JP3100156B2 - プロテーゼ用半月 - Google Patents

プロテーゼ用半月

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JP3100156B2
JP3100156B2 JP02505044A JP50504490A JP3100156B2 JP 3100156 B2 JP3100156 B2 JP 3100156B2 JP 02505044 A JP02505044 A JP 02505044A JP 50504490 A JP50504490 A JP 50504490A JP 3100156 B2 JP3100156 B2 JP 3100156B2
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アール． ストーン，ケビン
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レゲン バイオロジクス インコーポレイテッド
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は移植可能な医療装置の分野にあり、一層特に
は、プロテーゼ用半月及び半月組織を再生するためのイ
ン・ビボの足場（scaffold）として有用なデバイス並び
にそれらの製造方法を指向するものである。
開示の背景 内側及び外側半月は、膝関節において、一緒になって
重要な安定部、力分配用機構、脛骨と大腿骨との接触領
域における潤滑としての働きをする一対の軟骨構造であ
る。半月が無ければ、異常な関節機構に関連して応力の
集中が膝に生じ、関節炎変化の早期発生が生じる。
従来技術では、損傷した或は疾患のある半月の治療
は、外科的修復及び切除の両方によるのが普通であっ
た。切除によって、半月組織の再生が行われ得る。加え
て、半月線維軟骨細胞はフィブリン血餅で満ちた欠損中
に移動して正常な半月線維軟骨と見掛け上同様の組織を
形成することが知られている。適当なマトリックス足場
が半骨欠損内に存在する場合に、このような半月線維軟
骨が形成され得る。半月組織は、また、出血組織に暴露
された際に、自己修復することができ、加えて、また、
従来技術において、組織培養中の半月細胞が細胞分裂及
びマトリックス合成の能力があることも知られている。
損傷した半月をその他は異常の無い関節において代える
ことは、関節炎変化を防止しかつ関節を安定化すること
ができる。病気にかかった関節では、半月を代えれば病
気経過の進行を低減させ及び痛みの軽減をもたらすこと
ができる。異系移植或は半月移植は犬やヒトの両方で実
施されてきた一置換方法である。しかし、このアプロー
チは、移植片に対する宿主の免疫学的応答、寒冷貯蔵プ
ロセスの不良、結合部位の不良により、長期にわたり、
部分的な成功があったにすぎなかった。
代りの従来技術の置換アプローチでは、半月を恒久的
人工材料で構成されるプロテーゼに取り替えた。このよ
うなプロテーゼは、免疫学的応答の可能性を最小にする
ために、純粋に人工の材料で構築されてきた。加えて、
このような材料を使用することは、膝関節において遭遇
する高いかつ繰り返しの負荷に耐えることができる構造
の構築を可能にし、及び関節機構を生物学的材料ならば
耐えないような有利な方法で変えることができることか
ら有利であると考えられる。
例えば、犬の切除された半月に代えてテフロンネット
を用いて線維性内部成長或は再生が観察されたが、有意
の軟骨の摩耗を伴った。プロテーゼ用半月は、また、ス
テンレススチール或はナイロンストランドの補強材を有
するシリコーンゴム或はテフロン等の弾性材料から作ら
れた（米国特許4,502,161号）。半月部材は、また弾性
プラスチック材料からも作られた（米国特許4,085,466
号）。加えて、半月病巣をカーボンファイバー−ポリウ
レタン−ポリ（Ｌ−ラクチド）で再形成しようと試みら
たが、これらの材料によるその成功は最小のものである
（Leeslag等、Biological and Biomechanical Performa
nce of Biomaterials（Christel等編集）Elsevier Scie
nce Publishers B.V.、アムステルダム、1986、347〜35
2頁）。
しかし、半月組織を恒久的人工材料から成る構造に代
えることは、主に、ヒト及び動物関節の対抗する関節軟
骨が脆弱であるため、うまくゆかないのが普通であっ
た。膝における人工の軟骨は摩耗界面にも、従来技術の
人工半月の移植から終局的に生じる正常からのコンプラ
イアンス変化にも耐えない。加えて、関節力は体重の数
倍であり、膝や股関節部の場合、代表的には１年当り百
万サイクルにわたってかかる力に遭遇する。従来技術の
恒久的人工半月は、従来、天然の半月特性を有する材料
で構成されておらず、このような日常の力に耐える程に
しっかり位置させることができなかった。
従って、必要とされる物は、軟質でありかつ潤滑性の
生体適合性材料で構成される改良されたプロテーゼ用半
月である。
皮膚や神経のような他の組織の修復は、合成及び天然
の両方の材料を使用して試みられてきた。例えば、ヤン
ナス（Yannas）等は、天然のコラーゲン及びグリコサミ
ノグリカンから、内皮移植片、及び人工表皮を作った
（米国特許4,060,081号）。ニールス（Nyiles）等（Tra
