JPH10500435A - 水に不溶な架橋されたポリカルボン酸組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリ（アルキレンカルボン酸）ストランドへの架橋の割合が２に対して約１〜約２００である、それぞれが式（ＩＩＩ）のストランド骨格［但し、各ストランドにおける少なくとも１つのマレオイル部分の一方のカルボニル基が-HN.[(H)_p(CH)_z．(OH)_m］.NH-部分に共有結合して、下記式（Ｖ）（但し、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコシキ、またはフェニルであり；ｚは１〜４の整数であり；ｐは０またはｚ−１までの整数であり；ｍは１またはｚまでの整数である）の架橋部分を少なくとも１つ生じさせる］を有する少なくとも２つのストランドを有する水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸を提供する。また、上記ポリヒドロキシポリカルボン酸の製造方法およびマトリックスを形成するタンパク質を含有する水性媒体からタンパク質を除去するためのポリヒドロキシポリカルボン酸の使用方法が開示される。タンパク質を変性させずにマトリックスからタンパク質を回収する方法ならびにマトリックスからのポリヒドロキシポリカルボン酸の回収方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 水に不溶な架橋されたポリカルボン酸組成物 発明の背景 発明の分野 沈殿による水性媒体からのタンパク質の除去 従来技術の説明 タンパク質は、従来、試薬または熱の使用により水性媒体から除去されてきた 。溶剤（クロロホルム、尿素）によってはタンパク質を変性することより沈殿さ せるものである。同様にして、塩の添加により媒体の電解質レベルを高い値に上 昇させることによっても、タンパク質が沈殿する。さらに、熱はタンパク質を変 性するだけでなく通常凝固させるので、タンパク質を水性媒体から分離する。 これらのタンパク質除去方法には主に３つの欠点がある。第一に、媒体から除 去される材料は純粋にタンパク質ではない。その代わり、媒体が細胞ライゼート である際等、媒体が化学薬品のコンプレックス混合物(complex mixture)を含む 際には、上記方法を用いるとタンパク質に加えて他の材料をも除去してしまう。 第二に、上記方法によって除去されたタンパク質は、通常、透析等の時間のかか る手順によってのみ不可逆的に変性されるまたは変性可能である。第三に、タン パク質の単離または精製は、従来、ある程度毒性のある溶剤（フェノールおよび ／またはクロロホルム）を使用するものであった。 米国特許番号４，４２１，６５３号に記載された高分子材料は、上記問題を解 決しようとするものであった。しかしながら、ジアミンで架橋された、上記材料 、ポリエチレンマレイン酸無水物誘導体は、血清の一 容量を除タンパクするために、溶液中に９容量まで必要である。このような非常 に過剰な「除タンパク剤」は非常に効率が悪く、市場のプロセスでは不適当なく らい高価になってしまう。さらに、このようなマトリックスはアルカリの範囲（ 即ち、ｐＨ１０）でタンパク質を沈殿させるため、ややアルカリ条件下でのマト リックスからの目的とするタンパク質の脱着が非常に困難になってしまう。 発明の要約 ポリ（アルキレンマレイン酸無水物）の初期量に対するジアミノヒドロキシア ルカンの初期量の割合が１モル／モルに対して約１〜約２００である、下記式の ポリマーを： ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｑは７〜１０，０００の整数である、 下記式のアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカン(alpha，omega diamin ohydroxy alkane)で： ただし、ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である、 架橋し、未反応の無水物群(anhydrideg roup)を加水分解することによって得ら れる水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸(pol yhydroxy polycarboxylic acid)組成物の一群を提供するものである。 これらの架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸(polyhydroxy polycarboxy lic acid)組成物は、ポリ（アルキレンカルボン酸）ストランドへの架橋の割合 が２に対して約１〜約２００である、それぞれが下記式のストランド骨格(stran d skeleton)を有する少なくとも２つのストランドを有する： ただし、各ストランドにおける少なくとも１つのストランド中(inter-strand)の マレオイル部分の一方のカルボニル基は、 −ＨＮ．［（Ｈ）_p（ＣＨ）_z．（ＯＨ）_m］．ＮＨ−部分 （ＩＶ） に共有結合して、下記式のストランド中(inter-strand)の架橋部分を生じさせる ： ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である。 また、式Ｉのポリマーと式ＩＩのヒドロキシジアミンとの反応生成物中には、 下記式ＶＩ： ただし、ｙはｍまでの整数であり、他の値は上記したのと同様である、を有する ことが推定される相当する「ポリマレイン酸エステル」もまた存在する。 本明細書中に開示された架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の製 造方法は、式Ｉのポリマーを式ＩＩのアルファ オメガ ジアミノヒドロキシア ルカンで架橋し、酸で未反応の無水物群を加水分解して、式Ｖ及びＶＩの化合物 の混合物を得ることからなる。 このポリマレイン酸エステル（ＶＩ）は、数時間、好ましくは少なくとも一晩 、周囲温度で、強塩基、好ましくは、希釈水性アルカリで緩やかに処理すること によって親のポリオール（Ｖ）に容易に加水分解により戻る。混合物をアルカリ 加水分解することにより実質的に純粋な式Ｖが得られる。 