CZ268096A3

CZ268096A3 - Composition based on cross-linked water-insoluble polycarboxylic acids

Info

Publication number: CZ268096A3
Application number: CZ962680A
Authority: CZ
Inventors: John Krupey
Original assignee: Ligochem Inc
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1994-03-14
Publication date: 1997-03-12
Also published as: JPH10500435A; WO1995025132A1; DE69411038T2; NZ263929A; DE69411038D1; EP0750644B1; EP0750644A1; AU6519394A; AU690111B2; US5453493A

Description

o co* ;X CO' CD

O C/X ; r£ i ar •°‘í w * * ' É

I

Kompozice na bázi zesítěnýeh^palykaEbonových kýselinf, nerozpustné ve vodě

Oblast techniky

Tento vynález se týká kompozice na bázi zesítěné polykarboxylové kyseliny, nerozpustné ve vodě. Tento vynález spadá obzvláště do oblasti odstraňování proteinů z vodného prostředí srážením.

Dosavadní stav techniky

Proteiny se obvykle odstraňují z vodného prostředí za použití reakčních činidel nebo tepla. Určitá rozpouštědla (chloroform, močovina) děnaturují protein a jsou příčinou jeho srážení. Podobně zvýšení hladiny elektrolytu v prostředí na vysoký stupeň přidáním solí také sráží proteiny. Kromě toho teplo nezpůsobuje pouze denaturaci, ale obecně koaguluje protein a tak způsobuje odstranění proteinu z vodného prostředí.

Jsou tři hlavní nevýhody těchto metod odstraňování proteinů. Za prvé, materiálem, který se odstraňuje z prostředí/ není jen čistě protein. Mimo to, pokud prostředí obsahuje komplexní směs chemických sloučenin, jako pokud je prostředím lyzát buněk, použití těchto metod může být příčinou odstranění jiných materiálů, kromě proteinů. Za druhé, proteiny odstraňované těmito metodami se obvykle nevratné děnaturují nebo jsou denaturovatělně pouze způsoby náročnými na čas, jako je dialýza. Za třetí, jak izolace, tak čištění proteinů obvykle zahrnuje použití poněkud toxických rozpouštědel (fenol a/nebo chloroform). 2

Tyto problémy se pokouší překonat polymerní látka popsaná v US patentu č. 4 421 653. Tato látka, derivát polyethylenmaleinanhydridu zesítěného diaminem, však vyžaduje použít až 9 objemů, za účelem deproteinace, na jediný objem krevního sera. Tento veliký přebytek "deproteinizačního přípravku" ukazuje na svou nízkou účinnost a projevuje se svými nežádoucí náklady při průmyslových procesech. Kromě toho tato základní hmota bude srážet proteiny v alkalické oblasti (to znamená při hodnotě pH 10), co skýtá desorpci požadovaného proteinu ze základní hmoty velmi obtížně za mírné alkalických podmínek.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje soubor kompozic na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny nerozpustné ve vodě, získaných zesítěním polymeru obecného vzorce I (- ch2 R 1 CH — CH — 1 CH - 1 1 0 = C 1 C = 0 (I) \ / o ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl a q představuje celé číslo od 7 do 10 000, 3

α ,οο-diaminohydroxyalkanem obecného vzorce II H2N.[(H)p(CH)z.(0H)m].NH2 (II), ve kterém z znamená celé číslo od Ido 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, a hydrolýzou nezreagovaných anhydridových skupin, přičemž poměr počátečního množství diaminohydroxyalkanu k počátečnímu množství poly(alkylenmaleinanhydridu) je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 1, uvedeno molárně.

Tyto kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarbo-xylové kyseliny obsahují alespoň dva řetězce, z nichž každý má řetězcovou kostru vzorce III

R - CH2 i i

CH ~ CH

\

(III)

ve kterém jedna karbonylová skupina alespoň jedné meziřetěz cové maleoylové části v každém řetězci je kovalentně vázána k části vzorce IV (IV) , -HN.((H)p(CH)2.(OH)m]·NH- 4

aby se dosáhlo přítomnosti alespoň jedné meziřetězcově zesíténé části vzorce V R I CH ~ CH ~ 1 CH- 1 o II - o- 1 C = 0 1 (V) HN 1 OH Hp" [ CH ] z [OH]m HN 1 OH 1 1 0 = C 1 - n- II o CH - CH — CH-

I

R ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl, z znamená celé číslo od 1 do 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, přičemž poměr příčného zesíténí k řetězcům poly(alkylen-karboxylové kyseliny) je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 2. V produktu reakce polymeru obecného vzorce I s hydro-xydiaminem obecného vzorce II je také přítomen odpovídající "poly(ester kyseliny maleinové)", u kterého se předpokládá, * 5

že má obecný vzorec VI - CHj -CH - CH — CH" (“ cí*2 - CH — CH — CH- í ! 1 1 = c c s o 1 0 = C c= ! ! 1 j í HN OH ------- ,-ι «π.-- ( OH ] m-y HN OH 1 (VI) 1 * C -Ο Ι o

! I

- CH

, - CH - CH — CH

I ve kterém y představuje celé číslo až do hodnoty m a ostatní symboly mají význam uvedený výše.