ns.Am.Soc.Artif.Intern.Organs（1983）29:307〜312）
は、合成の再吸収性ポリエステルを末梢神経再生用に使
用すること、及びコラーゲン導管を神経再生用の足場と
して使用することを報告した。
しかし、膝関節と異なる解剖学的構造を再構築するの
に適応させた前述の技術によってさえも、プロテーゼ用
半月として適しかつ完全に再吸収性の天然材料、或はそ
れらの類似物質から作られる構造物は従来技術において
開発されていない。
よって、本発明の目的は、正常の関節運動を可能にす
る改良された半月プロテーゼを提供するにある。
別の目的は生体力学的に正常の関節力に耐えることが
でき及びそれらの負荷において軟骨を保護し且つ関節を
安定にするように機能することができる半月代替え品或
はプロテーゼを提供するにある。
更に別の目的は、半月線維軟骨浸潤及び再生用の暫定
的イン・ビボ足場として働く再吸収性半月状プロテーゼ
を提供するにある。
なお別の目的は、正常の半月の機構に相当する機構を
有する生体適合性材料で構成される半月状プロテーゼを
提供するにある。
それ以上の目的は、標準の手術技法によって移植する
のに適応させた半月状プロテーゼを提供するにある。
別の目的は半月組織をイン・ビボで再生する方法を提
供するにある。
なおそれ以上の目的は、かかるプロテーゼ用半月を製
造することができる方法を提供するにある。
発明の要約 本発明は半月の形及び役割をとる、膝関節に移植する
ための生体適合性及び生体吸収性構造を提供する。この
プロテーゼ用半月は、天然の半月の物理的特性を有する
組織を再生するための足場を促進しかつ提供する。
本発明のプロテーゼ用半月は、天然ポリマー或はこれ
らの類似物質或はこれらの混合物を含む生体適合性生体
吸収性繊維の乾燥した多孔性マトリックスであるのが普
通である。マトリックスは天然半月と実質的に同じ外面
形をイン・ビボで有するように適応させる。更に、マト
リックスは、50ミクロンより大きい〜約500ミクロンよ
り小さいおおよその範囲の細孔寸法を有する。マトリッ
クスは、この形状を有することによって、半月線維軟骨
細胞を内部に成長するように適応させた少なくとも一部
生体吸収性の足場を確立する。マトリックスは、所定の
角が０度より大きくかつ360度に等しいか或はそれより
小さい範囲であり、かつ中央領域の厚さが周辺領域の厚
さに比べて薄い円周に伸びるくさびの形状を有するのが
よい。発明のいくつかの態様では、マトリックスは、例
えば簡単なくさび、２つの狭い末端領域の間に広い中央
領域を有する三日月形状のくさび、或は角度360度に及
びかつくぼんだ（凹形の）中央領域を有する円周に伸び
るくさびの形状をとることができる。
マトリックスは生体適合性及び生体吸収性繊維で構成
され、繊維の一部は架橋されてもよい。繊維は天然物質
或は天然物質の類似物質、例えば生合成により生成され
た類似物質を含む。発明の好ましい実施態様では、マト
リックスの繊維は、例えば動物或はヒトの組織から得ら
れる物のような天然分子のポリマーである。同じ目的に
有用な天然繊維はコラーゲン、エラスチン、レティキュ
リン、これらの類似物質及びこれらの混合物を含む。
発明のいくつかの態様では、繊維はマトリックス全体
にわたりランダムに配置されてもよく、或は特定の領域
に配列されてもよい。代わって、繊維は、プロテーゼ用
半月全体に渡り実質的に円周方向に伸びる或は実質的に
半径方向に伸びる配向をとってもよい。
マトリックスは、またグリコサミノグリカン分子（GA
G）を繊維に散在させて含んでもよい。GAGは発明のプロ
テーゼ用半月について潤滑及び架橋をもたらす任意のム
コ多糖分子である。発明の好ましい態様では、コンドロ
イチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラチン硫
酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸及び
これらの混合物のようなGAGがマトリックスの成分にな
る。これらのGAGはプロテーゼ用半月全体に渡って個々
の分子として均一に分散させてもよく、或は構造物の異
なる領域において異なる量で存在してもよい。
発明の種々の態様において、GAGは繊維との共有結合
性の架橋形成に直接関与してもよく、もしくは絡み合い
の形で或はインターロッキング機構によって繊維と機械
的に相互作用して安定な繊維−GAG複合体を形成しても
よい。
マトリックスは、乾燥重量により、天然及び／又は合
成繊維を約75〜100％及びGAGを約０〜25％含み、これら
の割合は構造物全体を通して一定でもよく或は異なって
もよい。
発明の好ましい実施態様では、マトリックスは密度約
0.07〜0.50マトリックスg/cm3を有する。ここで、「マ
トリックスg/cm3」は一立方センチメートのマトリック
スにおけるグラム数を意味する単位である。加えて、マ
トリックスは原繊維内及び原繊維間空隙約２〜25cm3/マ
トリックスｇを有する。
発明の別の態様では、プロテーゼ用半月は、更に生体
吸収性、生体適合性物質で構成されるメッシュをマトリ
ックスの外面の部分に結合させて成ってもよい。メッシ
ュは、暫定的定着機構を供することによって、プロテー
ゼ用半月を膝関節にうまく移植するのを助成する。
発明は、また半月組織をイン・ビボで再生する方法を
