JPH10501155A

JPH10501155A - 半月板補強装置

Info

Publication number: JPH10501155A
Application number: JP8500992A
Authority: JP
Inventors: リ、シュ−タング; アール．ストン、ケビン
Original assignee: リージェンバイオロジクスインコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-27
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 1998-02-03
Also published as: US6042610A; EP0760598B1; CA2191330A1; ES2224126T3; ATE271312T1; DE69533285T2; AU2555395A; EP0760598A4; DE69533285D1; PT760598E; US5735903A; DK0760598T3; EP0760598A1; WO1995032623A1; CA2191330C; US5681353A; AU684183B2

Abstract

(57)【要約】本発明は患者の半月板の部分的欠陥に移植するため、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な線維からなる半月板補強装置に関する。移植時には、装置及び半月板の複合物が半月板の線維質軟骨細胞の内部成長に適合した骨格を確立する。本発明は更にその装置の製造方法及び使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】半月板補強装置関連出願の相互参照本出願は、現在米国特許第４，８８０，４２９号となっている１９８７年７月２０日に出願された米国特許出願第０７／０７５，３５２号の一部継続出願である、現在米国特許第５，００７，９３４号となっている１９８９年３月２日に出願された米国特許出願第０７／３１７，９５１号の一部継続出願である、現在米国特許第５，１０８，４３８号となっている１９９０年５月７日に出願された米国特許出願第０７／５２０，０２７号の一部継続出願である、１９９１年１２月１７日に出願された米国特許出願第０７／８０９，００３号の一部継続出願である、１９９４年４月２５日に出願された米国特許出願第０８／ＸＸＸ，ＸＸＸ（ＳＯＬ−１２７ＣＮ）号の一部継続出願である。発明の分野本発明は移植可能な補綴装置に関するものであり、より詳細には、半月板補強装置及びインビボ骨格を使用する半月板組織の再生に関するものである。発明の背景内側及び外側の半月板は、両凹状をなし、大腿骨及び頸骨の関節顆間に位置する線維軟骨のほぼＣ字状のくさびである。両半月板は重要なスタビライザとして作用し、力を配分する機構を提供するとともに頸骨と大腿骨との間の潤滑剤の役割を果たす。機能可能な半月板がない場合、膝に異常な関節機構に起因する応力集中が生じる。このような現象は関節炎の早期発生につながることもある。今まで損傷もしくは疾病に冒された半月板の治療としては、部分的もしくは完全な半月板の切除または置換という選択肢があった。しかしながら、膝関節半月板切除術はしばしば膝関節内の変性変化を引き起こす。ところが、半月板の損傷を除けば健康である膝関節において、半月板の置換は関節炎変化を防止するとともに、関節を安定させることがある。疾病に冒された関節においては、半月板の置換は疾病の進行を遅らせることがある。同種移植、即ち半月板移植は犬及び人間に対して行われてきた。しかしながら、これらの方法は移植片に対する宿主の免疫反応、寒冷保存過程における失敗、付着箇所の失敗により、長期に見て部分的にのみしか成功していない。半月板は永久人工材料から成る補綴により置換されることもある。このような補綴は、免疫反応の可能性を最小化させるため完全に人工的な材料から構成されている。このような人工材料の使用は、膝関節が受ける高い、連続的な負荷に耐えることのできる構造を提供することができるとともに、生体材料が許容することのできない有益な方法により関節機構を変えることができるため有利であると考えられている。例として、犬の切除された半月板に取って代わってテフロン（商標登録）のネットが使用されたことがあり、顕著な軟骨磨耗を伴いながらも、ネット内への線維成長もしくは再生が確認された。補綴半月板の構造において、強化ステンレス鋼やナイロン線維を伴うシリコーンゴムやテフロン（商標登録）等の弾性材料が使用されたこともある（米国特許第４，５０２，１６１号）。弾性プラスチック材料から半月板成分が増殖されたこともある（米国特許第４，０８５，４６６号）。加えて、有る程度の成功を伴って病変の後を炭素繊維ポリウレタンポリ（Ｌ −ラクチド）で再構築させる試みがされた（リースラグ等（１９８６年）生物学的材料の生物学的及び生物機械学的性能（編集者、クリステル等）エルセビアサイエンスパブリッシャーズＢ．Ｖ．、アムセテルダム、３４１ページから３５２ページ）(Leeslag et al.(1986) Bioloical and Biomechanical Performance of Biomaterials(Christel et al.,eds.)Elsevier Science Publishers B.V.,Amste rdam,pp.341-352)。しかしながら、半月板組織の永久人工材料で構成される構造への置換は、概して不成功に終わっている。成功に至っていない理由は、主に人間及び動物の膝関節の対向している関節軟骨が脆いことにある。膝関節における関節軟骨は、人工補綴半月板が引き起こす磨耗の相互作用や通常と異なった弾力性に耐えることができない。また、関節に加わる力は体重の何倍もあり、膝や腰の場合には、このような力が年間百万回以上加えられる。従って、永久人工半月板は未だに天然の半月板特性を有するに至っていない上、このような日常的な力に耐え得るよう確実に配置されるに至っていない。ストーン(Stone)（米国特許第５，００７，９３４号、５，１１６，３７４号、５，１５８，５７４号）は、天然ポリマー等の生物学的適合性及び生物学的再吸収可能性を有する線維から構成される補綴用の吸収可能な半月板と、同補綴用半月板を形成する方法を開示している。また、ストーンは人間の膝に再吸収可能な補綴半月板を移植することにより半月板組織を再生させる方法を開示している。発明の概要本発明は患者の半月板の部分的欠陥に移植するための半月板補強装置に関するものである。半月板の部分的欠陥に移植された時、半月板及び装置により構成された複合物は部分的欠陥のない天然半月板とほぼ同一なインビボの外表面輪郭を備え、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な骨格を確立し、その骨格内部にて半月板の線維質軟骨細胞が成長するようになっている。内部成長した半月板の線維質軟骨細胞は骨格とともに天然の半月板への負荷力を支持する。ここでいう「半月板の部分的欠陥」は、結果として半月板の部分的切除につながる、半月板全体より小さい部分における断裂または病変（放射方向の断裂、水平方向の断裂、バケツ柄状断裂、複雑断裂）を包囲するものである。半月板補強装置は、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な天然ポリマーのような線維から構成され、半月板の部分的欠陥に対してほぼ相補的な外表面輪郭を備えている。本発明はまた半月板の部分的欠陥のインピボ形状を有する半月板の補強装置を製造する方法に関するものである。この方法は、生物学的適合性を有しかつ生物学的に再吸収可能な複数の線維を部分的欠陥の形状を有する金型内に配置し、線維を凍結乾燥し、線維が金型の形状を呈するように、その線維を化学的架橋剤に接触させる。