生及びＴ細胞細胞毒性等 のエフェクター機構を誘導する。Ｔ細胞に加えて、ＣＤ４は又、他の細胞型例え ばマクロファージ及びある種の脳細胞においても発現される。 ヒト免疫不全ウイルスウイルス（ＨＩＶ）を含むある種の感染性病原体の第一 次標的は、表面上にＣＤ４を発現している細胞である。ＣＤ４⁺細胞に対するＨ ＩＶの向性は、膜固定されたウイルス用レセプターとして機能するＣＤ４に帰因 する。従って、ＨＩＶの表面エンベロープ蛋白質により媒介されるＨＩＶのＣＤ ４への結合は、ＣＤ４⁺細胞をＨＩＶの標的とするものであると考えられる。Ｈ ＩＶの主要エンベロープ蛋白質は、前駆体ポリペプチド（ｇｐ１６０）として生 成され、それは、成熟形態では、外膜蛋白質（ｇｐ１２０）及び一層小さい膜貫 通蛋白質（ｇｐ４１）に開裂される（Ratner,L．等(1985)Nature 313:227-284） 。ｇｐ１２０のＣＤ４への結合は、ＣＤ４⁺細胞の感染を開始すると考えられ（D algleish,A.G.等(1984)Nature 312:763-767; Klatzmann,D.等(1984)Nature 312: 767-768）、更に、感染したＣＤ４⁺細胞と未感染ＣＤ４⁺細胞との膜融合（シン シチウム形成と呼ばれる）を開始することができ、これは、ウイルスの細胞−細 胞伝達及びその細胞病理的効果に貢献し得る（Habeshaw,J.A．及びDalgleish,A. G.(1989)J.AIDS 2:457-468; Lifson,J.D．及びEngleman,E.G.(1989)Immunol.Rev .109:93-117）。 ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、及びヒトＣＤ４蛋白質の推定のアミ ノ酸配列が報告された（Maddon,P.J．等(1985)Cell 42:93-104; 及びLittman,D. 等(1988)Cell 55:541 に報告された修正された配列参照）。構造的に、このＣＤ ４蛋白質は、細胞外ドメイン（凡そ、アミノ酸１〜３７５）、膜内ドメイン（凡 そ、アミノ酸３７６〜３９５）及び細胞質ドメイン（凡そ、アミノ酸３９６〜４ ３３）に分けることができる。ＣＤ４は、２５アミノ酸のシグナル配列を有する 前駆体蛋白質として合成される。ＣＤ４細胞外ドメインは、更に、免疫グロブリ ンＶＪ領域に対する相同性を有するＶ１、Ｖ２、Ｖ３及びＶ４と呼ばれる４つの 直列の領域に分けることができる。Ｖ１領域は、凡そアミノ酸１〜１１３に及び 、Ｖ２領域は、凡そアミノ酸１１４〜１８０に及び、Ｖ３領域は、凡そアミノ酸 １８１〜２９７に及び、そしてＶ４領域は、凡そアミノ酸２９８〜３７５に及ぶ （Maddon,P.J．等(1985)前出参照）。Ｖ１領域は、ＨＩＶｇｐ１２０に対する結 合部位として同定された（Arthros,J.等(1989)Cell 57:469-481; Mizukami,T.等 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9273-9277; Peterson,A.及び Seed,B.(1988) Cell 54:65-72; Landua,N.R.等(1988)Nature 334:159-162; Clayton,L.K.等(198 8)Nature 335:363-366）。 天然のＣＤ４分子の特定の領域に結合する幾つかの抗ＣＤ４抗体が記載された 。これらの抗体の例には、ＣＤ４Ｖ１特異的抗体Ｌｅｕ３Ａ及びＯＫＴ４Ａ（例 えば、Sattentau,Q.J.等(1986)Science 234:1120-1123; Jameson，B.A.等(1988) Science 240:1335-1339; Peterson,A.及びSeed,B.（1988）前出; Bates,P.A.等( 1988)Prot.Engng.3:13-21; McDougal,J.S.等(1986)J.Immunol.137:2937-2944;及 びDalgleish,A.G.等(1987)Lancet 2:1047-1050を参照）、ＯＫＴ４Ａ及びＬｅｕ ３Ａにより結合されるものと異なるＣＤ４エピトープに結合するＭＴ１５１、Ｖ ＩＴ４及びＭＴ３２１（例えば、Sattentau,Q.J.等(1986)前出; Sattentau,Q.J. 等(1989)J.Exp.Med.170:1319-1334; Bates,P.A．等(1989)前出; Landau N.R．等 (1988)前出; 及びMerkenschlager,M．等(1990)J.Immunol.9:2839-2845 を参照） 、ＣＤ４Ｖ２特異的抗体ＯＫＴ４Ｂ（例えば、Kieber-Emmons,T．等(1989)Bioch im.Biophys.Acta 989:281-300; McDougal,J.S．等(1986)前出; Ludin,K.等(1987 )J.Immunol.Methods 97:93-100;及びLamarre,D.等(1989)EMBO J.8:3271-3277を 参照）、及びＣＤ４Ｖ３Ｖ４特異的抗体ＯＫＴ４ （例えば、Berger,E.A．等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2357-2361 を参照 ）が含まれる。かかる抗体は、ｇｐ１２０結合をブロックし、ＨＩＶ誘導のシン シチウム形成を阻止し及び／又はＡＩＤＳ、ＡＲＣ若しくはＨＩＶ感染の治療の ための潜在的治療剤として機能するそれらの能力に関して研究されてきた。ＣＤ ４のＶ１領域に結合する抗体例えばＬｅｕ３Ａ及びＯＫＴ４Ａは、ｇｐ１２０の ＣＤ４への結合を競争的に阻害する。しかしながら、かかる抗体は、既にＨＩＶ ｇｐ１２０に結合したＣＤ４に対して作用する能力のないことにより、それらの 治療上の有用性において制限され得る。ＣＤ４の他の領域に結合するある種の抗 体は、シンシチウム形成又はウイルス感染に対する幾らかの効果を有することが 見出されているが、実質的にｇｐ１２０のＣＤ４への結合を阻止しない。しかし ながら、天然の細胞表面ＣＤ４に結合する抗ＣＤ４抗体の利用に対する他の潜在 的限界は、それらの免疫抑制活性である。例えば、ＯＫＴ４Ａ及びＯＫＴ４Ｂの 両者は、免疫抑制性であることが報告されている（例えば、Lamarre,D.等(1989) 前出参照）。 ＣＤ４は、ｇｐ１２０との初期結合事象のみならず、ウイルスの細胞膜との融 合（ウイルスの細胞への侵入に必要）及びＨＩＶエンベロープ媒介されたシンシ チウム形成にも関係するということが示唆されてきた（例えば、Healey,D．等(1 990)J.Exp.Med.172:1233-1242; Celada,F.等(1990)J.Exp.Med.172:1143-1150参 照）。ある研究は、単独ではＣＤ４⁺細胞に結合しないが、精製した組換えｇｐ １２０と予備インキュベートしたＣＤ⁺細胞には弱く結合する自己抗体のＨＩＶ 感染した個人における検出を報告した（Sekigawa,I等(1991)Clin.Immunol.and I mmunopathol.58:145-153）。しかしながら、引き続く２つのＨＩＶ感染した個人 におけるＣＤ４に対する自己抗体の研究は、この観察を確認することができなか った（Callahan,L.N．等(1992)J.Immunol.149:2194-2202;及びChams,V.等(1991) AIDS 5:565参照）。その上、これらの後者の研究の一方（Callahan,L.N．等(199 2)前出）は、このｇｐ１２０処理した細胞への自己抗体の観察された結合を、用 いたアッセイ系におけるアーティファクトに帰した。現時点において、ＨＩＶの ＣＤ４への結合の際に新規なコンホメーション形態のＣＤ４がＣＤ４⁺細胞の表 面上に誘導されるかどうかは確立されておらず、この 推定上の変化したコンホメーション形態のＣＤ４を認識することのできる試薬が 必要である。発明の要約 この発明は、ＨＩＶ（又はそのエンベロープ蛋白質）の結合に際して誘導され る新規なコンホメーション形態の細胞表面ＣＤ４、抗体及び抗体模倣剤を含むこ の新規な形態のＣＤ４に結合するリガンド、この新規な形態のＣＤ４上に露出さ れた１つ以上のエピトープを発現する単離された分子、及びこれらの利用に関係 する。この発明の１つの面は、ＣＤ４⁺細胞の表面にその細胞とＨＩＶ又はその エンベロープ蛋白質（例えば、ｇｐ１２０）との接触に際して発現されたコンホ メーションの変化した形態のＣＤ４分子好ましくはヒトＣＤ４に結合し、それに より、細胞表面ＣＤ４におけるＨＩＶ誘導されたコンホメーション変化の証拠を 与える抗体又はその断片に関係する。この発明の抗体は、細胞とｇｐ１２０との 接触に際してコンホメーションの変化した形態のその細胞表面上のＣＤ４に結合 する能力及びｇｐ１２０との接触前の細胞表面上の自然のままのヒトＣＤ４に実 質的に結合し得ないことにより特徴付けられる。ｇｐ１２０と接触したＣＤ４⁺ 細胞の集団において、好ましくは、ｇｐ１２０⁺細胞の少なくとも３０％が、こ の発明の抗体により結合される。一層好ましくは、ｇｐ１２０⁺細胞の少なくと も５０％、更に一層好ましくは少なくとも７０〜９０％が、この発明の抗体によ り結合される。 好適具体例において、この発明の抗体は、モノクローナル抗体好ましくはヒト モノクローナル抗体である。この発明の好適な抗体は、ヒトモノクローナルＦａ ｂ（３−４７及び３−５１と呼ぶ）、又は３−４７若しくは３−５１により認識 される同じエピトープに結合する抗体である。更に、ｇｐ１２０結合に際して、 やはり３−４７又は３−５１エピトープを示すコンホメーションの変化した形態 のヒトＣＤ４上に露出された他のエピトープに結合する抗体が、この発明により 包含される。この発明は、更に、この発明の抗体と同じエピトープ結合特異性を 有する非抗体化合物である抗体模倣剤例えば３−４７又は３−５１模倣剤を提供 する。 この発明の他の面は、この発明の抗体の軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ 領域）をコードする、好ましくはモノクローナルＦａｂ３−４７又は３−５１の ＶＬ又はＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子（例 えば、ＤＮＡ）に関係する。一具体例において、ＶＬ領域をコードする核酸は、 更に、ＣＬ領域（即ち、完全長の抗体軽鎖）をコードする。他の具体例において は、ＶＨ領域をコードする核酸は、更に、ＣＨ１領域（即ち、免疫グロブリン重 鎖の第１の定常ドメイン）をコードする。更に別の具体例においては、ＶＨ領域 をコードする核酸は、完全長の抗体重鎖（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領 域を含む）をコードする。この発明の核酸分子を、発現ベクターに取り込ませて 宿主細胞（例えば、細菌又は哺乳動物細胞）に導入することができる。一具体例 において、モノクローナルＦａｂ３−４７を宿主細胞中で発現させる。他の具体 例においては、モノクローナルＦａｂ３−５１を宿主細胞中で発現させる。更に 別の具体例においては、モノクローナルＦａｂ３−４７又は３−５１のエピトー プ結合特異性（例えば、ＶＬ及びＶＨ領域）を有する完全長抗体を宿主細胞中で 発現させる。従って、この発明の単離した核酸分子、発現ベクター及び宿主細胞 は、この発明の組換え抗体特にモノクローナルＦａｂ３−４７又は３−５１のエ ピトープ結合特異性を有する特定の組換え抗体の産生に有用である。 これらの抗体又はその模倣剤を用いて、例えば、ＨＩＶ感染の過程又は治療用 養生法の有効性をモニターするために細胞表面上のコンホメーションの変化した 形態のＣＤ４の存在を検出することができる。細胞表面上のコンホメーションの 変化した形態のＣＤ４を検出するためには、その細胞を、この発明の抗体と接触 させ、その細胞の表面に結合した抗体を検出する。 この発明の抗体及び模倣剤は、更に、細胞表面におけるＣＤ４のコンホメーシ ョンの変化した形態の形成を阻止し又は誘導する能力について、薬剤をスクリー ニングするのに有用である。ＣＤ４のコンホメーションの変化した形態の形成を 阻止する薬剤を同定するために、ＣＤ４⁺細胞を、ｇｐ１２０及び試験すべき薬 剤と接触させ、更に、この発明の抗体と接触させ、そして、その細胞表面に結合 した抗体の量を測定することができる。その薬剤の不在時におけるｇｐ１２０処 理した細胞への抗体結合の量に比較して、その薬剤の存在時におけるｇｐ１２０ 処理した細胞への抗体の結合の減少した量は、その薬剤がその細胞表面上でのＣ Ｄ４のコンホメーションの変化した形態の形成を阻止するという指標として用い ることができる。或は、ＣＤ４のコンホメーションの変化した形態の形成を誘導 する薬剤を同定するために、ＣＤ４⁺細胞を、試験すべき薬剤と接触させ、更に 、この発明の抗体と接触させ、そして、その細胞表面に結合した抗体の量を測定 することができる。その薬剤の不在時におけるＣＤ４⁺細胞への抗体結合の量と 比較して、その薬剤の存在時におけるＣＤ４⁺細胞への抗体の結合の増加した量 は、その薬剤がその細胞表面におけるＣＤ４のコンホメーションの変化した形態 の形成を誘導するという指標として用いることができる。かかる細胞表面ＣＤ４ のコンホメーションの変化した形態の発現を阻止し又は誘導する薬剤は、ＨＩＶ 感染を治療する上で有用であり得る。 この発明の抗体及び抗体模倣剤は又、細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ） による感染を阻止するために用いることもできる。細胞のＨＩＶによる感染を阻 止するためには、その細胞を、治療上有効な量のこの発明の抗体又は模倣剤と接 触させる。細胞を、この抗体又は模倣剤とイン・ビトロで接触させ、或は、この 抗体又は模倣剤を、患者にイン・ビボで投与することができる。 この発明の更に別の面は、ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質若しくはペプチ ドとの接触に際して誘導されるコンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ４上 に発現される少なくとも１つのエピトープを発現する単離された分子に関係する 。好ましくは、このコンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ４は、モノクロ ーナル３−４７又はモノクローナル３−５１により結合されるエピトープを表示 するものである。一具体例において、この単離された分子は、３−４７又は３− ５１により結合される同じエピトープを発現する。他の具体例において、この分 子は、ｇｐ１２０結合に際してこのコンホメーションの変化した形態のＣＤ４上 でやはり発現される他のエピトープをも発現する。この分子は、蛋白質又はペプ チド例えば改変されたヒトＣＤ４蛋白質若しくはそのペプチド断片又は非ヒト霊 長類ＣＤ４蛋白質若しくはそのペプチド断片（例えば、アカゲザル又はチンパン ジーからのもの）であってよい。或は、この分子は、３−４７又は３−５１に結 合する抗イディオタイプ抗体又はその断片であってよい。その上、この分子 は、適当な変化したＣＤ４エピトープを発現するペプチド模倣物であってよい。 コンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ４により表示されるエピトープを発 現するこの発明の分子を、製薬組成物好ましくは製薬上許容し得るアジュバント を含む製薬組成物に取込ませることができる。哺乳動物を、かかる組成物で免疫 化して、ヒトＣＤ４のコンホメーションの変化した形態に結合する抗体を誘出す ることができる。 コンホメーションの変化した形態のＣＤ４の少なくとも１つのエピトープを発 現するこの発明の分子を用いて、患者における細胞のＨＩＶによる感染を阻止し 得る抗体応答をその患者において誘導することができる。従って、この発明の更 に別の面は、ヒトＣＤ４のコンホメーションの変化した形態において発現される 少なくとも１つのエピトープを発現する分子の治療上有効な量を、その分子によ り発現されるエピトープに対する抗体応答がその患者において誘導されるように 患者に投与することを含む、細胞のＨＩＶによる感染を阻止する方法に関係する 。 モノクローナルＦａｂ３−４７の軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするプラスミッ ドを有する細菌宿主細胞を、ブダペスト条約の規定の下に、１９９４年７月１９ 日に、メリーランド、Rockville 在、American Type Culture Collectionに寄託し、Ａ ＴＣＣ指定番号６９６５８を与えられた。モノクローナルＦａｂ３−５１の軽鎖 及び重鎖遺伝子をコードするプラスミッドを有する細菌宿主細胞を、ブダペスト 条約の規定の下に、１９９４年８月２５日に、メリーランド、Rockville在、American Type Culture Collectionに寄託し、ＡＴＣＣ指定番号６９６８４を与えられた 。図面の簡単な説明 図１は、４人のヒトｒｓＣＤ４免疫されたＨＩＶ感染したヒトの血清における ヒトｒｓＣＤ４特異的抗体の、免疫化の時点及びその後の様々な時点における滴 定のグラフ表示である。矢印は、免疫化の時点を示している。 図２は、組合せヒト免疫グロブリンライブラリーを構築するために用いたファ ージミドｐＣｏｍｂ３の図式表示である。矢印は、クローニングに用いた制限 部位を示している。Ｆａｂの発現は、ＩＰＴＧを用いてｌａｃＺプロモーターを 介して誘導される。ｐｅ１Ｂリーダー配列は、重鎖及び軽鎖を、Ｆａｂアセンブ リーが起きる誘導された細菌細胞のペリプラスムへ向ける。この重鎖は、ビリオ ン表面におけるＦａｂ分子の発現を指示する遺伝子IIIによりコードされるＭ１ ３コート蛋白質との融合蛋白質として発現される。 図３Ａ〜Ｊは、ＰＢＳ（パネルＡ〜Ｅ）又は組換えｇｐ１２０（パネルＦ〜Ｊ ）と予備インキュベートしたヒト末梢血液リンパ球に対する種々の抗体の結合を 描いた一連のフローサイトメトリープロフィルである。次の抗体について描いて ある：対照ＦＩＴＣ標識したヤギ抗ヒト第２抗体（パネルＡ及びＦ）、１９ｔｈ ｙ５Ｄ７（ＣＤ４のｇｐ１２０結合部位に特異的）（パネルＢ及びＧ）、Ｌ７３ ６５２３（ｇｐ１２０のＶ３ループドメインに特異的）（パネルＣ及びＨ）、Ｆ ａｂクローン３〜４７（パネルＤ及びＩ）及びＦａｂクローン３〜５１（パネル Ｅ及びＪ）。 図４は、Ｆａｂクローン３−４７の、ヒトｒｓＣＤ４及びヒト末梢血液リンパ 球溶解物由来のＣＤ４の両者を用いたウエスタンブロットにおける反応性を描写 している。これらのレーンは：ヒトｒｓＣＤ４を用いた無関係のｇｐ１２０特異 的抗体（Ｌ７３６５２３）（レーン１）、ヒトｒｓＣＤ４を用いたＣＤ４特異的 対照抗体（ヒト化５Ａ８）（レーン２）、ｒｓＣＤ４を用いたモノクローナルＦ ａｂ３−４７（レーン３）、ヒトＰＢＬ溶解物を用いたｇｐ１２０特異的抗体（ Ｌ７３６５２３）（レーン４）及びヒトＰＢＬ溶解物を用いたモノクローナルＦ ａｂ３−４７（レーン５）の反応性を示している。分子量を、キロダルトンで示 してある。 図５は、免疫沈降実験の写真であり、Ｈ９細胞溶解物由来の５５ｋＤの細胞表 面蛋白質（ＣＤ４の分子量に対応）を免疫沈降させるＦａｂ３−４７（負の対照 モノクローナル抗体ではない）の能力を描写している。 図６Ａ〜Ｈは、Ｆａｂ３−４７（パネルＤ及びＨ）、対照Ｆａｂ２−３６（パ ネルＣ及びＧ）、対照抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体（パネルＢ及びＦ）又は無抗 体（「ＰＢＳ」、パネルＡ及びＤ）の、ＨＩＶ−１ｒｇｐ１２０と４℃で予備イ ンキュベートしたヒトＰＢＬに対する結合（パネルＡ〜Ｄ）又はＨＩＶ−１ｒｇ ｐ１２０と３７℃で予備インキュベートしたヒトＰＢＬに対する結合（パネルＥ 〜Ｈ）を描いた一連のフローサイトメトリープロフィルであり、Ｆａｂ３−４７ が、ＨＩＶ−１ｒｇｐ１２０と３７℃でインキュベートしたヒトＰＢＬに結合す るが、４℃でインキュベートしたものには結合しないことを示している。 図７Ａ〜Ｄは、Ｆａｂ３−４７（パネルＤ）、対照Ｆａｂ２−３６（パネルＣ ）、対照抗ＣＤ４抗体（「Ｈｕ５Ａ８」、パネルＢ）又は無抗体（「ＰＢＳ」、 パネルＡ）の、生きたＨＩＶ−１と予備インキュベートしたＨ９細胞に対する結 合を描いた一連のフローサイトメトリープロフィルであり、Ｆａｂ３−４７が、 生きたＨＩＶ−１と予備インキュベートしたＨ）細胞と結合することを示してい る。発明の詳細な説明 この発明は、ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質の細胞への結合に際してＣＤ ４⁺細胞上に発現される細胞表面ＣＤ４分子のコンホメーションの変化した形態 に関係する。