含む。この方法はプロテーゼ用半月を製造しかつそれを
外科手法によって膝関節に移植することを含む。
更に、発明は上述したタイプのプロテーゼ用半月を製
造する方法を含む。その方法は、全体的には、複数の繊
維及び／又は繊維及びGAGを、膝関節機能のために有用
な形状を有する型に入れ、型における繊維（及びGAG）
に２サイクルの凍結及び溶融を施し、繊維或は繊維及び
GAGに化学的架橋用試薬を、繊維が次いで型の形状をと
るように接触させ、生成した構造物を凍結乾燥して乾燥
した多孔性体積マトリックスを得ることを含む。
繊維を、型を繊維を中にいれたままで回転して円周方
向に配置することができる。別法として、型内の繊維を
回転ピストンで圧縮してもよい。繊維の半径方向配置
は、繊維を線状の、半径方向に向けた方式で手動ペイン
トすることによって作られる。
特定の密度及び細孔寸法は、繊維或は繊維及びGAGを
型内で、第２凍結−融解サイクルの前、化学架橋工程の
後に圧縮することによって、マトリックスの種々の領域
で得ることができる。これは、所定の形状のピストンで
圧力をマトリックスの特定の領域に掛けることによっ
て、達成することができる。
発明の好ましい態様では、架橋工程は、分子内及び分
子間架橋を形成する化学薬剤を使用して行う。有用な化
学薬剤は、例えば下記を含む：グルタルアルデヒド、ホ
ルムアルデヒド、生体適合性の二官能価アルデヒド、カ
ルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス
−イオニデート、グリオキサール、ポリグリセロールポ
リグリシジルエーテル、グリオキサール、及びこれらの
混合物。特に有用な架橋剤は下記の通りである:1−エチ
ル、３−（３−ジメチルアミノプロピル）、ポリグリセ
ロールポリグリシジルエーテル、及びグルタルアルデヒ
ド。
発明の他の態様では、化学的に架橋したマトリックス
を凍結乾燥し、次いでそれに脱水熱架橋手順を施して、
追加の架橋工程を行う。
発明を、次に所定の例示する実施態様に関して説明す
る。しかし、種々の変更、追加及び削除を発明の趣旨或
は範囲から逸脱しないでなし得ることは明らかであろ
う。
図面の簡単な説明 本発明の前述した及びその他の目的、発明の種々の特
徴、並びに発明それ自体は、下記の説明から、添付図面
と共に読む際に、一層完全に理解することができる。
第１図は、半月が自然に位置するヒトの膝関節の簡易
図解を示し； 第1A図は、内側及び外側半月を、内側及び外側顆の上
にイン・ビボで配置された通りに示す膝関節の切断図の
図解である。
第２図は本発明に従う典型的なプロテーゼ用半月の斜
視図を示し； 第３図は第２図のプロテーゼ用半月の半径方向斜視断
面を示し； 第４図は本発明の別の実施態様の斜視図を示し； 第５図は第４図のプロテーゼ用半月の線５−５に沿う
断面図を示す。
第６図は、円筒形パッド形状を有するプロテーゼ用半
月を製造するために設計した型を示す。
第７図は、三日月くさび形状を有するプロテーゼ用半
月を製造するために設計した型を示す。
第８図は、円筒形プロテーゼ用半月を製造するために
設計した型を示す。
第９図は、80％切除しかつプロテーゼ用半月を移植し
た後のイン・ビボでの半月再成長の写真図である。
第10図は、足場のセクションを収容し、かつ半月組織
が足場の中にイン・ビトロで再成長することを立証する
移植した犬の半月の写真図である。
第11図は、外科切除して３月した後の２つの犬の膝関
節の写真図である。
第12図は、再生された半月におけるプロテオグリカン
集合体の流体力学的プロフィル（第12B図）を、切除し
たリム単独（第12D図）と比較し、培地中の残留線維軟
骨後切除（第12A図）及び連合エキストラクト中の残留
線維軟骨後切除（第12C図）を含む対照サンプルと比較
して示す一連のグラフである。
発明の詳細な説明 生体適合性であり且つ生体吸収可能な繊維から作られ
たプロテーゼ用半月は、正常の関節動作及び強度を与え
るように、外科的に膝関節に移植することが可能である
ということが発見された。このプロテーゼ用半月は又、
移植デバイスの物理的特性により内殖が促進される半月
組織を再生させる足場としても作用する。
図１は、大腿骨２と脛骨４との間のヒト膝関節３にお
ける内側半月７及び外側半月８の正常の位置の図示を示
している。これらの半月は、大腿骨２と脛骨４の間で圧
縮されたとき、それらの付着点以外においては強靭にな
る。図1Aは、膝関節３における内側半月７と外側半月８
のイン・ビボでの構造を示している。半月は、それらが
はさまっている面の形状に整合しており、それにより、
２つの明確なイン・ビボでの形状を生じる。例えば、内
側半月７は、比較的開いた三日月型をしており、他方、
外側半月８は比較的閉じた三日月型をしている。
典型的なプロテーゼ用半月10を、図２に示す。プロテ
ーゼ用半月10は、一般に、少なくとも部分的に、中心軸
11の回りで周辺及び側方へ広がる、くさび形で多孔性の
乾燥したマトリックス又は足場である。好ましい形態に
おいて、プロテーゼ用半月10は、三日月型のくさびの形
状をしており、軸11の回りで周辺へ広がり、２つの狭い
末端領域14と16の間の比較的広い中心領域12を含んでい
る。好ましい形態において、このくさびは、周辺縁にお
いて約0.4インチ（1.0cm）の最大高さＡを、その中心点
において約0.2インチ（0.5cm）の高さＤを、そして約1.
