JPH04504968A - プロテーゼ用半月 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテーゼ用半月 １豆立ユ１ 本発明は移植可能な医療装置の分野にあり、一層特には、プロテーゼ用半月及び 半月組織を再生するためのヱン・ビボの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｌとして有用な デノ（イス並びにそれらの製造方法を指向するものである。

１旦立且１ 内側及び外側半月は、膝関節において、−緒になって重要な安定部、力分配用機 構、脛骨と大腿骨との接触領域における潤滑としての働きをする一対の軟骨構造 である。半月が無ければ、異冨な関節機構番ご関連して応力の集中が膝に生じ、 関節炎変化の早期発生力Ｓ生じる。

従来技術では、損傷した或は疾患のある半月の治療は、外科的修復及び切除の両 方によるのカ５普通であった。切除によって、半月組織の再生が行われ得る。加 えて、半月線維軟骨細胞はフィブリン血餅で満ちた欠損中に移動して正常な半月 線維軟骨と見掛は上同様の組織を形成することが知られている。適当なマド１） ツクス足場が半骨欠損内に存在する場合に、このような半月線維軟骨が形成され 得る。半月組織は、また、出血組織に暴露された際に、自己修復することができ 、加えて、また、びマトリックス合成の能力があることも知られている。

損傷した半月をその他は真書の無い関節において代えることば、関節炎変化を防 止しかつ関節を安定化することができる。病気にかかった関節では、半月を代え れば病気経過の進行を低減させ及び痛みの軽減をもたらすことができる。異系移 植或は半月移植は犬やヒトの両方で実施されてきた一置換方法である。しかし、 このアプローチは、移植片に対する宿主の免疫学的応答、寒冷貯蔵プロセスの不 良、結合部位の不良により、長期にわたり、部分的な成功があったにすぎなかっ た。

代りの従来技術の置換アプローチでは、半月を恒久的人工材料で構成される補て つに取り替えた。このような補でつば、免疫学的応答の可能性を最小にするため に、純粋に人工の材料で構築されてきた。加えて、このような材料を使用するこ とは、膝関節において遭遇する高いかつ繰り返しの負荷に耐えることができる構 造の構築を可能にし、及び関節機構を生物学的材料ならば耐えないような有利な 方法で変えることができることから有利であると考えられる。

例えば、犬の切除された半月に代えてテフロンネットを用いて線維性内部成長或 は再生が観察されたが、有意の軟骨の摩耗を伴った。プロテーゼ用半月は、また 、ステンレススチール或はナイロンストランドの補強材を有するシリコーンゴム 或はテフロン等の弾性材料から作られた（米国特許４，５０２．１６１号）、半 月部材は、また弾性プラスチック材料からも作られた（米国特許４．０ｇ５．４ ６６号）、加えて、半月病巣をカーボンファイバー−ポリウレタン−ポリ（Ｌ− ラクチド）で再形成しようと試みらだが、これらの材料によるその成功は最小の ものである（　Ｌｅｅｓｌａｇ等、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅ ｃｈａｎｉｃａｌＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　 （Ｃｈｒｉｓｔｅ１等編集）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、、アムステルダム、１９８６．３４７〜３５２頁）。

しかし、半月組織を恒久的人工材料から成る構造に代えることは、主に、ヒト及 び動物関節の対抗する関節軟骨が脆弱であるため、うま（ゆかないのが普通であ った。膝における人工の軟骨は摩耗界面にも、従来技術の人工半月の移植から終 局的に生じる正常からのコンプライアンス変化にも耐えない、加えて、関節力は 体重の数倍であり、膝や股関節部の場合、代表的には１年当り百方サイクルにわ たってかかる力に遭遇する。従来技術の恒久的人工半月は、従来、天然の半月特 性を有する材料で構成されておらず、このような日常の力に耐える程にしっかり 位置させることができなかった。

従って、必要とされる物は、軟質でありかつ潤滑性の生体適合性材料で構成され る改良されたプロテーゼ用半月である。

皮膚や神経のような他の組織の修復は、合成及び天然の両方の材料を使用して試 みられてきた。例えば、ヤンナス（Ｙａｎｎａｓ）等は、天然のコラーゲン及び グリコサミノグリカンから、内皮移植片、及び人工表皮を作った（米国特許４， ０６０．０８１号）。ニールス（Ｎｙｉｌｅｓｌ等（Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｓ ｏｃ、　Ａｒｔｉｆ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒｇａｎｓ（１９８３）　２９：３ ０７〜３１２）は、合成の再吸収性ポリエステルを末梢神経再生用に使用するこ と、及びコラーゲン導管を神経再生用の足場として使用することを報告した。

しかし、膝関節と異なる解削学的構造を再構築するのに適応させた前述の技術に よってさえも、プロテーゼ用半月として適しかつ完全に再吸収性の天然材料、或 はそれらのアナログから作られる構造物は従来技術において開発されていない。

よって、本発明の目的は、正常の関節運動を可能にする改良された半月部てつを 提供するにある。

別の目的は生体力学的に正常の関節力に耐えることができ及びそれらの負荷にお いて軟骨を保護し且つ関節を安定にするように機能することができる半月代替え 品或は補てつを提供するにある。

更に別の目的は、半月線維軟骨浸潤及び再生用の暫定的イン・ビポ足場として働 く再吸収性半月状プロテーゼを提供するにある。

なお別の目的は、正常の半月の機構に相当する機構を有する生体適合性材料で構 成される半月状プロテーゼを提供するにある。

それ以上の目的は、標準の手術技法によって移植するのに適応させた半月状プロ テーゼを提供するにある。

別の目的は半月組織をイン・ビボで再生する方法を提供するにある。

なおそれ以上の目的は、かかるプロテーゼ用半月を製造することができる方法を 提供するにある。

免豆立１上 本発明は半月の形及び役割をとる、膝関節に移植するための生体適合性及び生体 吸収性構造を提供する。このプロテーゼ用半月は、天然の半月の物理的特性を有 する組織を再生するための足場を促進しかつ提供する。

本発明のプロテーゼ用半月は、天然ポリマー或はこれらのアナログ或はこれらの 混合物を含む生体適合性生体吸収性繊維の乾燥した多孔性マトリックスであるの が普通である。マトリックスは天然半月と実質的に同じ外面形をイン・ビポで有 するように適応させる。更に、マトリックスは、５０ミクロンより大きい〜約５ ００ミクロンより小さいおおよその範囲の細孔寸法を有する。マトリックスは、 この形状を有することによって、半月線維軟骨細胞を内部に成長するように適応 させた少な（とも一部生体吸収性の足場を確立する。マトリックスは、所定の角 が０度より大きくかつ３６０度に等しいか或はそれより小さい範囲であり、かつ 中央領域の厚さが周辺領域の厚さに比べて薄い円周に伸びる（さびの形状を有す るのがよい６発明のいくつかの態様では、マトリックスは、例えば簡単なくさび 、２つの狭い末端領域の間に広い中央領域を有する三日月形状のくさび、或は角 度３６０度に及びかつくぼんだ（凹形の）中央領域を有する円周に伸びるくさび の形状をとることができる。