ここに記載のように、このＣＤ４のコンホメーションの変化した形 態は、ＣＤ４⁺細胞を単離したｇｐ１２０（例えば、可溶性の組換えｇｐ１２０ ）と接触させることにより誘導することができる。この発明の種々の面は、ＨＩ Ｖ又はその一部との接触に際してＣＤ４上に露出される新規なエピトープに結合 する抗体、抗体断片及び抗体模倣剤を含むリガンド、並びにＣＤ４上に露出され たこれらの新規なエピトープを発現し、そのために用いられる単離された分子に 関係する。この発明の抗体は、ＣＤ４をＣＤ４⁺細胞の表面上に、その細胞のｇ ｐ１２０との接触の後に結合させることができるが、ｇｐ１２０との接触前には その細胞の表面上のＣＤ４と実質的に結合しない。従って、これらの抗体は、ｇ ｐ１２０結合に際してＣＤ４分子上に露出されたエピトープに特異的である。ｇ ｐ１２０と接触したＣＤ４⁺細胞の集団において、好ましくは、ｇｐ１２０⁺細胞 の少なくとも３０％が、この発明の抗体により結合される。一層好ましくは、ｇ ｐ１２０⁺細胞の少なくとも５０％が、この発明の抗体により結合される。更に 一層好ましくは、ｇｐ１２０⁺細胞の少なくとも７０〜９０％が、この発明の抗 体により結合される。 この発明の好適な抗体は、３−４７及び３−５１と呼ばれるヒトモノクローナ ルＦａｂ断片である。これらのＦａｂ断片は、不完全フロイントアジュバント中 の可溶性組換えヒトＣＤ４で多数回免疫したＨＩＶ感染した個人から調製したラ ンダム組合せ免疫グロブリンファージディスプレーライブラリーから単離した。 モノクローナルＦａｂ３−４７及び３−５１の軽鎖及び重鎖可変領域は異なり、 これは、それらが別個の抗体であることを示している。好適具体例において、Ｈ ＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質の結合に際して誘導される細胞表面ＣＤ４のコ ンホメーションの変化した形態は、ＣＤ４分子上の３−４７又は３−５１により 認識されるエピトープ（ここでは、それぞれ、３−４７及び３−５１エピトープ と呼ぶ）の発現により規定される。従って、この発明の一つの面は、３−４７若 しくは３−５１エピトープに結合し又は、３−４７及び／若しくは３−５１エピ トープをも発現するＣＤ４のコンホメーションの変化した形態上に露出した他の エピトープに結合する抗体又はその断片に関係する。これらの３−４７及び３− ５１エピトープの発見は、ＣＤ４レセプターにおけるＨＩＶ誘導されたコンホメ ーション変化の証拠を提供し、それは、ここに記載のように、診断、スクリーニ ング及び治療目的のための標的となり得る。 用語「抗体」は、ここで用いる場合、免疫グロブリン分子及び免疫学的に活性 な免疫グロブリン分子の部分即ち、抗原例えばＣＤ４のコンホメーションの変化 した形態に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。 この発明は、ポリクローナル及び一層好ましくはモノクローナル抗体に関係する 。一具体例において、この発明のモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗 体である。更に、組換え抗体例えばキメラ及びヒト化モノクローナル抗体（ヒト 及び非ヒト部分の両者を含む）は、この発明の範囲内にある。 構造的には、最も単純な天然の抗体（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチ ド鎖｛ジスルフィド結合により内部結合された２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖 （Ｌ）｝を含む。抗体の抗原結合機能は、天然の抗体の断片によって達成され得 るということが示されている。従って、これらの抗原結合性断片も又、用語「抗 体」により呼ばれる。この用語の抗体に包含される結合性断片の例には、（ｉ） ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及び ＣＨ１ドメインよりなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶ ＨドメインよりなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂ断片（Ward 等(1989)Nature 341:544-546）；（ｖ）単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）； 及び（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）₂断片｛ヒンジ領域でジスルフィド橋により結合され た２つのＦａｂ断片を含む二価断片｝が含まれる。抗体断片例えばＦａｂ及びＦ （ａｂ’）₂断片を、全抗体から、慣用技術例えば、全抗体の、それぞれパパイ ン又はペプシン消化を用いて調製することができる。その上、抗体断片は、ここ に記載のように、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。更に、Ｆ ｖ断片の２つのドメインが別々の遺伝子によりコードされても、それらを、組換 え法によって、単一の蛋白質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；Bird等(1 988)Science 242:423-426;及びHuston等(1988)PNAS 85:5879-5883）として作成 することを可能にする合成リンカーを作ることができる。かかる単一鎖抗体も又 、用語「抗体」に包含される。この発明の抗体は、更に、ＣＤ４のコンホメーシ ョンの変化した形態を認識する結合部分を有する二特異性及びキメラ分子を含む ことを意図している。 用語「抗体結合部位」は、ここで用いる場合、抗原に特異的に結合する（免疫 反応する）重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域よりなる抗体分子の構造的部分を いう。用語「免疫反応する」又は「反応性」はその種々の形態において、ここで 用いる場合、抗原決定基含有分子と抗体結合部位を含む分子例えば全抗体分子又 はその一部分との間の結合をいう。用語「エピトープ」は、ここで用いる場合、 抗体結合部位により免疫学的に結合される抗原の実際の構造部分をいう。この用 語は又、「抗原決定基」と交換可能に用いられる。特定のエピトープが分子上に 存在し且つ免疫学的認識（例えば、抗体による結合）に利用され得る場合は、そ のエピトープは、その分子により「発現される」又は「表示される」という。 自然のままの細胞表面ＣＤ４分子上では、この発明に関する特に興味深いエピ トープは、構成的には発現されておらず、むしろ、ここに記載のように、ｇｐ１ ２０結合に際してコンホメーションの変化した形態のＣＤ４上で発現される（即 ち、露出される）ようになる。かかる分子のコンホメーション変化に際して分子 上に露出したエピトープを、この分野では、しばしば、「ネオ−エピトー プ」という。抗体の「エピトープ結合特異性」なる用語は、ここで用いる場合、 特異的エピトープに対する抗体の反応性をいう。即ち、同じエピトープに結合す る抗体は、同じエピトープ結合特異性を有するという。２つの抗体が特定の抗原 上の同じエピトープ（例えば、ここに記載のコンホメーションの変化した形態の ＣＤ４上の３−４７エピトープ）に結合するかどうかを決定するために、一方の 抗体の、他方の抗体が抗原に結合するのを競争的に阻害する能力を慣用技術によ って測定することができる。 この発明の様々な面を、更に、下記の小区分において詳細に説明する。Ｉ．抗体の調製及び同定 Ａ．免疫化 この発明の抗体は、典型的には、適当な患者を適当なＣＤ４免疫原で免疫化し 、ここに記載の特性を有する抗体を単離することにより調製する。好適具体例に おいて、モノクローナル抗体は、慣用の抗体分泌性ハイブリドーマをスクリーニ ングすることによっても単離することができるが、免疫化した患者から調製した 組合せ免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることにより単離する。 或は、所望のエピトープ結合特異性を有するモノクローナル抗体を、免疫化され た患者（例えば、ＨＩＶ感染した患者又は未感染患者）から調製した組合せ免疫 グロブリンライブラリーをスクリーニングすることにより単離することも可能で ある。 好適具体例において、ＣＤ４免疫原は、ヒト組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４ ）であり、免疫化される患者は、ＨＩＶ感染したヒトである。或は、免疫化され る患者は、未感染の患者（例えば、ヒト）であってよい。更に、患者を他の種由 来の可溶性ＣＤ４で免疫化することにより、細胞表面ＣＤ４のコンホメーション の変化した形態に対する抗体を生成することが可能である。例えば、非ヒト霊長 類例えばアカゲザル又はチンパンジーをヒトｒｓＣＤ４で免疫化することができ 、或は、ヒトを非ヒト霊長類ｒｓＣＤ４分子（例えば、アカゲザル又はチンパン ジーのＣＤ４）で免疫化することができる。他の具体例においては、 ３−４７及び／又は３−５１エピトープを発現する分子（例えば、ペプチド）で 患者を免疫化することができる（以下で、更に詳細に説明する）。或は、可溶性 ＣＤ４−ｇｐ１２０複合体で又は、可溶性組換えｇｐ１２０で処理した（即ち、 該ｇｐ１２０と接触した）ＣＤ４⁺細胞（例えば、末梢血液リンパ球）で動物を 免疫化することも望ましい。ヒトＣＤ４についてトランスジェニックの（それ故 に、自然のままのヒト細胞表面ＣＤ４に寛容である）マウスを、ＣＤ４免疫原例 えば可溶性形態の非ヒト霊長類ＣＤ４分子又は変化した形態の可溶性ヒトＣＤ４ を用いて免疫化することによって、ここに記載のように、抗体を高めることも又 可能であり得る。 ＣＤ４免疫原の単位投与量及び免疫化養生法は、免疫化される哺乳動物種、そ の免疫状態、その哺乳動物の体重及び投与されるＣＤ４免疫原のＣＤ４含有量に 依存する。免疫化のためには、ＣＤ４免疫原を、典型的には、アジュバント例え ばフロイントの完全又は不完全アジュバントと共に投与する。説明のための具体 例において、不完全フロイントアジュバント中の１ｍｇのヒトｒｓＣＤ４を、Ｈ ＩＶ感染した個人に筋肉注射し（５００より多い絶対ＣＤ４数）、その個人を、 規則的間隔で（例えば、３〜５週毎に）数回（例えば、５回）追加免疫する。 上記のようにＣＤ４免疫原を用いる患者の免疫化は、ポリクローナル抗ＣＤ４ 抗体応答を誘導する。抗ＣＤ４抗体の免疫化した個人における力価は、標準的技 術例えば固定化したｒｓＣＤ４を用いる酵素結合した免疫吸着剤アッセイ（ＥＬ ＩＳＡ）によって、長期にわたってモニターすることができる。所望であれば、 ポリクローナル抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、更に、 周知の技術例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ画分を 得ることができる。免疫化後の適当な時点に、例えば、抗ＣＤ４抗体力価が最高 の時点において、モノクローナル抗体を調製し及びスクリーニングすることがで きる。Ｂ．組換え組合せ抗体ライブラリー 好適具体例において、免疫化した患者のリンパ球由来のｍＲＮＡから調製した 免疫グロブリン軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡを用いて、組換え組合せ免疫グロブリンラ イブラリー例えばＦａｂファージディスプレーライブラリーを構築することによ り、モノクローナル抗体を調製することができる。かかるライブラリーを調製し 及びスクリーニングする方法論は、実施例に詳述する。簡単には、ｍＲＮＡを、 リンパ球含有細胞集団例えば骨髄リンパ球から単離する。第１鎖ｃＤＮＡを、重 鎖の定常領域（例えば、ＣＨ３）並びにκ及びλ軽鎖の各々の定常領域に特異的 なプライマーを用いて合成する。可変及び定常領域に特異的なプライマーを用い て、重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅 する。増幅されたＤＮＡを、次いで、ディスプレーパッケージのライブラリーの 生成における更なる操作のための適当なベクター中にライゲートする。増幅プロ トコールにおいて有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、ユニークであり又は 縮重してよく且つ縮重位置にイノシンを取込むことができる。制限エンドヌクレ アーゼ認識配列も又、プライマーに取込ませることができ、増幅された断片を、 発現のための予め決めたリーディングフレームにてベクター中にクローン化する ことを可能にする。 免疫グロブリンライブラリー例えばＦａｂライブラリーは、ディスプレーパッ ケージ（好ましくは、繊維状ファージ由来）の集団により発現されて、抗体のデ ィスプレーライブラリーを形成する。理想的には、このディスプレーパッケージ は、大きい多様な抗体ディスプレーライブラリーのサンプリング、各アフィニテ ィー分離ラウンドの後の迅速な整理、及び精製したディスプレーパッケージから の抗体遺伝子の容易な単離を可能にする系を含む。ファージディスプレーライブ ラリーの生成のための市販のキット（例えば、Pharmacia Recombinant Phage An tibody System,カタログ番号２７−９４００−０１；及びStratagene SurfZAP（ 商標）ファージディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗 体ディスプレーライブラリーの生成における使用に特に従順な方法及び試薬の例 は、例えば、Ladner等米国特許第５，２２３，４０９号；Kang等国際公開ＷＯ９ ２／１８６１９；Dower 等国際公開ＷＯ９１／１７２７１；Winter等国際公開Ｗ Ｏ９２／２０７９１；Markland等国際公開ＷＯ９２／１５６７９；Breitling 等 国際公開ＷＯ９３／０１２８８；McCafferty等国際公開ＷＯ９２／０１０４ ７；Garrard 等国際公開ＷＯ９２／０９６９０：Ladner等国際公開ＷＯ９０／０ ２８０９；Fuchs 等(1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay 等(1992)Hum Anti bod Hybridomas 3:81-85; Huse等(1989)Science 246:1275-1281; Griffiths等(1 993)EMBO J 12:725-734; Hawkins等(1992)J Mol Biol 226:889-896; Clackson等 (1991)Nature 352:624-628; Gram等(1992)PNAS 89:3576-3580;Garrad等(1991)Bi o/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137;及 びBarbas等(1991)PNAS 88:7978-7982 に見出すことができる。ある種の具体例に おいては、重鎖及び軽鎖のＶ領域ドメインを同じポリペプチド上で発現させ、フ レキシブルリンカーにより結合して一本鎖Ｆｖ断片を形成することができ、ｓｃ Ｆｖ遺伝子を、次いで、所望の発現ベクター又はファージゲノム中にクローン化 することができる。McCafferty等Nature(1990)348:552-554 に一般的に記載され たように、フレキシブル（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₃リンカーにより結合された抗体の 完全なＶＨ及びＶＬドメインを用いて、ディスプレーパッケージ例えば繊維状フ ァージの表面で発現される一本鎖抗体を生成することができる。 一度ディスプレーパッケージ（例えば、繊維状ファージ）の表面上に表示され たならば、この抗体ライブラリーをスクリーニングして、コンホメーションの変 化した形態のＣＤ４に結合する抗体を発現するパッケージを同定し、単離する。 好適具体例において、このライブラリーの第一次スクリーニングは、固定化した ｒｓＣＤ４を用いて又は一層好ましくは固定化したｒｓＣＤ４／ｇｐ１２０複合 体（実施例３に更に詳述）を用いて選分けることを含む。固定化ＣＤ４又は一層 好ましくは固定化ｒｓＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に結合する抗体を発現するディ スプレーパッケージを選択する。可溶性形態の選択した抗体を、次いで、（実施 例３に記載のように）生成し、更に、可溶性抗体を、第二次スクリーニングにお いて、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ及び／又はフローサイトメトリー （ＦＡＣＳ分析）により選択する。例えば、ＣＤ４のコンホメーションの変化し た形態に結合する抗体は、好ましくは、組換えｇｐ１２０と接触したＣＤ４⁺細 胞に結合するが、ｇｐ１２０処理前のＣＤ４⁺細胞には実質的に結合しないその 能力に基づいて選択する（実施例４参照）。好ましくは、ＦＡＣＳ分析を用い て、抗体が、ｇｐ１２０処理の有る場合又は無い場合において、細胞表面ＣＤ４ に結合するかどうかを決定する。ＦＡＣＳ分析を用いて、この抗体に結合するｇ ｐ１２０⁺、ＣＤ４⁺細胞のパーセンテージを決定することもできる。 この発明の抗体をスクリーニングするのに有用な試薬は、この分野において詳 細に記載されており且つ／又は市販されている。例えば、上記のスクリーニング アッセイにおいて有用な完全長の及び切り詰められた可溶性形態のヒトＣＤ４は 、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２９４０及びFisher,R.A．等(1988)Natu re 331:76-78に開示されている。参照は、Littman(1988)Cell 55:541にも為され 、これは、プレーヒトＣＤ４の正確なシグナル配列開裂部位を記載しており、Ｐ ＣＴ／ＵＳ８８／０２９４０の出願日後に公開された。組換え可溶性ヒトＣＤ４ は、市販されている（例えば、マサチューセッツ、Cambridge 在、ABT から）。上記のア ッセイにおいて用いるためのＨＩＶｇｐ１２０は、例えば、ＨＩＶから単離され たｇｐ１２０又は一層好ましくはＨＩＶｇｐ１２０の遺伝子でトランスフェクト した宿主細胞により発現された組換えｇｐ１２０であってよい。好ましくは、Ｈ ＩＶｇｐ１２０をコードする切り詰めたｇｐ１６０遺伝子でトランスフェクトし た単細胞宿主から単離した、精製された可溶性ＨＩＶｇｐ１２０を用いる。精製 された組換えＨＩＶｇｐ１２０は、市販されている（例えば、マサチューセッツ、Cambri dge 在、Repligen又は英国、Berkshire 在、Celltechから）。組換え体ｇｐ１２ ０を産生する細胞は、例えば、Lasky 等(1986)Science 233:209-212に記載され ている。スクリーニングアッセイで用いるためのＣＤ４⁺細胞には、末梢血液リ ンパ球（未分画又は選択したＣＤ４⁺サブポピュレーション）及び完全長のヒト ＣＤ４をコードするＤＮＡでトランスフェクトされ表面上にＣＤ４を発現してい る組織培養細胞が含まれる。適当なトランスフェクトされたＣＤ４⁺組織培養細 胞は、Fisher,R.A．等(1988)Nature 331:76-78に記載されている。 組換え免疫グロブリンディスプレーライブラリーからのこの発明のモノクロー ナル抗体のスクリーニング及び単離の後に、選択した抗体をコードする核酸を、 ディスプレーパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収することがで き、標準的組換えＤＮＡ技術によって、他の発現ベクター中にサブクローン化す ることができる。この核酸を更に操作し（例えば、更なる免疫グロブリンドメイ ン例えば更なる定常領域をコードする核酸に結合する）且つ／又は、以下に更に 詳述するように、宿主細胞において発現させることができる。Ｃ．ハイブリドーマ 抗体ディスプレーライブラリーのスクリーニングの別法として、この発明のモ ノクローナル抗体を、連続的培養細胞株により抗体分子の産生を与える技術を用 いて調製し、単離することができる。