0インチ（2.5cm）の半径寸法Ｃを有する。この三日月型
くさびは、軸11の回りで角Ｂに、実質的には約135〜155
゜、好ましくは、約150゜で対する。
図２に示した具体例において、プロテーゼ用半月10
は、その周辺縁から広がるメッシュ部材20を含む。メッ
シュ部材20は、生体適合性の、生体吸収可能な材料から
なり、配列10の位置を固定するための簡便な手段を提供
する。メッシュ部材20は、十分な組織内殖が生じ、次い
で機能を提供するまで、この容積内で機能し得る。例と
して、メッシュ部材20は、ポリグリコネート、デクソン
（Dexon）、又はポリジオキサン（PDS）などをメッシュ
に織った吸収可能な縫合材料からなる＃１メッシュスク
リーンであってよい。ゴレテックス（Goretex）などの
非吸収性縫合材料も又用い得る。
図４及び５は、図２に描かれたプロテーゼ用半月と類
似した組成の本発明の更なる具体例を示す。より詳細に
は、図４は真円筒型半月22を描いているが、それは軸11
の回り全体に広がっており、即ち、角Ｂは０゜に等しい
（即ち、半月は360゜に対する）。図５は、図４に示し
た半月の線５−５に沿っての切断面を示す。図４及び５
に説明したデバイスは、移植時に半月22の形を示す；即
ち、領域11における高さＤは、このデバイスの周辺の高
さＡより小さい。移植前は、デバイス22は、幾つかの場
合、この関係を持たないが、移植時には、身体により加
えられる正常の負荷がこのコンホメーションを強制す
る。
この発明の別形態において、更に別の形状を用い得
る。例えば、このくさびは左右対称であることは必要で
ない。これらの具体例は、コラーゲン繊維の密度及びGA
G分子の分散及び架橋を有して良く、異なる圧力レベ
ル、内殖の速度、及び弾性の調節を可能にしている。一
定の密度を有するデバイスが移植された場合、異なる密
度がイン・ビボで得られ、身体の負荷がデバイスの一定
でない圧縮を引き起こす。
プロテーゼ用半月は、天然材料又はそれらの類似物質
を含む任意の生体適合性の、生体吸収可能な繊維から製
造出来るが、それは、好ましくは、重合体構造を有し、
機械的強度及び防護及び潤滑を与え、他方、組織の内殖
を促進する（例えば、コラーゲン、レティキュリン、エ
ラスチン、セルロース又はそれらの生合成により生成さ
れた類似物質）。これらの繊維は、実質的に、円周状に
広がる又は放射状に広がる方向に秩序づけられて良く、
繊維の密度は実質的にマトリックス中で一定である。別
法として、マトリックス繊維は無秩序であって良い。秩
序立った又は無秩序の構成において、繊維の密度は一定
でなくて良い。一定でない構成において、比較的高密度
の繊維を、局所的適用により高圧力が予想される点にお
いて確立することが出来る。
この発明の別の面において、繊維内及び繊維間の空間
は比較的多く、再生半月組織の内殖を促進する条件であ
る。例えば、半月の密度は約10−25gマトリックス/cm3
であって良い。別法として、繊維内及び繊維間の空間は
比較的少なく、膝関節のための緩衝、潤滑及び機械的支
持を与える条件であり、且つ組織及び細胞の内殖を妨
げ、それにより、足場の再吸収速度を減じる（例えば、
密度は約２−10gマトリックス/cm3の範囲である）。
イン・ビボにおけるこの構造の形状の一時的安定性、
及び半月の再吸収速度は、共に、繊維の少なくとも一部
分の間での効果的な架橋形成に帰する。使用する架橋試
薬は、単一繊維（分子内架橋）、又は繊維とGAG上のア
ミノ基、カルボキシル基又は水酸基と相互作用して隣接
する分子間の共有結合形成（分子間架橋）を生じる任意
の生体適合性の、二官能性試薬であって良い。有用な架
橋試薬は、アルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネー
ト、ビス−イミデート、ポリグリセロールポリグリシジ
ルエーテル、及びカルボジイミドを含む。
架橋したデバイスは、天然の半月の特性（即ち、機械
的圧力に耐える能力、及び関節面を防護し滑らかにする
能力）と類似した十分な親水性及び弾性を維持する。更
に、この構造は細胞の浸潤及び細胞外マトリックスの合
成及び沈着に理想的環境を与え、天然の半月組織の再生
を生じる。
GAGは繊維中に分散し得る。別法として、それらは繊
維間の分子間架橋として作用し得る。これらのGAG架橋
は、典型的には、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイ
チン６−硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリ
ン硫酸及びヒアルロン酸からなる分子の群の少なくとも
一つから構成される。GAG架橋の分散は、好ましくは、
一定であるが、高圧力が予想されるところ（典型的に
は、末端の領域14及び16）では濃縮されて良く、中心領
域12（図１）では希薄で良い。そのような構成におい
て、GAG濃度は、末端領域14及び16では約０−25％の範
囲で、中心領域12では約０−10％の範囲であって良い。
しかしながら、一定の場合、プロテーゼ用半月中のGAG
の分散は、例えば、約１−15％の範囲であって良い。
分子間架橋は又、リジン又はヒドロキシリジンのイプ
シロンアミノ基とアスパラギン酸又はグルタミン酸のカ
ルボキシル基との間のペプチド結合形成を生じる脱水熱
法（dehydrothermal process）（加熱と真空）により確
立し得る。
架橋したデバイスは、約55−85℃、好ましくは約65−
75℃での比較的高い熱安定性を有するが、これは、イン
・ビボでの安定性のためには十分である。これは、試薬