金型は部分的欠陥を相補するように装置の外表面を形成する。或いは、成形完了後に金型内に形成された構造またはマトリックスはその外表面が部分的欠陥と相補的になるように切断される。この方法は半月板における部分的欠陥の形状と相補的な外表面輪郭を有するように乾燥した多孔性の容積マトリックスを生産する。半月板の部分的欠陥に移植された時、マトリックスは半月板の線維質軟骨細胞がマトリックス内部へ成長するため、及び天然半月板への負荷力を支持するため、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な骨格を確立する。半月板の複合物及び移植されたマトリックスの外表面は、部分的欠陥のない天然半月板とほぼ同一である。更に、本発明はインビボで半月板組織を再生するための方法を提供する。この方法は上記のように生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な線維から構成された半月板補強装置を製造し、その後に半月板の部分的欠陥に移植する。この移植された装置は、骨格内部にて半月板の線維質軟骨細胞が成長するように、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な骨格を確立する。骨格は、骨格内部にて成長する半月板の線維質軟骨細胞とともに天然半月板の負荷力を支持する。図面の簡単な説明本発明の前記及びその他の目的、本発明の種々の特徴、更には本発明そのものは、下記の説明を以下に添付する図面とともに読むことにより完全に理解することができる。図１は無傷な人間の膝関節を示す写真である。図２は半月板の部分的欠陥を有する人間の膝関節を示す写真である。図３は半月板の部分的欠陥を有する人間の膝関節を示す写真である。図４は半月板の部分的欠陥に縫合された半月板補強装置を示す写真である。図５は部分的欠陥を有する半月板を示す写真である。図６は部分的欠陥を有する半月板を示す写真である。図７は半月板の部分的欠陥に縫合された半月板補強装置を示す写真である。図８は半月板の部分的欠陥内に外科的に移植された半月板補強装置を示す概略図である。図９は半月板の部分的欠陥内に載置される半月板補強装置を示す概略図である。図１０は半月板の軟骨に縫合される半月板補強装置を示す概略図である。図１１は元来の半月板に半月板補強装置を接合するための最終的縫合を示す概略図である。図１２は元来の半月板に縫合された半月板補強装置を示す概略図である。好ましい実施の形態の詳細な説明生体適合性及び生体再吸収性を有する線維から形成された半月板補強装置は正常な関節運動及び関節強度を実現すべく手術により半月板の部分的欠陥に移植可能なことが確認されている。半月板補強装置は半月板組織を再生するための足場としても機能する。半月板補強装置内への半月板組織の成長は移植された装置の物理特性によって促進される。この種の半月板組織の成長により、被移植体の半月板及び補強装置からなる複合体が形成される。この複合体は部分的欠陥を有さない天然半月板にほぼ等しい生体内外面形状（in vivo outer surface contour ）を有する。本発明の半月板補強装置の線維は一部に架橋結合を有し得る乾燥した多孔性の容積マトリックス（Dry,porous volume matrix）の形態を常には有する。好ましい実施の形態において、線維は潤滑性及び機械的強度を提供可能な天然材料、好ましくは天然ポリマーを有する。更に、多孔性マトリックスは半月板線維軟骨細胞（Meniscal fibrochondrocytes）と、内皮細胞と、線維芽細胞と、細胞外マトリックスを常には占領する他の細胞とが同多孔性マトリックス内へ成長することを促進し、さらには細胞外マトリックス成分の生成及び蓄積を促進する。これらの線維は動物組織または人体組織から一般的に採取可能なコラーゲンと、エラスチンと、レチクリンと、これらの類似体と、これらの混合物とを含む。本発明の幾つかの形態において、線維はマトリックス全体にわたって不規則に配向されている。これに代えて、線維の長さを半月板補強装置全体にわたってほぼ周方向に配向するか、またはほぼ半径方向に配向し得る。半月板補強装置の線維密度を装置全体にわたって均一または不均一に形成可能である。線維密度を不均一にする場合、高い応力が予測される部分の線維密度を他より高く形成し得る。装置の機械的強度及び緩衝能力を維持する一方で、本発明の多孔性容積マトリックス内への半月板線維軟骨細胞及び他の細胞の成長を促進すべく、半月板補強装置の線維密度を操作し得る。例えば、多孔性容積マトリックス内への組織成長を促進すべく比較的大きな線維内空間及び線維間空間（Intrafibrillary and in terfibrillary space）を望む場合、装置の線維密度を約０．０７〜約０．１５ｇマトリックス／ｃｍ³（g matrix/cm³）に形成可能である。ここで、ｇ／ｃｍ³ は１立方センチメートルのマトリックス内に含まれるグラム数を表す。これに代えて、膝関節に対する機械的支持及び高い緩衝能力を実現すべく比較的小さな線維内空間及び線維間空間を望む場合、装置の線維密度を約０．１５〜０．５０ｇマトリックス／ｃｍ³に形成可能である。本発明の好ましい実施の形態において、マトリックスは約０．１０〜０．２５ｇマトリックス／ｃｍ³の密度と、約８〜９ｃｍ³／ｇマトリックス（cm³/g matrix）の線維内空間及び線維間空間とを有する。これは半月板への自然な負荷を支持する十分な機械的強度を維持する一方で、多孔性容積マトリックス内への半月板線維軟骨細胞及び他の細胞の成長にとって理想的な環境を提供する。マトリックスは線維全体にわたって分散するグリコサミノグリカン分子（以下、ＧＡＧと称する）を有し得る。これらの分子はＮ−アセチル化ヘキソサミンを含む二糖類の繰返し単位からなる鎖を有するとともに、半月板補強装置に対して潤滑性及び架橋結合を提供する。本発明に使用可能なＧＡＧには、マトリックスの成分としてのコンドロイチン４−サルフェート（Chondroitin 4-sulfate）、コンドロイチン６−サルフェート（Chondroitin 6-sulfate）、ケラタンサルフェート（Keratan sulfate）、デルマタンサルフェート（Dermatan sulfate）、ヘパランサルフェート（Heparan sulfate）、ヒアルウロン酸（Hyaluronic acid ）及びこれらの混合物が含まれる。ＧＡＧを個々の分子として半月板補強装置全体にわたって均一に分散させるか、またはＧＡＧの含有量を装置の複数の異なる領域において変化させ得る。マトリックスは乾燥重量として約７５〜１００％の天然線維及び約０〜２５％のＧＡＧを有し得る。これらの割合はマトリックス全体を通じて一定とするか、または変化させ得る。生体内における半月板補強装置の形状の一時的安定性と、線維の再吸収率（装置がＧＡＧを有する場合はＧＡＧの再吸収率を含む）とは少なくとも一部の線維間における架橋結合に基づいて変化する。更に、ＧＡＧは線維との共有結合の形成に直接関与するか、または安定した線維及びＧＡＧの複合体を形成すべく線維と絡み合うことにより線維と機械的に作用し得る。架橋結合の形成に使用する架橋剤は生体適合性を有する二官能性架橋剤を含む。これらの架橋剤は分子間架橋結合を形成すべく１つの分子上のアミノ基、カルボキシル基及び水酸基のいずれか１つと反応する。これに代えて、架橋剤は分子間架橋結合を形成すべく異なる複数の分子上、即ち線維及びＧＡＧ上のアミノ基、カルボキシル基及び水酸基のいずれか１つと反応し得る。効果的な架橋剤はグルタルアルデヒド、フォルムアルデヒド、生体適合性／二官能性アルデヒド（Biocompatible/bifunctional ald ehydes）、カルボジイミド、ヘキサメチレン・ジイソシアナート、ビス−イミデート、ポリグリセロール・ポリグリシジル・エーテル、グリオキサール及びこれらの混合物を含む。