これらは、Kohler及びMilstein（1975,Nat ure 256:495-497）により最初に記載されたハイブリドーマ技術（Brown 等(1981 )J.Immunol 127:539-46; Brown 等(1980)J Biol Chem 255:4980-83; Yeh等(1976 )PNAS 76:2927-31; 及びYeh 等(1982)Int.J.Cancer 29:269-75も参照されたい） 、及びもっと最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor等(1983)Immunol To day 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ，Alan R.Liss，Inc.77-96 頁）及びトリオーマ技術を含む が、それらに限られない。 モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術は、周知である［一般的に は、R.H.Kenneth，｛Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses ，(ニューヨーク、ニューヨーク 在、Plenum Publishing Corp.)(1980)中｝；E.A.Le rner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387-402; M.L.Gefter 等(1977)Somatic Cell G enet.,3:231-36 を参照されたい］。簡単には、不滅化細胞株（典型的には、ミ エローマ細胞）を、上記のように、ＣＤ４免疫原で免疫化した哺乳動物由来のリ ンパ球（典型的には、脾臓細胞）と融合させ、その結果生成したハイブリドーマ 細胞の培養上清を、上記のように、組換え免疫グロブリンライブラリーのスクリ ーニングのためにスクリーニングし、それにより、この発明の抗体を同定する。 リンパ球と不滅化細胞株との融合に用いられる多くの周知のプロトコールのど れでも、この発明の抗体を生成する目的に応用することができる（例えば、G.Ga lfre等(1977)Nature 266:55052; Gefter等、Somatic Cell Genet.前出;Lerner,Y ale J.Biol.Med.，前出; Kenneth,Monoclonal Antibodies,前出を参照されたい ）。更に、当業者は、やはり有用であるそのような方法の多くの変法があること を認めるであろう。典型的には、不滅化細胞株（例えば、ミエローマ細胞株）を 、リンパ球と同じ哺乳動物種から導く。例えば、マウスハイブリドーマを、ＣＤ ４免疫原で免疫化したマウス由来のリンパ球を不滅化したマウス細胞株と融 合させることにより作成することができる。好適な不滅化細胞株は、ヒポキサン チン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性 のマウスミエローマ細胞株である。多くのミエローマ細胞株例えばＰ３−ＮＳ１ ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミ エローマ株の何れでも、標準的技術によって、融合の相手として用いることがで きる。これらのミエローマ株は、メリーランド、Rockville在、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマ ウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて、マウ ス脾臓細胞と融合させる。その融合の結果生成したハイブリドーマ細胞を、次い で、ＨＡＴ培地を用いて選択するが、この培地は、未融合の及び非産生的に融合 したミエローマ細胞を殺す（未融合の脾臓細胞は、トランスフォームされていな いので、数日後に死ぬ）。或は、ヒトハイブリドーマを、ヒトリンパ球（例えば 、上記のように、可溶性ヒトＣＤ４で免疫化したＨＩＶ感染した個人からのもの ）及びヒトＢ細胞又はＥＢＶハイブリドーマ技術を用いて作成することができる 。 この発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、上記のスク リーニングアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングするこ とにより検出される。例えば、第一次スクリーニングを行なって、固定化ヒトｒ ｓＣＤ４又は一層好ましくは固定化ｒｓＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に結合する抗 体を選択することができる（例えば、ＥＬＩＳＡによる）。次いで、第二次スク リーニングを行なって、組換えｇｐ１２０で処理したＣＤ４⁺細胞に結合するが 、ｇｐ１２０処理前のＣＤ４⁺細胞には実質的に結合しない抗体を同定すること ができる。この第二次スクリーニングは、好ましくは、ＦＡＣＳ分析により行な う。 上記のスクリーニングアッセイで陽性のハイブリドーマ細胞を、栄養培地で、 それらのハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培養培地に分泌する条件下 で十分な時間培養し、それにより、完全な抗体を産生することができる。組織培 養技術及びハイブリドーマに適した培養培地は、周知である（例えば、Lerner,Y ale J.Biol.Med.及びKenneth，Monoclonal Antibodies，前出を参照）。次い で、調整した抗体を含むハイブリドーマ培養上清を集めることができる。或は、 所望の抗体を、ハイブリドーマ細胞を、免疫化したマウスの腹膜腔に注入するこ とにより生成することができる。それらのハイブリドーマ細胞は、腹膜腔内で増 殖して、抗体相同物を分泌し、腹水液として蓄積する（Lerner，Yale J.Biol.Me d.及びKenneth，Monoclonal Antibodies前出参照）。腹水液を腹膜腔から注射器 で引き出すことにより、抗体を収穫した。従って、この発明の抗体は、調整した ハイブリドーマ培養上清又は腹水から容易に精製することができるということは 、当業者には理解されよう。 マウス（又は他の非ヒト）ハイブリドーマから調製したモノクローナル抗体は 、他の種（例えば、ヒト）の患者においては外来物として認識されるという不都 合を有する。この問題を回避する一つのアプローチは、以下に詳述するように、 元の非ヒトモノクローナル抗体に由来する組換えのキメラ又はヒト化抗体を作成 することである。非ヒトモノクローナル抗体をヒト化するための別法としては、 ヒト蛋白質に対するヒトモノクローナルを、ヒト抗体レパトアを有するトランス ジェニックマウスにて生成することができる（例えば、Wood等ＰＣＴ公開ＷＯ９ １／００９０６、Kucherlapati等ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１；Lonberg 等 ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８；Kay 等ＰＣＴ公開９２／０３９１７；Lonber g,N.等(1994)Nature 368:856-859; Green,L.L.等(1994)Nature Genet.7:13-21; Morrison,S.L.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Bruggeman 等(19 93)Year Immunol 7:33-40; Tuaillon等(1993)PNAS 90:3720-3724; Bruggeman 等 (1991)Eur J Immunol 21:1323-1326を参照されたい）。ヒト抗体−トランスジェ ニックマウスを、上記のようにＣＤ４免疫原を用いて免疫化し、次いで、これら の免疫化したトランスジェニックマウスからの脾臓細胞を用いてハイブリドーマ を作成し、上記のようにこの発明の抗体を同定するためにスクリーニングするこ とができる。更に、二重トランスジェニック動物例えばヒトＣＤ４とヒト抗体遺 伝子の両方についてトランスジェニックの動物を、ＣＤ４免疫原で免疫化し、そ れから、リンパ球をこの発明のヒトモノクローナル抗体を生成するために用いる ことができる。Ｄ．キメラ抗体及びヒト化抗体 この発明の抗体は、更に、キメラ抗体及びヒト化抗体等の組換え型の抗体を包 含する。非ヒト被験者にて生成した抗体をヒトにおいて治療に用いる場合には、 それらは、種々の程度に外来物として認識され、その患者において免疫応答を生 じ得る。この問題を最小化し又は除去する一つのアプローチは、全体的免疫抑制 に適したものであるが、キメラ抗体誘導体即ち、非ヒト動物の可変領域とヒトの 定常領域とを結合した抗体分子を生成することである。かかる抗体は、元のモノ クローナル抗体のエピトープ結合特異性を保持し且つヒトに投与されたときに免 疫原性が低いであろうから、その患者により寛容とされることは一層ありそうで ある。 キメラモノクローナル抗体は、当分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって生成 することができる。例えば、非ヒト抗体分子の定常領域をコードする遺伝子をヒ ト定常領域をコードする遺伝子で置き変える（Robinson等、国際特許出願ＰＣＴ ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira 等、欧州特許出願第１８４，１８７；Taniguch i,M.、欧州特許出願第１７１，４９６；Morrison等、欧州特許出願第１７３，４ ９４；Neuberger 等、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly 等、米国特許 第４，８１６，５６７；欧州特許出願第１２５，０２３；Better等（1988 Scien ce 240:1041-1043）；Liu 等(1987)PNAS 84:3439-3443; Liu等(1987)J.Immunol.139 :3521-3526; Sun等(1987)PNAS 84:214-218; Nishimura等(1987)Canc.Res.47: 999-1005; Wood等(1985)Nature 314:446-449; 及びShaw等(1988)J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559 を参照）。 キメラ抗体を、更に、抗原結合に関与しない可変領域の部分をヒト可変領域由 来の同等部分で置き替えることにより「ヒト化」することができる。「ヒト化」 キメラ抗体の一般的総説は、Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202-1207及びOi 等(1986)BioTechniques 4:214 により与えられている。かかる方法は、重鎖又は 軽鎖の少なくとも一方に由来する免疫グロブリン可変領域の全部又は一部をコー ドする核酸配列を単離し、操作し及び発現させることを含む。ヒト化キメラ抗体 又はその断片をコードするｃＤＮＡを、次いで、適当な発現ベクター中にクロー ン化することができる。或は、適当な「ヒト化」抗体を、ＣＤＲ又はＣＥＡ置 換により生成することができる（Winterの米国特許第５，２２５，５３９；Jone s 等(1986)Nature 321:552-525; Verhoeyan 等(1988)Science 239:1534; 及びBe idler 等(1988)J.Immunol.141:4053-4060参照）。Ｅ．誘導体化抗体 他の具体例において、この発明は、この発明の抗体を（化学結合、遺伝的融合 等により）１つ以上の他の分子的実体例えばこの発明の他の抗体、この発明の模 倣剤（後述）、検出用剤、細胞毒性剤及び／又は医薬に機能的に結合した誘導体 化した抗体を提供する。 誘導体化抗体の１つの型は、（同じ型又は異なる型の）２つ以上の抗体を架橋 することにより生成される。適当な架橋剤には、適当なスペーサーで分けられた ２つの異なる反応性の基を有するヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ−マレイミ ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性のも の（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。かかるリンカーは、イリノイ 、Rockford在、Pierce Chemical Company から入手することができる。 適当な検出用剤には、蛍光性化合物が含まれる。蛍光性検出用剤の例には、フ ルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチル アミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等が含まれる。 抗体は又、検出可能な酵素例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオ キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いて誘導体化することもできる。抗 体を検出可能な酵素を用いて誘導体化したときは、それは、その酵素が検出可能 な反応生成物を生成するのに用いる更なる試薬を加えることにより検出される。 例えば、検出用剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するときには、過酸化水素 とジアミノベンジジンの添加は、検出可能な有色の反応生成物を生じる。抗体は 又、ビオチンを用いて誘導体化し、アビジン結合の間接的測定により検出するこ ともできる。 この発明は又、１つ以上の医薬に結合された抗体をも提供する。有用な医薬に は、生物学的に活性なペプチド、ポリペプチド及び蛋白質例えばＣＤ４以外の ヒトポリペプチドに特異的な抗体が含まれる。他の有用な医薬には、非蛋白質様 医薬例えばＨＩＶ逆転写酵素インヒビター（例えば、３’−アジド−２’，３’ −ジデオキシチミジン（「ＡＺＴ」）及び２’，３’−ジデオキシイノシン（「 ＤＤＩ）及び他の抗ウイルス性化合物、又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリ ン又はＦＫ５０６）が含まれる。Ｆ．抗体模倣剤 この発明は、更に、ここに記載の抗体のエピトープ結合特異性を真似る非抗体 分子を包含する。これらの薬剤は、ここでは、「抗体模倣剤」と呼ぶことにする 。この発明の抗体模倣剤は、ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質のＣＤ４への結 合に際してコンホメーションの変化した形態のＣＤ４上に露出されたエピトープ に結合する非抗体化合物である。従って、これらの化合物は、ｇｐ１２０とのイ ンキュベーションに際してＣＤ４⁺細胞に結合するが、ｇｐ１２０処理前のＣＤ ４⁺細胞には実質的に結合しない。この発明の好適な抗体模倣剤は、モノクロー ナルＦａｂ３−４７により認識されるエピトープに結合し（ここでは、「３−４ ７模倣剤」と呼ぶ）、又はモノクローナルＦａｂ３−５１により認識されるエピ トープに結合する（ここでは、「３−５１模倣剤」と呼ぶ）。好適な抗体模倣剤 例えば３−４７又は３−５１模倣剤は、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶによる感染を阻止 する。この発明の最も好適な抗体模倣剤は、この発明の１つ以上の抗体（例えば 、モノクローナルＦａｂ３−４７又は３−５１）の特性を示す。 この発明の抗体模倣剤は、複数のペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸の長さ ）、半ペプチド化合物又は非ペプチド有機化合物を合成し、次いで、それらの化 合物を、ｇｐ１２０での細胞の処理に際してＣＤ４⁺細胞に結合する能力につい て、ここに記載のアッセイを用いてスクリーニングすることにより生成すること ができる。ペプチドライブラリー構築及びスクリーニングの一般的説明について は、米国特許第４，８３３，０９２；Scott,J.K.及びSmith,G.P.(1990)Science 249 :86-90; Devlin,J.J.等(1990)Science 249:404-407を参照されたい。或は、 これらの薬剤を、ｇｐ１２０処理したＣＤ４⁺細胞へのこの発明の抗体の結合を 競争的に阻止するそれらの能力についてスクリーニングすることがで きる。例えば、３−４７模倣剤は、ｇｐ１２０処理したＣＤ４⁺細胞へのモノク ローナルＦａｂ３−４７の結合を阻止するその能力に基づいて同定することがで きる。好ましくは、ＦＡＣＳ分析を用いて、抗体模倣剤がｇｐ１２０処理したＣ Ｄ４⁺細胞に対するこの発明の抗体の結合を競争的に阻止し得るかどうかを測定 する。II ．抗体の組換え発現 一具体例において、この発明の抗体は、宿主細胞における、免疫グロブリン軽 鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により、定量的に生成される。組換えにより抗体 を発現するためには、宿主細胞における軽鎖及び重鎖の発現に適した形態で抗体 の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡで宿主をトランスフェクトす る。組換え抗体は、周知の遺伝子工学的技術により生成することができる（例え ば、米国特許第４，８１６，３９７を参照されたい）。 この発明の抗体（又は抗体断片）を、上記のように、組換え免疫グロブリンデ ィスプレーライブラリーから単離する場合には、関心ある選択した抗体の軽鎖及 び重鎖をコードするＤＮＡを、ディスプレーパッケージから（例えば、繊維状フ ァージのゲノムから）回収し、所望であれば更に、操作することができる。かか る操作には、部分的抗体鎖の完全長抗体鎖への変換が含まれ得る。例えば、Ｆａ ｂ発現ライブラリーをスクリーニングする場合には、Ｆａｂの重鎖をコードする 単離したＤＮＡを、そのＤＮＡを更なる重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分 子に機能的に結合することにより、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる 。この方法において、ここに記載のモノクローナルＦａｂ断片３−４７及び３− ５１を、３−４７又は３−５１と同じエピトープ結合特異性を有する完全長の完 全な抗体に変換することができる。同様に、もしｓｃＦｖライブラリーをスクリ ーニングするならば、ｓｃＦｖの結合されたＶＬ及びＶＨ領域をコードする単離 したＤＮＡの部分を分離し、次いで、分離したＶＬ及びＶＨコーディングＤＮＡ 分子を、適当な軽鎖及び重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子に機能的に結 合して完全長の抗体遺伝子を生成することができる。 或は、この発明の抗体を、上記のようにハイブリドーマをスクリーニングする ことにより単離するならば、選択した抗体又はその一部分の免疫グロブリン軽鎖 及び重鎖をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、ハイブリドーマ細胞から、 標準的分子生物学的技術により単離することができる。 単離及び所望であれば更なる操作の後に、部分的又は完全長の軽鎖又は重鎖を コードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、発現ベクターに、両遺伝子がそれら自 身の転写及び翻訳制御配列に機能的に結合されるように挿入する。この発現ベク ター及び発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合性であるものを選択する。 典型的には、両遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。軽鎖及び重鎖の発現の ために、この発現ベクターを宿主細胞中に標準的技術によりトランスフェクトす る。原核又は真核宿主細胞を用いることができる。用語「トランスフェクション 」又は「トランスフェクトする」は、外因性ＤＮＡの原核又は真核宿主細胞への 導入のために一般的に用いられる広範囲の様々な技術例えばエレクトロポレーシ ョン、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション等を 包含することを意図している。真核宿主細胞における抗体の発現は、かかる細胞 は原核細胞よりも適当に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を集めて分泌するこ とがありそうなので好ましい。しかしながら、任意の生成された抗体であって不 適当な折畳みのために不活性であるものは、周知の方法によって復元することが できる（例えば、P.S.Kim 及びR.L.Baldwin(1982)Ann.Rev.Biochem.51:45989参 照）。 