マトリックスは生体適合性及び生体吸収性繊維で構成され、繊維の一部は架橋さ れてもよい、繊維は天然物質或は天然物質のアナログ、例えば生合成アナログを 含む０発明の好ましい実施態様では、マトリックスの繊維は、例えば動物或はヒ トの組織から得られる物のような天然分子のポリマーである。同じ目的に有用な 天然繊維はコラーゲン、エラスチン、レティキエリン、これらのアナログ及びこ れらの混合物を含む。

発明のいくつかの態様では、繊維はマトリックス全体にわたりランダムに配置さ れてもよく、或は特定の領域に配列されてもよい１代わって、繊維は、プロテー ゼ用半月全体に渡り実質的に円周方向に伸びる或は実質的に半径方向に伸びる配 向をとってもよい。

マトリックスは、またグリコサミノグリカン分子（ＧＡＧ）を繊維に散在させて 含んでもよい、ＧＡＧは発明のプロテーゼ用半月について潤滑及び架橋をもたら す任意のムコ多糖分子である０発明の好ましい態様では、コンドロイチン４−硫 酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、 ヒアルロン酸及びこれらの混合物のようなＧＡＧがマトリックスの成分になる。

これらのＧＡＧはプロテーゼ用半月全体に渡って個々の分子として均一に分散さ せてもよく、或は構造物の異なる領域において異なる量で存在してもよい。

発明の種々の態様において、ＧＡＧは繊維との共有結合性の架橋形成に直接関与 してもよく、もしくは絡み合いの形で或はインターロッキング機構によって繊維 と機械的に相互作用して安定な繊維−〇ＡＧ複合体を形成してもよい。

マトリックスは、乾燥重量により、天然及び／又は合成繊維を約７５〜１００％ 及びＧＡＧを約０〜２５％含み、これらの割合は構造物全体を通して一定でもよ く或は異なってもよい。

発明の好ましい実施態様では、マトリックスは密度約０．０７〜０．５０マトリ ックスｇ／ｃ１１″を有する。ここで、「マトリックスｇ／ｃｍ’　Ｊは一立方 センチメートのマトリックスにおけるグラム数を意味する単位である。加えて、 マトリックスは原繊維間及び原繊維間空隙約２〜２５　ｃ＋＊”　／マトリック スｇを有する。

発明の別の態様では、プロテーゼ用半月は、更に生体吸収性、生体適合性物質で 構成されるメツシュをマトリックスの外面の部分に結合させて成ってもよい。メ ツシュは、暫定的定着機構を供することによって、プロチー　−ゼ用半月を膝関 節にうまく移植するのを助成する。

発明は、また半月組織をイン・ビポで再生する方法を含む。この方法はプロテー ゼ用半月を製造しかつそれを外科手法によって膝関節に移植することを含む。

更に、発明は上述したタイプのプロテーゼ用半月を製造する方法を含む、その方 法は、全体的には、複数の繊維及び／又は繊維及びＧＡＧを、膝関節機能のため に有用な形状を有する型に入れ、型における繊維（及びＧＡＧ）に　２サイクル の凍結及び溶融を施し、繊維或は繊維及びＧＡＧに化学的架橋用試薬を、繊維が 次いで型の形状をとるように接触させ、生成した構造物を凍結乾燥して乾燥した 多孔性体積マトリックスを得ることを含む。

繊維を、型を繊維を中にいれたままで回転して円周方向に配置することができる 。別法として、型内の繊維を回転ピストンで圧縮してもよい。繊維の半径方向配 置は、繊維を線状の、半径方向に向けた方式で手動ペイントすることによって作 られる。

特定の密度及び細孔寸法は、繊維或は繊維及びＧＡＧを型内で、第２凍結−融解 サイクルの前、化学架橋工程の後に圧縮することによって、マトリックスの種々 の領域で得ることができる。これは、所定の形状のピストンで圧力をマトリック スの特定の領域に掛けることによって、達成することができる。

発明の好ましい態様では、架橋工程は、分子内及び分子間架橋を形成する化学薬 剤を使用して行う。有用な化学薬剤は、例えば下記を含むニゲルタルアルデヒド 、ホルムアルデヒド、生体適合性の二官能価アルデヒド、カルボジイミド、ヘキ サメチレンジイソシアネート、ビスーイオニデート、グリオキサール、ポリグリ セロールポリグリシジルエーテル、グリオキサール、及びこれらの混合物。特に 有用な架橋剤は下記の通りである：１−エチル、３−（３−ジメチルアミノプロ ピル）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、及びグルタルアルデヒド。

発明の他の態様では、化学的に架橋したマトリックスを凍結乾燥し１次いでそれ に脱水熱架橋手順を施して、追加の架橋工程を行う。

発明を、次に所定の例示する実施態様に関して説明する。しかし、種々の変更、 追加及び削除を発明の趣旨或は範囲から逸脱しないでなし得ることは明らかであ ろう。

の　な一 本発明の前述した及びその他の目的、発明の種々の特徴、並びに発明それ自体は 、下記の説明から、添付図面と共に読む際に、一層完全に理解することができる 。

第１図は、半月が自然に位置するヒトの膝関節の簡易図解を示し； 第１Ａ図は、内側及び外側半月を、内側及び外側類の上にイン・ビボで配置され た通りに示す膝関節の切断図の図解である。

第２図は本発明に従う典型的なプロテーゼ用半月の斜視図を示し； 第３図は第２図のプロテーゼ用半月の半径方向斜視断面を示し； 第４図は本発明の別の実施態様の斜視図を示し；第５図は第４図のプロテーゼ用 半月の線５−５に沿う断面図を示す。