分子間架橋結合は脱水加熱プロセス（加熱及び真空）を通じて形成可能である。脱水加熱プロセスはリジンまたはヒドロキシリジンのアミノ基と、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基との間にペプチド結合を形成する。架橋結合された装置は約５５〜８５℃、好ましくは約６５〜７５℃の比較的高い熱安定性を有し、同熱安定性は生体内での十分な安定性を提供する。この熱安定性は架橋剤濃度、温度、ｐＨ及び時間を含む架橋条件の操作を通じて実現し得る。架橋結合された装置は十分な親水性及び弾性を維持する。この結果、装置は天然半月板の特性または同天然半月板の一部の特性に類似する特性（即ち、機械的応力を支持する能力、並びに関節面を保護し、かつ滑らかにする能力）を有する。更に、装置の構造は細胞浸潤、並びに細胞外マトリックスの生成及び蓄積にとって理想的な環境を提供する。半月板補強装置はＧＡＧ架橋結合を有さないＩ型コラーゲン線維（Type I col lagen fibers）から主に形成されている。Ｉ型コラーゲン線維は動物のアキレス腱から採取可能である。しかし、線維は動物の皮膚、人間の皮膚及び人間の腱のいずれか１つから採取可能である。非コラーゲン材料を完全に除去するか、または非コラーゲン材料を最小限レベルまで削減すべく組織を一連の機械的手段及び化学的手段で処理する。好ましい処理工程では、腱または皮膚を別の処理に効果的な細片まで機械的に分解する。分解は組織を液体窒素温度において粉砕するか、または組織を鋭利なナイフで小片に切断することにより実現可能である。特定のアプリケーションでは、機械的強度に必要な線維長を維持すべく腱を線維の方向に沿って機械的に分解する。中性ｐＨにおける腱の塩抽出は、安定した線維に結合されていない新たに生成された少量のコラーゲン分子を除去する。更に、静電気作用を通じて塩はコラーゲンに付随する糖蛋白質及びプロテオグリカンの一部を除去する。塩化カリウム等の他の塩を塩化ナトリウムの代替物として使用できる。細胞膜またはコラーゲン・マトリックスに付随する脂質はトリトンＸ−１００（Triton X-100）等の洗剤を用いて最初に抽出し、次いでエーテル及びエタノールの混合物を用いて抽出することにより除去できる。トリトンＸ−１００の濃度は一般的に約２〜４％、好ましくは約３％である。エーテル及びエタノールの好ましい混合物は一般的に約１：１の割合（ｖ／ｖ）で混合されている。抽出時間は一般的に８〜９６時間、好ましくは約２４〜４８時間である。別の抽出は２つの極端なｐＨでのマトリックス膨潤（Matrix swelling）により実現可能である。酸性膨潤及び塩基性膨潤（Acidic and basic swelling）は非共有結合分子間作用（Non-covalent intermolecular interactions）を弱める。従って、非共有結合により結合された糖蛋白質、ＧＡＧ及び他の非コラーゲン分子をコラーゲン・マトリックスの開放された孔を通じて放出することが促進される。アルカリ性ｐＨでのマトリックスの膨潤はコラーゲンを高いｐＨにおいてCa(O H)₂、NaOH及びこれらに類似する物質のいずれか１つによって約８〜９６時間処理することにより実現される。(CH₃)₄NCl、(NH₄)₂SO₄及びこれらに類似する物質のいずれか１つに代表される三重螺旋安定塩（Triple-helical stabilizing sal ts）の存在下におけるアルカリ抽出は、コラーゲン変性の潜在的危険性を低減する。アルカリ処理は非架橋結合により結合された糖蛋白質及びＧＡＧをコラーゲン・マトリックスから分離する。アルカリは鹸化を通じて残留脂質を除去する。酸性膨潤は酢酸、塩酸及びこれらに類似する物質のいずれか１つの存在下において低いｐＨで実施可能である。アルカリ処理同様に、酸性膨潤は非架橋結合によって結合された糖蛋白質及びＧＡＧを除去する。分子の非三重螺旋部分（テロペプチド）は分子間架橋結合の形成に関与する。これらは弱い抗原であり、かつペプシン及びトリプシン等のプロテアーゼによる攻撃に弱い。これらのプロテアーゼによる長時間の消化は、小線維（線維）を個々の分子へ分離させる。しかし、最大量のテロペプチドを完全分離を伴うことなく除去するように消化プロセスを適切に制御した場合、機械的強度を犠牲にすることなく小線維の免疫原性を最小レベルまで低下させ得る。例えば、分子コラーゲンを分離すべく、皮膚または腱のペプチドによる消化は室温以下の温度で約２４〜９６時間にわたって約１：１０の酵素及びコラーゲンの割合で常には実施される。小線維は約１：１００（酵素：コラーゲン）の割合で、４℃において約２４〜９６時間にわたって実施したペプシン限定消化（Limited pepsin digestion ）により得られる。次いで、この方法によって得られたコラーゲン線維を本発明の半月板補強装置を形成すべく使用する。しかし、II型コラーゲン（Type II collagen）等の別の種類のコラーゲンと、生物学的に合成したコラーゲン等の別の供給源から得られたコラーゲンと、これらに類似するコラーゲンとのうちのいずれか１つを半月板補強装置の形成に使用可能である。人工半月板補強装置は線維ネットワーク内に含まれる接着分子、即ち接着部分等を有し得る。本明細書中において、接着分子とは細胞を接着させ得る接着面を装置上に提供し、これにより半月板組織の再生を補助する分子を意味する。効果的な接着分子はコンドロネクチン（Chondronectin）、オステオネタチン（Osteo nectin）及びフィブロネクチンを含むが、これらに限定されるものではない（米国特許第４，５８９，８８１号、第４，６６１，１１１号及び第４，５７８，０７９号参照）。更に、これらの一部をコンドロイチンサルフェート等に結合させ得る。これに代えて、またはこれに加えて、人工補強装置は線維ネットワーク全体にわたって分散及び結合された成長因子を含み得る。成長因子は半月板組織再生を補助する。成長因子には形質転換成長因子αと、形質転換成長因子βと、線維芽細胞成長因子と、表皮成長因子と、血小板由来成長因子と、これらに類似し、かつ対応する天然成長因子の生物活性を有する成長因子とが含まれる。マトリックスは任意に組合された複数の成長因子を含み得る。更に、本発明は前記の種類の半月板補強装置を製造する方法に関する。半月板補強装置を製造する方法は、複数の線維（または線維及びＧＡＧ、若しくは線維及び成長因子及び／若しくは接着因子及び／若しくはＧＡＧ）を補修対象である半月板内の部分的欠陥によって画定される形状（または補修対象である部分的欠陥より更に大きな形状）を有する金型内へ配置し、線維を凍結乾燥し、乾燥した多孔性の容積マトリックスを形成すべく線維と、線維及びＧＡＧとのいずれか一方が金型の形状を呈するように、同線維と、線維及びＧＡＧとのいずれか一方を化学的架橋剤に接触させることを含む。金型は装置の形状を部分的欠陥の形状に適合させるべく同装置の外面形状を画定し得る。これに代えて、本発明の別の態様において、化学的に架橋結合されたマトリックスを凍結乾燥し、次いで同マトリックスに対して脱水加熱架橋結合処理（Dehydrothermal crosslinking proced ures）を施すことにより別の架橋結合工程を実施し得る。金型が補修対象である特定の欠陥より大きい形状を画定する場合、マトリックスの外周部分を切断することにより同マトリックスの形状を欠陥の形状に適合させ得る。線維はランダムにあるいは特定の方向に向かせて並べられる。例えば線維は円筒形等の鋳型状に向きを揃えても良い。或いは鋳型を回転させながらその中に線維を置くことによって円周状に並べて置いても良い。これに代えて、線維を直線状且つ放射状に手で置くことにより、鋳型中に放射状に並べても良い。構造に様々な橋架け処理と、様々な化学的及び／又は脱水熱の方法を含む脱水処理を加える前に、他の組成、例えば橋架け反応に関わるＧＡＧ等がランダムに或いは非ランダムに線維に混合されても良い。