宿主細胞を用いて、完全な抗体の部分例えば軽鎖２量体又は重鎖２量体を生成 することもでき、これらは、ここで用いる用語「抗体」に包含される。上記の手 順の変法が本発明の範囲内にあることは理解されよう。例えば、この発明の抗体 の軽鎖又は重鎖（但し、両方ではない）をコードするＤＮＡで宿主細胞をトラン スフェクトすることは望ましいであろう。組換えＤＮＡ技術を用いて、コンホメ ーションの変化した形態のＣＤ４への結合に必要な軽鎖及び重鎖の何れか又は両 方をコードするＤＮＡの幾らか又は全部をを除去することもできる。かかる切り 詰められたＤＮＡ分子から発現された分子も又、この発明の抗体に包含される。 更に、一方の重鎖及び軽鎖がこの発明の抗体であり且つ他方の重鎖及び軽鎖がＣ Ｄ４以外の抗原又はＣＤ４の他のエピトープに対して特異的である二官能性抗 体を生成することができる。 好適具体例において、モノクローナルＦａｂ３−４７又は３−４７と同じエピ トープ結合特異性を有する完全長抗体（例えば、３−４７のＶＬ及びＶＨ領域） を宿主細胞において組換えにより生成する。３−４７の軽鎖可変領域（ＶＬ）を コードする単離した核酸分子（例えば、ＤＮＡ）の部分的ヌクレオチド配列をSE Q ID NO:１５に示す。３−４７の重鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離した核 酸分子（例えば、ＤＮＡ）の部分的ヌクレオチド配列をSEQ ID NO:１６に示す。 モノクローナルＦａｂ３−４７の軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするプラスミッド を有する細菌宿主を、ブダペスト条約の規定の下で、１９９４年７月１９日に、メリーランド 、Rockville 在、American Type Culture Collectionに寄託して、ＡＴＣ Ｃ指定番号６９６５８を与えられた。実施例２に記載したオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて、３−４７の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、このプラス ミッドをテンプレートＤＮＡとして用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅する ことができる。 好適具体例において、モノクローナルＦａｂ３−５１又は３−５１と同じエピ トープ結合特異性を有する完全長抗体（例えば、３−５１のＶＬ及びＶＨ領域） を宿主細胞において組換えにより生成する。３−５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を コードする単離した核酸分子（例えば、ＤＮＡ）の部分的ヌクレオチド配列をSE Q ID NO:１７に示す。３−５１の重鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離した核 酸分子（例えば、ＤＮＡ）の部分的ヌクレオチド配列をSEQ ID NO:１８に示す。 モノクローナルＦａｂ３−５１の軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするプラスミッド を有する細菌宿主を、ブダペスト条約の規定の下で、１９９４年８月２５日に、メリーランド 、Rockville 在、American Type Culture Collectionに寄託して、ＡＴＣ Ｃ指定番号６９６８４を与えられた。実施例２に記載したオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて、３−５１の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、このプラス ミッドをテンプレートＤＮＡとして用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅する ことができる。 この発明の核酸分子は、この発明の抗体の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖 可変領域のみ例えば３−４７又は３−５１Ｆａｂをコードすることができる。 一層好ましくは、核酸分子は又、可変領域をコードするＤＮＡに機能的に結合さ れた少なくとも１つの免疫グロブリン定常領域をコードするヌクレオチド配列を も含む（即ち、ＶＬ領域をＣＬ領域に結合することができ、又はＶＨ領域を１つ 以上のＣＨ領域に結合することができる）。この発明の核酸分子を、上記のよう に、発現ベクターに挿入して宿主細胞にトランスフェクトし、モノクローナルＦ ａｂ断片３−４７若しくは３−５１又はその断片、又は３−４７若しくは３−５ １由来のＶＬ及びＶＨ領域を有する完全長抗体を発現させることができる。一具 体例において、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌）である。他の好適具体 例においては、宿主細胞は、哺乳動物細胞例えばＣＨＯ細胞又はミエローマ細胞 である。モノクローナルＦａｂ３−４７若しくは３−５１を生成し又は、３−４ ７若しくは３−５１のエピトープ結合特性を有する抗体（例えば、完全長抗体） を生成するために、宿主細胞を、その宿主細胞における抗体の発現を可能にし、 一層好ましくは、その宿主細胞が生育している培養培地中への抗体の分泌を可能 にするだけ十分な期間培養する。III ．抗体組成物 この発明の抗体は、第一次標的がＣＤ４⁺リンパ球である感染性病原体により 引き起こされる病気の予防又は治療において、予防用又は治療用に用いることの できる医薬組成物に取り込ませることができる。かかる病気には、ヒトにおける ＡＩＤＳ、ＡＲＣ及びＨＩＶ感染が含まれる。包括的用語「ＨＩＶ」は、ＡＩＤ Ｓ患者由来の独立の分離株及びそこから導かれた実験室的株をいうことを意図し ている。この用語ＨＩＶは又、何処かで、ヒトＴ細胞リンホトロフィックウイル スIII型（ＨＴＬＶ−III）、リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）及びＡＩＤＳ 関連レトロウイルス（ＡＲＶ）として同定されたウイルスを含むことをも意図す る。この組成物は又、他のレトロウイルス例えばサル免疫不全ウイルスにより引 き起こされるＡＩＤＳ様疾患を治療し又は予防するために有用であり得る。 この発明の好適な医薬組成物は、モノクローナルＦａｂ３−４７のエピトープ 結合特異性又はモノクローナルＦａｂ３−５１のエピトープ結合特異性を有する 抗体を含む。この抗体は、例えば、３−４７若しくは３−５１それ自身であって よく、又は３−４７若しくは３−５１由来のＶＬ及びＶＨ領域を含む完全な抗体 であってよい（ここに記載のように）。 この発明の医薬組成物は、更に、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ及びＨＩＶ感染の予防又は 治療のための他の治療剤を含むことができる。例えば、この発明の抗体は、逆転 写酵素をブロックする抗ウイルス性剤例えばＡＺＴ、ＤＤＩ、ＨＰＡ−２３、ホ スホノホルメート、スラミン、リバビリン及びジデオキシシチジンと共に、又は ＨＩＶプロテアーゼを阻害する薬剤と共に用いることができる。更に、この発明 の医薬組成物は、抗ウイルス剤例えばインターフェロン（アルファインターフェ ロン、ベータインターフェロン及びガンマーインターフェロンを含む）又はグル コシダーゼインヒビター例えばカスタノスペルミン、又は免疫抑制剤例えば副腎 コルチコステロイド、アザトリオプリン、シクロスポリン若しくはＦＫ５０６を 含むことができる。 その上、この発明の抗体は、ここに記載した抗体と異なる抗原特異性を有する 抗ＣＤ４抗体、例えばｇｐ１２０結合のない場合に自然のままの細胞表面ＣＤ４ と結合する抗ＣＤ４抗体（例えば、自然のままのＣＤ４のＶ１、Ｖ２、Ｖ３又は Ｖ４ドメインに特異的なもの）と組合せて投与することができる。それらは又、 ＨＩＶポリペプチド例えばｇｐ１２０及びｇｐ４１に特異的な抗体（抗イディオ タイプ等）と組合せて投与することができる。 更に、この発明の１つ以上の抗体を、前述の治療剤の２つ以上と組合せて用い ることができる。かかる組合せ治療は、有利には、投与する治療剤の一層少ない 投与量を用いることができ、それ故、種々の単独の治療と関連する可能な毒性又 は合併症を回避することができる。 好ましくは、この発明の医薬組成物は、免疫療法上有効な量の１種以上のこの 発明による抗体又はその誘導体型及び好ましくは製薬上許容し得るキャリアーを 含む。「治療上有効な量」とは、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ若しくはＨＩＶ感染又は第一 次標的がＣＤ４⁺リンパ球である感染性病原体により引き起こされる他の疾患の 広がり、重さ又は免疫無防備効果を減じることのできる量を意味する。好ましく は、この治療上有効な量は、予防に用いた場合に、かかるウイルスによる感染を 完全に予防することのできる量である。 用語「製薬上許容し得るキャリアー」は、それが投与される患者において、ア レルギー反応又は他の望ましくない効果を引き起こさないキャリアーをいう。適 当な製薬上許容し得るキャリアーには、例えば、水、塩溶液、リン酸緩衝塩溶液 、デキストロース、グリセロール、エタノール等の内の１つ以上、及びこれらの 組合せが含まれる。製薬上許容し得るキャリアーは、更に、抗体の棚持ち又は有 効性を増大させる少量の補助的物質例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤 を含むことができる。 この発明の組成物は、種々の形態であってよい。これらは、例えば、固体、半 固体及び液体の投薬形態、例えば錠剤、丸剤、粉末、液体溶液、分散若しくは懸 濁液、リポソーム、坐剤、注射及び注入溶液を含む。好適形態は、意図する投与 及び治療応用の様式に依存する。これらの好適組成物は、注射又は注入溶液の形 態である。この発明の好適な医薬組成物は、他の抗体を用いるヒトの受動免疫化 に用いられるものと類似している。投与の好適な様式は、非経口投与（例えば、 静脈、皮下、腹膜腔投与）である。 この発明の抗体の治療上有効な量は、とりわけ、投与スケジュール、投与する 抗体の単位投与量、抗体を他の治療剤と組み合わせて投与するかどうか、患者の 免疫状態及び健康並びに投与する特定の抗体の治療活性に依存することは、当業 者には明らかとなろう。ＨＩＶ感染、ＡＲＣ又はＡＩＤＳの治療又は予防のため の単独の治療において、完全な抗体の単位投与量当りの治療上有効な量は、典型 的には、約０．５〜５ｍｇ／ｋｇ患者の体重に及び、好ましくは約２〜３ｍｇ／ ｋｇ患者の体重に及ぶ。単位投与量を、無期限の治療期間の間中、３日に１回〜 ２８日に１回、抗ウイルス効果が認められるまで、好ましくは毎週１回投与すべ きである。抗ウイルス効果は、ウイルス量の評価、リンパ球計数並びに臨床的徴 候及び症状を含む様々な方法によって測定することができる。しかしながら、一 層低いか又は一層高い投薬量及び他の投与スケジュールを採用することができる ことは、当業者には明らかとなろう。完全でない抗体（例えば、Ｆａｂ断片）の ための治療養生法は、それらのサイズ及び医薬特性に依って異なり得る。 この発明の抗体模倣剤も又、前述の記載に従って、医薬組成物に取込むことが できるということは認められるべきである。抗体模倣剤のための治療養生法は、 それらのサイズ及び医薬特性に依って異なり得る。更に、この発明の抗体模倣剤 は、この発明の抗体と組み合わせて用いることができる。 この発明の抗体及び抗体模倣剤は又、診断用組成物及び方法例えばヘルパーＴ 細胞数の変化を含む病気の診断のための診断用組成物及び方法においても有用で ある。例えば、それらを用いて、ＨＩＶ感染の経過又は治療の効果をモニターす ることができる。従って、この発明は、診断用に有効な量のこの発明による抗体 又は抗体模倣剤により特徴付けられる組成物、キット及び方法を包含する。「診 断用に有効な量の」抗体又はその模倣剤は、ＨＩＶ感染の経過又はＨＩＶ感染に 対する治療の効果をモニターするのに十分な量をいう。例えば、患者若しくは患 者から得た試料中のＣＤ４⁺細胞数の定量を与え、又は、コンホメーションの変 化した形態のＣＤ４を表面に発現しているＣＤ４⁺細胞の患者若しくは患者から 得た試料中の量を測定するのに十分な抗体又は模倣剤の量。IV ．この発明の抗体の利用 この発明の抗体は、診断、スクリーニング又は治療目的のために標的となり得 る細胞表面ＣＤ４の新規なコンホメーション形態を同定する。従って、種々の具 体例において、この発明の抗体は、コンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ ４分子を表面に発現している細胞を検出する方法、細胞のＨＩＶによる感染を（ 例えば、ウイルスの細胞への侵入を邪魔することにより）阻止する方法及びこの コンホメーションの変化した形態のＣＤ４の細胞表面での形成を阻止し又は誘導 する薬剤を同定する方法（これらの薬剤は、それら自身、ＨＩＶ感染の治療にお いて有用であり得る）において有用である。 一具体例において、この発明は、ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質（例えば 、ｇｐ１２０）の細胞への結合に際して誘導されたコンホメーションの変化した 形態のヒトＣＤ４分子を表面に発現している当該細胞を検出する方法を提供する 。この方法は、細胞をこの発明の抗体と接触させ、その細胞表面に結合した抗体 を検出し、それにより、その細胞表面に発現されたヒトＣＤ４分子のコンホメー ションの変化した形態を検出することを含む。この方法で使用するために好適な 抗体は、モノクローナルＦａｂ３−４７及び３−５１、又は３−４７若しくは ３−５１と同じエピトープ結合特異性を有する抗体である。細胞表面に結合した 抗体は、直接検出することができ、例えば、抗体を、検出可能な物質（例えば、 上記のように、蛍光標識又は放射性同位体で標識したこの発明の誘導体化した抗 体）で直接標識することができ、或は、細胞表面に結合した抗体を、例えばこの 発明の抗体を認識する標識した第２の抗体を用いて、間接的に検出することがで きる。このコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の細胞表面での形成は、Ｃ Ｄ４⁺細胞のＨＩＶによる感染の機構の中間段階であると考えられるので、この 検出方法を用いて、例えば治療養生法において、ＨＩＶ感染の進行をモニターす ることができる。 他の具体例において、この発明は、細胞表面に誘導されるヒトＣＤ４分子のコ ンホメーションの変化した形態の形成を阻止又は誘導する薬剤を同定する方法を 提供する。コンホメーションの変化したＣＤ４の形成を阻止する薬剤を同定する ためには、ＣＤ４⁺細胞をｇｐ１２０組成物及び試験すべき薬剤と接触させ、次 いで、更に、この発明の抗体（例えば、モノクローナルＦａｂ３−４７若しくは ３−５１、又は３−４７若しくは３−５１と同じエピトープ結合特異性を有する 抗体）と接触させる。続いて、それらの細胞に結合した抗体の量を測定する（例 えば、上記のように、直接又は間接的に）。この薬剤の存在時におけるｇｐ１２ ０処理した細胞に対する抗体の結合の減少した量（この薬剤の不在時におけるｇ ｐ１２０処理した細胞に結合した抗体の量と比較して）は、その薬剤がコンホメ ーションの変化した形態のＣＤ４の細胞表面上での形成を阻止することの指標と して用いられる。ＣＤ４のコンホメーションの変化した形態の形成を誘導する薬 剤（即ち、ｇｐ１２０以外の薬剤）を同定するためには、ＣＤ４⁺細胞を試験す べき薬剤と接触させ、次いで、更に、この発明の抗体と接触させる。続いて、そ れらの細胞に結合した抗体の量を測定する（例えば、上記のように、直接又は間 接に）。この薬剤の存在時におけるＣＤ４⁺細胞への抗体の結合の減少した量（ この薬剤の不在時におけるＣＤ４⁺細胞に結合した抗体の量と比較して）は、そ の薬剤がコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の細胞表面上での形成を誘導 することの指標として用いられる。 これらのスクリーニングアッセイにおいて使用するためのＣＤ４⁺細胞は、例 えば、ＣＤ４⁺リンパ球（例えば、末梢血液由来）又は、上記のように、ＣＤ４ をコードするＤＮＡでトランスフェクトした組織培養細胞であってよい。ＨＩＶ 自身又はＨＩＶに感染した細胞もＣＤ４⁺細胞の表面上にＣＤ４のコンホメーシ ョン変化を誘導するために用いることができるが、細胞と接触してその細胞表面 にＣＤ４のコンホメーションの変化した形態を誘導するｇｐ１２０組成物は、好 ましくは、可溶性の組換えｇｐ１２０である。ＣＤ４⁺細胞の表面への抗体結合 の量は、ＦＡＣＳ分析又はその他の当分野で公知の適当なアッセイにより測定す ることができる。 更に別の具体例において、この発明は、細胞をこの発明の抗体（又は抗体模倣 剤）と接触させることを含む、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ（又は関連するＣＤ４向性 ウイルス例えばＳＩＶ）による感染を阻止する方法を提供する。この方法で使用 するための好適な抗体は、モノクローナルＦａｂ３−４７及び３−５１、又は３ −４７若しくは３−５１と同じエピトープ結合特異性を有する抗体である。好適 具体例において、この抗体を患者に投与して、細胞のイン・ビボでのＨＩＶによ る感染を阻止する。機構によって限定される意図はないが、これらの抗体は、ウ イルス感染において、ウイルスの膜融合及びウイルスの細胞への侵入に必要な細 胞表面ＣＤ４のコンホメーション変化の誘導の後に必要な中間段階を阻止するこ とができる（即ち、コンホメーションの変化した形態のＣＤ４への抗体の結合は 、ウイルス感染に必要な引き続くプロセスを阻止することができる）と考えられ る。更に、この発明の抗体は、ＣＤ４⁺細胞の表面上の自然のままのＣＤ４には 結合せず、ｇｐ１２０結合に際してＣＤ４⁺細胞に結合するだけであるので、こ れらの抗体が、自然のままの細胞表面ＣＤ４に結合する抗ＣＤ４抗体よりも免疫 抑制が低いということはありそうなことである。 細胞を、細胞のＨＩＶによる感染を実質的に阻止するのに十分な治療上有効な 量の抗体と接触させる。好ましくは、細胞の「感染の実質的阻止」は、ＣＤ４⁺ 細胞のＨＩＶによるイン・ビトロでの感染の少なくとも８０％の減少を示す。こ の発明の特定の抗体が、ＣＤ４⁺細胞のＨＩＶによる感染を実質的に阻止するか どうかを決定するために、ＨＩＶ感染及び／又は複製の如何なる表示をもモニタ ーすることができる。例えば、ＨＩＶ感染の阻止は、ＨＩＶ感染したＣＤ４⁺ 細胞培養における抗体の存在時及び不在時におけるＨＩＶｐ２４レベルを比較す ることにより測定することができる。ＨＩＶｐ２４レベルは、例えば、ＥＬＩＳ Ａ、放射免疫アッセイ等により測定することができる。ウイルスの感染性に対す る抗体の効果を測定するために用い得る他のアッセイには、逆転写活性のアッセ イ、骨髄細胞コロニー形成アッセイ及び骨髄マクロファージのウイルス感染をイ ン・ビトロで測定するアッセイが含まれる（各々、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ ９０／００３５８に記載されている）。 更に、ＨＩＶ感染の初期事象（例えば、ウイルスのＣＤ４⁺細胞への侵入）を ブロックするこの発明の抗体の能力を、ウイルス複製の一巡のみを与えるアッセ イにおいて測定することができる。例えば、ＣＤ４⁺細胞に、この発明の抗体の 存在時又は不在時に、組換えＨＩＶ株を感染させることができる。このアッセイ に用いる組換えＨＩＶ株は、感染した細胞において検出可能な遺伝子産物（例え ば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））の発現を指 示し且つウイルスエンベロープ遺伝子に欠失を有する。かかるビリオンは、標的 ＣＤ４⁺細胞に感染することができるが、そのウイルスゲノム中のエンベロープ 遺伝子中の欠失の結果、感染性の子孫ビリオンの合成を指示しない。感染細胞数 は、このウイルスにさらされた細胞中で合成された検出可能な遺伝子産物（例え ば、ＣＡＴ）の量を測定することにより評価することができる。従って、この発 明の抗体の存在下での、ウイルスにさらされた細胞における、検出可能な遺伝子 産物の、この抗体の不在時に測定されたものと比較して減少した量（例えば、減 少したＣＡＴ活性）は、この抗体がＣＤ４⁺細胞のＨＩＶ感染の初期事象をブロ ックする（例えば、阻止する）ことの指標として用いることができる。 