第６図は、円筒形パッド形状を有するプロテーゼ用半月を製造するために設計し た型を示す。

第７図は、三日月（さび形状を有するプロテーゼ用半月を製造するために設計し た型を示す。

第８図は、円筒形プロテーゼ用半月を製造するために設計した型を示す。

第９図は、８０％切除しかつプロテーゼ用半月を移植した後のＬヱニヱ！での半 月再成長の写真図である。

第１０図は、足場のセクションを収容し、かつ半月組織が足場の中にイン・ビト ロで再成長することを立証する移植した犬の半月の写真図である。

第１１図は、外科切除して３月した後の２つの犬の膝関節の写真図である。

第１２図は、再生された半月におけるプロテオグリカン集合体の流体力学的プロ フィル（第１２Ｂ図）を、切除したリム単独（第１２Ｄ図）と比較し、培地中の 残留線維軟骨後切除（第１２Ａ図）及び連合エキストラクト中の残留線維軟骨後 切除（第１２Ｃ図）を含む対照サンプルと比較して示す一連のグラフである。

のツ 生体適合性であり且つ生体吸収可能な繊維から作られたプロテーゼ用半月は、正 常の関節動作及び強度を与えるように、外科的に膝関節に移植することが可能で あるということが発見された。このプロテーゼ用半月は又、移植デバイスの物理 的特性により内題が促進される半月組織を再生させる足場としても作用する。

図１は、大腿骨２と脛骨４との間のヒト膝関節３における内側半月７及び外側半 月８の正常の位置の図示を示している。これらの半月は、大腿骨２と脛骨４の間 で圧縮されたとき、それらの付着点以外においては強靭になる。図ＩＡは、膝関 節３における内側半月７と外側半月８のＬＺニヱ１での構造を示している。半月 は、それらがはさまっている面の形状に整合しており、それにより、２つの明確 なＬヱニヱ！での形状を生じる０例えば、内側半月７は、比較酌量いた三日月型 をしており、他方、外側半月８は比較酌量じた三日月型をしている。

典型的なプロテーゼ用半月１０を、図２に示す。プロテーゼ用半月１０は、一般 に、少な（とも部分的に、中心軸１１の回りで周辺及び側方へ広がる、くさび形 で多孔性の乾燥したマトリックス又は足場である。好ましい形態において、プロ テーゼ用半月１０は、三日月型のくさびの形状をしており、軸１１の回りで周辺 へ広がり、２つの狭い末端領域１４と１６の間の比較的広い中心領域１２を含ん でいる。好ましい形態において、この（さびは、周辺縁において約０．４インチ （１，０ｃｍ）の最大高さＡを、その中心点において約０．２インチ（０，５ｃ ｍ）の高さＤを、そして約１．０インチ（２，５ｃｍ）の半径寸法Ｃを有する。

この三日月型くさびは、軸１１の回りで角Ｂに、実質的には約１３５〜１５５″ 、好ましくは、約１５０６で対する。

図２に示した具体例において、プロテーゼ用半月ＩＯは、その周辺縁から広がる メツシュ部材２０を含む。メツシュ部材２０は、生体適合性の、生体吸収可能な 材料からなり、配列１０の位置を固定するための簡便な手段を提供する。メツシ ュ部材２０は、十分な組織内薄が生じ、次いで機能を提供するまで、この容積内 で機能し得る０例として、メツシュ部材２０は、ポリグリコネート、デクソン（ Ｄｅｘｏｎ　）　、又はポリジオキサン（ＰＤＳ）などをメッシエに織った吸収 可能な縫合材料からなる＃１メツシュスクリーンであってよい。ゴレテツクス（ Ｇｏｒｅｔｅｘ　）などの非吸収性縫合材料も又用い得る。

図４及び５は、図２に描かれたプロテーゼ用半月と類似した組成の本発明の更な る具体例を示す。より詳細には、図４は真円筒型半月２２を描いているが、それ は軸１１の回り全体に広がっており、即ち、角Ｂは０°に等しい（即ち、半月は ３６０°に対する）０図５は、図４に示した半月の線５−５に沿っての切断面を 示す。図４及び５に説明したデバイスは、移植時に半月２２の形を示す；即ち、 領域１１における高さＤは、このデバイスの周辺の高さＡより小さい、移植前は 、デバイス２２は、幾つかの場合、この関係を持たないが、移植時には、身体に より加えられる正常の負荷がこのコンホメーションを強制する。

この発明の別形態において、更に別の形状を用い得る。例久ば、この（さびは左 右対称であることは必要でない。これらの具体例は、コラーゲン繊維の密度及び ＧＡＧ分子の分散及び架橋を有して良く、異なる圧力レベル、内題の速度、及び 弾性の調節を可能にしてし）る、一定の密度を有するデバイスが移植された場合 、異なる密度がイン・ビボで得られ、身体の負荷がデバイスの一定でない圧縮を 引き起こす。

プロテーゼ用半月は、天然材料又はそれらのアナログを含む任意の生体適合性の 、生体吸収可能な繊維から製造出来るが、それは、好ましくは、重合体構造を有 し、機械的強度及び防護及び潤滑を与え、他方、組織の内題を促進する（例えば 、コラーゲン、レテイキュリン、エラスチン、セルロース又はそれらの生合成ア ナログ）。

これらの繊維は、実質的に、円周状に広がる又は放射状に広がる方向に秩序づけ られて良く、繊維の密度は実質的にマトリックス中で一定である。別法として、 マトリックス繊維は無秩序であって良い、秩序立った又は無秩序の構成において 、繊維の密度は一定でなくて良し）、一定でない構成において、比較的高密度の 繊維を、局所的適用により高圧力が予想される点において確立することが出来る 。

この発明の別の面において、繊維内及び繊維間の空間は比較的多く、再生半月組 織の内薄を促進する条件である０例えば、半月の密度は約１０−２５ｇマトリッ クス／　ｃ　ｍ　”であって良い、別法として、繊維内及び繊維間の空間は比較 的少なく、膝関節のための緩衝、潤滑及び機械的支持を与える条件であり、且つ 組織及び細胞の内薄を妨げ、それにより、足場の再吸収速度を減じる（例えば、 密度は約２−１０ｇマトリックス／　ｃ　ｍ　’の範囲である）。

イン・ビボにおけるこの構造の形状の一時的安定性、及び半月の再吸収速度は、 共に、繊維の少な（とも一部分の間での効果的な架橋形成に帰する。使用する架 橋試薬は、単一繊維（分子内架橋）、又は繊維とＧＡＧ上のアミノ基、カルボキ シル基又は水酸基と相互作用して隣接する分子間の共有結合形成（分子間架橋） を生じる任意の生体適合性の、二官能性試薬であって良い、有用な架橋試薬は、 アルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イミデート、ポリグリセ ロールポリグリシジルエーテル、及びカルボジイミドを含む。

架橋したデバイスは、天然の半月の特性（即ち、機械的圧力に耐える能力、及び 関節面を防護し滑らかにする能力）と類似した十分な親水性及び弾性を維持する 。更に、この構造は細胞の浸潤及び細胞外マトリックスの合成及び沈着に理想的 環境を与え、天然の半月組織の再生を生じる。