Zde nalezený způsob přípravy kompozic na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny vyžaduje zesítění polymeru obecného vzorce I α,οο-diaminohydroxyalkanem obecného vzorce II a hydrolýzu nezreagovaných anhydridových skupin kyselinou, aby se dostala směs sloučenin obecného vzorce V a obecného vzorce VI.

Tento póly(ester kyseliny maleinové) obecného vzorce VI se může snadno hydrolýzovat zpět na základní polyol obecného vzorce V zpracováním se silnou bází za mírných podmínek, účelně zpracováním se zředěným vodným roztokem alkalické sloučeniny za teploty místnosti po dobu několika hodin, výhodně alespoň přes noc. Hydrolýza směsi za 6 alkalických podmínek poskytuje v podstatě čistou sloučeninu obecného vzorce V.

Obě tyto kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypoly-karboxylové kyseliny skýtají způsob srážení proteinu z vodného prostředí, které je obsahuje. Tento způsob spočívá v přidání takového účinného množství kompozic zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, aby se dostala základní hmota obsahující kompozici zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny s proteinem. Sloučeniny obecného vzorce V jsou však v podstatě účinnější než směsi, které obsahují odpovídající estery. Účelně použité hmotnostní množství kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny je přinejmenším rovno odhadovanému množství proteinu, který je obsažen ve vodném prostředí s jeho obsahem. Kromě toho je žádoucí, aby se použila kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny ve vodném prostředí. Bylo nalezeno, že v tomto stupni srážení je vhodné, aby hmotnostní koncentrace proteinu a kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny ve svých vodných prostředích měla poměr od přibližně 3:1 do zhruba 1:3, přičemž je obzvláště výhodné, pokud jsou hmotnostní koncentrace proteinu a kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny ve svých vodných prostředích v podstatě ekvivalentní.

Skutečný způsob srážení je však poněkud závislý na hodnotě pH v dosti širokém rozmezí. Tak pokud R znamená atom vodíku, je žádoucí, aby hodnota pH prostředí obsahujícího kompozici na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny byla od přibližně 3 do zhruba 6,2, za předpokladu, že hodnota pH prostředí po smíchání složek nebude převyšovat přibližně 6,5. Obdobně, pokud R znamená fenyl, je žádoucí, aby hodnota pH prostředí obsahujícího polyhydroxypolykarboxy- 7 lovou kyselinu byla od přibližně 5,5 do zhruba 7,5, za předpokladu, že hodnota pH prostředí po smíchání složek nebude převyšovat přibližně 7,5.

Poté co došlo ke srážecí reakci, je žádoucí odstředit reakční směs, aby se z ní dostala základní hmota ve formě pelet.

Oddělení proteinu ze základní hmoty bez denaturace tohoto proteinu se může provádět zpracováním této základní hmoty s pufrem při hodnotě pH od přibližně 8,6 do zhruba 9,5. Účelně se používá přibližně 1 až zhruba 5 objemů pufru, o hodnotě pH od přibližné 8,6 do zhruba 9,5, na objem pelet základní hmoty. I když tento vynález není tím omezen, vynikající výsledky se mohou dosáhnout, pokud pufrem je Tris pufr.

Způsob je také obzvláště vhodný k oddělování nukleové kyseliny z kapalin, které obsahují jak protein, tak nukleovou kyselinu. V takových případech zdrojem nukleových kyselin nebo jejich směsí je často buněčný lyzát, který je suspendován ve vodném guanidiniumthiokyanátu.

Podle jiného provedení se kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny mohou získat ze základní hmoty určené k jejímu získání tím, že se základní hmota zpracuje s vodným roztokem laurylsulfátu sodného a potom, pokud je to žádoucí, reakční směs se odstředí a polyhydroxy-polykarboxylová kyselina se získá z výsledných pelet nebo jako takové pelety. Při způsobu, při kterém je protein denaturován, se používá přibližné 1 až zhruba 3 objemů laurylsulfátu sodného δ ο koncentraci od přibližně 0,5 do zhruba 2 % (hmotnost/ /hmotnost) na objem výsledných pelet. Potom, pokud je to žádoucí, zahrne se další stupeň promývání získaného zbytku polyhydroxypolykarboxylové kyseliny a opětovného suspendování v pufru, kde pokud R znamená fenyl, použije se fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem, účelně při hodnotě pH od 7,1 do 7,5. Při jiném provedení, kde R znamená atom vodíku, používá se acetátový pufr o hodnotě pH 4 až 4,5.

Popis výhodných provedeni

Kompozice na bázi zesítěné polyhydroxykarboxylové kyseliny

Tento vynález zahrnuje kompozici z hmoty vytvořené zesítěním polymeru obecného vzorce I

R

I (- CH2 - CH ~ CH---CH - » i 0 = C Č = 0 ) (I) \ / o

a ,<M-diaminohydroxyalkanem obecného vzorce II H2N.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH2 (II).

Symboly atomů znázorněných v závorkách v obecném vzorci I představují opakující se jednotku polymeru a q představuje počet takových jednotek v polymeru před zesítěním polymeru diaminohydroxyalkanem. Jednotky, které jsou představované symbolem q, se mohou měnit od 7 do 10 000. R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo 9 nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl.