ＨＩＶ感染と関連した他の現象もアッセイして、かかる現象に対するこの発明 の抗体の効果を測定することができる。例えば、この抗体の存在下におけるシン シチウム形成を調べることができる。特定の抗体がＣＤ４⁺細胞間のＨＩＶ誘導 されたシンシチウム形成に有意に影響する（例えば、ブロックする）かどうかを 測定するために、任意の公知のシンシチウムアッセイを用いることができる。好 ましくは、ＨＩＶの実験室分離株又はＨＩＶ感染したＣＤ４⁺組織培養細胞（例 えば、Ｈ９）を、Ｃ８１６６又はＣＥＭＸ１７４細胞培養物に加え、且つこの抗 体を量を変えて対照培養以外のすべてに加える。或は、抗体を、ＨＩＶ遺伝子産 物（ｇｐ１６０）を発現する組織培養細胞間でのシンシチウムを阻止する能力に ついて評価することができる。対照用培養物（負の対照）には、何も補わないか 又は抗体相同物と同じイソタイプの無関係の抗体を補う。インキュベーション後 に、すべての培養物を、シンシチウムについて、視覚的検査により評価する。こ の方法において、この抗体のシンシチウム形成をブロックする能力が評価される 。 更に、ＣＤ４⁺細胞の表面でのコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の発 現を阻止し又は誘導する薬剤（例えば、上記のようなスクリーニングアッセイに て同定）は、ＨＩＶ感染の治療において治療上の有用性を有し得る。従って、か かる薬剤を、医薬組成物中に配合することができ、患者に投与して、例えば、そ の患者中の細胞のＨＩＶによる感染を阻止することができる。Ｖ．変化したＣＤ４エピトープを発現する分子及びそれらの利用 この発明の他の面は、ｇｐ１２０との接触に際してＣＤ４⁺細胞の表面に誘導 されたコンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ４上に露出した少なくとも１ つのエピトープを発現する単離した分子に関係する。好ましくは、この変化した コンホメーション形態は、３−４７エピトープ及び／又は３−５１エピトープ（ 即ち、それぞれ、モノクローナルＦａｂ３−４７及び３−５１により結合される エピトープ）を発現するものである。更に一層好ましくは、この単離した分子そ れ自身が３−４７エピトープ及び／又は３−５１エピトープを発現する。或は（ 又は、更に）、この分子は、ｇｐ１２０結合に際してコンホメーションの変化し た形態のＣＤ４上に露出した他のエピトープを発現することができる。 ここで用いる場合、用語「単離した」は、天然の起源から精製するか組換えＤ ＮＡ技術によって宿主細胞において生成した場合に細胞性物質若しくは培養培地 を実質的に含まない分子、又は化学合成した場合に化学的前駆物質若しくは他の 化学物質を実質的に含まない分子をいう。一具体例において、この単離した分子 は、蛋白質又はペプチドである。例えば、この分子は、改変されたヒトＣＤ４蛋 白質若しくはそのペプチド断片、又は非ヒトＣＤ４蛋白質若しくはそのペプチド 断片例えば非ヒト霊長類ＣＤ４蛋白質若しくはペプチド（例えば、アカゲザル又 はチンパンジー由来のもの）であってよい。或は、この分子は、モノクローナル Ｆａｂ３−４７又は３−５１に結合する抗イディオタイプ抗体又はその断片であ ってよい（即ち、この分子は、３−４７又は３−５１Ｆａｂの抗原結合部位に対 する特異性を有する抗体であってよい）。或は、この分子は、ペプチド模倣物で あってよい。このペプチド模倣物は、ｇｐ１２０結合に際してコンホメーション の変化した形態のＣＤ４上に露出したエピトープ例えば３−４７エピトープ又は ３−５１エピトープのコンホメーションを真似する半ペプチド化合物又は非ペプ チド有機化合物であってよい。 コンホメーションの変化した形態のＣＤ４上に露出したエピトープを発現して いるこの発明の分子は、例えば、この発明の抗体を用いて化合物のライブラリー をスクリーニングして、その抗体に結合する化合物を選択することによって同定 することができる。このライブラリーは、例えば、改変した（例えば、突然変異 した）ヒトＣＤ４蛋白質、非ヒトＣＤ４蛋白質（例えば、非ヒト霊長類ＣＤ４蛋 白質）、ペプチド、半ペプチド化合物又は非ペプチド有機化合物からなってよい 。好適具体例において、ランダムペプチドディスプレーライブラリーをディスプ レーパッケージ例えば繊維状ファージの表面上に発現させ、このペプチドライブ ラリーをこの発明の抗体を用いてスクリーニングする。このライブラリーをモノ クローナルＦａｂ３−４７を用いてスクリーニングして、３−４７に結合する（ 即ち、３−４７エピトープを発現している）ペプチドを同定して単離することが できる。或は、このライブラリーをモノクローナル３−５１を用いてスクリーニ ングして、３−５１に結合する（即ち、３−５１エピトープを発現している）ペ プチドを同定して単離することができる。ランダムペプチドディスプレーライブ ラリーを調製してそれを抗体を用いてスクリーニングする技術は、当分野で公知 である（例えば、Parmley,S.F.及びSmith,G.P.(1988)Gene 73:305-318; Cwirla, S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382; Devlin,J.J.等(1990)Scie nce 249:404-406; Scott,J.K.及びSmith,G.P.(1990)Science 249:386-390; Houg hten,R.A.等(1991)Nature 354:84-86; Houghten,R.A．等(1992)BioTechniques 1 3 :412-421; Pinilla,C.等(1992)BioTechniques 13:901-905; 及びOldenburg,K.R .等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393-5397 を参照されたい）。 このライブラリーから選択した抗体結合性ペプチドを、標準的技術によって、 配列決定し、次いで、それらの選択したペプチドのアミノ酸配列を比較して、抗 体により認識される好適又は最適アミノ酸配列を表す共通のモチーフを生成する ことができる。この発明の抗体により結合されるエピトープの共通モチーフは、 更に、このエピトープを発現する他の分子をデザインするために用いることがで きる。例えば、ヒト若しくは非ヒトＣＤ４蛋白質又はそれらのペプチド断片を、 系統的に変異させて（例えば、位置指定突然変異導入法により）、その蛋白質又 はペプチドを、それが、この発明の抗体により結合されるエピトープを構成的に 発現するように変化させる（即ち、ＣＤ４蛋白質を変化させて、ｇｐ１２０の不 在時にこのエピトープを発現させる）ことができる。 細胞表面ＣＤ４のコンホメーションの変化した形態の上に露出された少なくと も１つのエピトープを発現するこの発明の分子は、この発明の抗体をその分子で 動物を免疫化することにより生成するために有用である。従って、この発明は、 ここに記載のこの発明の分子で動物を免疫化することを含む、コンホメーション の変化した形態のヒトＣＤ４分子上に露出したエピトープに結合する抗体を生成 する方法を提供する。標準的技術によってポリクローナル抗体を誘導することが でき且つモノクローナル抗体を、前に記載のようにして、調製して選択すること ができる。 イン・ビボ投与のためには、コンホメーションの変化した形態のＣＤ４上に露 出した少なくとも１つのエピトープを発現しているこの発明の分子を、医薬組成 物に取込むことができる。かかる組成物は、典型的には、少なくともそのエピト ープを発現する分子及び製薬上許容し得るキャリアーを含む。かかる組成物の配 合及び投与は、この発明の抗体組成物について上記したものと同様である。好ま しくは、この分子は、患者においてこの分子に対する免疫応答（例えば、この分 子に対する抗体応答）を誘導するのに有効な量でこの組成物中に含まれる。好ま しくは、この組成物を、１回以上の、好ましくは数回の投与により、筋肉中に投 与する。 この分子に対する免疫（即ち、抗体）応答を誘導するためには、製薬上許容し 得るアジュバントをもこの組成物に含ませるのが望ましい。アジュバントは、最 も広義に用い、如何なる免疫刺激性化合物をも含むことを意図している。当分野 で用いられる典型的アジュバントは、フロイント不完全アジュバントである。説 明のための適当なアジュバント及びキャリアー組成物の例は、ムラミルジペプチ ド誘導体及び、デタージェント及び遊離脂肪酸の組合せを含むキャリアーである 。これらの組成物における使用のための他の適当なアジュバント及びキャリアー には、例えば、イオン交換剤、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン 、血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝用物質例えば、ホスフェー ト、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グ リセリド混合物、水、塩又は電解質例えばプロタミン、硫酸塩、リン酸水素二ナ トリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、マグネシウムトリシリケ ート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質及びポリエチレングリ コールが含まれる。局所用又はゲルベース形態のためのアジュバントは、カルボ キシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポ リオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び木蝋アルコ ールから選択することができる。 患者において、コンホメーションの変化した形態の細胞表面ＣＤ４上に露出し た１つ以上のエピトープに対する抗体応答を誘導するこの発明の分子の能力は、 患者における細胞のＨＩＶによる感染を阻止する治療法において利用することが できる。機構により限定される意図はないが、これらの分子は、患者において抗 ウイルス活性を有する抗体応答を誘導することにより治療上の有用性を有するこ とができ、例えば、誘導された抗体は、ウイルスの細胞への侵入に必要な中間段 階を阻止することができ、それにより、その細胞のＨＩＶによる感染を阻止し得 るものと考えられる。従って、他の具体例においては、この発明は、患者におけ る細胞のＨＩＶによる感染を阻止する方法であって、その患者にコンホメーショ ンの変化した形態のヒトＣＤ４上に露出した少なくとも１つのエピトープを発現 する分子の治療上有効な量を、その分子により発現されるエピトープに対する抗 体応答がその患者において誘導されるように投与することを含む当該方法を提供 する。好ましくは、この患者を、３−４７エピトープ及び／又は３−５１エピト ープを発現する分子を用いて免疫化する。 この分子を、好ましくは上記の医薬組成物（例えば、アジュバントを含む）に て、患者における抗体応答を誘導するのに十分な投薬量及び経路にて投与する。 この分子を、典型的には、筋肉内投与するが、他の適当な経路例えば皮下、皮内 、静脈経路等によっても投与し得る。この分子は、１回で投与することができ、 又は、一層好ましくは、一連の治療にわたって投与する。投与及び投薬養生法の 最も効果的な様式は、治療に用いる特定の組成物及び／又はアジュバント感染の 重さ及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び治療に対する応答、及び治療す る医師の判断に依存する。例えばアジュバントを使用した場合のように、より高 い免疫原性の化合物の形態は、より少ない投薬量又は治療時間しか必要としない ということは認められよう。 非制限的な説明のための具体例において、体重１ｋｇ当り約０．１〜１．０ ｍｇの活性化合物の１日量を、患者に、１日１回、約３０日間投与する。その患 者は、断続的な追加免疫（例えば、週ベース又は月ベースで、約０．１〜１．０ ｍｇ／ｋｇ体重）を必要とし得る。他の具体例 他のＣＤ４向性ウイルスの細胞への結合に際して非ヒト細胞表面上に誘導され たコンホメーションの変化した形態の非ヒトＣＤ４分子例えばサル免疫不全ウイ ルス（ＳＩＶ）の結合に際して誘導された変化した形態のサルＣＤ４分子に結合 する抗体も又、この発明の教示を用いて生成することができ、それらもこの発明 の範囲内にあるということは認められるべきである。例えば、ＳＩＶ感染したア カゲザルを、可溶性のアカゲザル又はヒトのＣＤ４を用いて免疫化し、ＳＩＶ結 合に際して細胞表面上に誘導されたコンホメーションの変化した形態のアカゲザ ルＣＤ４に結合する抗体を上記のように選択することができる。 更に、ここに記載のコンホメーションの変化した形態のＣＤ４（例えば、３− ４７及び３−５１エピトープを発現するＣＤ４の形態）は、ＨＩＶ又はそのエン ベロープ蛋白質の結合に際して誘導されるが、ＨＩＶ結合に際して誘導されるＣ Ｄ４ネオエピトープは、ＣＤ４分子の天然の隠れたエピトープである。従って、 このＣＤ４の変化した形態は、ＨＩＶ結合に加えて、他の機構によって（例えば 、ＣＤ４が自然に相互作用する他の蛋白質を介して）誘導することが可能であろ う。 この発明を、更に、下記の実施例によって説明するが、それらは、限定するも のと解釈すべきではない。この出願中で引用されたすべての参考文献、特許及び 公開された特許出願の内容を、参考として、本明細書中に援用する。実施例１ ： ヒトｒｓＣＤ４を用いるＨＩＶ感染したヒトの免疫化による ｒｓＣＤ４特異的抗体の誘出 この実施例においては、ＨＩＶ感染したヒトを、アジュバント中の組換え可溶 性ヒトＣＤ４（ｒｓＣＤ４）を用いて免疫化し、ポリクローナル抗ＣＤ４抗体の 力価を測定して、抗ＣＤ４応答が免疫化により誘出されたかどうかを測定した。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個人のヒト組換え可溶性ＣＤ４免疫 化 ５００より多い絶対ＣＤ４カウントを有する４人の無症候性のＨＩＶ感染した ヒトを、不完全フロイントアジュバント中の１ｍｇのヒト組換え可溶性ＣＤ４（ ｒｓＣＤ４）（マサチューセッツ、Cambridge 在、Biogen,Inc．）を用いて免疫化し、筋 肉中に５回追加免疫した。ｒｓＣＤ４免疫化したＨＩＶ感染したヒトの血清中のｒｓＣＤ４特異的抗体力価 の測定 ヒトｒｓＣＤ４を、一晩、４℃で、終濃度０．３μｇ／ｍＬにて、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ上に被覆した。それらのウェルを、 ＰＢＳで３回洗い、０．５％脱脂粉乳／ＰＢＳで室温で２時間ブロックした。こ れらのウェルを、次いで、０．５％脱脂粉乳／０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ で３回洗った。１ｍｌの患者の血漿を、５６℃で、３０分間、加熱不活性化し、 ０．５％脱脂粉乳／０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳで１：６０、１：１８０、 １：５４０及び１：１６２０に希釈した。希釈した血漿の５０μｌを適当なウェ ルに加え、室温で２時間インキュベートした。これらのウェルを０．５％脱脂粉 乳／０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳで３回洗った後に、５０μｌの１：５０， ０００希釈したＨＲＰ結合したＦ（ａｂ’）₂ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加 えた。室温で１時間経過後に、これらのウェルを、０．５％脱脂粉乳／０．０５ ％ツイーン２０／ＰＢＳで３回洗った。１００μｌのＴＭＢＯｎｅ Ｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（メリーランド、Gaithersburg在、 KPL）を加えることにより、発色させた。この反応を、１００μｌの１Ｎ Ｈ₂Ｓ Ｏ₄を加えることにより停止させた。プレートを、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリ ーダーにて、ＯＤ＝４５０ｎｍで読んだ。結果 これらの４人の免疫化した個人の、ＥＬＩＳＡにより測定した抗ＣＤ４抗体力 価を図１に示す。４人のｒｓＣＤ４免疫化した個人すべての血清中の抗体がヒト ｒｓＣＤ４に結合することを、標準的ＥＬＩＳＡにより示すことができた。しか しながら、これらの抗体は、比較的低力価で存在する。これらの抗体の、自己蛋 白質を用いる免疫化による誘出は、これらの個人が寛容でないエピトープが、こ れらのヒトｒｓＣＤ４分子により免疫系に与えられたことを示唆する。実施例２ ： ｒｓＣＤ４免疫化したＨＩＶ感染した個人由来の ヒト組合せ免疫グロブリンライブラリーの調製 この実施例においては、実施例１に記載のｒｓＣＤ４免疫化したＨＩＶ感染し た患者ＨＥＴ由来のヒト組合せ免疫グロブリンライブラリーを生成した。この個 人は、免疫後に、この研究の他の患者よりも高い抗ＣＤ４抗体力価を示した（図 １参照）。免疫グロブリン遺伝子増幅のためのｍＲＮＡ源として用いる骨髄細胞 を、この個人から、最初の免疫化の２００日後に、ピークのｒｓＣＤ４特異的抗 体力価の時点で得た。３×１０⁶メンバーの組合せ免疫グロブリンライブラリー を、Ｍ１３バクテリオファージベクターｐＣＯＭＢ３にて発現させた。このクロ ーニング系において、Ｆａｂを、Ｍ１３コート蛋白質、遺伝子IIIとの融合蛋白 質としての重鎖の発現により、Ｍ１３バクテリオファージ粒子の表面に発現させ る。次いで、所定の抗原特異性のＦａｂクローンを、これらの組換えバクテリオ ファージを関心ある抗原に関して選り分けることにより選択することができる。 下記の方法論を用いて、組合せ免疫グロブリンライブラリーを生成した：骨髄試料の採取及び貯蔵 ２０ｍｌのヘパリン化骨髄細胞を、ｒｓＣＤ４免疫化したＨＩＶ感染した個人 から、ピークの明白なｒｓＣＤ４特異的抗体力価の時点（最初の免疫化の２００ 日後）（図１参照）に採取した。これらの試料から、フィコール−ジアトリゾエ ート密度勾配遠心分離によってリンパ球を単離し、ドライアイス上で急速に凍結 して、ＲＮＡ抽出まで−７０℃に貯蔵した。免疫グロブリンＤＮＡの増幅 ２×１０⁷の骨髄細胞から、Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ−ｍＲＮＡ Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ウィスコンシン、Milwaukee在、Pharmacia）を用い てｍＲＮＡを単離した。次いで、免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡを、ヒト重鎖の第 ３の定常ドメインに特異的なプライマーを用いて合成した。同様に、免疫グロブ リン軽鎖ｃＤＮＡを、ヒトのカッパー及びラムダ軽鎖の定常ドメインに対応する プライマーを用いて合成した。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ＤＮＡのｃＤＮＡ合 成及びＰＣＲ増幅に用いたプライマーのヌクレオチド配列は、下記の通りである （クローニング目的でプライマーに導入した制限部位に下線を付けた）：重鎖可変領域のプライマー ： カッパー軽鎖可変領域のプライマー： ラムダ軽鎖可変領域のプライマー： 重鎖定常領域のプライマー： カッパー軽鎖定常領域のプライマー： ラムダ軽鎖定常領域のプライマー： ｃＤＮＡ合成のために、４００ｎｇの適当な定常領域プライマーを３０μｌの 単離したｍＲＮＡ（２×１０⁷の骨髄リンパ球から単離した全ｍＲＮＡの１／３ に相当）に加え、６５℃に５分間加熱して水浴中で室温までゆっくりと冷却した 。逆転写酵素緩衝液（メリーランド、Gaithersburg在、Gibco BRL）、８０単位のｒＲ ＮＡｓｉｎ（ウィスコンシン、Madison在、Promega）、０．８ｍＭ ｄＮＴＰ（ウィスコンシン 、Madison在、Promega）、２００単位のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（メリーランド、Gait hersburg在、Gibco BRL）及び１６．７ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ （メリーランド、 Gaithersburg在、Gibco BRL）を加えることにより、逆転写を開始した。この反 応を３７℃で２時間進めた後に、反応物を６５℃に２０分間加熱することにより 逆転写酵素を不活性化した。この結果生成したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅まで−２０ ℃に貯蔵した。 