ＧＡＧは繊維中に分散し得る。別法として、それらは繊維間の分子間架橋として 作用し得る。これらのＧＡＧ架橋は、典型的には、コンドロイチン４−硫酸、コ ンドロイチン６−硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫駿、ヘパリン硫酸及びヒア ルロン酸からなる分子の群の少なくとも一つから構成される。ＧＡＧ架橋の分散 は、好ましくは、一定であるが、高圧力が予想されるところ（典型的には、末端 の領域１４及び１６）では濃縮されて良く、中心領域１２（図１）では希薄で良 い、そのような構成において、ＧＡＧ濃度は、末端領域１４及び１６では約０− ２５％の範囲で、中心領域１２では約０−１０％の範囲であって良い、しかしな がら、一定の場合、プロテーゼ用半月中のＧＡＧの分散は、例えば、約１−１５ ％の範囲であって良い。

分子間架橋は又、リジン又はヒドロキシリジンのイプシロンアミノ基とアスパラ ギン酸又はグルタミ°ン酸のカルボキシル基との間のペプチド結合形成を生じる 脱水熱法（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）　（加熱と真空） により確立し得る。

架橋したデバイスは、約５５−８５℃、好ましくは約６５−７５℃での比較的高 い熱安定性を有するが、これは、Ｌヱニヱ！での安定性のためには十分である。

これは、試薬濃度、温度、ｐＨ及び時間を含む架橋条件の操作により達成し得る 。

一つの具体例において、プロテーゼ用半月は、主としてＧＡＧ架橋を持たない１ 型コラーゲン繊維から構築する。、Ｉ型コラーゲン繊維は動物のアキレス鍵から 得られる。しかしながら、この繊維は又、動物の皮膚或はヒトの皮膚又は脚から 得ることも出来る。これらの組織を一連の１１！械的及び化学的手段で処理して 、非コラーゲン物質を全部除去するか又はそれらを最小レベルに減じる。

好ましい処理ステップにおいて、謎又は皮膚を機械的に、更なる処理に有用な細 片に砕解する。この砕解は、組織を液体窒素温度で粉砕することにより、又は組 織を鋭利なナイフで小片に切ることにより達成し得る。ある適用においては、組 織を、機械的強度のために繊維の長さを維持するために、その繊維方向に沿って 機械的に砕解する。

中性ｐＨにおける塩抽出は、新たに合成され、まだ安定な原繊維に取り込まれて いないコラーゲン分子の小部分を除去する。塩は又、静電相互作用によりコラー ゲンと会合する幾つかの糖蛋白質及びプロテオグリカンをも除去する。ＫＣｌな どの他の塩をＮａＣ１の代用に使用することが出来る。

細胞膜又はコラーゲンマトリックスと会合している脂質はトリトンＸ−１００な どのデタージェントでの最初の抽出及びその後でのエーテル−エタノール混合物 による抽出により除去し得る。トリトンＸ−１００の濃度は、通常、約２−４％ であるが、好ましくは約３％である。エーテル−エタノールの好ましい混合物は 、通常、約ｌ＝１の比（ｖ　／　ｖ　）である、抽出時間は、通常、８−９６時 間である。

更なる抽出は、２つの両極端なｐＨにおける処理によるマトリックスの膨潤によ り達成し得る。酸性及び塩基性の膨潤は共に非共有結合性分子間相互作用を弱め 、それ故、非共有結合的に付着した糖蛋白質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ） 及び他の非コラーゲン分子がコラーゲン性マトリックスの開いた細孔から遊離す ることを容易にする。

マトリックスのアルカリ性のｐＨでの膨潤は、コラーゲンをＣａ　（ＯＨ）　ｘ 　、　Ｎ　ａ　ＯＨなどで、高いｐＨで、約８−９６時間処理することによりな される。

（ＣＨＩ　）ＮＣＩ、ＮＨｓ　ＳＯ２などの三重らせん安定化塩の存在下におけ るアルカリ抽出は、コラーゲンの変性の潜在的危険を減じる。アルカリ処理は、 コラーゲンマトリックスから非架橋糖蛋白質及びＧＡＧを解離する。アルカリも 又残余の脂質を鹸化により除去した。

酸膨潤は、酢駿、ＨＣＩなどの存在下において、低いｐＨで処理することが出来 る。アルカリ処理と同様に５酸膨潤は非架橋糖蛋白質及びＧＡＧを除去する。

分子の非三重らせん部分（テロペプチド）は分子間架橋形成に含まれる。それら は弱い抗原であり、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼによる攻撃に感受 性である。そのようなプロテアーゼによる長時間の消化は、原繊維（繊維）を個 々の分子に解離する。しかしながら、消化処理が、最大のテロペプチドが完全に 解離することなく除去されるように、適当に制御されるならば、原繊維の免疫原 性は、機械的強度を弱めることなく、最小レベルに減じ得る０例えば、分子状コ ラーゲンを単離するために、皮膚又は鍵のペプシンでの消化は、通常、約１：１ ０の酵素：コラーゲン比で、約２４−９６時間、室温以下で行なう、それに比べ て、原繊維は、約ｌ：　ｌｏｏ　（酵素；コラーゲン）の比で、約２４−９６時 間、４℃で達成される制限ペプシン消化により得られる。

この方法論により得られるコラーゲン繊維を、次いで、本発明のプロテーゼ用半 月を製造するのに用いる。

しかしながら、生合成的に産生されたコラーゲン又はそれらのアナログなどの他 の源から得られたコラーゲンも又このプロテーゼ用半月を構築するのに用い得る ということは理解されな（ではならない。

一つの具体例において、プロテーゼ用半月は、更に、繊維のネットワークに取り 込まれた付着分子又は付着部分又はそれらのアナログを含み、それらは半月組織 の再生を助成する。有用な付着分子は、フィブロネクチン（米国特許第４．５８ ９．８８１号、４，６６１，１１１号及び４．５７８，０７９号参照）などのペ プチドを含み、その一部は、例えば、コンドロイチン硫酸に結合し得る。

この製造方法は、コラーゲン繊維を、例えば、図６−８に関連して下に記す成形 用型を用いて所定の形状に成形することを含む。繊維は、型の中でランダムに場 所を定めるか、又は特定の方向を向いて特定の構造特性を有する半月を達成する ことが出来る。架橋反応に参加し得るＧＡＧなとの他の成分は、この構造を様々 な化学的及び／又は脱水熱法を含む様々な架橋及び脱水処理にかける前に、ラン ダムな又はランダムでない様式で繊維と混合することが出来る。付着分子又は付 着断片又はそれらのアナログは、この構造をその分子を含む溶液に浸すことによ り、又はそれを存在する繊維又は架橋に特異的にカップルさせることにより、最 終的に乾燥するステップの前にこの構造に加えることが出来る０例えば、フィブ ロネクチンの付着部分は、プロテーゼ用半月をその５０ｍｇ／ｍｌ溶液に浸すこ とにより、コンドロイチン硫酸１分子当り３分子の濃度でコンドロイチン硫酸に 架橋することが出来る。