この構造には処理中、粘着分子又は粘着断片はその類似体、又は成長因子又は生物学的に活性化された断片又はその類似体が含まれても良い。マトリクス中の幾つかの領域には、化学的橋架け工程に先立ち線維または線維とＧＡＧとを鋳型内で圧縮することで特定の密度と大きさの孔が形成される。これは特定の形状を持ったピストンによってマトリクスのある領域に圧力を掛けることで行われる。好ましい孔の大きさは約５０ミクロンから約５００ミクロンである。上記の例の中で詳述された工程を追うことで本発明の半月板補強装置が製造される。この装置は以下の表に示される特徴を有する。本発明は更に生体内で半月板組織を再生する方法に関する。この方法は上記した方法に従って半月板補強装置を製造する方法及び被験者の半月板の体節欠損部に半月板補強装置を移植する方法とを含む。「被験者」は半月板損傷を持ちうる生物、例えば哺乳類を含む。被験者の例としてはヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ネズミ及びハツカネズミが挙げられる。本発明の半月板補強装置を外科的に移植する一つの方法が例２５のおいて説明され、図８−１２に表わされる。本発明は以下に示す複数の例によって詳述されるが、それらによって発明が限定されるものではない。本明細書中に引用されるすべての参考文献、特許、公開特許申請、同時継続中の特許申請は、参考のためにここに含まれる。例１．不溶性Ｉ型コラーゲンの準備方法１（Ａ）組織の準備牛のアキレス腱を米国農務省公認の屠殺場から取り寄せる。牛の好ましい年齢は１２乃至１８ヶ月である。組織はその劣化とバクテリア汚染を防ぐための精装工程の間特定の箇所を除いて低温に保たれる。（Ｂ）機械的分解注意深く選択された腱に付着した組織、髪、脂肪等の汚染物質及び外部物質がまず機械的に擦りとられる。次に腱は市販のステンレス製肉用スライサーによって腱の軸に垂直な方向にスライスされる。この時の腱の厚さは０．５ｍｍから１．０ｍｍである。腱は長い組織を生成するためにその軸方向に沿ってスライスされても良い。（Ｃ）水による抽出スライスされた腱は発熱物質の含まれていない蒸留水によって２回抽出される。２回の抽出はそれぞれ別の蒸留水によって行われる。抽出の温度は２２℃であり合計時間は４乃至８時間である。この時血液と水溶性タンパク質を取り除くため蒸留水は攪拌される。（Ｄ）脂質の抽出スライスされた腱はそれぞれ別の４分量のイソプロパノールによって２回抽出される。抽出の合計時間は２４時間であり、イソプロパノールは脂質を取り除くために攪拌される。イソプロパノールによって抽出された腱は発熱物質の含まれていないそれぞれ別の１０分量の蒸留水によって２回洗浄される。洗浄の合計時は間２乃至４時間であり、蒸留水の温度は２２℃である。（Ｅ）塩化ナトリウムの抽出スライスされた腱は前置フィルター（０．２μｍ）によって濾過されたそれぞれ別の１０分量の５％塩化ナトリウム溶液によって約２０時間抽出される。この時の塩化ナトリウム溶液の温度は２２℃に保たれ、また塩溶性の非コラーゲン物質を取り除くために攪拌される。塩分を抽出された腱は発熱物質の含まれていないそれぞれ別の１０分量の蒸留水によって洗浄される。（Ｆ）水酸化ナトリウムの抽出残留した脂質等のアルカリに感応する非コラーゲン物質はアルカリ抽出によって取り除かれる。腱のアルカリ抽出は１３を越えるｐＨに於いて行われ、３重らせんの安定塩を用いることで過度の膨張とタンパク質の変性が防がれる。腱は５分量の１．０Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液中で抽出される。ここでは１．１Ｍの硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）が構造安定塩として用いられる。この抽出は２４時間、温度を２２℃に保ち攪拌を伴って行われる。アルカリを抽出された腱は０．１５Ｍの硫酸で約ｐＨ５．０に中和される。このとき１．１Ｍの硫酸ナトリウムが腱の膨張を最小限に抑えるために用いられる。次にｐＨ５．０にされた発熱物質の含まれていない１０分量の水で塩分を取り除くためのすすぎが４回行われる。（Ｇ）凍結乾燥浄化された腱のスライスはヴィルティス凍結乾燥器によって凍結乾燥され使用されるまで乾燥保管される。２．不溶性Ｉ型コラーゲンの準備方法２（Ａ）組織ウシ、ブタ或いはヒツジのアキレス腱を米国農務省公認の屠殺場から取り寄せる。対象となる動物の好ましい年齢は１２乃至１８ヶ月である。（Ｂ）機械的分解注意深く選択された腱に付着した組織がまず機械的に擦りとられる。そして腱は細かく切り刻まれる。切り刻まれた腱は大量（１０分量）の冷水によって残留血液タンパク質及び水溶性物質を取り除くために洗浄される。（Ｃ）塩分抽出洗浄された腱は１０分量の５％ＮａＣｌ（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）によって２４（±４）時間抽出される。塩分を抽出された腱は約１０分量の水によって塩分を取り除くため繰り返し洗浄される。（Ｄ）脂質抽出腱（以下、原料）は３％のトリトンＸ−１００（洗剤）によって２４（±２）時間抽出される。この洗剤は水による集中的な洗浄により取り除かれる。原料は更に含有脂質を低減するために３乃至４分量のエーテル−エタノール（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）によって抽出される。脂質を抽出された原料はエーテルとエタノールを取り除くために集中的に洗浄される。（Ｅ）マトリクス膨張次に非コラーゲン物質を取り除くための極端なｐＨ抽出が２回、原料に対して行われる。アルカリ抽出が３乃至４分量の０．２ＭのＮａＯＨによってｐＨ１２．５乃至１３．５で室温に於いて行われる。この処理は２４（±２）時間行われ、１．０Ｍの（ＣＨ₃）₄ＮＣｌも用いられる。アルカリ抽出に続いて、ｐＨがＨＣｌによって中和され、原料は水で洗浄される。ｐＨは次に濃縮酢酸を加えることで２．５乃至３．０に調整され、最終的な濃度は０．５Ｍにされる。この酸抽出は攪拌を伴って２４（±２）時間続けて行われる。（Ｆ）限定的タンパク質分解消化次に、酸によって膨張した原料に対してペプシン（酵素：コラーゲンは１：１００）による限定的タンパク質分解消化が２４（±２）時間行われる。ペプシンとテロペプチドは透析によって取り除かれる。膨張した繊維原料は、１ＭのＮａＯＨ又はＨＣｌを用いてｐＨを等イオン点にすること、或いはＮａＣｌを用いてイオン強度を０．７にすることによってコアセルベート化される。集まったコラーゲン線維が濾過によって収集される。濾過された原料は冷たい緩衝液によって集中的に洗浄される。この高精製Ｉ型コラーゲンは使用されるまで−２０℃から−４０℃にて保管されても良い。３．溶性Ｉ型コラーゲンの準備組織準備（Ａ）、機械的分解（Ｂ）及び水による抽出（Ｃ）は例１と同様に実行される。（Ｄ）ペプシン消化腱のスライスは１０分量の０．０７Ｍの乳酸によって膨張させられる。１：１０酵素：腱（ｗ／ｗ）の比率を持つペプシンが腱に加えられ、腱は２４時間４℃ にて消化される。消化された腱はメッシュ膜フィルタによって濾過され、上清が集められ冷蔵庫に保管される。不溶性の残留物がペプシンによって再抽出され上清が再び集められる。２つの上清は合わせられ６０目および２００目のステンレス鋼膜で濾過される。（Ｅ）沈殿最終濃度が１．０Ｍになるまで、ＮａＣｌの結晶が濾過された上清にゆっくりと加えられ攪拌される。Ｉ型コラーゲンはゆっくりと溶液から沈殿する。沈殿物は遠心分離器にかけられ集められる。（Ｆ）精製沈殿物は１０分量の０．０３Ｍの乳酸中で再融解され、１ＭのＮａＣｌによって再沈殿される。沈殿物は再び遠心分離器にかけられ集められる。最後に沈殿物は１分量の０．０３Ｍの乳酸中で再融解され、酸を取り除くため蒸留水に対して透析される。