ＰＣＲ増幅の２ラウンドを用いて、クローニングのための十分量の免疫グロブ リン重鎖物質を得た。第１ラウンドのＰＣＲ反応物は、２０μｌの重鎖特異的ｃ ＤＮＡ、２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ（カリフォルニア、La Jolla 在、Stratagene ）Ｐｆｕ緩衝液II、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ウィスコンシン、Madison在、Promega）、 １０ｎｇの重鎖ＣＨ３定常領域プライマー（SEQ ID NO:１２；カリフォルニア、Alameda 在、Operon）、１０ｎｇの可変領域プライマー｛６つの重鎖ファミリーに対応す る６つの可変領域プライマー（SEQ ID NO:１〜６；カリフォルニア、Alameda 在、Opero n）の１つ｝、及びＲＮアーゼを含んでいない水（オハイオ、Cleveland）を含み、最 終容積は１００μｌであった。ホットスタート技術を用いる２５増幅サイクル及 びその後の７２℃で１０分間の最終伸長を実施した（使用条件：９４℃で１．５ 分、５２℃で２．５分、７２℃で３分）。 この第１ラウンドＰＣＲ生成物の１μｌを、次いで、同じ条件下で増幅の同一 の２５サイクルにさらした｛但し、重鎖ＣＨ１定常領域プライマー（SEQ ID NO: １１）をＣＨ３定常領域プライマー（SEQ ID NO:１２）の代わりに用いた｝。 免疫グロブリン軽鎖ＤＮＡを、上記したのと同じ３５サイクルにより増幅した ｛但し、カッパー又はラムダ軽鎖の第１の定常ドメインに対応するプライマー（ SEQ ID NO:１３又は１４）、並びに異なるカッパー及びラムダ軽鎖ファミリーに 特異的な４つの可変領域プライマー（SEQ ID NO:７〜１０）を使用｝。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ＤＮＡのＭ１３ファージミドベクターｐＣＯＭＢ３ 中へのクローン化 ＰＣＲ増幅した重鎖及び軽鎖ＤＮＡを、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎｄ Ｐｒ ｅｐキット（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）を用いて１．５％アガロー スゲルから精製した。次いで、各軽鎖ファミリーからの等量の物質をプールし、 酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩ（インディアナ、Indianapolis在、Boehringer Mannheim）で消化した。消化した物質を上記のようにゲル精製し、ＸｂａＩ／Ｓ ａｃＩ消化したｐＣＯＭＢ３ベクター（カリフォルニア、La Jolla 在、TSI）と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（メリーランド、Gaithersbu rg在、Gibco BRL）を含む１５０μｌの反応液中で、２：１の挿入物：ベクター のモル比で、一晩、１６℃で、ライゲートした（図２に示してある）。 このライゲーション生成物を、エレクトロコンピテントなＸＬ１ブルー細胞（カリフォルニア 、La Jolla 在、Stratagene）中に、エレクトロポレーションによりトラ ンスフォームした。特に、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し たライゲーション生成物を予備冷却した０．２ｃｍ遺伝子パルサーキュベット（ニューヨーク 、Melville在、Bio-Rad）中の３００μｌのエレクトロコンピテントなＸ Ｌ１ブルー細胞に加えた。これらの細胞を、Bio-Rad 遺伝子パルサー装置セット で、２５ｕＦ、２．５ｋＶ及び２００オームにてパルスした。次いで、３ｍｌの ＳＯＣ緩衝液を加え、これらの細胞を３７℃で１時間、震盪インキュベーター中 で生育させた。トランスフォームされた細胞を、１０ｍｌのスーパーブロス、２ ０μｇ／ｍｌのカーベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で、１時 間、３７℃で、選択した。最後に、トランスフォームされた細胞を、一晩、３７ ℃シェーカーにて、１００ｍｌスーパーブロス、５０μｇ／ｍｌのカーベニシリ ン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で増幅した。 この一晩培養物から、Ｗｉｚａｒｄ Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ウィスコンシン 、Madison在、Promega）を用いて、組換えプラスミッドＤＮＡを単離し た。次いで、組換えＤＮＡを、制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ（インディアナ、Indian apolis在、Boehringer Mannheim）で消化し、ゲル精製し、そして、プールした ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化してゲル精製した軽鎖ＰＣＲ生成物と、１．６：１の挿 入物：ベクター比を用いて、一晩、１６℃で、ライゲートした。 次いで、これらの結合ライゲーション生成物を、上記のように、ＸＬ１ブルー 細胞中にエレクトロポレートした。その結果生成したクローンの制限分析を行な って、このライブラリーが軽鎖及び重鎖挿入物の両方を有するクローンからなる ことを保証した。この組合せライブラリーのＦａｂ発現Ｍ１３バクテリオファージフォーマットへ の変換 この初期組合せライブラリーを、１００ｍｌの容積のスーパーブロス、５０μ ｇ／ｍｌのカーベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で、３７℃で １時間、震盪インキュベーターにて増幅した。次いで、Ｍ１３ヘルパーファージ ＶＣＳＭ１３（カリフォルニア、La Jolla 在、Stratagene）（１０¹²ｐｆｕ）を加えて 、Ｍ１３結合バクテリオファージのアセンブリーを指示した。３７℃で２時間生 育させた後に、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加え、ヘルパーファージの感染 した細胞を、一晩、３７℃で生育させた。Ｆａｂを発現するＭ１３バクテリオファージの沈殿 組換えＭ１３バクテリオファージを、４％のポリエチレングリコール８０００ （ミズーリ、St.Louis在、Sigma）及び３％の塩化ナトリウム（ミズーリ、St.Louis在、S igma）の存在下で、氷上で１時間沈殿させた。沈殿したファージを、４℃で、９ ０００ｒｐｍ２０分にてペレット化した。最後に、このファージペレットを、２ ｍｌのＰＢＳに再懸濁して−２０℃に貯蔵した。Ｍ１３結合バクテリオファージの滴定 バクテリオファージの種々の希釈物を、ＯＤ₆₀₀／ｍｌ１．０まで生育させた ＸＬ１ブルー培養物５０μｌと、１５分間、室温でインキュベートした。次いで 、感染した細胞を、ＬＢ、５０μｇ／ｍｌカーベニシリン寒天プレート上にプレ ートした。実施例３ ： ｒｓＣＤ４免疫化したＨＩＶ感染した個人由来の ヒト組合せ免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング ＨＩＶ感染した個人のｒｓＣＤ４免疫化により誘出された抗体を特性決定する ために、実施例２で上記のように生成したヒト組合せ免疫グロブリンライブラリ ーを、ＣＤ４特異的抗体についてスクリーニングした。２つの選り分けストラテ ジーを用いて、ＣＤ４特異的Ｆａｂをこの免疫化した個人から選択した。第１の ストラテジーにおいては、このライブラリーを、ヒトｒｓＣＤ４に対して選り分 けた。第２のストラテジーにおいては、このライブラリーを、ＥＬＩＳＡウェル 上に捕獲された予備形成したＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に対して抗ＣＤ４モノク ローナル抗体５Ｄ４を用いて選り分けた。これらの選り分け手順の各々により選 択した関心あるクローンを、次いで、可溶性Ｆａｂを発現するクローンに変換し てＥＬＩＳＡによるそれらの結合特異性の特性決定を容易にした。次いで、ＥＬ ＩＳＡによりＣＤ４に結合したがｇｐ１２０には結合しなかったクローンを、更 なる特性決定用に選択した。下記の方法論を用いた：選り分け Ａ．ヒトｒｓＣＤ４に対する選り分け Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（カリフォルニア、Newbury Park 在、Nunc）の ４つのウェルを、一晩、４℃で、１００μｌの容積のＰＢＳ中の２μｇのＣＤ４ 特異的抗体５Ｄ４（Hasunuma,T．等(1992)J.Immunol.148:1841-1846）で被覆し た。未結合の抗体を、３５０μｌのＴＢＳで３回洗うことにより除去した。次い で、これらのウェルを、３５０μｌの２％脱脂粉乳／ＴＢＳを用いて室温で３０ 分間ブロックした。このブロック溶液を振り落とした後に、１．２５μｇのヒト ｒｓＣＤ４を各ウェルに１００μｌ容積にて加え、室温で２時間結合させた。未 結合のｒｓＣＤ４を、無菌の２回蒸留水３５０μｌで３回洗うことにより除去し た。これらのウェルを、再び、３５０μｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて３７℃ で１時間ブロックした。このブロック溶液を振り落とした後に、１００μｌのＭ １３結合ファージ（１０¹²ｐｆｕ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュ ベートした。非付着ファージを除去し、各ウェルを無菌の２回蒸留水で１回洗っ た。次いで、各ウェルを、１時間にわたって、室温で、３５０μｌのＴＢＳ／０ ．５％ツイーン２０で１０回洗った。無菌の２回蒸留水で１回洗うことにより デタージェントを除去し、１００μｌのファージ溶出用緩衝液（０．１Ｍ ＨＣ ｌ、グリシンを含む１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ｐＨ２．２）を加えることによりフ ァージを溶出した。この溶出を、室温で、１０分間進行させた。次いで、この溶 液をピペットで数回吸い出しして、無菌のチューブに移し、そして、１００μｌ の溶出したファージ当り６μｌの２Ｍ トリスベースで中和した。選り分けたフ ァージを滴定して、増幅及び更なる選り分けのラウンド用に−２０℃に貯蔵した 。この選り分け手順を、各増幅／選り分けサイクルの後に、ファージの収率パー セント（溶出したファージの数を加えたファージの数で除して１００を乗じたも の）により測定して、抗原特異的クローンが豊富になるまで繰り返した。Ｂ．ヒトｒｓＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に対する選り分け この手順は、上記のｒｓＣＤ４選り分けの手順と同じであった｛但し、５Ｄ４ 被覆したウェルを、ブロックした後に、予備形成したｒｓＣＤ４／ｇｐ１２０複 合体とインキュベートした｝。これらの複合体は、ｇｐ１２０とヒトｒｓＣＤ４ を１．４：１のモル比で３７℃で１．５時間インキュベートすることにより形成 した。選り分けたバクテリオファージの増幅 溶出したファージを、２ｍｌのＯＤ₆₀₀／ｍｌ＝１．０ＸＬ１ブルー培養物と 室温で１５分間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、３７℃の震盪イ ンキュベーターにて、１時間、１０ｍｌのスーパーブロス、２０μｇ／ｍｌのカ ーベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で生育させた。次いで、こ れらの細胞を、更に１時間、１００ｍｌ容積のスーパーブロス、５０μｇ／ｍｌ の、カーベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で生育させた。この 時点において、これらの細胞に、１０¹²ｐｆｕのＭ１３ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３を感染させて、Ｆａｂを発現するＭ１３バクテリオファージのアセンブリ ーを指示した。最後に、ヘルパーファージに感染した細胞を、その培養物を、一 晩、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で生育させることにより選択した。クローンの可溶性Ｆａｂ発現フォーマットへの変換 可溶性Ｆａｂを得るためには、遺伝子III、Ｆａｂ分子をファージ表面上に固 定する原因となる蛋白質をこれらの結合プラスミッドから除去することが必要で あった。プラスミッドＤＮＡを、個々の選り分けたクローンの３ｍＬの一晩培養 物から、Ｗｉｚａｒｄ Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ウィスコンシン、Madis on在、Promega）を用いて単離した。このＤＮＡをＳｐｅＩ及びＮｈｅＩで消化 して、遺伝子IIIを除去した（図２参照）。次いで、残りの４．７Ｋｂのベクタ ー断片をゲル精製した。ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ制限部位は、互換性があるので、 このベクターを一晩１６℃でライゲートすることにより再環化プラスミッドを生 成した。このライゲーション生成物を、Ｆａｂ発現の誘導のために、コンピテン トなＸＬ１ブルー細胞中にトランスフォームした。ｓＦａｂ発現の誘導 結合クローンを、５００ｍｌのスーパーブロス、５０μｇ／ｍｌのカーベニシ リン、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂に接種して、３７℃で、震盪インキュベーター中で ＯＤ₆₀₀／ｍｌが１．０になるまで生育させた。次いで、可溶性Ｆａｂの発現を これらの培養物を一晩３０℃で、１ｍＭ ＩＰＴＧ（カリフォルニア、La Jolla 在、St ratagene）及び４ｎＭ ジブチリルｃＡＭＰ（ミズーリ、St.Louis 在、Sigma）の存 在下で生育させることにより誘導した。誘導した細菌培養物からのｓＦａｂの単離 ｐＣｏｍｂ３ベクターのｐｅ１Ｂリーダー配列は、Ｆａｂ分子を誘導された細 菌細胞のペリプラスムに向けるので、浸透ショック手順を実施して、これらの細 胞からペリプラスム抽出物を得た。特に、誘導された細菌細胞を、４℃で、３０ 分間、４０００ｒｐｍでペレット化した。上清を捨てた後に、誘導された細菌細 胞を、氷上で、４０ｍｌの浸透ショック溶液Ａ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ．６）、５００ｍＭ シュークロース、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ た。２ｍｌの４ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加え、その後直ちに１６０ｍｌの浸透 ショック溶液Ｂ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５０ｍＭ シ ュークロース、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）を加えるこ とにより、細胞壁を溶解させた。氷上での１０分間のインキュベーションの後に 、この溶解物を、４℃で、５分間、１２，５００ｒｐｍで、３５ｍｌオークリッ ジ管にて遠心分離することにより、細胞残渣をペレット化した。その上清を新し いオークリッジ管に移した後に、プロテアーゼインヒビターＡＥＢＳＦ（カリフォルニア 、San Diego在、Calbiochem）を、終濃度１ｍＭまで加えた。この抽出物を、再 び、４℃で１５分間、１２，５００ｒｐｍで遠心分離することにより、残りの細 菌残渣を除去した。最後に、この上清を、０．２μｍのアクロディスク（ミシガン、 Ann Arbor 在、Gelman Sciences）を通して濾過した。可溶性Ｆａｂの精製 特性決定のためのＦａｂの純粋な源を得るために、誘導した細胞のペリプラス ム抽出物を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂アフィニティーカラムに加えた。これら のアフィニティーカラムは、４ｍｇのヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア、West Grove在、Jackson Immunoresearch）を、２ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄ ＧＳｅ ｐｈａｒｏｓｅビーズ（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）と、室温で、１ 時間、震盪プラットホーム上でインキュベートすることにより調製した。結合し たビーズを、１０ｍｌの０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で、４回洗 った後に、それらのビーズを、震盪器上で、０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ ９．０）中の濃度２０ｍＭのカップリング試薬ＤＭＰと１．５時間インキュベー トした。このカップリング反応を、０．２Ｍ エタノールアミン（ｐＨ８．０） で１回洗い、これらのビーズを、震盪器上で、室温で、２時間、エタノールアミ ン中でインキュベートすることにより終了させた。これらのビーズを、０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）にて３回洗い、１０ｍｌのＰＢＳ／０．５％ アジ化ナトリウムに再懸濁させて４℃に貯蔵した。 結合したビーズを、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム（カリフォルニア、Hercules 在、Bio- Rad）上に載せ、そのカラムをＰＢＳで数回洗うことによりアジ化ナトリウムを 除去した。次いで、そのカラムを、１０カラム容積の溶出用緩衝液（３．５Ｍナ トリウムチオシアネート）で平衡化して、未結合のＩｇＧを除去した。これら のカラムをＰＢＳで数回洗った後に、５００ｍｌの誘導した培養物から単離した ペリプラスム抽出物を、４℃のカラムに加えた。非特異的に結合した蛋白質を、 ２００ｍｌのＰＢＳ／１ｍＭ ＡＥＢＳＦ(カリフォルニア、San Diego在、Calbiochem) を用いて、洗い落とした。最後に、結合したＦａｂを、８カラム容積の３．５Ｍ ＮａＳＣＮを用いて溶出させ、これらの試料を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０限外 濾過装置（マサチューセッツ、Beverly 在、Amicon）を用いて脱塩した。可溶性Ｆａｂの抗原特異性についてのスクリーニング ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルを、一晩、４℃で、１５０μｌ の容積中の１μｇの関心ある抗原で被覆した。ＴＢＳで８回洗った後に、これら のウェルを、１時間、３７℃で、０．５％脱脂粉乳／０．０５％ツイーン２０／ ＴＢＳでブロックした。次いで、ブロック用溶液を除去し、これらのＦａｂを、 適当なウェル中で、１時間、３７℃でインキュベートした。未結合のＦａｂを、 ＴＢＳで８回洗うことにより除去した。次いで、結合したＦａｂを、それらのウ ェルを、１時間、３７℃で、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合したＦ（ａｂ’）₂ ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂(ペンシルベニア、West Grove 在、Jackson Immunoresearch) の１：５０，０００希釈物とインキュベートすることにより検出した。８回のＴ ＢＳ洗浄の後に、ＴＭＢ−成分基質（メリ-ランド、Gaithersburg在、KPL）を加えた 。これらの反応を、２０分後に、２／３Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄の添加により終了させ、Ｄ ｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００ＥＬＩＳＡリーダー（バージニア、Chantilly在、Dyna tech Lab.，Inc．）