上記の処理に続いて、実施例を以下に記すが、図２又は３に示した形のプロテー ゼ用半月は、下記の表１に列挙した特性を有するように構築することが出来る。

１１皿皿上 上さＡ＝０．２０−０．４０インチ 角　Ｂ＝　２５−４５度 半径Ｃ＝０．５　−２．０インチ 高さＤ＝０．０５−０．１０インチ 密度　＝　０　、０７−０　、５　ｇ　／　ｃ　ｍ　”繊維内及び繊維間空間＝ ２−２５ｃｍ’／ｇマトリックス 腹盪 繊維（コラーゲン）含量＝７５−１００％ＧＡＧ含量：０−２５％ 下記の非制限的実施例は、この発明のプロテーゼ用半月の製造方法及びイン・ビ ボ試験の方法を記述する。

Ｌ立上ユ ！ＬＬ！！： プロテーゼ用半月の製造に有用な型１００を、移植可能なステンレス鋼又はテフ ロン、ポリプロピレン、デルリン（ｄａｌｒｉｎ）などの生体適合性プラスチッ ク、又はこれらの物置の組み合わせから作る。型ｌＯＯは、図６−８に示すよう に３つの部分１０２．１０４及び１０６からなる。

例えば、図４及び５に示されるディスク型半月には、図６の型１００を用いた。

第一の部分１０２はディスク様であり、所望の半月の直径と実質的に等しい直径 を有する１部分１０２には、加圧により液体を通過させるために穴を開ける１部 分１０２の内面１０３は、形成する半月の一面の所望の形状を有する。

第二の部分１０４は、第一の部分１０２と同じ内部寸法を有する中空の円筒であ る。第三の部分１０６は、部分１０４の内径より僅かに小さい外径を有する円筒 状ピストンである。ピストン１０６の“頂点”又は頭頂部表面１０８は形成する 半月の一面の所望の形状を有する。

図３の半月には、部分１０２の形状、及び部分１０４の横断面が傾斜セグメント （ａｎｇｕｌａｒ　ｓｅｇ＋ｎｅｎｔ　）の形状を有する図７の型を用いた。平 田型ディス、り状牟月には、部分１０２及び１０４が図６と同じで、部分１０６ が図１０８中のその部分と類似しているが平な頭頂部表面１０８を有するｒＸｉ ８の型ｌＯＯを用いた。

半月ｌＯの製造の間、部分１０２は１図６−８に示すように、先ず、部分１０４ に取り付ける。成分繊維（液状）を部分１０２の表面１０３に対して位置させる 。次いで、ピストン１０６の頭頂部表面１０８を圧縮軸１０６ａに沿って繊維が 圧縮されるまで面１０３に向かって動かし、液体を部分１０２から追い出し、そ して、圧縮した繊維の配列の所望の軸長を達成する。次いで、この型を化学架橋 用に凍結する。

１１亘ユ Ｉ　コラーゲンの・ Ａ）組織： ウシ、ブタ又はヒツジのアキレス鍵を、米国農務省認可の屠殺場から得る。動物 の好ましい年齢は１２−１８か月である。組織は、細菌混入及び組織の分解を最 小限にすることが規定されている場合を除いて、精製工程の間冷蔵する。

Ｂ）機械的砕解： 注意深（選択した鍵の付着組織を、先ず、機械的に捨てる０次ぎに、その組織を ミンスし即ち細片に切り、そして、過剰量（１０体積）の冷水中で洗って残留血 液蛋白質及び水溶性物質を除去する。

Ｃ）塩抽出： 洗った鍵を１０倍量の５％ＮａＣ１，Ｏ，ＯＩＭ）リス、ｐＨ７，４中で２４　 （＋／−２）時間抽出して塩溶解性物質を除去する。塩抽出した鍵を約１０倍量 の水中で繰り返し洗って塩を除去する。

Ｄ）脂質抽出： この材料を３％トリトンｘ−ｉｏｏ中で２４（＋／−）時間抽出する。水で多数 回洗ってデタージエントを除去する０次いで、この材料を３−４倍量のエーテル −エタノール（１：ｌ、ｖ／ｖ）中で２４　（＋／−２）時間抽出して脂質含量 を更に小さくする。この脂質抽出した材料を水で多数回洗ってエーテルとエタノ ールを除去する。

Ｅ）マトリックス膨潤： 次ぎに、この材料を２つの両極端ｐＨ抽出に掛けて非コラーゲン物質を除去する 。アルカリ抽出は、３−４容の０．２ＭＮａＯＨ（ｐＨ１２，５−１３，５）に より、室温（ＲＴ）で、１．ＯＭ　（ＣＨ）ＮＣＩの存在下で、２４　（＋／− ２）時間、穏やかに撹拌しながら行なう。

アルカリ抽出の後、ＭＣＩでｐＨを中性にし、この材料を水で洗う。次いで、ｐ Ｈを、濃酢酸を終濃度０．５Ｍになるように加えることにより２．５−３．０に 調節する。酸抽出を、撹拌しながら２４　（＋／−２）時間待なう。

Ｆ）制限蛋白質加水分解消化： 次ぎに、酸膨潤した鍵を、ペプシン（酵素：′コラーゲン三重　：　１００）に よる２４　（＋／−）２時間の制限蛋白質加水分解消化に掛ける。ペプシン及び テロペプチドを透析により除去する。

次いで、膨潤繊維マトリックスを、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ又はＨＣＩでｐＨをそ の等イオン点に調整することにより、又はＮａＣ１でイオン強度を０．７に調製 することによりコアセルベート化する。凝集したコラーゲン繊維を濾過により採 取し、ン濾過した物質を冷緩衝溶液で多数回洗う、この高度に精製した■型コラ ーゲンを使用まで保存（−２０〜−４０℃）する。

見立■に 二エス±１１ Ａ）実施例２からの高度に精製したＩ型コラーゲン繊維のコラーゲン含量を、重 量法により、又はヒドロキシプロリン（１３，５重量％のヒドロキシプロリンが １型コラーゲン中にあると仮定する）の含量を測定することにより決定する。既 定の密度の半月デバイスを製造するのに必要な精製した材料の量を、次いで、測 定し、重量を測る。