Je výhodné, pokud symbol R v obecného vzorce I představuje atom vodíku. Takový polymer, ve kterém q znamená číslo od 120 do zhruba 250, se může získat od společnosti Monsanto Chemical Co., St. Luis, Missouri, USA, pod označením EMA (kopolymer ethylenu s anhydridem kyseliny maleinové). Výhodný je také polymer obecného vzorce I, ve kterém R představuje methoxyskupinu. Takový polymer, ve kterém q je číslo od přibližné 100 do zhruba 600, se může získat pod jménem Gantrez AN od GAF Copr., Chemical Division, Wayne, New Jersey, USA. Také výhodný je polymer obecného vzorce I, ve kterém R znamená methenyl, ethenyl, methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu. V obecného vzorce II z znamená celé číslo od 1 do 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1 a m znamená 1 nebo celé číslo až do z. Je třeba vzít v úvahu, že každá skupina vzorce (CH) v obecném vzorci II má k sobě připojenu bud jednu nebo žádnou hydroxyskupinu. Všechny zesítbující části obsahují alespoň jednu hydroxyskupinu a mohou obsahovat až jednu hydroxyskupinu na skupinu vzorce (CH) v zesítujícím řetězci, to znamená až z hydroxyskupin mezi dvěma amidovými skupinami. α,οο-Diaminohydroxyalkany jako sloučeniny obecného vzorce II jsou obchodně dostupné, například 1,3-diamino-2--hydroxypropan lze získat od Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA.

Jakékoli anhydridové skupiny, které jsou i nadále v zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyselině nerozpustné ve vodě, jsou hydrolýzovány. 10 V kompozici na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylo-vé kyseliny, která je nerozpustná ve vodě, je poměr původně vneseného diaminohydroxyalkanu k původně vnesenému poly-(alkylenmaleinanhydridu) od přibližně 1 do zhruba 200 ku 1, uvedeno molárné.

Při dalším provedení, zesítěná polyhydroxypolykarboxy-lová kyselina, která je nerozpustná ve vodě, obsahuje alespoň dva řetězce, z nichž každý má řetězcovou kostru vzorce III i - CH2 - CH — CH — CH - (III)

I I i i 0 = C C = 0 \ /

ve kterém jedna karbonylová skupina alespoň jedné maleoylové části v každém řetězci je kovalentně vázána k a,<»-diamino-hydroxyalkylové části vzorce IV “HN.[(H)p(CH)z·(OH)m 3·NH- (IV).

To vede k přítomnosti alespoň jedné zesítěné části vzorce V 11 R 1 - CH — CH — 1 CH- 1 o u - o- - ΟΙ! O (V) HN 1 1 OH Hp” [ CH ] 1 [0H]W HN OH 1 i 0 = C 1 1 C = 0 1 - CH - CH — 1 1 CH- 1 R Symboly R, p, z a m mají stejné významy, jako v obec ných vzorcích I a II uvedených výše. Poměr zesítění k řetězcům póly(alkylenkarboxylové kyseliny) v obecném vzorci V je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 2 (1:2 až 200:2).

Způsob přípravy kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypoly-karboxylové kyseliny Při dalším provedení tohoto vynálezu způsob přípravy kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny vyžaduje zesítění polymeru obecného vzorce I α,οο-diaminohydroxyalkanem obecného vzorce II a hydrolýzu nezreagovaných anhydridových skupin. Do reakční nádoby se vnese objem póly(alkylenmaleinanhydridu) přizpůsobený polymeru obecného vzorce I. Do reakční nádoby se také přidá příslušný objem α,οο-diaminohydroxyalkanu obecného vzorce II. Poměr na počátku vneseného diaminohydroxyalkanu k na počátku vnesenému poly(alkylenmaleinanhydridu) činí od přibližně 1 do zhruba 200 ku 1, uvedeno molárně. 12

Tento způsob se provádí výhodně mícháním polymeru obecného vzorce I s a ,°o-diaminohydroxyalkanem ve vodě nebo v organickém rozpouštědle, jako je aceton, po dobu 1 až 5 hodin a potom se reakční směs nechá stát po dobu 0 až 24 hodin za teploty místnosti. Reakce se může provádět za atmosférického tlaku za teploty místnosti nebo při zvýšené teplotě. Diaminohydroxyalkan konvertuje zesítující reakcí anhydridové skupiny polymeru obecného vzorce I na karboxysku-piny a amidové skupiny. Současně, v závislosti na použitých reakčních podmínkách, se určitá část hydroxyskupin, vázaných na hydroxydiamidový řetězec, esterifikuje další reakcí s anhydridem za vzniku odpovídajícího "póly(esteru raaleinové kyseliny)" obecného vzorce VI. Současně nebo po této reakci se nezreagované anhydridové skupiny konvertují na karboxysku-piny, čehož se dosahuje hydrolýzou ve vodném prostředí (jako přídavkem roztoku kyseliny, ke snížení hodnoty pH). I když směs obsahující esterifikované části obecného vzorce VI je účinná k odstranění proteinů, je výhodné hydrolýzovat tyto esterové části digescí ve vodném roztoku alkalické sloučeniny, účelně ve zředěném roztoku alkalické sloučeniny, například v 0,05 až 0,5-normálním vodném roztoku hydroxidu sodného, výhodně za teploty místnosti po dobu přibližné 12 až 36 hodin, aby se dostala čistá polyhydroxysloučenina obecného vzorce V.