濃度、温度、pH及び時間を含む架橋条件の操作により達
成し得る。
一つの具体例において、プロテーゼ用半月は、主とし
てGAG架橋を持たないＩ型コラーゲン繊維から構築す
る。Ｉ型コラーゲン繊維は動物のアキレス腱から得られ
る。しかしながら、この繊維は又、動物の皮膚或はヒト
の皮膚又は腱から得ることも出来る。これらの組織を一
連の機械的及び化学的手段で処理して、非コラーゲン物
質を全部除去するか又はそれらを最小レベルに減じる。
好ましい処理ステップにおいて、腱又は皮膚を機械的
に、更なる処理に有用な細片に砕解する。この砕解は、
組織を液体窒素温度で粉砕することにより、又は組織を
鋭利なナイフで小片に切ることにより達成し得る。ある
適用においては、組織を、機械的強度のために繊維の長
さを維持するために、その繊維方向に沿って機械的に砕
解する。
中性pHにおける塩抽出は、新たに合成され、まだ安定
な原繊維に取り込まれていないコラーゲン分子の小部分
を除去する。塩は又、静電相互作用によりコラーゲンと
会合する幾つかの糖蛋白質及びプロテオグリカンをも除
去する。KClなどの他の塩をNaClの代用に使用すること
が出来る。
細胞膜又はコラーゲンマトリックスと会合している脂
質はトリトンＸ−100などの界面活性剤での最初の抽出
及びその後でのエーテル−エタノール混合物による抽出
により除去し得る。トリトンＸ−100の濃度は、通常、
約２−４％であるが、好ましくは約３％である。エーテ
ル−エタノールの好ましい混合物は、通常、約1:1の比
（v/v）である。抽出時間は、通常、８−96時間であ
る。
更なる抽出は、２つの両極端なpHにおける処理による
マトリックスの膨潤により達成し得る。酸性及び塩基性
の膨潤は共に非共有結合性分子間相互作用を弱め、それ
故、非共有結合的に付着した糖蛋白質、グリコサミノグ
リカン（GAG）及び他の非コラーゲン分子がコラーゲン
性マトリックスの開いた細孔から遊離することを容易に
する。
マトリックスのアルカリ性のpHでの膨潤は、コラーゲ
ンをCa（OH）2,NaOHなどで、高いpHで、約８−96時間処
理することによりなされる。（CH3）NCl,NH3SO4などの
三重らせん安定化塩の存在下におけるアルカリ抽出は、
コラーゲンの変性の潜在的危険を減じる。アルカリ処理
は、コラーゲンマトリックスから非架橋糖蛋白質及びGA
Gを解離する。アルカリも又残余の脂質を鹸化により除
去した。
酸膨潤は、酢酸、ΗClなどの存在下において、低いpH
で処理することが出来る。アルカリ処理と同様に、酸膨
潤は非架橋糖蛋白質及びGAGを除去する。
分子の非三重らせん部分（テロペプチド）は分子間架
橋形成に含まれる。それらは弱い抗原であり、ペプシ
ン、トリプシンなどのプロテアーゼによる攻撃に感受性
である。そのようなプロテアーゼによる長時間の消化
は、原繊維（繊維）を個々の分子に解離する。しかしな
がら、消化処理が、最大のテロペプチドが完全に解離す
ることなく除去されるように、適当に制御されるなら
ば、原繊維の免疫原性は、機械的強度を弱めることな
く、最小レベルに減じ得る。例えば、分子状コラーゲン
を単離するために、皮膚又は腱のペプシンでの消化は、
通常、約1:10の酵素：コラーゲン比で、約24−96時間、
室温以下で行なう。それに比べて、原繊維は、約1:100
（酵素：コラーゲン）の比で、約24−96時間、４℃で達
成される制限ペプシン消化により得られる。
この方法論により得られるコラーゲン繊維を、次い
で、本発明のプロテーゼ用半月を製造するのに用いる。
しかしながら、生合成的に産生されたコラーゲン又はそ
れらの類似物質などの他の源から得られたコラーゲンも
又このプロテーゼ用半月を構築するのに用い得るという
ことは理解されなくてはならない。
一つの具体例において、プロテーゼ用半月は、更に、
繊維のネットワークに取り込まれた付着分子又は付着部
分又はそれらの類似物質を含み、それらは半月組織の再
生を助成する。有用な付着分子は、フィブロネクチン
（米国特許第4,589,881号、4,661,111号及び4,578,079
号参照）などのペプチドを含み、その一部は、例えば、
コンドロイチン硫酸に結合し得る。
この製造方法は、コラーゲン繊維を、例えば、図６−
８に関連して下に記す成形用型を用いて所定の形状に成
形することを含む。繊維は、型の中でランダムに場所を
定めるか、又は特定の方向を向いて特定の構造特性を有
する半月を達成することが出来る。架橋反応に参加し得
るGAGなどの他の成分は、この構造を様々な化学的及び
／又は脱水熱法を含む様々な架橋及び脱水処理にかける
前に、ランダムな又はランダムでない様式で繊維と混合
することが出来る。付着分子又は付着断片又はそれらの
類似物質は、この構造をその分子を含む溶液に浸すこと
により、又はそれを存在する繊維又は架橋に特異的にカ
ップルさせることにより、最終的に乾燥するステップの
前にこの構造に加えることが出来る。例えば、フィブロ
ネクチンの付着部分は、プロテーゼ用半月をその50mg/m
l溶液に浸すことにより、コンドロイチン硫酸１分子当
り３分子の濃度でコンドロイチン硫酸に架橋することが
出来る。
上記の処理に続いて、実施例を以下に記すが、図２又
は３に示した形のプロテーゼ用半月は、下記の表１に列
挙した特性を有するように構築することが出来る。
表１ 物理的特性 高さＡ＝0.51−1.02cm（0.20−0.40インチ） 角 Ｂ＝25−45度 半径Ｃ＝1.27〜5.08cm（0.5−2.0インチ） 高さＤ＝0.13−0.25cm（0.05−0.10インチ） 密度 ＝0.07−0.5g/cm3 繊維内及び繊維間空間＝２−25cm3/gマトリックス 成分 繊維（コラーゲン）含量＝75−100％ GAG含量＝０−25％ 下記の非制限的実施例は、この発明のプロテーゼ用半