Ｂ）繊維コラーゲンの溶液を注意深（規定の寸法の型にはめ込む０例えば、典型 的な半月は、図２−５に関連して上述した（実施例Ｉ及び図６−８の型の説明参 照）、コラーゲン繊維はランダムな仕方で又は方向付けられた仕方で横たわる。

方向付ける場合、繊維の円周方向は、物質が型の中で圧縮される際、ビス１ンの 主軸の回りの回転により作る。放射方向は、コラーゲン繊維を線状に、放射方向 に手で塗装することにより作る。

Ｃ）繊維を一２０℃で凍結し、型から取り出し、ＲＴで解凍する。

Ｄ）次いで、繊維を燐酸緩衝塩溶液中に再懸濁し、所望の方向で型に戻し、ピス トンで圧縮する。

Ｅ）圧縮した繊維を、次ぎに、−２０℃で再凍結し、次いで、ＲＴで解凍する。

Ｆ）その結果出来たの構造を、０．２％グルタルアルデヒド溶液、ｐＨ７，６に ２４　（＋／−０，５）時間浸すことにより架橋する。それぞれのグルタルアル デヒド架橋した半月デバイスを、続いて、５００ｍ１の燐酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ ）　、ｐＨ７，４中で、４．８．２４及び４８時間繰り返してすすぐ。

Ｇ）すすいだマトリックスを、次いで、凍結乾燥する。

叉Ｗ デバ　ス■Ｉ　″ Ａ）−Ｇ）（実施例３と同じ） Ｈ）凍結乾燥したマトリックスを真空と加熱による脱水熱架橋に掛ける。先ず、 真空を適用して残留水分を最小レベルに減じる（幾らかの構造水（約３％）が、 依然として、構造安定化因子の一部として、コラーゲン三重らせんに結合してい る）、熱を段階的に１１０℃（＋／−５℃）まで増加し、継続的に、真空中で、 １１０℃で、２４　（＋／−２）時間加える。

Ｌｉ五上 デバイス■Ｉ工　゛ Ａ）（実施例３と同じ） Ｂ））ラーゲン材料を０．０ＬＨＣＩ溶液、ｐＨ２−２，５中に分散させる。様 々な所定量のＧＡＧを測り、水に溶かす０例えば、既定の密度０．２５ｇ／ｃｍ のためには、２．５％ＧＡＧ含量に対してコラーゲン含量を０．２４４ｇ、ヒア ルロン酸含量を０．００３ｇ及びコンドロイチン硫酸含量を０．００３ｇにする 。ＧＡＧ溶液をコラーゲン溶液と混ぜ、実施例２に記したように所望の方向で型 内に位置させる。

Ｃ）−Ｇ）（実施例３と同じ） 夾１０１旦 デバイスＬＬＬｉ Ａ）−Ｃ）（実施例３と同じ） Ｄ）（横たえた繊維を圧縮しないこと以外は実施例３と同じ） Ｅ）−Ｇ）（実施例３と同じ） １１土ユ 二二工盈ヱ１ｊ Ａ）−Ｅ）（実施例３と同じ） Ｆ）型成形したコラーゲンを、５０％エタノール中の５％ポリグリセロールポリ グリシジルエーテル及び０．１ＭＮａＣ０−（ｐＨ１０，０）中で２４　（＋／ −２）時間架橋する。架橋したデバイスを、４．８．２４及び４８時間、それぞ れ５００ｍ１のＰＢＳ、ｐＨ７゜見立上上 デバイスＵ告 Ａ）−Ｅ）（実施例３と同じ） Ｆ）型成形したコラーゲンを、０．９％ＮａＣ１中の１−エチル−３−（３−ジ メチルアミノプロピル）カルボジイミド（１０ｍ　ｇ　／　ｇマトリックス）の 存在下で、ｐＨ４，７で、室温で、２４　（＋／−２）時間架橋する。３−４時 間ごとにカルボジイミドを加え、各カルボジイミド添加の後にｐＨを４．７に調 整する。

Ｇ）（実施例３と同じ） １１土ユ デバイスｖＩ工　′ （Ａ）−（Ｄ）実施例ＩＩで記したステップ（Ａ）−（Ｄ）と同じ。

（Ｅ）取り付は目的のために、型の寸法に合わせた、吸収可能なポリグリコネー ト縫合材料のメツシュを分散したコラーゲン中に、それがその構造の周囲から突 き出て頚骨のプラトーを超えて広がる裾を形成するように横たわらせる。このメ ツシュは、直接の取り付は部位と長期に渡る繊維の内層の両方を与える。

見立土ユニ 区１ プロテーゼ用半月を、正常の半月組織の再生の鋳型として機能し又は助成する能 力を測定するために、動物モデルを用いてイン・ビボで、そしてイン・ビトロで 評価した。

１、イン・ビボの　力 １７個のプロテーゼ用半月（デバイスＩＩＩ型）を１１匹の未成熟のヨークシャ ー豚に移植した。７個の関節の中間の半月の２／３を不完全切除して適合するプ ロテーゼ用半月で置き換えたが；２個の関節は２／３の不完全切除を受けただけ であり；２個の関節は類似の不完全な半月切除術を受け切除部分を直ちに縫合固 定した；そして２個の関節は完全な半月切除術のみを受けた。

すべての関節の評価は、３又は６週目に行なった。すべての関節手術は十分癒え 、すべての動物は完全な体重を有するまで発育した。最終的評価において、すべ ての補綴材料は、部分的に又は完全に分解吸収されていたが、関節の破壊又は軟 骨の摩滅の証拠はない。移植したプロテーゼ用半月並びに対照の両方において、 基礎的治廼機構として血管新生が観察され、すべての関節において、早期の半月 再生の証拠があった。このプロテーゼ用半月の材料は、適当な関節の形状に適合 した。更に、６週間に渡って移植物の拒絶の診療上の証拠はなかった。

組織学的には、急性の炎症があり、その後、血管新生及びあだらに形成されたコ ラーゲンの初期のヒアリン化を伴う繊維組織形成があった（図９参照）。

成熟イヌにおけるこの発明のイン・ビボの研究は、プロテーゼ用半月により誘導 された半月再生を示した。通冨、成熟イヌの後膝関節は半月を再生しないこと及 び有意の関節炎変化を生じることが知られている。しかしながら、半月切除及び 本発明による足場の移植の６週後、この足場による半月の有意の再生が生じた。