Poté co je reakce ukončena, může se přidat vodná fáze ke směsi, organická fáze se odstraní obvyklým způsobem, jako odpařením za sníženého tlaku a odparek se vysuší za teploty místnosti, aby se dostala zesítěná polyhydroxypolykarboxylová kyselina, která je nerozpustná ve vodě.

Způsob odstranění proteinu za použití kompozice na bázi zesíténé polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, která je 13 nerozpustná ve vodě

Dalším provedením tohoto vynálezu je způsob srážení proteinu z vodného prostředí s jeho obsahem, který spočívá v přidání účinného množství kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny do vodného prostředí, aby se dostala základní hmota s obsahem proteinu a kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny.

Vodným prostředím může být zředěná nebo nezředěná biologická tekutina obsahující požadovaný protein, který má být odstraněn, a zahrnuje takové tekutiny, jako je úplná krev, plasma, sérum, lymfa, žluč, moč, kapalina, míšní mok, slina, pot a podobně, stejně jako vylučovaná stolice. Je také možné, aby se použilo tekutých preparátů z lidské tkáně nebo tkáně jiných živočichů, jako jsou kosterní svaly, srdce, ledviny, plíce, mozek včetně extraktů buněčné kultury, mléko nebo tekutiny z mikrobiologické kultury nebo rostlinné extrakty. Výhodné biologické tekutiny jsou lidská krev a bakteriální buněčné lyzáty.

Kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které jsou nerozpustné ve vodě, se mohou přidat k vodnému prostředí, které obsahuje protein ve formě emulze, suspenze, roztoku nebo suchého prášku.

Poměr kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny k biologické tekutině se může měnit podle stupně požadovaného odstranění proteinů. Optimální poměr se však výhodně stanoví v každém případě s ohledem na koncentraci proteinů, povahu a koncentraci látky určené k vyčištění, teplotu, hodnotu pH a koncentraci ionů. Teplota a hodnota pH jsou hlavní, avšak nikoli kritické veličiny. 14

Teplota však obecně leží mezi 0 a 100 °C, výhodně je od 4 °C až do 60 °C, avšak nikoli nad touto teplotou, ježto nad touto teplotou nastává podstatná nevratná denaturace.

Je třeba poznamenat, že účinnost srážení dosahovaná pomocí kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny se ukazuje vyšší při vyšších teplotách. Uvedeno jinými slovy, méně kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny je vyžadováno k odstranění 90 % proteinu z roztoku vzorku za teploty 60 °C než z jinak identického roztoku proteinu za teploty 30 °C.

Hodnota pH vodného prostředí obsahujícího protein, po přidání zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, která je nerozpustná ve vodě, nepřekračuje hodnotu pH přibližně 7,5 nebo výhodně hodnotu pH přibližně 6,5.

Hmotnostní koncentrace proteinu a polyhydroxypolykarboxylové kyseliny a jejich příslušných vodných prostředí účelně mají poměr od přibližně 3:1 do zhruba 1:3.

Hmotnostní množství používané kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny je obecně alespoň rovno odhadnutému množství proteinu, který má být obsažen ve vodném prostředí s jeho obsahem.

Pokud kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, která je nerozpustná ve vodě, se suspenduje ve svém vlastním vodném prostředí před tím, než se přidá k vodnému prostředí s obsahem proteinu, a R znamená atom vodíku, hodnota pH prostředí obsahujícího kompozici na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny je od přibližně 3 do zhruba 5, aby se dosáhlo po smíchání složek prostředí, které 15 nepřekračuje hodnotu pH přibližně 6,5.

Podle jiného provedení, pokud R znamená fenyl, hodnota pH prostředí obsahujícího kompozici na bázi zesítěné poly-hydroxypolykarboxylové kyseliny je od přibližně 5,5 do zhruba 7,5, aby se dosáhlo po smíchání složek prostředí, které nepřekračuje hodnotu pH přibližně 7,5.

Stupeň deproteinace vodného prostředí závisí na hustotě reaktivních skupin v kompozičním přípravku na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny. Pro provedení tohoto vynálezu není rozhodující hustota reaktivních skupin, za předpokladu, že je přítomno příslušné množství těchto skupin, které zajistí, že nastane vázání v dostatečném rozsahu.

Obvykle se kompoziční přípravek na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny přidává k biologické tekutině a po pevně daném čase (obvykle 5 až 15 minut) intenzivního kontaktu (například mícháním nebo nepřímým mícháním s následujícím stáním), se odstraní výsledná fáze nerozpustná ve vodě, zahrnující základní hmotu z proteinu a kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, co je doprovázeno odstraněním proteinu. Toto odstranění se může provést libovolným způsobem, obvyklým pro oddělování fází (například odstředfováním, filtrací nebo sedimentací). Odstranění fáze nerozpustné ve vodě přitom poskytne depro-teinovaný superaatant.