これらの架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の両方ともにより、 有効量の上記架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を水性媒体に加え てタンパク質／ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物マトリックスを形成するこ とからなるタンパク質を含む水性媒体からのそのタンパク質を沈殿させる方法が 提供される。しかしながら、式Ｖの化合物は、相当するエステルを含有する混合 物より実質的により効率的である。好ましくは、ポリヒドロキシポリカルボン酸 組成物の使用量は、重量で、タンパク質を含む水性媒体中に含有すると評価され るそのタンパク質の量に少なくとも等しい。さらに、ポリヒドロキシポリカルボ ン酸組成物が水性媒体中で用いられることが望ましい。上記沈殿段階では、それ ぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボン酸組成物 の重量による濃度は約３：１から約１：３の割合を有する、特に好ましくは、各 水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の重量 による濃度が実質的に等しい際に有用であることが分かった。 実際の沈殿プロセスは、若干広範な範囲内であるが、ある程度ｐＨに依存する 。したがって、Ｒが水素である際には、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン 酸組成物含有媒体のｐＨは、ｐＨが約６．５を超えない成分の混合後の媒体を形 成できるように約３〜約６．２の間であることが望ましい。同様にして、Ｒがフ ェニルである際には、ポリヒドロキシポリカルボン酸含有媒体のｐＨは、ｐＨが 約７．５を超えない成分の混合後の媒体を形成できるように約５．５〜約７．５ の間であることが望ましい。 沈殿反応が起こった後に、反応混合物を遠心してペレットとしてマトリックス を回収することが望ましい。 タンパク質を変性させずにマトリックスからタンパク質を分離するこ とは、マトリックスを約８．６から約９．５のｐＨで緩衝液により処理すること によって行われる。好ましくは、マトリックスのペレット１容量当たり、約８． ６〜約９．５のｐＨで、約１〜約５容量の緩衝液を使用する。本発明は以下に制 限されないが、緩衝液がトリスバッファーである際に優れた結果が得られた。 上記プロセスはまた、タンパク質及び核酸の両方を含む液体から核酸を分離す るのに特に有効である。このような場合には、核酸またはこの混合物の源は、水 性グアニジニウムチオシアネート(aqueous guanidinium thiocyanate)に懸濁し た細胞ライゼートであることが多い。 または、マトリックスをラウリル硫酸ナトリウムの水溶液で処置した後、望ま しくは反応混合物を遠心してポリヒドロキシポリカルボン酸の形態をまたは残留 ペレットとして回収することによって、回収すべきマトリックスから架橋された ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を回収してもよい。 タンパク質を変性させる、上記プロセスにおいて、マトリックス残留ペレット １容量当たり約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）の間の濃度のラウリル硫酸ナトリウム 約１〜約３容量を使用する。その後、回収されたポリヒドロキシポリカルボン酸 残渣を洗浄し、緩衝液中に再懸濁する段階をさらに含ませることが望ましく、こ の際、緩衝液は、Ｒ＝フェニルである際には、好ましくは７．１〜７．５のｐＨ で、リン酸緩衝溶液が使用される。または、Ｒ＝Ｈである際には、４〜４．５の ｐＨで酢酸緩衝液が使用される。 好ましい実施態様の説明 架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物 本発明は、下記式Ｉのポリマーを： 下記式ＩＩのアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカンで架橋することに よって形成された組成物を包含するものである： 式Ｉの括弧中に示される原子のシンボルはポリマーの繰り返し単位を示し、ｑ はジアミノヒドロシキアルカンによるポリマーの架橋前のポリマー中で結合した 数を示すものである。ｑにより表わされた単位は７〜１０，０００まで変化する 。 Ｒは、水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコシキ 、またはフェニルである。 式Ｉ中のシンボルＲは水素であることが好ましい。ｑが１２０〜約２５０であ るこのようなポリマーは、モンサント ケミカル カンパニー(Monsanto Chemic al Co.)、セント ルイス、ミズリー州(St．Louis，Missouri)、米国からエチレ ン−マレイン酸無水物共重合体（ＥＭＡ）の名称で得られる。また、Ｒがメトキ シである式Ｉのポリマーが好ましい。ｑが約１００〜約６００であるこのような ポリマーは、ジーエーエフ コーポレイション(GAF Corp.)、ケミカル ディヴ ィジョン、ウェイン、ニュージャージー州(Chemical Division，Wayne，New Jer sey)からのガンツレッツ エーエヌ(Gantrez AN)の名称で得られる。また、Ｒが メテニル、エテニル、メトシキまたはエトキシである式Ｉのポリマーもまた好ま しい。 式ＩＩにおいて、ｚは１〜４の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数で あり、およびｍは１またはｚまでの整数である。式ＩＩの各 （ＣＨ）基には１つのヒドロキシル基が結合しているまたはヒドロキシル基が結 合していないと解する。全体の架橋部分は、少なくとも１つのヒドロキシル基を 有し、架橋鎖中に（ＣＨ）基１個当たり１つまでのヒドロキシル基、即ち、２ア ミド基間にｚ個までのヒドロキシル基を有する。 式ＩＩのアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカン等のアルファ、オメ ガ ジアミノヒドロキシアルカンは、例えば、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキ シ−プロパン(アルドリッヒ ケミカル カンパニー(Aldrich Chemical Co.)、 ミルウォーキー、ウィスコンシン州(Milwaukee，WI)）等、市販されている。 水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸中に残る無水物群は加水 分解される。 