この足場は関節の保護を与λたか、それは、減じた軟骨浸食、骨増殖体形成及び インディアインクへの親和性により測定された。

図１１は、外科的切除の３か周接の２個のイヌの膝関節の写真描写である。この 関節は、新しい半月の引き続く再成長を伴う補綴移植物により保護された。図１ １の右側の関節は、８０％の半月切除のみを受けた。この劇的な関節軟骨の保護 はインディアインクにより際立っている。

新しいコラーゲン及びグリコサミノグリカン形成は、アルシアンブルー及びマソ ンのトリクロム（Ｍａｓｓｏｎ　’　ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色により組織学 的に証明された。半月状移植物と対照の両方において合成されたプロテオグリカ ンの流体力学的寸法及びクロマトグラフィー上のプロフィルは、図１２に示すよ うに５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−５００カラム上で分析した場合には類似していた 。図１２は、再生した半月中のプロテオグリカン凝集体の流体力学的プロフィル （図１２Ｂ）を、切除された縁のみ（図１２Ｄ）と比較して、そして、媒質中の （図１２Ａ）及び結合性抽出物中の（図１２０）切除後残留繊維軟骨を含む対照 試料と比較して示す一連のグラフである。

２、イン・ビトロの　” 半月を無菌的に成熟イヌから採取し、すべての付着組織を取り、Ｇａｙの平衡塩 溶液中に置いた。各半月を頭頂平面内で２等分し、各半半月に３ｍｍの十分な深 さの円形欠損を作った。これらの欠損に２つのプロトタイプの複合コラーゲンを 基礎とする生合成の足場（プロテーゼ用半月）の１つを満たした。これらの半月 を、１０％仔牛血清、アスコルビン酸及び０．１％ペニシリン／ストレプトマイ シンを補った６ｍｌのダルベツコ改変イーグル培地を含む６穴培養プレート中に 置いた。培養を、３７℃で、１０％Ｃｏｔ／９０％空気の湿潤大気中に維持し、 週に３回補給をし、そして、毎週新しい培養穴に移して移植片細胞培養の形成を 防止した。培養開始後、１．４及び６週の間隔で、各群から３個の半月を取り出 し、固定し、そして、連続切片と染色により評価した。

その結果（図１０に示す）は、長期に渡る細胞の移動及び侵入の増加を示した。

この材料からの明日な毒性はなかった。移動細胞の形態学的特長は、自然の繊維 軟骨細胞より紡錘形であり、細長かった。この足場への細胞浸透の深さは、補綴 複合体の密度により制限されることが分かった。

本発明は、その趣旨又は必須の特性の中で他の特定の形態において具体化し得る 。それ故、本発明は、説明した及び説明していないすべての点において、この発 明の範囲は、前述の説明よりは添付の請求項により示され、それ故、その請求項 と等しい意味及び範囲に属するすべての変化はそれらに包含されると考えられる 。