Když se odstraňuje fáze nerozpustná ve vodě odstřecťo-váním, odstředování by se mělo provádět při přetížení přibližně od 5 do 100 000 g po dobu od 0,2 do 10 hodin nebo usazováním za jednotkové gravitace. Výhodně se mohou použít 16 ultraodstřeďovací rychlosti, protože výsledné pelety jsou tak těsně upěchovány, že se neztrácejí žádné jemné částice, pokud se dekantuje supernatant. Přítomný způsob odstraňování proteinu se může také použít k extrakci látky, která se vysrážela kompozicí na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny nebo se s ní vysrážela vhodným zpracováním, jako například při použití zvláštních pufrových roztoků nebo jiných extrakčních činidel, jako jsou povrchově aktivní látky. Odstranění této látky se může provádět k preparativním nebo analytickým účelům. Pokud se pufrované roztoky použijí k oddělení proteinu ze základní hmoty, toto oddělení se uskutečňuje mícháním, rozmělněním a/nebo promícháváním uvedené základní hmoty s pufrem při hodnotě pH přibližně 8,6 až zhruba 9,5 po dobu 10 až 60 minut. Používá se přibližně 1 až zhruba 5 objemů pufru na jeden objem pelet základní hmoty, při hodnotě pH od přibližné 8,6 do zhruba 9,5. Účelně pufrem může být Tris pufr. Pokud se základní hmota zpracuje s povrchově aktivním extrakčním činidlem, účelně laurylsulfátem sodným, jako takové činidlo se může použít přibližně 1 až zhruba 3 objemů laurylsulfátu sodného o koncentraci od přibližně 0,5 do zhruba 2 % hmotnostních na objem zbývajících pelet základní hmoty.

Když se provádí výše uvedené stupně a z vysrážené základní hmoty se dostává kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, která je nerozpustná ve vodě, kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny se může promýt a znovu suspendovat ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem, o hodnotě pH 7,1 až 7,5. Tak další provedení způsobu srážení proteinu přináší další stupeň promývání znovuzískané kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny a její opětovné suspendování ve 17 fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem, který má výhodně hodnotu pH 7,1 až 7,5.

Způsob srážení proteinu je zvláště výhodný, pokud protein je přítomen ve vodném prostředí s nukleovou kyselinou nebo se směsí nukleových kyselin. To se stává často v případě, kdy zdrojem nukleové kyseliny nebo směsi těchto kyselin je buněčný lyzát suspendovaný ve vodném guanidiumthiokyanátu.

Deproteinizovaný supernatant (deproteinizovaná tekutina zbývající po odstranění proteinů) se může dále zpracovat libovolným způsobem. K preparativním účelům (například k čištění peptidů, glykoproteinů, steroidů, lipidů, nukleových kyselin, enzymů, hormonů, vitaminů, virů, polysacharidů nebo alkaloidů) se může další čisticí stupeň například vynechat. V tomto případě je zvláště vhodná chromatografie (například iontoměničová chromátografie, chromátografie na Sephadexu, afinitní chromatografie nebo chromatografie adsorpční), filtrace (například ultrafiltra-ce), elektroforéza (například bloková, disková nebo nosiče prostá elektroforéza), isoelektrické fokusování a selektivní srážení.

Aniž by bylo přáním jakýmkoli způsobem omezovat rozsah tohoto vynálezu, majitel tohoto patentu si přeje vyjádřit, jak rozumí tomuto vynálezu, totiž mechanismu, kterým kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny odstraňuje protein z vodného prostředí. Srážení je funkce rozpustnosti ve vodném prostředí. Rozpustnost je naopak funkcí přinejmenším z části stupně hydrofobičnosti proteinu. Všechny proteiny mají alespoň určité hydrofóbní části na svém povrchu, které jsou vystaveny vodnému prostředí. Majitel patentu předpokládá, že kompozice na bázi zesítěné 18 polyhydroxypolykarboxylové kyseliny podle tohoto vynálezu dovoluje hydrofóbním částem rozdílných molekul proteinu se navzájem ovlivňovat a způsobovat agregaci v takovém stupni, že se proteiny popřípadě vysráží. (To se zdá být potvrzeno zvýšenou účinností odstraňování proteinů působením kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny z roztoků při vyšších teplotách. Naproti tomu, pokud srážení proteinu je způsobeno jinými jevy, například asociací nebo disociací, je vidět, že srážení proteinu klesá, pokud stoupá teplota.) Před tím než toto nastane, kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny se váže s alespoň jednou molekulou proteinu nekovalentní interakcí, jako přitažlivostí elektrického náboje. (Kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny má řadu negativních nábojů, které mohou vzájemné působit s částečně positivními náboji, jež jsou přítomny na několika místech všech molekul proteinu, například v argininových zbytcích.) Místní uspořádání vody vyvolané povrchovými hydrofóbními skupinami je termodynamicky nepříznivé. Vázaná voda se může uvolňovat, pokud tyto hydrofóbní skupiny jsou apolární, a může navzájem působit s jinou takovou skupinou a vytvářet agregát. Tak když dva nebo větší počet proteinů, které vzájemně působí s flexibilní kompozicí na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny jako kuličky na šňůře, uspořádání kompozice - šňůra může potom přijmout takové apolární části odlišných proteinů a kuličky mohou vytvářet agregát. Když počet nebo velikost agregovaných molekul proteinu je dostatečně veliká, vysráží se komplex proteinu s kompozicí. Příklady provedeni vynálezu 19 Dále uvedené příklady jsou míněny jako ilustrace tohoto vynálezu a v žádném ohledu neomezují tento vynález. Příklad 1