にて、ＯＤ＝４５０ｎｍで読んだ。ｓＦａｂ濃度の測定 − 定量的ＥＬＩＳＡ ウェルを、一晩、４℃で、１μｇのＦ（ａｂ’）₂ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア 、West Grove 在、Jackson Immunoresearch）で被覆した。８回のＴＢＳ 洗浄の後に、これらのウェルを、前に記載のようにブロックした。次いで、各Ｆ ａｂ調製物の種々の希釈物、並びに既知濃度の精製ヒトＦａｂ標準（メイン、Kenne bunk在、Biodesign International）をロードした。結合したＦａｂの検出を、 上記のように行なった。結果 ｒｓＣＤ４選り分けの２ラウンドの後に、このライブラリーは、ファージの収 率パーセント（溶出されたファージの数を加えたファージの数で除して１００を 乗じたもの）により測定して、ｒｓＣＤ４特異的クローンについて３倍豊富であ った。この富化ライブラリー由来の５５クローンを、可溶性Ｆａｂを発現するク ローンに変換して、ＥＬＩＳＡによるそれらの特異性の特性決定を容易にした。 これらのクローンの内の９個が、ＥＬＩＳＡにより、ヒトｒｓＣＤ４との強い反 応性を示したが、組換えｇｐ１２０との反応性は示さなかった。これらの代表的 クローン２〜６についてのＥＬＩＳＡの結果を、下記の表１に示す。 第２に、ＨＩＶのＣＤ４レセプターへの結合に際してのみ露出されるＣＤ４の エピトープに特異的であろう抗体へのアクセスを得るために、このライブラリー を、ＥＬＩＳＡウェル上に捕獲された予備形成したＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に 対して、抗ＣＤ４モノクローナル抗体５Ｄ４を用いて選り分けた。選り分けの３ ラウンドの後に、このライブラリーは、ＣＤ４／ｇｐ１２０特異的クローンにつ いて２倍富化された。この富化ライブラリー由来の３５クローンを、可溶性のＦ ａｂを発現するクローンに変換した。これらのクローンの内の９個が、ＥＬＩＳ Ａにより、ヒトｒｓＣＤ４と反応するが、ｒｇｐ１２０とは反応しないことが示 された。２つの代表的クローン３−４７及び３−５１についてのＥＬＩＳＡの結 果を、下記の表１に示す。 同定されたｒｓＣＤ４特異的Ｆａｂクローンのすべてがユニークであるかどう かを測定するために、慣用のＤＮＡ配列決定を、これらのクローンの重鎖及び軽 鎖可変領域について行なった。同定された１８のｒｓＣＤ４特異的Ｆａｂの内の １４は、クローン３−４７及び３−５１を含む、重鎖及び軽鎖のユニークな組合 せを有することが示された。クローン３−４７の軽鎖及び重鎖可変領域をコード する核酸分子の部分的ヌクレオチド配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１５及び１６ に示す。クローン３−５１の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸分子の部分 的ヌクレオチド配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１７及び１８に示す。これらの分 子の完全長配列を、ここに開示した配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオ チドプライマーを用いて、標準的ＤＮＡ配列決定技術（例えば、ジデオキシ配列 決定法）によって決定することができる。実施例４ ： ｒｓＣＤ４特異的な可溶性Ｆａｂクローンの特性決定 この実施例においては、実施例３に記載した１４のＣＤ４特異的抗体の結合特 性を調べた。第１のシリーズの実験においては、ｒｓＣＤ４特異的なＦａｂ断片 の、ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の表面上に発現された自然のままのＣＤ４ に結合する能力、又はｇｐ１２０でパルスしたＰＢＬの表面上のＣＤ４に結合す る能力を調べた。ＰＢＬの表面上のＣＤ４へのＦａｂの結合を、それらの細胞を この抗体とインキュベートし、その後、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ ＩＴＣ）標識したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂第２抗体とインキュベートすること により評価した。次いで、結合した抗体を、ＦＡＣＳ分析により検出し た。Ｉ．細胞染色 ヒト末梢血液リンパ球を、フィコールジアトリゾエート密度勾配遠心分離によ り、１０ｍｌのヘパリン化血液から単離した。これらの細胞を、ＰＢＳ又は３５ μｇ／ｍｌの組換えｇｐ１２０（ＨＩＶ−１_SF2株）（カリフォルニア、Emeryville のC hironの好意により提供された）と、３７℃で、１時間、予備インキュベートし た。洗浄後に、これらの細胞を、２０分間、氷上で、Ｆａｂ又は対照用抗体と、 ２μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。１９ｔｈｙ５Ｄ７は、ＣＤ４ドメイ ン１特異的抗体であり、ＯＫＴ４は、ＣＤ４ドメイン３を認識する。Ｌ７３６５ ２３は、ｇｐ１２０特異的抗体である。ＰＢＳで洗った後に、これらの細胞を、 ４℃で、２０分間、ＦＩＴＣ結合したＦ（ａｂ’）₂ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア 、West Grove 在、Jackson Immunoresearch）又はＦＩＴＣ結合したＦ（ ａｂ’）₂ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア、West Grove 在、Jackson Immu noresearch）の１：５０希釈物を用いて染色した。洗浄後に、これらの試料を、 ＥＰＩＣＳ−Ｃフローサイトメーター(フロリダ、Hialeah 在、Coulter Corp.)にて 分析した。負の対照として、間接染色（第一次抗体の代わりにＰＢＳを使用する ）を行なった。結果 表面染色実験の代表的結果を、図３のパネルＡ〜Ｊに描いた一連のフローサイ トメトリープロフィルに示す。パネルＡ〜Ｅにおいては、ＰＢＳと予備インキュ ベートしたヒト末梢血液リンパ球を、種々の抗体を用いて染色した。パネルＦ〜 Ｊにおいては、組換えｇｐ１２０と予備インキュベートしたヒト末梢血液リンパ 球を、種々の抗体を用いて染色した。図３は、次の抗体を用いた細胞染色を描い たものである：対照用ＦＩＴＣ標識したヤギ抗ヒト第２抗体（パネルＡ及びＦ） 、１９ｔｈｙ５Ｄ７（ＣＤ４のｇｐ１２０結合部位に特異的）（パネルＢ及びＧ ）、Ｌ７３６５２３（ｇｐ１２０のＶ３ループドメインに特異的）（パネルＣ及 びＨ）、Ｆａｂクローン３−４７（パネルＤ及びＩ）及びＦａｂクローン ３−５１（パネルＥ及びＪ）。 ＣＤ４特異的抗体１９ｔｈｙ５Ｄ７は、ＰＢＳ処理したＰＢＬ上の自然のまま の細胞表面ＣＤ４に結合したが、試験したＦａｂ断片の何れもＰＢＬ上の自然の ままの細胞表面ＣＤ４に結合しなかった（クローン３−４７により例示；図３、 パネルＤ）。ＨＩＶ感染したヒトのｒｓＣＤ４免疫化により誘出されたｒｓＣＤ ４特異的ＦａｂがＣＤ４分子へのＨＩＶの結合に際して潜在的に露出されたＣＤ ４エピトープを認識したかどうかを測定するために、これらのクローン化したＦ ａｂの、組換えＨＩＶエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０と予備インキュベートした ヒトＰＢＬに結合する能力を評価した。ｇｐ１２０がこの細胞集団上のＣＤ４に 結合したことを確認するために、ｇｐ１２０予備処理したＰＢＬの、ＣＤ４のｇ ｐ１２０結合部位に特異的なモノクローナル抗体（１９ｔｈｙ５Ｄ７）を用いる 減じた染色（図３、パネルＧ）｛未処理細胞に対する１９ｔｈｙ５Ｄ７結合（図 ３、パネルＢ）と比較して｝を示した。その上、抗体Ｌ７３６５２３（ｇｐ１２ ０のＶ３ループドメインに特異的）は、ｇｐ１２０処理したＰＢＬに結合した（ 図３、パネルＨ）。ＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に対して選り分けたＦａｂクロー ン３−４７は、ｇｐ１２０結合したヒトＰＢＬの少なくとも９０％を染色した（ 図３、パネルＩ）。やはりＣＤ４／ｇｐ１２０複合体に対して選り分けたＦａｂ クローン３−５１は、ｇｐ１２０結合したヒトＰＢＬの少なくとも３０％を染色 した（図３、パネルＪ）。これらの結果は、Ｆａｂクローン３−４７及び３−５ １が、ｇｐ１２０結合後にのみ細胞表面に露出されるＣＤ４レセプターの以前に は未同定であったエピトープを認識したことを示している。 Ｆａｂクローン３−４７のＣＤ４特異性の更なる証拠を提供するために、ヒト ＰＢＬ溶解物のウエスタンブロットを、この精製Ｆａｂをプローブとして探り、 免疫沈降実験を、下記のように実施した。 II．ウエスタンブロット 末梢血液リンパ球を、フィコールジアトリゾエート勾配遠心分離により、７０ ｍｌのヘパリン化ヒト血液から、末梢血液リンパ球を単離した。ＰＢＳで洗った 後、これらの細胞を、トリトンＸ−１００溶解緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、 ５０ｍＭ トリスＨＣＬ（ｐＨ７．６）、０．５％ トリトンＸ１００、１０μ ｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 １．８ｍｇ／ｍｌヨードアセタミド）にて、氷上で、４５分間、時々混合して、 溶解させた。細胞残渣を、４℃で、１２，５００ｒｐｍ、１５分にてペレット化 した後に、その上清を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。ドデシ ル硫酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウムを、終濃度０．２％に加え、 これらの溶解物を、ゲルに載せるまで氷上に貯蔵した。 非還元的５×試料用緩衝液（６０ｍＭ トリスＨＣＬ（ｐＨ６．８）、２５％ グリセロール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー）を加えた後に、 この溶解物を、９５℃に、１０分間加熱し、６％分離用／５％スタッキングＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲルに載せた。ヒトｒｓＣＤ４及び組換えｇｐ１２０試料 （１５μｇ／ウェル）も又、このゲルに載せた。このゲルを、１００Ｖで、約６ 時間、ランしてから、これらの蛋白質を、トランスファー用緩衝液（５０ｍＭ トリスベース、３８０ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール）に て、一晩、４℃で、Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ電気泳動ＴＥ４２ユ ニット（カリフォルニア、San Francisco在、Hoefer Scientific Instruments）にて、 ニトロセルロース膜（カリフォルニア、La Jolla 在、Stratagene）にトランスファーし た。 トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）にて３回すすいだ後に、この膜を、空気乾燥して ＴＢＳＴ（１００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．９％ＮａＣｌ、０． １％ツイーン２０）にて、２時間、穏やかに震盪してブロックした。この膜を、 ストリップ状に切り、適当な抗体又はＦａｂ（ＴＢＳＴにて、２μｇ／ｍｌの濃 度に稀釈したもの）をプローブとして、１時間、室温で、穏やかに震盪して検査 した。５分間のＴＢＳＴ洗浄を５回行なった後に、これらのストリップを、西洋 ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂（ペンシルペニア 、West Grove 在、Jackson Immunoresearch）の１：５０稀釈物をプローブとし て、室温で、１時間、穏やかに震盪して、検査した。次いで、これらのストリッ プを、２時間、多量のＴＢＳＴで洗った。結合したＦａｂを、ＥＣＬ化学ルミネ セントウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham）を用いて、製 造者の指示に従って検出した。結果 これらのウエスタンブロッティングの結果は、図４に示してあり、無関係のｇ ｐ１２０特異的抗体（Ｌ７３６５２３）とヒトｒｓＣＤ４との反応性（レーン１ ）、ＣＤ４特異的対照抗体（ヒト化５Ａ８）とヒトｒｓＣＤ４との反応性（レー ン２）、モノクローナルＦａｂ３−４７とｒｓＣＤ４との反応性（レーン３）、 ｇｐ１２０特異的抗体（Ｌ７３６５２３）とヒトＰＢＬ溶解物との反応性（レー ン４）及びモノクローナルＦａｂ３−４７とヒトＰＢＬ溶解物との反応性（レー ン５）を示している。更に、このＦａｂクローンは、ヒトＰＢＬ溶解物（レーン ５）からの６０ｋＤａ蛋白質（ＣＤ４の分子量に対応）を認識する。これらの結 果は、Ｆａｂクローン３−４７のＣＤ４特異性を確認し、上記の細胞染色データ と共に、Ｆａｂクローン３−４７が、コンホメーションの変化した形態のＣＤ４ 分子上に露出されるエピトープ（ｇｐ１２０のＣＤ４への結合に際して露出され る）を認識することを示唆する。従って、Ｆａｂクローン３−４７は、ＣＤ４レ セプターにおけるＨＩＶ誘導されたコンホメーション変化の直接的証拠を提供す る。ＨＩＶエンベロープ蛋白質の、ＣＤ４におけるこのコンホメーション変化を 誘導する能力は、ＨＩＶ侵入は、ＣＤ４の第１のドメインへのエンベロープの結 合及びその後の細胞膜との融合に関係するだけでなく、ＣＤ４レセプターの多く の領域に関係する一連の事象にも関係することを示唆する。 III．免疫沈降 Ｆａｂ３−４７がＣＤ４分子を認識することを更に示すために、免疫沈降実験 を、ビオチン化Ｈ９細胞を用いて行なった。これらの細胞をビオチン化するため に、３×１０⁷のＨ９細胞を、ＰＢＳ−Ｐｌｕｓ（ＰＢＳ／０．１ｍＭ ＣａＣ ｌ₂／０．１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）で３回洗い、３ｍｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉ ｏｔｉｎ（Pierceより入手；ＰＢＳ−Ｐｌｕｓ中の１ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁し た。１時間、４℃で、穏やかに撹拌してインキュベートした後に、これらの細胞 を、ＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗い、その後、ＰＢＳ− Ｐｌｕｓで３回洗った。 ビオチン化Ｈ９細胞ペレットを、トリトンＸ−１００溶解用緩衝液（３００ｍ Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５％ トリトンＸ −１００、１００μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、 １ｍＭ ＰＭＳＦ、１．８ｍｇ／ｍｌのヨードアセタミド）にて、氷上で、４５ 分間、時々混合して溶解させた。細胞残渣を、ミクロ遠心分離機にて、４℃で、 １５分間、１２，５００ｒｐｍにてペレット化した後に、上清を、１．５ｍｌの エッペンドルフチューブに移した。この細胞溶解物を予備清澄化するために、こ の溶解物を、１時間、４℃で、ＰＢＳ中のＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｇビーズ（Phar macia）の５０％懸濁液３００μｌと、穏やかに撹拌してインキュベートした。 これらの試料を、ミクロ遠心分離機にて、１２，５０００ｒｐｍで、１分間、遠 心分離した。次いで、この予備清澄化した溶解物を、Ｆａｂ３−４７又は負の対 照抗体（ｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体Ｌ７３６５２３）（１５μｇ／ｍ ｌの濃度）と、一晩、インキュベートした。次に、これらの試料を、ＰＢＳ中の ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）₂結合したＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｇビーズの７ ５％懸濁液２００μｌと、１時間、４℃で、震盪してインキュベートした。次い で、これらのビーズを、上記のようにペレット化し、高塩洗浄用緩衝液（０．５ Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｎａ−デオ キシコレート０．５％ＮＰ−４、３０％シュークロース）で３回洗い、その後、 低塩洗浄用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ト リ スＨＣｌ、ｐＨ７ ．６）で２回洗った。 これらのビーズから、免疫沈降した蛋白質を、非還元的試料用緩衝液（６０ｍ Ｍ トリスＨＣｌ、Ｈ６．８、２５％ グリセロール、２％ Ｓ Ｄ Ｓ、０． １％ ブロモフェノールブルー）にて、９５℃で、１０分間溶出させ、１０％Ｓ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せた。電気泳動の後に、これらの蛋白質を 、一晩、ニトロセルロースにトランスファーした。この膜を、５％ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳＴ（１００ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．９ ％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）を用いてブロックし、２μｇ／ｍｌの西洋 ワサビペルオキシダーゼ結合したアビジン（Pierce）／０．３％ＢＳＡ／ ＴＢＳＴをプローブとして、ビオチン化蛋白質を検出した。多量のＴＢＳＴで洗 った後に、ＨＲＰ−アビジン結合したビオチン化蛋白質を、ＥＣＬ検出システム （Amersham）を用いて可視化した。 これらの結果（図５に示した）は、Ｆａｂ３−４７（負の対照抗ｇｐ１２０モ ノクローナル抗体ではない）が、ビオチン化したＨ９細胞溶解物から、５５ｋＤ の蛋白質（即ち、ＣＤ４の分子量に対応する）を免疫沈降させることを示してい る。実施例５ ： ＣＤ４特異的Ｆａｂのドメイン特異性のマッピング Ｆａｂ３−４７が結合するＣＤ４分子内の位置を決定するために、完全長又は 切り詰めたＣＤ４分子を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、 Ｆａｂ３−４７及び対照抗体と共に用いた。完全長のヒトｒｓＣＤ４（アミノ酸 １〜３７１を含む）又は切り詰めたヒトｒｓＣＤ４（アミノ酸１〜１８３を含み 、Ｖ１及びＶ２ドメインに対応する）の１μｇを、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの ウェル上に、一晩、４℃で、吸着させた。トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）で８回洗 った後に、これらのウェルを、０．５％脱脂粉乳／０．０５％ツイーン２０／Ｔ ＢＳを用いて、１時間、３７℃でブロックした。次いで、ブロック用溶液を除去 し、Ｆａｂ断片を、適当なウェルにて、１時間、３７℃でインキュベートした。 ＴＢＳで８回洗うことにより、未結合のＦａｂを除去した。次いで、結合したＦ ａｂを、これらのウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合したヤギ抗ヒトＩ ｇＧＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア、West Grove 在、Jackson Immunoresearch）の１ ：５０，０００希釈物と共に、１時間、３７℃でインキュベートすることにより 検出した。８回のＴＢＳ洗浄の後に、ＴＭＰ１成分基質溶液（メリーランド、Gaithers burg在、KPL）を加えた。これらの反応を、２０分後に、２／３Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄の 添加により終了させた。吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｍ Ｒ５０００ＬＩ ＳＡリーダー(バージニア、Chantilly在、Dynatech Lab，Inc.）