水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物において、初期に 仕込まれたポリ（アルキレンマレイン酸無水物）に対する初期に仕込まれたジア ミノヒドロキシアルカンの割合は、１モル／モルに対して、約１〜約２００であ る。 さらなる実施態様によると、水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボ ン酸は、それぞれが下記式ＩＩＩのストランド骨格(strand skeleton)を有する 少なくとも２つのストランドを有する： ただし、各ストランドにおける少なくとも１つのマレオイル部分の一方のカルボ ニル基は、下記式ＩＶ： −ＨＮ．［（Ｈ）_p（ＣＨ）_z．（ＯＨ）_m］．ＮＨ−部分 （ＩＶ） のアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルキルに共有結合する。 これにより、少なくとも１つの下記式Ｖの架橋部分が生じる： ただし、Ｒ、ｐ、ｚ及びｍは、それぞれ上記式Ｉ及びＩＩと同様の値を有する 。式Ｖにおけるポリ（アルキレンカルボン酸）ストランドへの架橋の割合は２に 対して約１〜約２００である（１：２〜２００：２）。架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の製造方法 本発明のさらなる実施態様によると、水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポ リカルボン酸組成物の製造方法は、式Ｉのポリマーを式ＩＩのアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカンで架橋して、未反応の無水物群を加水分解するこ とからなる。１容量の式Ｉによるポリ（アルキレンマレイン酸無水物）を反応容 器に加える。１容量の式ＩＩによるアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアル カンもまたは上記反応容器に添加する。初期に仕込まれたポリ（アルキレンマレ イン酸無水物）に対する初期に仕込まれたジアミノヒドロキシアルカンの割合は 、１モル／モルに対して、約１〜約２００である。 上記は、例えば、１〜５時間、水中でまたはアセトン等の有機溶剤中で式Ｉの ポリマーをアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカンと 混合した後、さらに０〜２４時間、上記反応混合物を室温で放置することによっ て行われる。この反応は、室温または高い温度で大気圧で行われる。ジアミノヒ ドロキシアルカンは、架橋反応によって式Ｉのポリマーの無水物群をカルボキシ ル及びアミド基に変換する。同時に、使用される反応条件によって変化する量で 、連結するヒドロキシジアミド鎖におけるヒドロキシル基によっては無水物との さらなる反応によりエステル化されて、相当する「ポリマレイン酸エステル」（ ＶＩ）を形成する。上記反応中または反応後に、場合によっては、未反応の無水 物群を水性媒体中で加水分解により（酸性溶液を添加してｐＨを下げることによ る等）カルボキシル基に変換する。エステル化部分（ＶＩ）を含む混合物はタン パク質を除去する効力があるが、好ましくは約１２〜約３６時間、周囲温度で、 水性アルカリ、好ましくは、例えば、０．０５〜０．５Ｎの水性の水酸化ナトリ ウム等の希釈アルカリ中で消化することにより上記エステル部分を加水分解して 純粋なポリヒドロキシ化合物（Ｖ）を得ることが好ましい。 反応終了後、水相は混合物に添加し、有機相は真空蒸発による等の従来技術に より除去し、残渣を室温で乾燥して、水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリ カルボン酸を得る。水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を用いたタンパク質 の除去方法 本発明のさらなる実施態様としては、有効量の架橋されたポリヒドロキシポリ カルボン酸組成物を水性媒体に加えてタンパク質／ポリヒドロキシポリカルボン 酸組成物マトリックスを形成することからなるタンパク質を含む水性媒体からの そのタンパク質の沈殿方法がある。 水性媒体は、除去されることが望ましいタンパク質を含む希釈されたまたは希 釈されない生物学的液体であり、具体的には、全血、血漿、血 清、リンパ、胆汁、尿、体液(liquid)、髄液、痰、汗等、および便排泄物が挙げ られる。また、細胞培養抽出物またはミルクまたは微生物培養液または植物抽出 物を含む、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳等のヒトまたは他の動物組織の液体調製 物を使用することも可能である。好ましい生物学的液体はヒトの血液及び細菌細 胞のライゼートである。 水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、乳濁液、懸濁 液、溶液または乾燥粉末の形態でタンパク質を含む水性媒体に添加される。 生物学的液体に対する架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の割合 は、目的とする除タンパクの度合いによって異なる。しかしながら、最適な割合 は、タンパク質の濃度、精製されるべき物質の性質や濃度、温度、ｐＨ値および イオン濃度を考慮してそれぞれの場合で決定されるのが好ましい。温度及びｐＨ 値は原則的には重要ではない。しかしながら、温度は、通常、０〜１００℃であ り、実質的に不可逆的なタンパク質の変性が６０℃を超えると起こるので、好ま しくは４℃〜６０℃を超えない範囲である。 架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によるタンパク質の沈殿効率 は温度が高くなると増加すると考えられることに留意する。換言すると、９０％ のタンパク質を除去するためには、６０℃におけるサンプル溶液からの方が３０ ℃における同様のタンパク質溶液からより、より少ない架橋されたポリヒドロキ シポリカルボン酸組成物が必要である。 水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸の添加後のタンパク質含 有水性媒体のｐＨ値はｐＨ約７．５、好ましくはｐＨ約６．５を超えない。 それぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカ ルボン酸の重量による濃度は約３：１から約１：３の割合を有することが好まし い。 架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の使用量は、重量で、通常、 タンパク質を含む水性媒体中に含有すると評価されるそのタンパク質の量と少な くとも等しい。 水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物をタンパク質含有 水性媒体に添加する前に水性媒体自身中に懸濁し、かつＲがＨである場合には、 ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物含有媒体のｐＨは、ｐＨが約６．５を超え ない成分の混合後の媒体を形成するために約３〜約５である。 または、Ｒがフェニルである場合には、架橋されたポリヒドロキシポリカルボ ン酸組成物含有媒体のｐＨは、ｐＨが約７．５を超えない成分の混合後の媒体を 形成するために約５．５〜約７．５である。 水性媒体の除タンパクの度合いは、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸 組成物物質における反応性基の密度によって異なる。反応性基の密度は、十分な 量の結合を保証するために適当な量が存在する際には本発明の操作性には重要で はない。 具体的には、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物物質を生物学的 液体に添加した後、所定時間（通常、５〜１５分）十分接触される（例えば、攪 拌または反転(inversion)によった後放置による）。タンパク質と予め会合した 架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物及びタンパク質のマトリックス からなる得られる水に不溶な相を除去する。このような除去は、相分離（例えば 、遠心、濾過または沈降）に関する既知の従来方法によって行われる。水に不溶 な相の除去により、除タンパクされた上清が得られる。 水に不溶な相の除去を遠心による場合には、遠心は、約５〜１００， ０００ｇで０．２〜１０時間または単位重力(unit gravity)で沈降することによ り行われなければならない。上清をデカンテーションしても微細な物質が失われ ないくらい得られるペレットはきつく充填されるため、超遠心分離速度が好まし く使用される。 本タンパク質の除去方法は物質を抽出するのにも使用され、この場合には、物 質は架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によって沈殿するまたは、 例えば、特定の緩衝液または界面活性剤等の他の抽出剤を用いることによるなど の適当な処理によって沈殿する。上記物質の除去は調製または分析を目的として なされる。緩衝液を用いてマトリックスからタンパク質を分離する際には、１０ 〜６０分間、約８．６〜約９．５のｐＨで緩衝液と共にマトリックスを攪拌(sti rring)、粉砕および／またはかきまぜる(agitating)ことによって達成される。 マトリックスのペレット１容量当たり、約８．６〜約９．５のｐＨで、約１〜約 ５容量の緩衝液を使用する。緩衝液はトリスバッファーであることが好ましい。 マトリックスを界面活性剤などの抽出剤（好ましくは、ラウリル硫酸ナトリウム ）で処理する際には、マトリックスの残留ペレット１容量当たり、約０．５〜約 ２％（ｗ／ｗ）の濃度のラウリル硫酸ナトリウムを約１〜約３容量使用する。 上記段階を行い、沈殿したマトリックスから水に不溶な架橋されたポリヒドロ キシポリカルボン酸組成物を回収する際には、ポリヒドロキシポリカルボン酸組 成物を洗浄して、ｐＨが７．１〜７．５のリン酸緩衝溶液に再懸濁してもよい。 したがって、タンパク質の沈殿方法のさらなる実施態様は、上記回収された架橋 されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を洗浄して、好ましくはｐＨが７． １〜７．５のリン酸緩衝溶液中に再懸濁する段階をさらに行うことである。 上記タンパク質の沈殿方法は、タンパク質が核酸またはその混合物を 含む水性媒体中に存在する際に特に有用である。このようなことは、しばしば、 核酸またはその混合物の源が水性グアニジニウムチオシアネート(guanidinium t hiocyanate)中に懸濁した細胞ライゼートである際に起こる。 除タンパクされた上清（除タンパク後に残った除タンパクされた液体）をさら に加工してもよい。調製を目的として（例えば、ペプチド、糖タンパク質、ステ ロイド、リポイド、核酸、酵素、ホルモン、ビタミン、ウィルス、多糖またはア ルカロイドの精製を目的として）、例えば、精製段階をさらに行ってもよい。こ の場合には、特に、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、セファデックス (Sephadex)、アフィニティーまたは吸着クロマトグラフィー）、濾過（例えば、 限外濾過）、電気泳動（例えば、ブロック、ディスクまたはキャリアー−フリー (carrier-free)電気泳動）、等電点電気泳動及び選択沈殿(selective precipita tion)が好ましい。 本発明の概念を何等制限するものではないが、本出願人は、本発明の理解、即 ち、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物が水性媒体からタンパク質 を除去する機構を説明したい。沈殿性は、水性媒体中の溶解性の機能である。次 に、溶解性はタンパク質の疎水性の度合いを少なくとも一部示すものである。す べてのタンパク質は水性媒体に接触する表面に少なくとも疎水性部分を有する。 本出願人は、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物が異なるタンパク 質分子の疎水性部分が相互に接近してタンパク質が最終的には沈殿する程度まで 凝集させることができると考える。（上記は、より高い温度では溶液からの架橋 されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物のタンパク質除去効率が上昇するこ とにより証明されると考えられる。