透析された溶性Ｉ型コラーゲンは凍結乾燥され使用されるまで乾燥保管される。４．不溶性ＩＩ型コラーゲンの準備（Ａ）組織ウシの膝関節部分を米国農務省公認の屠殺場から取り寄せる。大腿部関節丘及び脛骨平坦部の関節軟骨を鋭い刃物によって薄いスライス状に切り取る。スライス状の関節軟骨は蒸留水によって集中的に洗浄され凍結乾燥される。（Ｂ）機械的分解乾燥された関節のスライスはグラインダ又はステンレス鋼のウェアリングブレンダを用いて細かく裂かれ、抽出に適した大きさにされる。脂質抽出（Ｃ）と塩化ナトリウム抽出（Ｄ）は例１と同様に実行される。（Ｅ）グアニジン−塩酸塩抽出関節組織は１０分量の４Ｍのグアジニン−ＨＣｌに２回抽出される。この処理は４℃で２４時間行われる。抽出された関節組織はグアジミン−ＨＣｌを取り除くため１０分量の蒸留水で洗浄される。水酸化ナトリウム抽出（Ｆ）及び不溶性関節ＩＩ型コラーゲンの凍結乾燥（Ｇ）は例１と同様に実行される。５．可溶性ＩＩ型コラーゲンの調製組織の調製（Ａ）及び機械的分解（Ｂ）は、例４の記載に従って実施された。（Ｃ）トリトンＸ−１００による抽出軟骨組織は、１０倍量の１％トリトンＸ−１００及び２Ｍ塩化ナトリウム中にて、４℃で、２４時間撹拌しながら抽出された。（Ｄ）塩酸グアニジンによる抽出軟骨組織は、１０倍量の４Ｍ塩酸グアニジンを用いて、４℃にて、２４時間抽出され、エクストラクタントは廃棄された。不溶性の残渣は、塩及び塩酸グアニジンを除去するために１０倍量の蒸留水にて２４時間洗浄された。（Ｅ）ペプシン消化軟骨組織は、まずｐＨ２．５〜３．０にて０．０７Ｍ乳酸中で膨潤させた。次いで、酵素：軟骨組織の重量比が１：１０であるペプシンを加え、組織を４℃にて２４時間消化させた。消化された組織は、３０番メッシュのスクリーンフィルタにてろ過され、上澄み液は回収され、冷所に保存された。不溶性の残渣は、再びペプシンにて消化され、上澄み液は、最初の抽出による上澄み液と合わせた。軟骨ＩＩ型コラーゲンの析出及びＩＩ型コラーゲンの精製は、例２の記載に従って実施された。６．不溶性Ｉ型コラーゲンディスパージョンの調製例１から得られた精製されたコラーゲン約１００ｇは、同コラーゲンを膨潤させるために、ステンレス鋼製容器中の０．０７Ｍ乳酸１４リットル中に加えられる。膨潤したコラーゲンのｐＨは、２．５〜約３の間にあるべきである。膨潤したコラーゲンは、インラインシルバーソン（in-line Silverson）ホモジナイザー（アメリカ合衆国マサチューセッツ州イーストロングミードゥ（East Longmea dow））にてホモジナイズされる。ホモジナイズされたコラーゲンディスパージョンは、３０メッシュのステンレス鋼のフィルタにてろ過され、ホモジナイズされていない粒子が取り除かれ、装置製造用の均一なディスパージョンが得られる。７．不溶性ＩＩ型コラーゲンディスパージョンの調製Ｉ型コラーゲンに代えて、例４から得られるＩＩ型コラーゲンを使用する以外は、例６と同様に調製する。８．不溶性Ｉ型コラーゲン−ＧＡＧディスパージョンの調製約１．３ｇのヒアルウロン酸及び約１．３ｇのコンドロイチン硫酸が、ステンレス鋼製容器中の０．０７Ｍ乳酸１４リットル中にて溶解される。次いで、例１から得られた精製されたＩ型コラーゲン約１００ｇは、ＧＡＧ溶液中に加えられ、最低４時間、コラーゲンを膨潤させる。膨潤したコラーゲン−ＧＡＧがインラインシルバーソンホモジナイザー（マサチューセッツ州、イーストロングミードゥ）にてホモジナイズされる。ホモジナイズされたコラーゲン−ＧＡＧディスパージョンは、３０メッシュのステンレス鋼フィルタにてろ過され、ホモジナイズされていない粒子が取り除かれ、装置製造用の均一なディスパージョンが得られる。９．不溶性Ｉ型コラーゲン−ＴＧＦディスパージョンの調製約１０μｇのＴＧＦ−αあるいはＴＧＦ−β（アメリカ合衆国ニューヨーク州グランドアイランド（Grand Island）に所在のギブコ・ビー・アール・エル（Gi bco BRL）社）が、ステンレス鋼製容器中の０．０７Ｍ乳酸１４リットル中にて溶解される。次いで、例１から得られる精製されたＩ型コラーゲン約１０ｇは、ＴＧＦ−β溶液中に加えられ、最低４時間、コラーゲンを膨潤させる。膨潤したコラーゲン−ＴＧＦ−βは、インラインシルバーソンホモジナイザー（マサチューセッツ州、イーストロングミードゥ）にてホモジナイズされる。ホモジナイズされたコラーゲン−ＴＦＧ−βディスパージョンは、３０メッシュのステンレス鋼フィルタにてろ過され、ホモジナイズされていない粒子が取り除かれ、装置製造用の均一なディスパージョンが得られる。１０．不溶性Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンディスパージョンの調製約５０ｇのＩ型コラーゲン（例１から得られる）及び約５０ｇのＩＩ型コラーゲン（例４から得られる）は、０．０７Ｍ乳酸溶液１４リットル中にて膨潤される。次いで、膨潤したコラーゲンは、インラインシルバーソンホモジナイザー（マサチューセッツ州、イーストロングミードゥ）にてホモジナイズされる。ホモジナイズされたＩ型−ＩＩ型コラーゲン混合物（重量比１：１）は、３０メッシュのステンレス鋼フィルタにてろ過され、大きな粒子が除去される。分散されたＩ型−ＩＩ型コラーゲン混合物は、装置製造用に使用され得る。１１．不溶性Ｉ型コラーゲン−可溶性ＩＩ型コラーゲンディスパージョンの調製約５０ｇの可溶性ＩＩ型コラーゲン（例４から得られる）は、０．０７Ｍ乳酸１４リットル中に溶解される。次いで、５０ｇの不溶性Ｉ型コラーゲン（例から得られる）が、同Ｉ型コラーゲンを膨潤するために、ＩＩ型コラーゲン溶液中に加えられる。膨潤したＩ型コラーゲンはホモジナイズされ、例５と同様にろ過される。分散されたＩ型−ＩＩ型コラーゲン混合物（重量比１：１）は、装置製造用に使用され得る。１２．装置Ｉの製造（Ａ）約７００ｇのＩ型コラーゲンディスパージョン（例６における記載にて調製される）は、２リットルの真空フラスコ中に入れられる。０．６％水酸化アンモニウム溶液約１２０ｍｌが、コラーゲンをコアセルベートするためにディスパージョンに加えられる。次いで、２０％塩化ナトリウム約８０ｍｌが、更に繊維間の溶液インビビションを低減するためにコアセルベートされた繊維に加えられる。（Ｂ）完全にコアセルベートされた繊維は、同繊維から過剰の溶液を除去するために、有孔メッシュバスケット中にて、約７０〜８０ｇに脱水される。（Ｃ）部分的に脱水されたコラーゲン繊維は、治療されるべき欠陥部分の寸法に合わせた特殊な寸法の金型に注入される。繊維から水が徐々に除去されながらも、全体にわたって同一の密度を維持するために、一定重量（３００グラム〜７００グラムの間）を用いた金型中にて更なる脱水が行われる。この緩速脱水工程は、所望の寸法（厚さ約８ｍｍ）に達するまで、約２４時間続けられる。（Ｄ）脱水されたコラーゲンマトリックスは、更に、所望の形状に形成される。（Ｅ）脱水されたコラーゲン繊維は、ヴィルティス（Virtis）凍結乾燥器にて凍結乾燥する前に、予め−２０℃にて、少なくとも４時間凍結される。（Ｆ）凍結されたコラーゲン繊維は、まず−１０℃にて、４８〜７２時間乾燥され、次いで、２０℃、４００ミリバールの真空中にて、１６〜２４時間乾燥される。（Ｇ）凍結乾燥されたマトリックスは、フォルムアルデヒド架橋工程にて処理される。マトリックスは、閉じられたチャンバ中において、２２℃にて、２％フォルムアルデヒド溶液から発生するフォルムアルデヒド蒸気と４０時間反応させることにより架橋される。架橋されたマトリックスは、結合していないフォルムアルデヒドを除去するために、通気される。（Ｈ）次いで、マトリックスは、更に架橋を増強するために加熱真空処理がなされる。（Ｉ）マトリックスは、治療されるべき半月板の部分的欠陥の形状に合わせて切断される。切断されたマトリックスは、同マトリックスがインビトロ及びインビボにおいて生物学的適合性が得られる程度まで、残渣の塩及びフォルムアルデヒドを除去するために、発熱性物質（pyrogen）の含まれていない蒸留水中にて集中的に洗浄される。