にて、ＯＤ＝４５０ ｎｍで読んだ。 Ｆａｂ３−４７についての代表的結果を、下記に要約する： これらの結果は、Ｆａｂ３−４７が、完全長のｒｓＣＤ４（ドメイン１〜４を含 む）に結合するのと同程度に切り詰めた形態のｒｓＣＤ４（ドメイン１及び２の みを含む）に結合することを示し、これは、Ｆａｂ３−４７に対する結合部位が ヒトＣＤ４のドメイン１及び２（即ち、Ｖ１及びＶ２）に含まれていることを示 している。実施例６ ： ＣＤ４特異的Ｆａｂにより認識される コンホメーションの変化したＣＤ４分子の形成の条件 この発明の特異的抗ＣＤ抗体例えばＦａｂ３−４７により認識されるコンホメ ーションの変化したＣＤ４分子の形成を生じた条件を更に調べるために、上記の 実施例４、第Ｉ節に記載したものと類似する更なる細胞染色研究を実施した。第 １の一連の実験において、Ｆａｂ３−４７又は種々の対照抗体を、ＨＩＶ−１組 換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０）と４又は３７℃で予備インキュベートしたヒト 末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とインキュベートした。これらの対照には、正の対 照抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（Ｌ７３６５２３）、負の対照Ｆａｂ（２− ３６）及び無抗体対照（即ち、ＰＢＳのみ）が含まれた。これらの細胞染色実験 を、上記の実施例４、第Ｉ節に記載のように実施した。それらのフローサイトメ トリープロフィルを、図６のパネルＡ〜Ｈに示す。パネルＡ〜Ｄは、ｒｇｐ１２ ０と４℃で予備インキュベートしたヒトＰＢＬを表す。パネルＥ〜Ｈは、ｒｇｐ １２０と３７℃で予備インキュベートしたヒトＰＢＬを表す。パネルＡ及びＤの 細胞は、ＰＢＳだけとインキュベートした。パネルＢ及びＦの細胞は、対照ｇｐ １２０抗体とインキュベートした。パネルＣ及びＧの細胞は、対照Ｆａｂ２−３ ６とインキュベートした。パネルＤ及びＨの細胞は、Ｆａｂ３−４７とインキュ ベートした。これらの結果は、Ｆａｂ３−４７により認識さ れるコンホメーションの変化した形態のＣＤ４は、ヒトＰＢＬをｒｇｐ１２０と ３７℃で予備インキュベートしたときに形成され、ヒトＰＢＬをｒｇｐ１２０と ４℃で予備インキュベートしたときではない（即ち、Ｆａｂ３−４７のヒトＰＢ Ｌへの結合は、予備インキュベーションを３７℃で行なったときに認められ、予 備インキュベーションを４℃で行なったときではない）ということを示している 。 第２の一連の実験において、Ｆａｂ３−４７の、生きたＨＩＶ−１ウイルスと 予備インキュベートしたＨ９細胞に結合する能力を調べた。これらのウイルス結 合実験において、Ｈ９細胞を、一晩、３７℃で、感染性組換えＨＩＶ−１_MN（１ ．５×１０６細胞当り２０ｎｇのｐ２４）と、Ｆａｂ３−４７、正の対照抗ＣＤ ４モノクローナル抗体（Ｈｕ５Ａ８、ＣＤ４のドメイン２を認識するヒト化抗体 ）又は負の対照Ｆａｂ（２−３６）（各々、２μｇ／ｍｌの濃度）の存在下でイ ンキュベートした。洗浄後、結合した抗体を、これらの細胞を４℃で２０分間、 ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）₂（ペンシルベニア、West Grove 在、Jackson Immunores earch）の１：５０希釈物とインキュベートすることにより検出した。洗浄後、 これらの細胞試料を、ＥＰＩＣＳ−Ｃフローサイトメーター（フロリダ、Hialeah 在 、Coulter Corp．）にて分析した。負の対照として、間接染色（第１抗体の代わ りにＰＢＳを使用）を行なった。これらの結果を、図７、パネルＡ〜Ｄに示す。 パネルＡは、ＰＢＳ対照を表している。パネルＢは、正の対照抗ＣＤ４抗体（Ｈ ｕ５Ａ８）を用いる細胞染色を表している。パネルＣは、負の対照Ｆａｂ２−３ ６を用いる細胞染色を表している。パネルＤは、Ｆａｂ３−４７を用いる細胞染 色を表している。これらの結果は、Ｆａｂ３−４７は、生きたＨＩＶ−１と予備 インキュベートしたＨ９細胞に結合することを示しており、これは、Ｈ９細胞の 生きたＨＩＶ−１との予備インキュベーションが、Ｆａｂ３−４７により認識さ れるＣＤ４のコンホメーションの変化した形態の形成へと導くことを示している 。同等物 当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認 識し、又は常例的実験を用いて確かめることができる。かかる同等物は、後記の 請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ０７Ｋ 14/73 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ｃ０７Ｋ 14/73 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＣＤ４⁺細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はそのエンベロープ蛋白 質との接触に際してその細胞表面に発現されるコンホメーションの変化した形態 のＣＤ４分子に結合する抗体又はその断片であって、その抗体又はその断片が、 ＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質とその細胞との接触前にはその細胞表面上の ＣＤ４に実質的に結合しない、上記の抗体又はその断片。 ２．モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。 ３．ヒトモノクローナル抗体である、請求項２に記載の抗体。 ４．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６５８を与え られた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナルＦａ ｂ３−４７により結合されるエピトープ、又はAmerican Type Culture Collecti onに寄託されて指定番号６９６８４を与えられた細菌により運ばれるプラスミッ ドによりコードされるモノクローナルＦａｂ３−５１により結合されるエピトー プを発現するコンホメーションの変化した形態のヒトＣＤ４に結合する、請求項 ２に記載の抗体。 ５．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６５８を与え られた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナルＦａ ｂ３−４７のエピトープ結合特異性を有する、請求項４に記載の抗体。 ６．モノクローナルＦａｂ３−４７の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を有 する完全長モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。 ７．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６８４を与え られた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナルＦａ ｂ３−５１のエピトープ結合特異性を有する、請求項４に記載の抗体。 ８．モノクローナルＦａｂ３−５１の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を有 する完全長モノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。 ９．Ｆａｂ断片である、請求項１に記載の抗体。 １０．抗体、抗体模倣剤、検出用剤、細胞毒性剤及び医薬よりなる群から選択す る剤に機能的に結合された、請求項１に記載の抗体。 １１．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６５８を与 えられた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナルＦ ａｂ３−４７のエピトープ結合特異性を有するモノクローナル抗体又はその断片 。 １２．モノクローナルＦａｂ３−４７である、請求項１１に記載のモノクローナ ル抗体。 １３．抗体、抗体模倣剤、検出用剤、細胞毒性剤及び医薬よりなる群から選択す る剤と機能的に結合された、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。 １４．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６８４を与 えられた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナルＦ ａｂ３−５１のエピトープ結合特異性を有するモノクローナル抗体又はその断片 。 １５．モノクローナルＦａｂ３−５１である、請求項１４に記載のモノクローナ ル抗体。 １６．抗体、抗体模倣剤、検出用剤、細胞毒性剤及び医薬よりなる群から選択す る剤と機能的に結合された、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。 １７．請求項１に記載の抗体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬組成 物。 １８．請求項１１に記載のモノクローナル抗体及び製薬上許容し得るキャリアー を含む、製薬組成物。 １９．請求項１４に記載のモノクローナル抗体及び製薬上許容し得るキャリアー を含む、製薬組成物。 ２０．請求項１２に記載のモノクローナルＦａｂ３−４７の免疫グロブリン軽鎖 可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 ２１．免疫グロブリン軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含む、 請求項２０に記載の核酸分子。 ２２．請求項２１に記載の核酸を含む発現ベクター。 ２３．請求項２２に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。 ２４．請求項１２に記載のモノクローナルＦａｂ３−４７の免疫グロブリン重鎖 可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 ２５．少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖定常領域をコードするヌクレオチド 配列を更に含む、請求項２４に記載の核酸分子。 ２６．請求項２５に記載の核酸を含む発現ベクター。 ２７．請求項２６に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。 ２８．請求項１５に記載のモノクローナルＦａｂ３−５１の免疫グロブリン軽鎖 可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 ２９．免疫グロブリン軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含む、 請求項２８に記載の核酸分子。 ３０．請求項２９に記載の核酸を含む発現ベクター。 ３１．請求項３０に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。 ３２．請求項１５に記載のＦａｂモノクローナル３−５１の免疫グロブリン重鎖 可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 ３３．少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖定常領域をコードするヌクレオチド 配列を更に含む、請求項３２に記載の核酸分子。 ３４．請求項３３に記載の核酸を含む発現ベクター。 ３５．請求項３４に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。 ３６．ＣＤ４⁺細胞の表面に、その細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又は そのエンベロープ蛋白質との接触の際に発現されたコンホメーションの変化した 形態のＣＤ４分子に結合する抗体模倣剤であって、その抗体模倣剤が、その細胞 のＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質との接触まえにはその細胞表面のＣＤ４に 実質的に結合しない、上記の抗体模倣剤。 ３７．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６５８を与 えられた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナル３ −４７のエピトープ結合特異性を有する、請求項３６に記載の抗体模倣剤。 ３８．American Type Culture Collectionに寄託されて指定番号６９６８４を与 えられた細菌により運ばれるプラスミッドによりコードされるモノクローナル３ −５１のエピトープ結合特異性を有する、請求項３６に記載の抗体模倣剤。 ３９．ヒト免疫不全ウイルス又はそのエンベロープ蛋白質のＣＤ４⁺細胞への結 合に際して誘導されたコンホメーションの変化した形態のＣＤ４をその表面上に 発現しているＣＤ４⁺細胞を検出する方法であって、下記を含む当該方法： ＣＤ４⁺細胞を、３−４７及び３−５１から選択するモノクローナルＦａｂと 接触させ；及び その細胞表面に結合したモノクローナルＦａｂを検出し、それにより、その細 胞表面上で発現されたコンホメーションの変化した形態のＣＤ４分子を検出する 。 ４０．ＣＤ４⁺細胞の表面上に、ヒト免疫不全ウイルス又はそのエンベロープ蛋 白質のその細胞への結合に際して発現されるコンホメーションの変化した形態の ＣＤ４分子の形成を阻止する薬剤を同定する方法であって、下記を含む当該方法 ： このＣＤ４⁺細胞を下記のものと接触させ： ｇｐ１２０組成物；及び この細胞表面上のコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の形成を阻止す る能力について試験すべき薬剤； この細胞を、更に、３−４７及び３−５１から選択するモノクローナルＦａｂ と接触させ；及び その細胞に結合したモノクローナルＦａｂの量を測定し、ここに、この薬剤の 存在時におけるモノクローナルＦａｂのｇｐ１２０処理した細胞への結合の、こ の薬剤の不在時におけるモノクローナルＦａｂのｇｐ１２０処理した細胞への結 合の量と比較して減少した量は、この薬剤がこの細胞表面上でのコンホメーショ ンの変化した形態のＣＤ４の形成を阻止することを示す。 ４１．ＣＤ４⁺細胞の表面上のコンホメーションの変化した形態のＣＤ４の形成 を誘導する薬剤を同定する方法であって、下記を含む当該方法： ＣＤ４⁺細胞を、この細胞表面でのコンホメーションの変化した形態のＣＤ４ の形成を誘導する能力について試験すべき薬剤と接触させ； その細胞を、更に、３−４７及び３−５１から選択するモノクローナルＦａｂ と接触させ；及び その細胞に結合したモノクローナルＦａｂの量を測定し、ここに、この薬剤の 存在時におけるモノクローナルＦａｂのＣＤ４⁺細胞への結合の、この薬剤の不 在時におけるモノクローナルＦａｂのＣＤ４⁺細胞への結合の量と比較して増加 した量は、この薬剤がこの細胞表面上でのコンホメーションの変化した形態のＣ Ｄ４の形成を誘導することを示す。 ４２．ＣＤ４⁺細胞のヒト免疫不全ウイルスによる感染を阻止する方法であって 、その細胞を、その細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はそのエンベロー プ蛋白質との接触に際してその細胞表面上に発現されるコンホメーションの変化 した形態のＣＤ４分子と結合する抗体又はその断片と接触させることを含み、こ の抗体又はその断片が、この細胞のＨＩＶ又はそのエンベロープ蛋白質との接触 前にはその細胞表面上のＣＤ４に実質的に結合しない、上記の方法。 ４３．抗体又はその断片がモノクローナル抗体又はその断片である、請求項４２ に記載の方法。 ４４．このモノクローナル抗体又はその断片がヒトモノクローナル抗体である、 請求項４３に記載の方法。 ４５．抗体がモノクローナルＦａｂ３−４７のエピトープ結合特異性を有する、 請求項４４に記載の方法。 ４６．抗体がモノクローナルＦａｂ３−４７である、請求項４５に記載の方法。 ４７．抗体がモノクローナルＦａｂ３−５１のエピトープ結合特異性を有する、 請求項４４に記載の方法。 ４８．抗体がモノクローナルＦａｂ３−５１である、請求項４７に記載の方法。 ４９．抗体を患者に投与する、請求項４２に記載の方法。 ５０．ＣＤ４⁺細胞表面上に、その細胞のヒト免疫不全ウイルス又はそのエンベ ロープ蛋白質との接触に際して誘導されるコンホメーションの変化した形態のＣ Ｄ４上に発現される少なくとも１つのエピトープを発現する単離された分子。 ５１．コンホメーションの変化した形態のＣＤ４が、モノクローナルＦａｂ３− ４７により結合されるエピトープを発現する、請求項５０に記載の分子。 ５２．モノクローナルＦａｂ３−４７により結合されるエピトープを発現する、 請求項５１に記載の分子。 ５３．コンホメーションの変化した形態のＣＤ４が、モノクローナルＦａｂ３− ５１により結合されるエピトープを発現する、請求項５０に記載の分子。 ５４．モノクローナルＦａｂ３−５１により結合されるエピトープを発現する、 請求項５３に記載の分子。 ５５．蛋白質又はペプチドである、請求項５０に記載の分子。 ５６．改変されたヒトＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片である、請求項５５に 記載の分子。 ５７．非ヒト霊長類ＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片である、請求項５５に記 載の分子。 ５８．アカゲザル又はチンパンジーＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片である、 請求項５７に記載の分子。 ５９．モノクローナルＦａｂ３−４７又はモノクローナルＦａｂ３−５１に結合 する抗イディオタイプ抗体又はその断片である、請求項５５に記載の分子。 ６０．ペプチド模倣物質である、請求項５０に記載の分子。 ６１．請求項５０に記載の分子及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬組 成物。 ６２．製薬上許容し得るアジュバントを更に含む、請求項６１に記載の製薬組成 物。 ６３．請求項５０に記載の分子を用いて動物を免疫化することを含む、ＣＤ４⁺ 細胞表面上に、その細胞のヒト免疫不全ウイルス又はそのエンベロープ蛋白質と の接触に際して誘導されるコンホメーションの変化した形態のＣＤ４分子上に発 現されるエピトープに結合する抗体を製造する方法。 ６４．患者におけるＣＤ４⁺細胞のヒト免疫不全ウイルスによる感染を阻止する 方法であって、その患者に、ＣＤ４⁺細胞の表面に、その細胞のヒト免疫不全ウ イルス又はそのエンベロープ蛋白質との接触に際して誘導されるコンホメーショ ンの変化した形態のＣＤ４上に発現される少なくとも１つのエピトープを発現す る分子の治療上有効な量を、その分子により発現される少なくとも１つのエピ トープに対する抗体応答がその患者において誘導されるように投与することを含 む、上記の方法。 ６５．コンホメーションの変化した形態のＣＤ４が、モノクローナルＦａｂ３− ４７により結合されるエピトープを発現する、請求項６４に記載の方法。 ６６．分子が、モノクローナルＦａｂ３−４７により結合されるエピトープを発 現する、請求項６５に記載の方法。 ６７．コンホメーションの変化した形態のＣＤ４が、モノクローナルＦａｂ３− ５１により結合されるエビトープを発現する、請求項６４に記載の方法。 ６８．分子が、モノクローナルＦａｂ３−５１により結合されるエピトープを発 現する、請求項６７に記載の方法。 ６９．分子が、改変されたヒトＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片である、請求 項６４に記載の方法。 ７０．分子が、非ヒト霊長類ＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片である、請求項 ６９に記載の方法。 ７１．非ヒト霊長類ＣＤ４蛋白質又はそのペプチド断片が、アカゲザル又はチン パンジー由来のものである、請求項７０に記載の方法。