分画番号 国際調査報告

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．生体適合性の生体吸収可能な繊維の乾燥した多孔性マトリックスを含むプロ テーゼ用半月であって、前記の繊維が天然のポリマー又はそれらのアナログ又は 混合物を含み 前記のマトリックスが、イン・ビボで、実質的に天然の半月と同じ外面輪郭を有 するように適合され、前記のマトリックスが、５０ミクロンより大きく約５００ ミクロンより小さいおよその範囲に細孔寸法を有し、 それにより、前記のマトリックスが、少なくとも部分的に、生体吸収可能な、半 月繊維軟骨細胞の内殖に適合した足場を確立するプロテーゼ用半月。
2. ２．前記の繊維をコラーゲン、エラスチン、レティキュリン、及びセルロース並 びにそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
3. ３．前記のマトリックスが、実質的に、２つの狭い末端領域の間の広い中心領域 を含むくさび形を有する、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
4. ４．前記のマトリックスが、約０．０７〜０．５０ｇマトリックス／ｃｍ２の密 度を有する、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
5. ５．前記のマトリックスが、約２−２５ｃｍ３／ｇマトリックスの繊維間及び繊 維間空間を有する、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
6. ６．前記の天然ポリマーがエラスチンを含む、請求項１に記載のプロテーゼ用半 月。
7. ７．前記の天然ポリマーがレティキュリンを含む、請求項１に記載のプロテーゼ 用半月。
8. ８．前記の天然ポリマーがセルロースを含む、請求項１に記載のプロテーゼ用半 月。
9. ９．前記の天然ポリマーが動物由来のポリマーである、請求項１に記載のプロテ ーゼ用半月。
10. １０．前記の天然ポリマーがヒト由来のポリマーである請求項１に記載のプロテ ーゼ用半月。
11. １１．前記の天然ポリマーがコラーゲンを含む、請求項１に記載のプロテーゼ用 半月。
12. １２．前記の天然ポリマーが１型コラーゲンを含む、請求項１１に記載のプロテ ーゼ用半月。
13. １３．前記のコラーゲン繊維が、乾重量で約７５−１００％の濃度で存在し、且 つ前記のグリコサミノグリカン分子が、乾重量で約０−２５％の濃度で存在する 、請求項１２に記載のプロテーゼ用半月。
14. １４．前記の繊維に散在する多くのグリコサミノグリカン分子を、更に、含む、 請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
15. １５．前記の分子の少なくとも一部が前記の繊維の一部の間に架橋を与える、請 求項１４に記載のプロテーゼ用半月。
16. １６．前記の繊維が、乾重量で約７５−１００％の濃度で存在し、且つ前記のグ リコサミノグリカン分子が、乾重量で約０−２５％の濃度で存在する、請求項１ ４に記載のプロテーゼ用半月。
17. １７．前記のグリコサミノグリカン分子を、コンドロイチン４−硫酸、コンドロ イチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸 、及びそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項１４に記載のプロテーゼ用半 月。
18. １８．前記のグリコサミノグリカン分子が前記のマトリックス中に実質的に一様 に分散する、請求項１４に記載のプロテーゼ用半月。
19. １９．前記のグリコサミノグリカン分子が前記のマトリックス中に一様でなく分 散する、請求項１４に記載のプロテーゼ用半月。
20. ２０．前記の繊維の少なくとも一部の間に架橋を、更に、含む、請求項１に記載 のプロテーゼ用半月。
21. ２１．前記の架橋が化学架橋剤により形成される、請求項２０に記載のプロテー ゼ用半月。
22. ２２．前記の架橋剤を、グルクルアルデヒド、ホルムアルデヒド、生体適合性の 二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス −イオニデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサル及び それらの混合物からなる群から選ぶ、請求項２１に記載のプロテーゼ用半月。
23. ２３．前記の架橋剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）を含む 、請求項２２に記載のプロテーゼ用半月。
24. ２４．前記の架橋剤がポリグリセロールポリグリシジルエーテルを含む、請求項 ２２に記載のプロテーゼ用半月。
25. ２５．前記の架橋剤がグルタルアルデヒドを含む、請求項２２に記載のプロテー ゼ用半月。
26. ２６．前記のマトリックスが、中心領域とその周辺領域とを有する円周方向に広 がるくさびの形状を有し、所定の角が前記の中心領域の回りで０度より大きく３ ６０度に及び、且つ、 前記のくさびの前記の中心領域の厚さが前記のくさびの周辺領域の厚さより小さ い、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
27. ２７．前記の円周方向に広がるくさびが三日月型であり、狭い２つの末端領域の 間の広い中心領域を有する、請求項２６に記載のプロテーゼ用半月。
28. ２８．前記の円周方向に広がるくさひが３６０度の角度に及ぶ、請求項２６に記 載のプロテーゼ用半月。
29. ２９．前記の繊維が、前記のマトリックス中で、実質的に、ランダムな様式で方 向付けられる、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
30. ３０．前記の繊維が、前記のマトリックス中で、実質的に、秩序立った様式で方 向付けられる、請求項１に記載のプロテーゼ用半月。
31. ３１．前記のマトリックスが、実質的に、円周方向に広がる繊維を含む、請求項 ３０に記載のプロテーゼ用半月。
32. ３２．前記のマトリックスが、実質的に、放射状に広がる繊維を含む、請求項３ ０に記載のプロテーゼ用半月。
33. ３３．前記の繊維の密度が、実質的に、前記のマトリックス中で一定である、請 求項１に記載のプロテーゼ用半月。
34. ３４．前記のマトリックスの外面の一部から広がるメッシュを、更に、含み、前 記のメッシュが分解吸収可能且つ生体適合性である、請求項１に記載のプロテー ゼ用半月。
35. ３５．半月組織をイン・ビボで再生させる方法であって、下記のステップ： （ａ）生体適合性且つ生体吸収性繊維の乾燥した多孔性マトリックスを含むプロ テーゼ用半月を製造し、前記の繊維が天然のポリマー或はそれらのアナログ又は 混合物を含み、 前記のマトリックスが、イン・ビボで、実質的に、天然の半月と同じ外面輪郭を 有するように適合し、前記のマトリックスが、５０ミクロンより大きく約５００ ミクロンより小さいおよその範囲に細孔寸法を有し、 それにより、前記のマトリックスが少なくとも部分的に生体吸収可能な、半月繊 維軟骨細胞の内殖のために適合した足場を確立し、 （ｂ）前記のプロテーゼ用半月を外科的手順により膝関節に移植する ことを含む方法。
36. ３６．前記の製造ステップが、前記の繊維の少なくとも一部を架橋することを含 む、請求項３５に記載の方法。
37. ３７．前記のステップ（ａ）で製造したプロテーゼ用半月が多くのグリコサミノ グリカン分子を含む、請求項３５に記載の方法。
38. ３８．前記のステップ（ａ）で製造したプロテーゼ用半月が、ステップ（ｂ）で 移植された場合に天然の半月の形状をとる、請求項３５に記載の方法。
39. ３９．前記の製造ステップが、前記のマトリックスの外面の一部から広がるメッ シュを含むプロテーゼ用半月を製造することを含み、前記のメッシュが分解吸収 可能且つ生体適合性である、請求項３５に記載の方法。
40. ４０．プロテーゼ用半月を製造するための方法であって、下記のステップ： （ａ）多くの生体適合性且つ生体吸収性の繊維を型に入れ、前記の繊維は天然の ポリマー或はそれらのアナログ又は混合物を含み、前記の型は膝関節機能を可能 にする半月状プロテーゼの形状を定め； （ｂ）前記の繊維を前記の凍結及び解凍の第一及び第二のサイクルに掛け； （ｃ）前記の繊維を化学架橋剤と接触させて前記の繊維が前記の型の形状をとる ようにし；そして（ｄ）前記の架橋した繊維を凍結乾燥することを含む方法。
41. ４１．前記の天然ポリマーの前記のアナログが生合成アナログである、請求項４ ０に記載の方法。
42. ４２．前記の繊維を、コラーゲン、エラスチン、レティキュリン、セルロース、 並びにそれらのアナログ及び混合物からなる群から選ぶ、請求項４０に記載の方 法。
43. ４３．前記の型に入れるステップが、更に、多くのグリコサミノグリカン分子を 前記の型に入れることを含む、請求項４０に記載の方法。
44. ４４．前記のグリコサミノグリカン分子を、コンドロイチン４−硫酸、コンドロ イチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸 、及びそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項４３に記載の方法。
45. ４５．前記の型に入れるステップが、更に、前記の繊維を、実質的に、円周方向 に方向付けるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
46. ４６．前記の方向付けのステップが、前記の繊維を前記の型内でピストンで圧縮 することを含み、ピストン運動は、実質的に、圧縮軸に沿った方向であり、他方 、前記の圧縮ステップの間、前記のピストンは、前記の圧縮軸の回りで前記の型 に対して回転する、請求項４５に記載の方法。
47. ４７．前記の方向付けステップが、前記の型を、前記の繊維がその中に置かれた ときに、回転させることを含む、請求項４５に記載の方法。
48. ４８．前記の型に入れるステップが、更に、前記の繊維を、実質的に、放射状に 方向付けるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
49. ４９．前記の繊維を、前記の凍結及び解凍の第二のサイクルの前に圧縮するステ ップを、更に、含む、請求項４０に記載の方法。
50. ５０．前記の繊維及び前記のＧＡＧを、前記の凍結及び解凍の第二のサイクルの 前に圧縮するステップを、更に、含む、請求項４３に記載の方法。
51. ５１．前記の圧縮ステップが、所定量の圧力を前記のマトリックスの一領域にピ ストンで加えることを含み、前記のピストンが所定の形状を有する、請求項４９ に記載の方法。
52. ５２．前記の化学架橋剤を、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、生体適合 性且つ二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート 、ビスーイミデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサル 、及びそれらの混合物からなる群から選ぶ、請求項３９に記載の方法。
53. ５３．前記の化学架橋剤がグルタルアルデヒドを含む、請求項５２に記載の方法 。
54. ５４．前記の化学架橋剤がポリグリセロールポリグリシジルエーテルを含む、請 求項５２に記載の方法。
55. ５５．前記の化学架橋剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ ルボジイミドを含む、請求項５２に記載の方法。
56. ５６．前記の凍結乾燥したマトリックスを脱水熱架橋手順に掛ける追加のステッ プを、更に、含む、請求項３９に記載の方法。