これに対して、タンパク質の沈殿が他の現象 、例えば、会合／解離、によって起こる場合には、タ ンパク質の沈殿は温度が上昇すると低下すると考えられる。） このようなことが起こり得る前に、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸 組成物は、電荷引力(electrical charge attraction)等の非共有的な相互作用(n on-covalent interaction)によって１つまたはそれ以上のタンパク質分子と会合 する。（架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、例えば、アルギニ ン残基で等、すべてのタンパク質分子中の様々な点に存在する部分的な陽電荷と 相互作用できる多くの陰電荷を有する。）表面疎水性基により課された水の位置 的な順序は熱力学的に好ましくない。結合水は、これらの無極性である疎水性基 が互いに相互作用し凝集すると、放出される。したがって、柔軟性のある架橋さ れたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物と相互作用した２つまたはそれ以上の タンパク質がストリング上のビーズ様である際には、組成物−ストリングはこの ような異なるタンパク質−ビーズの無極性部分を包んで凝集する。凝集したタン パク質分子の数または大きさが十分大きい場合には、タンパク質−組成物複合体 は沈殿する。 下記実施例は本発明を詳細に説明するものであるが、本発明を何等制限するも のではない。 実施例１ 水に不溶な沈殿剤の調製（部分的にエステル化された材料（ＶＩ）及び脱エステ ル化された材料（Ｖ）の混合物） １００ｇ（０．０６３モル）のアトケム インコーポレイテッド(Atochem Inc .)、マルヴァーン、ペンシルバニア州(Malvern，PA)から得られたスチレンマレ イン酸無水物共重合体（エスエーエム^R レジン １０００エー(SAM^RResin 1000 A)）を１リットルのアセトンに溶解する。この溶液に、１７．５ｇ（０．１９４ モル）の１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（アルドリッヒ ケミカル カンパニー(Aldrich C hemical Company)、ミルウォーキー、ウィスコンシン州(Milwaukee，Wisconsin) ）を１リットルのアセトンに溶解した第二の溶液を、３．５時間、常時攪拌しな がら、５．０ｍｌ／分の速度で添加する。 次に、この反応混合物を室温で１２時間放置する。反応終了後、３リットルの 水を攪拌しながら加えた後、ポリマーを単位重力(unit gravity)下で沈降させる 。水性有機相をデカンテーションにより除去する。架橋されたポリマーを１リッ トルのＨ₂Ｏに懸濁し、ギフォード ウッド ホモゲナイザー(Gifford Wood hom ogenizer)（中程度のセッティング）を用いて１分間粉砕する。さらに、懸濁液 のｐＨを塩酸を添加することによって１．５に調節する。１時間後、ｐＨを水酸 化ナトリウムで９．０に調節し、混合物を３０分間攪拌する。続いて、ｐＨを７ ．０に調節して上清を捨てる。さらに、ポリマーをｐＨ７．２のリン酸緩衝溶液 ０．０１Ｍで洗浄し、最終的には上記緩衝液中に懸濁して、５．０％（ｗ／ｖ） の懸濁液を得る。これにより、ポリヒドロキシ材料（Ｖ）及びポリマレイン酸エ ステル材料（ＶＩ）の混合物が得られる。 ＲがＨ、炭素原子数１〜４の低級アルキレンまたは低級アルコシキであるポリ ヒドロキシポリカルボン酸組成物を、スチレンマレイン酸無水物ポリマーの代わ りにエチレンマレイン酸無水物ポリマー（例えば、モンサント ケミカル カン パニー(Monsanto Chemical Co.)、セントルイス、ミズリー州(St．Louis，Mo)か らの「ＥＭＡ−２１」）；アルファ−メチル−エチレンマレイン酸無水物ポリマ ー；またはアルファ−メトキシ−エチレンマレイン酸無水物ポリマーをそれぞれ 用いる以外は、上記と同様の段階に従って作製する。 炭素原子数２の架橋部分を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１ ，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わりに１，２−ジアミノ−１−ヒ ドロキシエタン等のジアミノヒドロキシエタンを用い る以外は、上記と同様の段階に従って形成する。架橋部分が複数のヒドロキシル 基を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２−ヒ ドロキシプロパンの代わりに１，２−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシエタンを 用いることによって、上記と同様の段階に従って形成する。 複数のヒドロキシル基を有する炭素原子数３の架橋部分を有するポリヒドロキ シポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わ りに１，３−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシプロパンまたは１，３−ジアミノ −１，２，３−トリヒドロキシプロパン等の１，３−ジアミノ−ジ−または１， ３−ジアミノ−トリ−ヒドロキシプロパンを用いる以外は、上記と同様の段階に 従って形成する。 炭素原子数４の架橋部分を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１ ，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わりに１，４−ジアミノ−３−ヒ ドロキシブタンまたは１，４−ジアミノ−１−ヒドロキシブタン等のアルファ、 オメガ−ジアミノ−モノ−ヒドロキシ−ｎ−ブタンを用いる以外は、上記と同様 の段階に従って形成する。架橋部分が１超のヒドロキシル基を有するポリヒドロ キシポリカルボン酸組成物は、アルファ、オメガ−ジアミノ−モノ−ヒドロキシ −ｎ−ブタンの代わりに１，４−ジアミノ−２，３−ジヒドロキシブタンまたは １，４−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシブタン；１，４−ジアミノ−１，２， ３−トリヒドロキシブタン；及び１，４−ジアミノ−１，２，３，４−テトラヒ ドキシブタン等の１，４−ジアミノ−ジ−、１，４−ジアミノ−トリ−または１ ，４−ジアミノ−テトラ−ヒドロキシブタンを用いる以外は、上記と同様の段階 に従って形成する。 