（Ｊ）洗浄されたマトリックスは、高性能微粒子除去フィルタ（hepafilter）にて乾燥され、梱包され、滅菌される。１３．装置ＩＩの製造装置ＩＩの製造方法は、約７００ｇのＩＩ型コラーゲンディスパージョン（例５の記載に従って調製）を使用することを除いて、例１２に記載された方法と同一である。１４．装置ＩＩＩの製造装置ＩＩＩの製造方法は、約７００ｇのＩＩ型コラーゲンディスパージョン（例７の記載に従って調製）を使用することを除いて、例１２に記載された方法と同一である。１５．装置ＩＶの製造装置ＩＶの製造方法は、約７００ｇのＩＩ型コラーゲン−ＧＡＧディスパージョン（例８の記載に従って調製）を使用することを除いて、例１２に記載された方法と同一である。１６．装置Ｖの製造装置Ｖの製造方法は、約７００ｇのＩ型コラーゲン−ＴＧＦ−βディスパージョン（例９の記載に従って調製）を使用することを除いて、例１２に記載された方法と同一である。１７．装置ＶＩの製造（Ａ）例２から得られる高純度のＩ型コラーゲン原繊維のコラーゲン量は、重量法によって、あるいはＩ型コラーゲン中のヒドロキシプロリン重量を総重量の１３．５％と仮定した場合のヒドロキシプロリン量から決定される。次いで、半月板補強装置の与えられた密度を製造するために必要な精製された材料量が、決定され、重量が測定される。（Ｂ）原繊維コラーゲン溶液が、例えば既に例示した半月板補強装置のような、特殊な寸法の金型に注入される。コラーゲン繊維は、ランダムな方法あるいは、配向された方法にて置かれる。配向された方法では、周方向に配向する繊維は、材料が金型に圧縮される際、主軸のまわりにピストンを回動することによって形成され、放射方向への配向は、直線放射方向に手動にてコラーゲン繊維を塗布することによって形成される。（Ｃ）繊維は、−２０℃にて凍結され、金型から取り出され、室温にて解凍される。（Ｄ）次に、繊維は、リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁され、金型中に所望の配向にて戻され、ピストンを用いて圧縮される。（Ｅ）圧縮された繊維は、その後−２０℃にて凍結され、次いで室温にて解凍される。（Ｆ）得られた構造物は、ｐＨ７．６の０．２％グルタルアルデヒド溶液に２４（±０．５）時間浸すことによって架橋される。次いで、各グルタルアルデヒド架橋半月板補強装置は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５００ｍｌ中にて、４，８，２４及び４８時間、繰り返し洗浄される。（Ｇ）次いで、洗浄されたマトリックスは凍結乾燥される。１８．装置ＶＩＩの製造工程（Ａ）〜（Ｇ）は、例１７と同様である。（Ｈ）凍結乾燥されたマトリックスは、真空加熱によって脱水熱架橋が施される。まず、残渣の水分量を最小レベル（約３％の構造的な水分は、構造安定因子の一部として、コラーゲン３重らせんに結合したままである）に減ずるために、真空状態にされる。加熱は、真空にて、２４（±２）時間、段階的に１１０℃まで昇温する。１９．装置ＶＩＩＩの製造工程（Ａ）は、例１７と同様である。（Ｂ）コラーゲン物質は、ｐＨ２〜２．５にて０．０１Ｍ塩酸溶液中に分散される。所定量の種々のＧＡＧ類は、重量が測定され、水に溶解される。例えば、与えられた密度０．２５ｇ／ｃｍを得るには、コラーゲン量は０．２４４ｇ、２．５％のＧＡＧ量を得るために、ヒアルウロン酸量０．００３ｇ及びコンドロイチン硫酸量０．００３ｇとなる。ＧＡＧ溶液は、コラーゲン溶液と混合され、例１２の記載に従って、所望の配向にて金型中に置かれる。工程（Ｃ）〜（Ｇ）は、例１７と同様である。２０．装置ＩＸの製造工程（Ａ）〜（Ｃ）は、例１７と同様である。工程（Ｄ）は、置かれた繊維を圧縮しない点を除いては、例１７と同様である。工程（Ｅ）〜（Ｇ）は、例１７と同様である。２１．装置Ｘの製造工程（Ａ）〜（Ｅ）は、例１７と同様である。（Ｆ）成形されたコラーゲンは、ｐＨ１０にて、５０％エタノール及び０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃中の５％ポリグリセリンポリグリシジルエーテルを用いて、２４（ ±２）時間架橋される。架橋された装置は、ｐＨ７．４のＰＢＳ５００ｍｌを用いて、それぞそれ４、８、２４及び４８時間洗浄される。工程（Ｇ）は、例１７と同様である。２２．装置ＸＩの製造工程（Ａ）〜（Ｅ）は、例１７と同様である。（Ｆ）成形されたコラーゲンは、ｐＨ４．７の０．９％塩化ナトリウム中の１０エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１０ｍｇ／ｇマトリックス）の存在下、室温にて２４（±２）時間架橋される。カルホジイミドの添加は、３〜４時間毎に行われ、カルボジイミドを添加する度に、ｐＨが４．７に調整される。工程（Ｇ）は、例１７と同様である。２３．インビトロ試験半月板補強装置が、正常な半月板組織の再生テンプレートとして機能及び／または作用する能力を判定するため、インビトロ試験を行った。無菌状態にて成熟イヌから半月板を採取して付着組織を全て取り除き、ギー（ Gey）の平衡生理的食塩水溶液に浸漬した。それぞれの半月板を冠状面にて二等分し、二等分された半月板のそれぞれに、３ｍｍの全層円形欠陥を形成した。その欠陥に、直径３ｍｍのコラーゲンまたはコラーゲン−ＧＡＧの半月板補強装置栓子を配置した。１０％ウシ胎仔血清、アスコルビン酸ナトリウム及び０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた６ｍｌのダルベッコの変性イーグル培養液を含む６ウェルの培養平板に、半月板を配置した。３７℃で、１０％ＣＯ₂ ／９０％空気の加湿雰囲気中にて培養を維持し、１週間に３回流加し、外植培養細胞の形成を防止するため、毎週１回新鮮な培養ウェルと交換した。培養開始から１，４及び６週後に、各群から３つの半月板を取り出して固定し、連続切片及び染色により評価した。結果は、培養期間中に細胞遊走及び表層浸潤（superficial invasion）が増加したことを示す。移植材料による明かな毒性はなかった。遊走細胞は、無変化の半月板線維軟骨細胞と比較して、より紡錘形状であり長尺状であった。骨格への細胞浸潤（cellular penetration）の深さは、半月板補強装置の密度によって規制されたようであった。また、前述の方法により製造された半月板補強装置において、以下の手順による試験を行った。（Ａ）縫合引き抜き試験縫合引き抜き試験の目的は、水和マトリックスの縫合引き抜き強度が、外科的移植術にて必要とされる強度を上回ることを確認することにある。Ｃ−９２７ｍｍ針に装着された２−０マクソン（Maxon）縫合糸（デイビスアンドゲッタ，ダンベリー（Davis＆Geck,Danbury），シーティー）を、予め水和された試料の外縁から３ｍｍの位置にて試料を貫通させることにより、縫合引き抜き試験を行う。結び目を結び、力ゲージ（シンポアメリカコープ（Shimpo America Cor p.），リンカーンウッド，アイエル）のフックに環を取り付けた。縫合糸が引き抜かれるまで、または、力が３ｌｂｓ（約１４ｋｇ）を上回るまで、試料を手で引っ張った。縫合引き抜き力は、３ｌｂｓ（約１４ｋｇ）を上回る。この数値の強度は、外科的移植術に必要とされる強度を満たしている。（Ｂ）膨潤試験例証のための膨潤試験の目的は、マトリックスの密度に関連する水和の度合いを測定することにある。膨潤指数は、乾燥コラーゲンマトリックスの重量当たりの溶液吸収量として定義される。まず試料の乾燥重量を測定し、次に試料を蒸留水中に２０分間浸漬して、膨潤指数を測定する。ビーカーのガラス壁に軽く叩きつけることにより、試料に含まれる過剰な水を取り除く。その後、生重量を測定する。膨潤指数は、４．