Způsob přípravy srážecího přípravku nerozpustného ve vodě (směs částečně esterifikované látky obecného vzorce VI a deesterifikované látky obecného vzorce V) 100 g (0,063 mol) kopolymeru styrenu s anhydridem kyseliny maleinové (SAM^Resin 1000A), získaného od firmy Atochem lne., Malvern, PA, USA, se rozpustí v 1 litru acetonu. K tomuto roztoku se přidá druhý roztok, který obsahuje 17,5 g (0, 194 mol) 1,3-diamino-2 hydroxypropanu (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin, USA) v 1 litru acetonu rychlostí 5,0 ml/min, při stálém míchání po dobu 3,5 hodiny.

Reakční směs se nechá stát za teploty místnosti po dobu 12 hodin. Po ukončení reakce se do reakční směsi přidají 3 litry vody za míchání a potom se polymer nechá usadit při jednotkové gravitaci. Vodná organická fáze se odstraní dekantací. Zesítěný polymer se suspenduje v 1 litru vody a rozmělní během 1 minuty za použití homogenizéru Gifford Wood (střední nastavení). Hodnota pH suspenze se potom upraví na 1,5 přídavkem kyseliny chlorovodíkové. Po jedné hodině se hodnota pH upraví na 9,0 hydroxidem sodným a směs se míchá po dobu 30 minut. Hodnota pH se potom znovu upraví na 7,0 a supernatant se odloží. Polymer se potom promyje 0,01-molář-ním fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, hodnota pH 7,2, a nakonec suspenduje v tomto pufru za vzniku 5,0 % (hmotnost/objem) suspenze. Tak se dostane směs polyhydroxy-sloučeniny obecného vzorce V a póly(esteru kyseliny 20 maleinové) obecného vzorce VI.

Kompozice na bázi polykarboxylové kyseliny, kde R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku, se mohou připravit za použití výše popsaných stupňů s tím rozdílem, že se polymer styrenu s anhydridem kyseliny maleinové nahradí polymerem ethylenu s anhydridem kyseliny maleinové (například "EMA-21" od Monsanto Chemical Co., St. Louis, MO, USA), polymerem α-methylethylenu s anhydridem kyseliny maleinové nebo polymerem α-methoxyethylenu s anhydridem kyseliny maleinové.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část se dvěma atomy uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí diaminohydroxyethanem, jako je 1,2-diamino-l-hydroxyethan. Kompozice na bázi polykarboxylové kyseliny, které obsahují větší počet hydroxysku-pin se mohou připravit podle výše uvedených stupňů tím, že se nahradí 1,3-diamino-2-hydroxypropan 1,2-diamino-l,2-dihydro-xyethanem.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část se třemi atomy uhlíku a mají větší počet hydroxyskupin, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxy-propan nahradí l,3-diaminodihydroxypropanem nebo 1,3-di-aminotrihydroxypropanem, jako je 1,3-diamino-l,2-dihydroxy-propan nebo 1,3-diamino-l,2,3-dihydroxypropan.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část se čtyřmi atomy uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, - 21 že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí α,οο-diamino-mono-hydroxy-n-butanem, jako je 1,4-diamino-3-hydroxybutan nebo 1,4-diamino-l-hydroxybutan. Kompozice na bázi polyhydroxy-polykarboxylové kyseliny, ve kterých zesítěná část obsahuje více než jednu hydroxyskupinu, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se a,αο-diamino-mono-hydroxy-n-butan nahradí 1,4-diaminodihydroxybutanem, 1,4-di-aminotrihydroxybutanem nebo 1,4-diaminotetrahydroxybutanem, jako je l,4-diamino-2,3-dihydroxybutan nebo 1,4-diamino-l,2--dihydroxybutan, 1,4-diamino-l,2,3-trihydroxybutan a 1,4--diamino-1,2,3,4-tetrahydroxybutan. Příklad 2

Způsob deesterifikace srážecího přípravku nerozpustného ve vodě (směsi částečně esterifikované látky obecného vzorce VI a deesterifikované látky obecného vzorce V)