月の製造方法及びイン・ビボ試験の方法を記述する。
実施例１ 型製造： プロテーゼ用半月の製造に有用な型100を、移植可能
なステンレス鋼又はテフロン、ポリプロピレン、デルリ
ン（delrin）などの生体適合性プラスチック、又はこれ
らの物質の組み合わせから作る。型100は、図６−８に
示すように３つの部分102、104及び106からなる。
例えば、図４及び５に示されるディスク型半月には、
図６の型100を用いた。第一の部分102はディスク様であ
り、所望の半月の直径と実質的に等しい直径を有する。
部分102には、加圧により液体を通過させるために穴を
開ける。部分102の内面103は、形成する半月の一面の所
望の形状を有する。
第二の部分104は、第一の部分102と同じ内部寸法を有
する中空の円筒である。第三の部分106は、部分104の内
径より僅かに小さい外径を有する円筒状ピストンであ
る。ピストン106の“頂点”又は頭頂部表面108は形成す
る半月の一面の所望の形状を有する。
図３の半月には、部分102の形状、及び部分104の横断
面が傾斜セグメント（angular segment）の形状を有す
る図７の型を用いた。平円型ディスク状半月には、部分
102及び104が図６と同じで、部分106が図108中のその部
分と類似しているが平な頭頂部表面108を有する図８の
型100を用いた。
半月10の製造の間、部分102は、図６−８に示すよう
に、先ず、部分104に取り付ける。成分繊維（液状）を
部分102の表面103に対して位置させる。次いで、ピスト
ン106の頭頂部表面108を圧縮軸106aに沿って繊維が圧縮
されるまで面103に向かって動かし、液体を部分102から
追い出し、そして、圧縮した繊維の配列の所望の軸長を
達成する。次いで、この型を化学架橋用に凍結する。
実施例２ 精製Ｉ型コラーゲンの調製 Ａ）組織： ウシ、ブタ又はヒツジのアキレス腱を、米国農務省認
可の屠殺場から得る。動物の好ましい年齢は12−18か月
である。組織は、細菌混入及び組織の分解を最小限にす
ることが規定されている場合を除いて、精製工程の間冷
蔵する。
Ｂ）機械的砕解： 注意深く選択した腱の付着組織を、先ず、機械的に捨
てる。次ぎに、その組織をミンスし即ち細片に切り、そ
して、過剰量（10体積）の冷水中で洗って残留血液蛋白
質及び水溶性物質を除去する。
Ｃ）塩抽出： 洗った腱を10倍量の５％NaCl、0.01Mトリス、pH7.4中
で24（＋／−２）時間抽出して塩溶解性物質を除去す
る。塩抽出した腱を約10倍量の水中で繰り返し洗って塩
を除去する。
Ｄ）脂質抽出： この材料を３％トリトンＸ−100中で24（＋／−）時
間抽出する。水で多数回洗って界面活性剤を除去する。
次いで、この材料を３−４倍量のエーテル−エタノール
（1:1、v/v）中で24（＋／−２）時間抽出して脂質含量
を更に小さくする。この脂質抽出した材料を水で多数回
洗ってエーテルとエタノールを除去する。
Ｅ）マトリックス膨潤： 次ぎに、この材料を２つの両極端pH抽出に掛けて非コ
ラーゲン物質を除去する。アルカリ抽出は、３−４容の
0.2M NaOH（pH12.5−13.5）により、室温（RT）で、1.0
M（CH）NClの存在下で、24（＋／−２）時間、穏やかに
撹拌しながら行なう。
アルカリ抽出の後、ΗClでpHを中性にし、この材料を
水で洗う。次いで、pHを、濃酢酸を終濃度0.5Mになるよ
うに加えることにより2.5−3.0に調節する。酸抽出を、
撹拌しながら24（＋／−２）時間行なう。
Ｆ）制限蛋白質加水分解消化： 次ぎに、酸膨潤した腱を、ペプシン（酵素：コラーゲ
ン＝1:100）による24（＋／−）２時間の制限蛋白質加
水分解消化に掛ける。ペプシン及びテロペプチドを透析
により除去する。
次いで、膨潤繊維マトリックスを、1M NaOH又はΗCl
でpHをその等イオン点に調整することにより、又はNaCl
でイオン強度を0.7に調製することによりコアセルベー
ト化する。凝集したコラーゲン繊維を過により採取
し、過した物質を冷緩衝溶液で多数回洗う。この高度
に精製したＩ型コラーゲンを使用まで保存（−20〜−40
℃）する。
実施例３ デバイスＩ製造 Ａ）実施例２からの高度に精製したＩ型コラーゲン繊維
のコラーゲン含量を、重量法により、又はヒドロキシプ
ロリン（13.5重量％のヒドロキシプロリンがＩ型コラー
ゲン中にあると仮定する）の含量を測定することにより
決定する。既定の密度の半月デバイスを製造するのに必
要な精製した材料の量を、次いで、測定し、重量を測
る。
Ｂ）繊維コラーゲンの溶液を注意深く規定の寸法の型に
はめ込む。例えば、典型的な半月は、図２−５に関連し
て上述した（実施例Ｉ及び図６−８の型の説明参照）。
コラーゲン繊維はランダムな仕方で又は方向付けられた
仕方で横たわる。方向付ける場合、繊維の円周方向は、
物質が型の中で圧縮される際、ピストンの主軸の回りの
回転により作る。放射方向は、コラーゲン繊維を線状
に、放射方向に手で塗装することにより作る。
Ｃ）繊維を−20℃で凍結し、型から取り出し、室温で解
凍する。
Ｄ）次いで、繊維を燐酸緩衝塩溶液中に再懸濁し、所望
の方向で型に戻し、ピストンで圧縮する。
Ｅ）圧縮した繊維を、次ぎに、−20℃で再凍結し、次い
で、室温で解凍する。
Ｆ）その結果出来たの構造を、0.2％グルタルアルデヒ