実施例２ 水に不溶な沈殿剤の脱エステル化（部分的にエステル化された材料（Ｖ Ｉ）及び脱エステル化された材料（Ｖ）の混合物） ５．０％（重量／容積）の懸濁濃度で緩衝液中に懸濁された実施例１で形成さ れたポリヒドロキシポリカルボン酸混合組成物を、３０００×ｇで１０分間遠心 し、懸濁した緩衝液を捨てる。次に、ペレットを脱イオン水に分散させて、５． ０％（ｗ／ｖ）の懸濁液を得た。等容の０．２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を攪 拌しながらポリマー懸濁液にゆっくり添加した。さらに、このアルカリ性の混合 物を２４時間室温で放置した。続いて、遊離塩基を繰り返し遠心し脱イオン水で 洗浄することによって除去した（上清中）。続いて、ポリマーをｐＨ７．２の０ ．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化して、５．０（ｗ／ｖ）のポリマー懸濁液を得た 。これにより、ポリマレイン酸エステル材料（ＶＩ）を含まないポリヒドロキシ 材料（Ｖ）が得られる。 上記方法に従って、ポリヒドロキシ材料（Ｖ）と混合したポリマレイン酸エス テル材料（ＶＩ）が精製できる。これは、下記源由来の材料を用いて行ってもよ い。 ＲがＨ、炭素原子数１〜４の低級アルキレンまたは低級アルコシキであるポリ ヒドロキシポリカルボン酸組成物を、スチレンマレイン酸無水物ポリマーの代わ りにエチレンマレイン酸無水物ポリマー（例えば、モンサント ケミカル カン パニー(Monsanto Chemical Co.)、セントルイス、ミズリー州(St．Louis，Mo)か らの「ＥＭＡ−２１」）；アルファ−メチル−エチレンマレイン酸無水物ポリマ ー；またはアルファ−メトキシ−エチレンマレイン酸無水物ポリマーをそれぞれ 用いる以外は、上記と同様の段階に従って作製する。 炭素原子数１の架橋部分を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１ ，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わりにジアミノヒドロキシメタン を用いる以外は、上記と同様の段階に従って形成する。 炭素原子数２の架橋部分を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１ ，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わりに１，２−ジアミノ−１−ヒ ドロキシエタン等のジアミノヒドロキシエタンを用いる以外は、上記と同様の段 階に従って形成する。架橋部分が複数のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシ ポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わり に１，２−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシエタンを用いることによって、上記 と同様の段階に従って形成する。 複数のヒドロキシル基を有する炭素原子数３の架橋部分を有するポリヒドロキ シポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わ りに１，３−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシプロパンまたは１，３−ジアミノ −１，２，３−トリヒドロキシプロパン等の１，３−ジアミノ−ジ−または１， ３−ジアミノ−トリ−ヒドロキシプロパンを用いる以外は、上記と同様の段階に 従って形成する。 炭素原子数４の架橋部分を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１ ，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの代わりに１，４−ジアミノ−３−ヒ ドロキシブタンまたは１，４−ジアミノ−１−ヒドロキシブタン等のアルファ、 オメガ−ジアミノ−モノ−ヒドロキシ−ｎ−ブタンを用いる以外は、上記と同様 の段階に従って形成する。架橋部分が１超のヒドロキシル基を有するポリヒドロ キシポリカルボン酸組成物は、アルファ、オメガ−ジアミノ−モノ−ヒドロキシ −ｎ−ブタンの代わりに１，４−ジアミノ−２，３−ジヒドロキシブタンまたは １，４−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシブタン；１，４−ジアミノ−１，２， ３−トリヒドロキシブタン；及び１，４−ジアミノ−１，２，３，４−テトラヒ ドキシブタン等の１，４−ジアミノ−ジ−、１，４−ジアミノ−トリ−または１ ，４−ジアミノ−テトラ−ヒドロキシブタンを用いる 以外は、上記と同様の段階に従って形成する。 実施例３ 実施例１に従って作製されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物（Ｖ及びＶ Ｉ）について、下記表１に列挙された様々な材料の沈降能を評価する。表１に列 挙されたすべての材料（ヒト血清アルブミンからプラスミドＤＮＡ由来まで）は 、シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Company)、セント ルイス、 ミズリー州(St．Louis，Missouri)から粉末または粒子の形態で得られる。 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を３３ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７．３〜７．５ を有する０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝０．９％溶液(sodium phosphate bu ffered 0.9% saline)中に溶解する。（残りの化合物；ヒトγグロブリンからプ ラスミドＤＮＡも同様にして表１に示される濃度で同様のリン酸緩衝溶液に溶解 する。）各タンパク質の等電点（ｐＩ）さらには炭水化物の割合（％Ｃａｒｂ． ）を表１に示す。 ５％重量／容積の実施例１で作製されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物 の溶液もまた、リン酸ナトリウム緩衝溶液を用いて作製する。 １容量の架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物（「除タンパク剤」 ）を１、２または４等容のサンプル溶液と合わせる。それぞれの組合わせの溶液 を反転(inversion)により混合し、室温で５〜１５分間放置する。次に、各溶液 を２，０００×ｇで１０分間遠心して、タンパク質−ポリヒドロキシポリカルボ ン酸組成物マトリックスを除去する。それぞれの残った上清からのタンパク質の 除去率（％）を紫外線吸収（２８０ｎｍでの）または比色測定（ピアース カン パニー(Pierce Company)、ロックヴィレ、イリノイ州(Rockville，IL)の「ビー シーエー プロテイン アッセイ リージェント(BCA Protein Assay Reagent) 」を用いた）によって測定する。タンパク質の除去率（％）（「％除去」） を、すべての３種類の容量の組合わせによる各サンプルに関して表１に示す。 タンパク質としての、ヒト血清アルブミン、ヒトγグロブリン、ヘモグロビン 、トランスフェリン及びシトクロムＣは、すべて、架橋されたポリヒドロキシポ リカルボン酸組成物によって９０％以上のレベルで除去される。上記タンパク質 は、低レベルのこれらのタンパク質と会合した炭水化物を均一に有する。これに 対して、Ａ１酸糖タンパク質(A1 acid glycoprotein)、西洋ワサビのペルオキシ ダーゼ及びフェチュインはそれぞれ、実質的な量の炭水化物を有するので、「％ 除去」はより低い。最後に、表１の２つのＤＮＡサンプルにより示されるように 、非タンパク質性材料は架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によっ ては沈殿しにくい。 実施例４ 実施例２に従って調製された部分的にエステル化された材料（ＶＩ）及び脱エ ステル化された材料（Ｖ）の懸濁液の２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）濃度で、実施例 ３の試験を繰り返した。 実施例５ ヒト血清アルブミン及びヒトγグロブリンの２溶液を、それぞれ、実施例３に 従って作製する（即ち、ｐＨ７．３〜７．５で０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩 衝０．９％溶液において、それぞれ、３３及び２５ｍｇ／ｍｌ）。また、実施例 １に従って作製された架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の５％（ 重量／容積）溶液を調製する。 第一のヒト血清アルブミン及びヒトγグロブリン溶液を室温（約２０℃）に維 持して、第二のそれぞれの上記溶液を６０℃に加熱して同温度で維持する。次に 、架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物溶液を、タンパク質サンプル の容積に対して１／４の容積で「除タンパク剤」として４つのタンパク質溶液の それぞれに添加する。 実施例２と同様にして測定されたタンパク質の除去効率の結果を下記表３に示 す。 実施例６ 前記実施例５の実験を、実施例２で製造された脱エステル化物質（Ｖ）を２． ５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリマー濃度で用いて繰り返した。サンプルに対するポ リマーの割合は１／５であった。結果を下記表４に要約する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．初期に仕込まれたポリ（アルキレンマレイン酸無水物）に対する初期に仕込 まれたジアミノヒドロキシアルカンの割合が１モル／モルに対して約１〜約２０ ０である、下記式のポリマーを： ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｑは７〜１０，０００の整数である、 下記式のアルファ、オメガ ジアミノヒドロキシアルカンで： ただし、ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である、 架橋し、未反応の無水物群を加水分解することによって得られる水に不溶な架橋 されたポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料。 ２．請求の範囲第１項に記載の生成物を水性アルカリで処理することによって得 られる生成物。 ３．ポリ（アルキレンカルボン酸）ストランドへの架橋の割合が２に対して約１ 〜約２００である、それぞれが下記式ＩＩＩのストランド骨格を有する少なくと も２つのストランドを有するポリヒドロキシポリカルボン酸からなる群より選ば れた、請求の範囲第１項に記載の水に不溶な 架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料： ただし、各ストランドにおける少なくとも１つのマレオイル部分の一方のカルボ ニル基は、 −ＨＮ．［（Ｈ）_p（ＣＨ）_z．（ＯＨ）_m］．ＮＨ−部分 に共有結合して、下記式： および ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｙはｍまでの整数であり、 ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である、 の架橋部分、および式ＩＩＩの骨格に相当する無水物とのこれらのエステルを生 じさせる。 ４．ポリ（アルキレンカルボン酸）ストランドへの架橋の割合が２に対して約１ 〜約２００である、それぞれが下記式ＩＩＩのストランド骨格を有する少なくと も２つのストランドを有する水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン 酸： ただし、各ストランドにおける少なくとも１つのマレオイル部分の一方のカルボ ニル基は、 −ＨＮ．［（Ｈ）_p（ＣＨ）_z．（ＯＨ）_m］．ＮＨ−部分 に共有結合して、下記式： ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である、 の架橋部分を少なくとも１つ生じさせる。 ５．初期に仕込まれたポリ（アルキレンマレイン酸無水物）に対する初期に仕込 まれたジアミノヒドロキシアルカンの割合が１モル／モルに対して約１〜約２０ ０である、下記式のポリマーを： ただし、Ｒは水素または炭素原子数１〜４の低級アルキレン若しくは低級アルコ シキ、またはフェニルであり、 ｑは、７〜１０，０００の整数である、 下記式のアルファ オメガ ジアミノヒドロキシアルカンで： ただし、ｚは１〜４の整数であり、 ｐは０またはｚ−１までの整数であり、 ｍは１またはｚまでの整数である、 架橋し、未反応の無水物群を加水分解することからなる、請求の範囲第３項に記 載の水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料の製造方法。 ６．希釈水性アルカリで請求の範囲第３項に記載の混合物を処理するこ とからなる、請求の範囲第４項に記載の水に不溶な架橋されたポリヒドロキシポ リカルボン酸の製造方法。 ７．有効量の請求の範囲第３項に記載のポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料 を水性媒体に加えてタンパク質／ポリヒドロキシポリカルボン酸マトリックスを 形成することからなる、タンパク質を含む水性媒体からのそのタンパク質の沈殿 方法。 ８．有効量の請求の範囲第４項に記載のポリヒドロキシポリカルボン酸を水性媒 体に加えてタンパク質／ポリヒドロキシポリカルボン酸マトリックスを形成する ことからなる、タンパク質を含む水性媒体からのそのタンパク質の沈殿方法。 ９．ポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料の使用量が、重量で、タンパク質を 含む水性媒体中に含有すると評価されるそのタンパク質の量に少なくとも等しい 、請求の範囲第７項に記載の方法。 １０．ポリヒドロキシポリカルボン酸の使用量が、重量で、タンパク質を含む水 性媒体中に含有すると評価されるそのタンパク質の量に少なくとも等しい、請求 の範囲第８項に記載の方法。 １１．ポリヒドロキシポリカルボン酸含有材料が水性媒体中で使用される、請求 の範囲第７項に記載の方法。 １２．ポリヒドロキシポリカルボン酸が水性媒体中で使用される、請求の範囲第 ８項に記載の方法。 １３．それぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボ ン酸含有材料の重量による濃度が約３：１から約１：３の割合を有する、請求の 範囲第１１項に記載の方法。 １４．それぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボ ン酸の重量による濃度が約３：１から約１：３の割合を有する、請求の範囲第１ ２項に記載の方法。 １５．それぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボ ン酸含有材料の重量による濃度が実質的に等しい、請求の範囲第１３項に記載の 方法。 １６．それぞれの水性媒体におけるタンパク質の及びポリヒドロキシポリカルボ ン酸の重量による濃度が実質的に等しい、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７．Ｒが水素であり、かつ、ポリヒドロキシポリカルボン酸含有媒体のｐＨが ｐＨが約６．５を超えない成分の混合後の媒体を形成できるように約３〜約６． ２の間である、請求の範囲第７項に記載の方法。 １８．Ｒが水素であり、かつ、ポリヒドロキシポリカルボン酸含有媒体のｐＨが ｐＨが約６．５を超えない成分の混合後の媒体を形成できるように約３〜約６． ２の間である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １９．Ｒがフェニルであり、かつ、ポリヒドロキシポリカルボン酸含有媒体のｐ ＨがｐＨが約７．５を超えない成分の混合後の媒体を形成できるように約５．５ 〜約７．５の間である、請求の範囲第７項に記載の方法。 ２０．Ｒがフェニルであり、かつ、ポリヒドロキシポリカルボン酸含有媒体のｐ ＨがｐＨが約７．５を超えない成分の混合後の媒体を形成できるように約５．５ 〜約７．５の間である、請求の範囲第８項に記載の方法。 ２１．反応混合物を遠心してペレットとしてマトリックスを回収する段階からさ らになる、請求の範囲第７項に記載の方法。 ２２．反応混合物を遠心してペレットとしてマトリックスを回収する段階からさ らになる、請求の範囲第８項に記載の方法。 ２３．マトリックスを約８．６から約９．５のｐＨで緩衝液により処理すること からなるタンパク質を変性させずに請求の範囲第７項に記載の マトリックスからタンパク質を分離する方法。 ２４．マトリックスを約８．６から約９．５のｐＨで緩衝液により処理すること からなるタンパク質を変性させずに請求の範囲第８項に記載のマトリックスから タンパク質を分離する方法。 ２５．マトリックスのペレット１容量当たり、約８．６〜約９．５のｐＨで、約 １〜約５容量の緩衝液を使用する、請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２６．緩衝液がトリスバッファーである、請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２７．マトリックスをラウリル硫酸ナトリウム水溶液で処置することからなる、 回収すべき請求の範囲第７項に記載のマトリックスからポリヒドロキシポリカル ボン酸含有材料を分離する方法。 ２８．マトリックスをラウリル硫酸ナトリウム水溶液で処置することからなる、 回収すべき請求の範囲第８項に記載のマトリックスからポリヒドロキシポリカル ボン酸含有材料を分離する方法。 ２９．予めラウリル硫酸ナトリウム溶液で処置したマトリックスを遠心し、さら に残留ペレットからポリヒドロキシポリカルボン酸を回収する段階をさらに含む 、請求の範囲第２３項に記載の方法。 ３０．マトリックス残留ペレット１容量当たり約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）の間 の濃度のラウリル硫酸ナトリウムを約１〜約３容量使用する、請求の範囲第２３ 項に記載の方法。 ３１．回収したポリヒドロキシポリカルボン酸残渣を洗浄し、リン酸緩衝溶液中 に再懸濁する段階をさらに含む、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ３２．７．１〜７．５のｐＨでリン酸緩衝溶液を用いることからなる、請求の範 囲第２６項に記載の方法。 ３３．タンパク質を含有する水性媒体がさらに核酸またはその混合物を含む、請 求の範囲第７項に記載の方法。 ３４．タンパク質を含有する水性媒体がさらに核酸またはその混合物を含む、請 求の範囲第８項に記載の方法。 ３５．核酸またはその混合物の源が水性グアニジニウムチオシアネートに懸濁し た細胞ライゼートである、請求の範囲第２８項に記載の方法。