Smíšená kompozice obsahující polyhydroxypolykarbonyly, připravená v příkladu 1, která byla suspendována v pufru na 5,0% (hmotnost/objem) suspenzi, se odstředí při přetížení-3000 g během 10 minut a suspendující pufr se odloží. Pelety se potom dispergují v deionizované vodě a poskytnou 5,0% (hmotnost/objem) suspenzi. K suspenzi polymeru se za míchání pomalu přidá rovný objem 0,2-normálního vodného roztoku hydroxidu sodného a alkalická směs se potom nechá stát za teploty místnosti po dobu 24 hodin. Volná báze se potom odstraní (v supernatantu) opakovaným odstřed!ováním a promyje deionizovanou vodou. Polymer se potom ekvilibruje 0,01-molárním fosfátovým pufrem, hodnota pH 7,2, aby se dostala 5,0% (hmotnost/objem) suspenze polymeru. Tak se dostane polyhydroxysloučenina obecného vzorce V, která je zbavena póly(esteru kyseliny maleinové) obecného vzorce VI. 22 -

Podle výše popsaného způsobu se může čistit póly(ester kyseliny maleinové) obecného vzorce VI smísený s polyhydroxy-sloučeninou obecného vzorce V. To se může provádět s látkami z dále uvedených zdrojů.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, kde R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku, se mohou připravit za použití výše popsaných stupňů s tím rozdílem, že se polymer styrenu s anhydridem kyseliny maleinové nahradí polymerem ethylenu s anhydridem kyseliny maleinové (například "EMA-21" od Monsanto Chemical Co., St. Louis, MO, USA), polymerem α-methylethylenu s anhydridem kyseliny maleinové nebo polymerem α-methoxyethylenu s anhydridem kyseliny maleinové.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část s jedním atomem uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí diaminohydroxy-methanem.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují dva atomy uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se nahradí 1,3-di-amino-2-hydroxypropan diaminohydroxyethanem, jako je 1,2-di-amino-l-hydroxyethan. Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, ve kterých zesítěná část obsahuje větší počet hydroxyskupin, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí 1,2-diamino-l,2-hydroxyethanem. 23

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část se třemi atomy uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí 1,3-diaminodihydroxypro-panem nebo 1,3-diaminotrihydroxypropanem, jako je 1,3-di-amino-1,2-dihydroxypropan nebo 1,3-diamino-l,2,3-trihydroxy-propan.

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které obsahují zesítěnou část se čtyřmi atomy uhlíku, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se 1,3-diamino-2-hydroxypropan nahradí a,°°-diamino-mono-hydroxy-n-butanem, jako je 1,4-diamino-3-hydroxybutan nebo 1,4-diamino-l-hydroxybutan. Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, ve kterých zesítěná část má více než jednu hydroxyskupinu, se mohou připravit podle výše uvedených stupňů s tím rozdílem, že se α,οο-diamino-mono-hydroxy-n-butan nahradí 1,4-diaminodihydroxybutanem, 1,4-di-aminotrihydroxybutanem nebo 1,4-diaminotetrahydroxybutanem, jako je 1,4-diamino-2,3-dihydroxybutan nebo 1,4-diamino-l,2--dihydroxybutan, 1,4-diamino-l,2,3-trihydroxybutan a 1,4-diamino-l ,2,3,4-tetrahydroxybutan. Příklad 3

Kompozice na bázi polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, připravená podle příkladu 1 (obecného vzorce V a obecného vzorce VI), se hodnotí na svou schopnost srážet odlišné látky shrnuté v tabulce 1 uvedené dále. Všechny tyto látky uvedené v tabulce 1 (od lidského sérového albuminu až po plasmidovou DNA) jsou získány v práškové formě nebo ve formě částic od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. 24

Lidský sérový albumin (HSA) se rozpustí v 0,9% fyziologickém roztoku pufrovaném 0,01-molárním natriumfosfátovým pufrem, který má hodnotu pH 7,3 až 7,5, při koncentraci 33 mg/ml. Zbývající sloučeniny, od lidských gama-globulinů až po plasmidovou DNA, se podobně rozpustí v identickém fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem, při koncentraci vyznačené v tabulce 1. Isoelektrický bod (pl), stejně jako procentuální obsah cukrů (uhlohydrátú) (označeno jako % cukru) u každého proteinu je uveden v tabulce 1. 5% (hmotnost/objem) roztok kompozice na bázi poly-hydroxypolykarboxylové kyseliny, která byla připravena v příkladu 1, se také připraví za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem sodným.

Jeden objem kompozice na bázi zesítěné polyhydroxy-polykarboxylové kyseliny, ("deproteinizační přípravek") se uvede do styku s 1, 2 nebo 4 stejnými objemy roztoku vzorku. Každá kombinace roztoků se nepřímo míchá a potom nechá stát za teploty místnosti po dobu 5 až 15 minut. Každý roztok se potom odstřeďuje při přetížení 2000 g po dobu 10 minut, aby se odstranila základní hmota z kompozice na bázi polyhydro-xypolykarboxylové kyseliny a proteinu. Procento odstraněného proteinu z každého zbývajícího supernatantu se měří ultrafialovou absorpcí (při vlnové délce 280 nm) nebo se stanoví kolorimetricky (za použití reakčního činidla pro testování proteinů "BCA Protein Assay Reagent" od společnosti Pierce Company, Rockville, IL, USA). Procento odstraněného proteinu ("% odstranění") je uvedeno v tabulce 1 pro každý vzorek při všech 3 objemech kombinacích.