ド溶液、pH7.6に24（＋／−0.5）時間浸すことにより架
橋する。それぞれのグルタルアルデヒド架橋した半月デ
バイスを、続いて、500mlの燐酸緩衝塩溶液（PBS）、pH
7.4中で、４、８、24及び48時間繰り返してすすぐ。
Ｇ）すすいだマトリックスを、次いで、凍結乾燥する。
実施例４ デバイスII製造 Ａ）−Ｇ）（実施例３と同じ） Η）凍結乾燥したマトリックスを真空と加熱による脱水
熱架橋に掛ける。先ず、真空を適用して残留水分を最小
レベルに減じる（幾らかの構造水（約３％）が、依然と
して、構造安定化因子の一部として、コラーゲン三重ら
せんに結合している）。熱を段階的に110℃（＋／−５
℃）まで増加し、継続的に、真空中で、110℃で、24
（＋／−２）時間加える。
実施例５ デバイスIII製造 Ａ）（実施例３と同じ） Ｂ）コラーゲン材料を0.01ΗCl溶液、pH2−2.5中に分散
させる。様々な所定量のGAGを測り、水に溶かす。例え
ば、既定の密度0.25g/cmのためには、2.5％GAG含量に対
してコラーゲン含量を0.244g、ヒアルロン酸含量を0.00
3g及びコンドロイチン硫酸含量を0.003gにする。GAG溶
液をコラーゲン溶液と混ぜ、実施例２に記したように所
望の方向で型内に位置させる。
Ｃ）−Ｇ）（実施例３と同じ） 実施例６ デバイスIV製造 Ａ）−Ｃ）（実施例３と同じ） Ｄ）（横たえた繊維を圧縮しないこと以外は実施例３と
同じ） Ｅ）−Ｇ）（実施例３と同じ） 実施例７ デバイスＶ製造 Ａ）−Ｅ）（実施例３と同じ） Ｆ）型成形したコラーゲンを、50％エタノール中の５％
ポリグリセロールポリグリシジルエーテル及び0.1M NaC
O3（pH10.0）中で24（＋／−２）時間架橋する。架橋し
たデバイスを、４、８、24及び48時間、それぞれ500ml
のPBS、pH7.4ですすぐ。
Ｇ）（実施例３と同じ） 実施例８ デバイスVI製造 Ａ）−Ｅ）（実施例３と同じ） Ｆ）型成形したコラーゲンを、0.9％NaCl中の１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（10mg/gマトリックス）の存在下で、pH4.7で、室温
で、24（＋／−２）時間架橋する。３−４時間ごとにカ
ルボジイミドを加え、各カルボジイミド添加の後にpHを
4.7に調整する。
Ｇ）（実施例３と同じ） 実施例９ デバイスVII製造 （Ａ）−（Ｄ）実施例IIで記したステップ（Ａ）−
（Ｄ）と同じ。
（Ｅ）取り付け目的のために、型の寸法に合わせた、吸
収可能なポリグリコネート縫合材料のメッシュを分散し
たコラーゲン中に、それがその構造の周囲から突き出て
頸骨のプラトーを超えて広がる裾を形成するように横た
わらせる。このメッシュは、直接の取り付け部位と長期
に渡る繊維の内殖の両方を与える。
実施例10 試験 プロテーゼ用半月を、正常の半月組織の再生の鋳型と
して機能し又は助成する能力を測定するために、動物モ
デルを用いてイン・ビボで、そしてイン・ビトロで評価
した。
1.イン・ビボの研究 17個のプロテーゼ用半月（デバイスIII型）を11匹の
未成熟のヨークシャー豚に移植した。７個の関節の中間
の半月の2/3を不完全切除して適合するプロテーゼ用半
月で置き換えたが;2個の関節は2/3の不完全切除を受け
ただけであり;2個の関節は類似の不完全な半月切除術を
受け切除部分を直ちに縫合固定した；そして２個の関節
は完全な半月切除術のみを受けた。
すべての関節の評価は、３又は６週目に行なった。す
べての関節手術は十分癒え、すべての動物は完全な体重
を有するまで発育した。最終的評価において、すべての
補綴材料は、部分的に又は完全に分解吸収されていた
が、関節の破壊又は軟骨の摩滅の証拠はない。移植した
プロテーゼ用半月並びに対照の両方において、基礎的治
癒機構として血管新生が観察され、すべての関節におい
て、早期の半月再生の証拠があった。このプロテーゼ用
半月の材料は、適当な関節の形状に適合した。更に、６
週間に渡って移植物の拒絶の診療上の証拠はなかった。
組織学的には、急性の炎症があり、その後、血管新生及
びあたらに形成されたコラーゲンの初期のヒアリン化を
伴う繊維組織形成があった（図９参照）。
成熟イヌにおけるこの発明のイン・ビボの研究は、プ
ロテーゼ用半月により誘導された半月再生を示した。通
常、成熟イヌの後膝関節は半月を再生しないこと及び有
意の関節炎変化を生じることが知られている。しかしな
がら、半月切除及び本発明による足場の移植の６週後、
この足場による半月の有意の再生が生じた。この足場は
関節の保護を与えたが、それは、減じた軟骨浸食、骨増
殖体形成及びインディアインクへの親和性により測定さ
れた。
図11は、外科的切除の３か月後の２個のイヌの膝関節
の写真描写である。この関節は、新しい半月の引き続く
再成長を伴う補綴移植物により保護された。図11の右側
の関節は、80％の半月切除のみを受けた。この劇的な関
節軟骨の保護はインディアインクにより際立っている。
新しいコラーゲン及びグリコサミノグリカン形成は、
アルシアンブルー及びマソンのトリクロム（Masson's T
richrome）染色により組織学的に証明された。半月状移
植物と対照の両方において合成されたプロテオグリカン
の流体力学的寸法及びクロマトグラフィー上のプロフィ
ルは、図12に示すようにSephacryl S−500カラム上で分
析した場合には類似していた。図12は、再生した半月中
のプロテオグリカン凝集体の流体力学的プロフィル（図
12B）を、切除された縁のみ（図12D）と比較して、そし