３ｇ／ｇマトリックスである。この数値の膨潤は、孔の構造及び組織の内部生長において必要とされる密度に一致している。（Ｃ）縮み温度縮み温度試験の目的は、マトリックスの水熱縮み温度の測定に基づき、架橋の度合いがインビボ安定性及び組織生長のために十分であることを確認することにある。０．７ｃｍｘ１．５ｃｍｘ０．２ｃｍの寸法を有する切片を縮み温度装置に取り付ける。コラーゲン試料の一端を、固定点にて固定する。次に、滑車を介して試料の他端を軽量重りに取り付けて、これにより一定の張力を保持する。ｐＨ７．４，０．０１Ｍリン酸緩衝生理的食塩水を入れたビーカー内にて、試料を平衡化する。１分間に１℃の割合で、溶液を加熱する。撓み角における試料の長さを、連続的に手測定した。マトリックスの縮み温度は、その長さが変化し始める時点（角撓み開始時点）の温度として定義される。架橋されたマトリックスは、６７℃の平均熱縮み温度を有する。イヌによる試験において、この温度は、組織生長のためのインビボ安定性を維持するために十分であることが判っている。（Ｄ）密度密度試験の目的は、密度が、組織の内部生長のための孔の構造の設計ガイドラインの範囲内にあることを確認することにある。第１に、マトリックスの寸法を、０．２ｍｍの精度範囲内で電気カリパスによって測定する。次に容積を算出する。その後、マトリックスを炉内にて４時間、１００℃で乾燥させる。乾燥マトリックスを０．２ｍｇの精度範囲にて重量測定し、密度をｇ／ｃｍ³にて算出する。マトリックスは０．２０ｇマトリックス／ｃｍ³の平均密度を有する。この密度は、組織の内部生長のための総マトリックス１ｃｍ³当たり０．８６ｃｍ³の間質（線維間）容積を有する。（Ｅ）透過性透過性試験の目的は、栄養素供給のための高分子に対するマトリックスの透過性を確認することにある。無作為の試料から、約１．０ｃｍｘ０．７ｃｍｘ０．５ｃｍの寸法を有する切片を調製する。各切片の乾燥重量を測定し、１００ｍｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマケミカルコー（Sigma Ch emical Co.），セントルイス，エムオー）に５時間浸漬する。次に生重量を測定する。マトリックス内のＢＳＡを、１００ｍｌの０．９％ＮａＣｌにより２０時間抽出する。次に、抽出液内のＢＳＡ濃度を、ブラッドフォード（アナルバイオケム（Anal. Biochem.）（１９７６）７２：２４８）に基づく手順に従い測定する。簡潔に説明すると、この手順では、０．５ｍｌの抽出液を０．５ｍｌのクーマッシープラス（Coomassie Plus）タンパク試薬により反応させる。予め乾燥させたＢＳＡを用いて標準品を調製する。展開した青色の吸光度を、分光光度計（パーキンエルマーコープ（Perkin Elmer Corp.），ノーウォーク，シーティー）を用いて、波長５９５ｎｍにて測定する。マトリックス内の間質（線維間は除く）空隙はＢＳＡに対して完全な透過性を有し、このことは設計基準を満たしている。（Ｆ）孔の構造孔の構造評価の目的は、マトリックスが、細胞の内部生長のために十分な多孔性を有することを確認することにある。マトリックスの切片標本を走査電子顕微鏡（ＳＥＭｓ）（ストラクチャープローブインク（Structure Probe Inc.），メトゥチェン，エヌジェー）によって調べることによって、マトリックスの孔の構造を評価する。ＳＥＭｓによって、孔は不規則な形状を有し、孔径は約５０ミクロンから約５００ミクロンまでの範囲内にあることが判る。この範囲の孔径は、細胞生長のために十分である。２４．外科的移植技術及び死体試験Ｉ型コラーゲン及びＧＡＧｓを含む半月板補強装置を、７０例のヒト死体移植術にて評価する。水平方向の溝及び部分的欠陥内に、装置を移植する。全膝に関する試験を、標準的な関節鏡門を用いて行う。内側半月板溝については、図８に示すように、中外側膝蓋骨内に関節鏡を配置して、前内側門を介して器具の操作を行う。半月板の安定な部分を保持する一方、半月板の裂傷及び断裂部分を関節鏡バイター（biters）及びシェイバー（shavers）により取り除く。次に、較正されたプローブを半月板欠陥に沿って配置し、欠陥の測定を行う。その後、プローブを半月板補強装置上に配置し、装置を欠陥に適合させるように切除して形を整える。半月板補強装置の形を整えた部分を、特殊な変更を施した関節鏡グラスパー（grasper）を用いて把持し、セグメントに挿入する。グラスパーに把持された状態で、グラスパーの孔、次に半月板補強装置、更に元来の半月板に１０インチの２−０ＰＤＳ縫合糸を通すことによって、装置を所定位置に縫合する。縫合糸を皮下被膜の上部にて直接結ぶ。図１０及び図１１に示すように、移植片を半月板縁に更に確実に固定するため、更なる縫合糸を配置する。縫合された半月板補強装置の最終的な外見を図１１に示す。膝は全範囲の動作において曲げられ、伸長される。装置は著しく膨潤するが、互いに対向する関節軟骨及び大腿顆の形状に適合するように、均質に成型される。いくつかの膝で、連続３ＤＭＲＩ像を撮影し、移植片の安定な位置決定と、脛骨粗面上の０°から１２０°までの屈曲における適切な可動域とを記録する。２５．インビボ試験半月板補強装置が、正常な半月板組織の再生テンプレートとして機能及び／または作用する能力を判定するため、インビボ試験を行った。Ｉ型コラーゲン及びＧＡＧｓを含む半月板補強装置の外科的移植を、１０名の患者に行った。試験はＦＤＡの承認を受けた利用可能性試験として行われ、全患者は内側半月板軟骨の著しい損失即ち修復不能な損傷を含む厳密な基準を満たしていた。移植後、専用仕様の膝に関する評価フォーム、移植片の寸法及び位置に関する標準的測定及び３ＤＭＲＩ測定、及び第２回目の関節鏡検査等の臨床フォローアップ評価を行った。移植の３ヵ月後に、移植片を関節鏡検査により観察した。臨床的、肉眼的、Ｘ線写真及び組織学的評価を現在実施中である。均等物当業者により、周知の技術のみを用いて、前述した本発明の実施形態に等価な多くの別例が認識され、確認され得る。このような等価な別例は、以下の請求の範囲に含まれるものとする。

Claims

【特許請求の範囲】１．患者の半月板の部分的欠陥に移植するための半月板補強装置であって、その装置は、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な複数の線維を備え、前記装置は半月板の部分的欠陥に対してほぼ相補的な外表面輪郭を備え、かつ、前記線維は天然ポリマー、天然ポリマーの類似物、並びに天然ポリマー及び／または類似ポリマーの混合物からなるグループから選択されたものであり、それにより、前記装置は半月板の部分的欠陥に移植された時、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な骨格を確立し、その骨格内部にて半月板の線維質軟骨細胞が成長するようになっており、前記骨格及び内部成長した半月板の線維質軟骨細胞が天然の半月板への負荷力を支持し、かつ、前記半月板及び装置の複合物のインビボの外表面が部分的欠陥のない天然半月板のそれとほぼ同一になる半月板補強装置。２．前記生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的に生物学的に再吸収可能な複数の線維は、乾燥した多孔性の容積マトリックスを備え、そのマトリックスは約５０ミクロンから約５００ミクロンの範囲の大きさの孔を備える請求項１に記載の装置。３．前記マトリックスは１立方センチメートル当たり、約０．１０から約０．２５グラムの密度を有する請求項２に記載の装置。４．前記マトリックスは１グラム当たり、約２から約２５立方センチメートルの線維内空間及び線維間空間を有する請求項２に記載の装置。５．前記天然ポリマーはヒト及びヒト以外の動物に由来するポリマーのグループから選択されたものである請求項１に記載の装置。６．ヒトに由来するポリマー及びヒト以外の動物に由来するポリマーはコラーゲン、エラスチン、レチクリン、セルロース、それらの類似物及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項５に記載の装置。７．前記ポリマーはコラーゲンである請求項６に記載の装置。８．前記コラーゲンはＩ型コラーゲン、II型コラーゲン及びそれらの組み合わせからなるグループから選択されたものである請求項７に記載の装置。９．前記線維の少なくとも一部は架橋されている請求項１に記載の装置。１０．前記マトリックスの線維に散在させた複数のグリコサミノグリカン分子を更に有する請求項２に記載の装置。１１．前記グリコサミノグリカン分子の少なくとも一部は前記マトリックスの線維の少なくとも一部と架橋されている請求項１０に記載の装置。１２．前記線維は約７５から１００乾燥重量％の濃度で存在し、前記グリコサミノグリカン分子は約０から２５乾燥重量％の濃度で存在する請求項１０に記載の装置。１３．前記グリコサミノグリカン分子はコンドロイチン４−サルフェート、コンドロイチン６−サルフェート、ケラタンサルフェート、ダーマタンサルフェート、ヘパランサルフェート、ヘパリン、ヒアルウロン酸、及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項１０に記載の装置。１４．前記架橋は化学的架橋剤によって形成される請求項９に記載の装置。１５．前記架橋は化学的架橋剤によって形成される請求項１１に記載の装置。１６．前記架橋剤はグルタールアルデヒド、フォルムアルデヒド、生物学的適合性を有する二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イミデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサール、及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項１４に記載の装置。１７．前記架橋剤はグルタールアルデヒド、フォルムアルデヒド、生物学的適合性を有する二官能性アルデヒド、カルホジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イミデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサール、及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項１５に記載の装置。１８．前記架橋剤はフォルムアルデヒドである請求項１６に記載の装置。１９．前記架橋剤はグルタールアルデヒドである請求項１６に記載の装置。２０．前記架橋剤はフォルムアルデヒドである請求項１７に記載の装置。２１．前記架橋剤はグルタールアルデヒドである請求項１７に記載の装置。２２．成長因子を更に備える請求項１に記載の装置。２３．前記成長因子は形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、またはそれらの組み合わせである請求項２２に記載の装置。２４．接着分子を更に備える請求項１に記載の装置。２５．前記接着分子はフィブロネクチン、コンドロネクチン、オステオネクチンまたはそれらの組み合わせである請求項２４に記載の装置。２６．半月板の部分的欠陥のインビボ形状を有する半月板の補強装置を製造する方法であって、（ａ）生物学的適合性を有しかつ生物学的に再吸収可能であり、かつ、天然ポリマー、天然ポリマーの類似物または天然ポリマーの混合物を含んだ複数の線維を金型内に配置し、（ｂ）成形された線維を凍結乾燥し、（ｃ）線維が金型の形状を呈するように、その線維を化学的架橋剤に接触させ、（ｄ）前記工程（ａ）の間、あるいは工程（ｃ）の後、前記半月板の部分的欠陥の形状とほぼ相補的になるように、前記装置の外表面を制御し、よって、約５０ミクロンから約５００ミクロンの大きさの範囲の直径を備えた孔を有する乾燥した多孔性の容積マトリックスを確立し、そのマトリックスは膝関節に移植された時、半月板の線維質軟質細胞のマトリックス内部への成長のため、及び天然半月板への負荷力を支持するため、生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的には生物学的に再吸収可能な骨格を確立し、それにより、前記骨格及び前記半月板の複合物のインビボ外表面が部分的欠陥のない天然半月板とほぼ同一になる方法。２７．請求項２６に記載の方法によって生成された半月板の補強装置。２８．前記天然ポリマーはヒト及びヒト以外の動物に由来するポリマーのグループから選択されたものである請求項２６に記載の方法。２９．前記ヒトに由来するポリマー及びヒト以外の動物に由来するポリマーはコラーゲン、エラスチン、レチクリン、セルロース、それらの類似物及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項２８に記載の方法。３０．（ａ）は複数のグリコサミノグリカン分子を前記金型内に配置することを更に含む請求項２６に記載の方法３１．前記グリコサミノグリカン分子は、コンドロイチン４−サルフェート、コンドロイチン６−サルフェート、ケラタンサルフェート、ダーマタンサルフェート、ヘパランサルフェート、ヘパリン、ヒアルウロン酸、及びそれらの混合物からなるグループから選択されたものである請求項３０に記載の方法。３２．配置工程（ａ）は更に前記金型内において所望のパターンに前記線維を配向することを含む請求項２６に記載の方法。３３．前記化学的架橋剤はグルタールアルデヒド、フォルムアルデヒド、生物学的適合性を有する二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イミデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサール、及びそれらの混合物からなる架橋剤のグループから選択されたものである請求項２６に記載の方法。３４．（Ａ）は更に生物学的適合性を有しかつ生物学的に再吸収可能な線維及び成長因子を金型内に配置することを更に含む請求項２６に記載の方法。３５．前記成長因子は形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、またはそれらの組み合わせである請求項３４に記載の方法。３６．（Ａ）は更に、生物学的適合性を有しかつ生物学的に再吸収可能な線維及び接着分子を金型内に配置することを含む請求項２６に記載の方法。３７．前記接着分子はフィブロネクチン、コンドロネクチン、オステオネクチンまたはそれらの組み合わせである請求項３６に記載の方法。３８．インビボで半月板組織を再生するための方法であって、（ａ）患者の半月板の部分的欠陥に移植するための半月板補強装置を製造し、その半月板補強装置は生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的に生物学的に再吸収可能な線維を備え、その装置は半月板の部分的欠陥に対してほぼ相補的な外表面輪郭を備え、かつ、前記線維は天然ポリマー、天然ポリマーの類似物、並びに天然ポリマー及び／または類似ポリマーの混合物からなるグループから選択されたものであり、それにより、前記装置は生物学的適合性を有しかつ少なくとも部分的に生物学的に再吸収可能な骨格を確立して、その骨格内部にて半月板の線維質軟質細胞が成長するように、前記半月板内の部分的欠陥に移植可能であり、かつ、前記骨格及び内部成長した半月板の線維質軟骨細胞が天然半月板の負荷力を支持し、（ｂ）前記装置を患者の半月板の部分的欠陥内に移植し、よって、前記装置及び前記半月板の複合物のインビボ外表面が部分的欠陥のない天然半月板とほぼ同一になる方法。３９．前記（ａ）で製造された装置は（ｂ）で移植される時、半月板の部分的欠陥の形状を呈する請求項３８に記載の方法。