て、媒質中の（図12A）及び結合性抽出物中の（図12C）
切除後残留繊維軟骨を含む対照試料と比較して示す一連
のグラフである。
2.イン・ビトロの研究 半月を無菌的に成熟イヌから採取し、すべての付着組
織を取り、Gayの平衡塩溶液中に置いた。各半月を頭頂
平面内で２等分し、各半半月に3mmの十分な深さの円形
欠損を作った。これらの欠損に２つのプロトタイプの複
合コラーゲンを基礎とする生合成の足場（プロテーゼ用
半月）の１つを満たした。これらの半月を、10％仔牛血
清、アスコルビン酸及び0.1％ペニシリン／ストレプト
マイシンを補った6mlのダルベッコ改変イーグル培地を
含む６穴培養プレート中に置いた。培養を、37℃で、10
％CO2/90％空気の湿潤大気中に維持し、週に３回補給を
し、そして、毎週新しい培養穴に移して移植片細胞培養
の形成を防止した。培養開始後、１、４及び６週の間隔
で、各群から３個の半月を取り出し、固定し、そして、
連続切片と染色により評価した。
その結果（図10に示す）は、長期に渡る細胞の移動及
び侵入の増加を示した。この材料からの明白な毒性はな
かった。移動細胞の形態学的特長は、自然の繊維軟骨細
胞より紡錘形であり、細長かった。この足場への細胞浸
透の深さは、補綴複合体の密度により制限されることが
分かった。
本発明は、その趣旨又は必須の特性の中で他の特定の
形態において具体化し得る。それ故、本発明は、説明し
た及び説明していないすべての点において、この発明の
範囲は、前述の説明よりは添付の請求項により示され、
それ故、その請求項と等しい意味及び範囲に属するすべ
ての変化はそれらに包含されると考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61F 2/28 A61F 2/30 A61F 2/54 A61L 27/00

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体適合性の生体吸収可能な繊維の乾燥し
    た多孔性マトリックスを含むプロテーゼ用半月であっ
    て、 前記の繊維が天然のポリマー若しくはそれらの類似物質
    又は混合物を含み 前記のマトリックスが、イン・ビボで、実質的に天然の
    半月と同じ外面輪郭を有するように適合され、 前記のマトリックスが、50ミクロンより大きく500ミク
    ロンより小さい範囲に細孔寸法を有し、 それにより、前記のマトリックスが、半月繊維軟骨細胞
    の内殖に適合した、少なくとも部分的に生体吸収可能な
    足場を確立する、上記のプロテーゼ用半月。
  2. 【請求項２】前記の繊維をコラーゲン、エラスチン、レ
    ティキュリン、及びセルロース並びにそれらの混合物か
    らなる群から選ぶ、請求項１に記載のプロテーゼ用半
    月。
  3. 【請求項３】前記のマトリックスが、２つの狭い末端領
    域の間の広い中心領域を含む、実質的にくさびの形状を
    有する、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
  4. 【請求項４】前記のマトリックスが、0.07〜0.50gマト
    リックス/cm3の密度を有する、請求項１に記載のプロテ
    ーゼ用半月。
  5. 【請求項５】前記のマトリックスが、２−25cm3/gマト
    リックスの繊維内及び繊維間空間を有する、請求項１に
    記載のプロテーゼ用半月。
  6. 【請求項６】プロテーゼ用半月を製造するための方法で
    あって、下記のステップ： （ａ）多くの生体適合性且つ生体吸収性の繊維を型に入
    れ、該繊維は天然のポリマー若しくはそれらの類似物質
    又は混合物を含み、該型は膝関節機能を可能にする半月
    状プロテーゼの形状を定め； （ｂ）前記の繊維を凍結及び解凍の第一及び第二のサイ
    クルに掛け； （ｃ）前記の繊維を化学架橋剤と接触させて前記の繊維
    が前記の型の形状をとるようにし；そして（ｄ）前記の
    架橋した繊維を凍結乾燥する ことを含む、上記の方法。
  7. 【請求項７】前記の天然ポリマーの前記の類似物質が生
    合成により生成された類似物質である、請求項６に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】前記の繊維を、コラーゲン、エラスチン、
    レティキュリン、セルロース、及びこれらの類似物質並
    びにそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項６に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】前記の型に入れるステップが、更に、多く
    のグリコサミノグリカン分子を前記の型に入れることを
    含む、請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記のグリコサミノグリカン分子を、コ
    ンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラ
    タン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン
    酸、及びそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項９
    に記載の方法。
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