Proteiny lidského sérového albuminu, lidských gama--globulinů, hemoglobin, Transferrinu a Cytochrome C, se vždy odstraňují na úroveň 90 % nebo více, zpracováním s kompozicí 25 na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny. Tyto proteiny mají stejnoměrně nízké úrovně cukrů (uhlohydrátů), které jsou s tím spojené. Naproti tomu A 1 kyselý glyko-protein, peroxidáza ze selského křenu a Fetuin vždy obsahují podstatná množství cukrů, a proto mají horší "procento odstranění". Konečně, jak je zřejmé na obou vzorcích DNA v tabulce 1, neproteinové látky se působením kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny vůbec těžce srážejí.

Tabulka 1

Reaktivní sloučeniny

Objem deproteinizačniho přípravku (VI) k objemu vzorku

Vzorek, koncentrace pl % cukru (% odstranění) (mg/ml) 1/1 1/2 1/4 Lidský sérový albumin 33 4,9 >99 99 90 Lidské gama- -globuliny 25 5-7 2-3 >99 95 91 Hemoglobin 10 00 vo >99 99 Transferrin 1 5,9 6 95 92 26

Tabulka 1 - pokračování

Objem deproteinizačního přípravku (VI) k objemu vzorku

Vzorek, koncentrace pl % cukru (% odstranění) (mg/ml) 1/1 1/2 1/4

Cyto- 2 10,6 >99 99

chromé C

Nereaktivní sloučeniny al-kyselina 1 2,7 41 60 2 glykoprotein

Peroxidáza 1 8,8 22 23 2 z křenu selského

Fetuin 1 3,5 22 55 1 DNA z telecí- A26o=2,0 <1 <1 <1 ho brzlíku

Plasmidová ^260“°'5 <1 <1 <1

DNA

Poznámka

Tyto hodnoty jsou získány z izolovaných systémů. Pro heterogenní systémy bude selektivita vzrůstat v důsledku kompetitivního prostředí. 27 Příklad 4

Testy z příkladu 3 se opakuji při koncentraci 2,5 % (hmotnost/objem) částečně esterifikovaného polymeru (obecného vzorce VI) a deesterifikovaného polymeru (obecného vzorce V) v suspenzi. Sloučeniny jsou připraveny podle příkladu 2.

Tabulka 2

Reaktivní sloučeniny

Končen- Objem deproteinizačního trace přípravku k objemu vzorku (% odstranění) Částečně esterifikovaná Pouze deesterifikovaná sloučenina (VI) + (V) sloučenina (V) (mg/ml) 1/1 1/2 1/4 1/1 1/2 1/4 Lidský sérový albumin 33 >99 85 60 >99 >99 96 Lidské gama- -globuliny 25 >95 88 50 >99 95 90 Hemoglobin 10 >99 99 82 >99 >99 >99 Transferrin 1 95 92 58 >99 98 90 Cyto-chrome C 2 >99 >99 90 >99 >99 >99 28

Tabulka 2 - pokračování

Nereaktivní sloučeniny

Končen- Objem deproteinizačniho trace přípravku k objemu vzorku (% odstranění) Částečně esterifikovaná Pouze deesterifikovaná sloučenina (VI) + (V) sloučenina (V) (mg/ml) 1/1 1/2 1/4 1/1 1/2 1/4 al-kyselina 1 glykoprotein 60 2 0,5 65 4 1 Peroxidáza 1 z křenu selského 20 2 0,5 24 2 1 Fetuin 1 45 1 0,5 51 1 1 DNA z telecí- &260 ho brzlíku =2,0 <1 <1 <1 <1 <1 <1 Plasmidová A260 DNA =0,5 <1 <1 <1 <1 <1 <1 Příklad 5

Dva roztoky, každý z lidského sérového albuminu a lidských gama-globulinů, se připraví podle příkladu 3 (to znamená v koncentraci 33 a 25 mg/ml v 0,9% fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem sodným, hodnota pH 7,3 až 29 7,5). Také se připraví 5% (hmotnost/objem) roztok kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, připravené podle příkladu 1.

Nejprve se roztoky lidského sérového albuminu a lidských gama-globulinů udržují za teploty místnosti (přibližně při 20 °C) a potom se každý z těchto roztoků zahřeje a udržuje za teploty 60 °C. Roztok kompozice na bázi zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny se potom přidá do každého ze čtyř roztoků proteinu v objemu odpovídajícím 1/4 "depreteinizačního přípravku", vztaženo na objem vzorku proteinu. Výsledky účinnosti odstranění proteinu, které se měří jako v příkladu 2, jsou uvedeny dále v tabulce 3.

Tabulka 3

Vzorek % odstranění

Lidský sérový albumin - 20 °C 90

Lidský sérový albumin - 60 °C větší než 99

Lidský gama-*globulin - 20 °C 91

Lidský gama-globulin - 60 °C větší než 99 Příklad 6

Experiment z předcházejícího příkladu 5 se opakuje za použití deesterifikačního přípravku (obecného vzorce V) připraveného v příkladu 2, při koncentraci polymeru 2,5 % (hmotnost/objem). Poměr polymeru k vzorku obnáší 1:5. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4 uvedené dále. 30 -

Tabulka 4

Vzorek % odstraněni Lidský sérový albumin - 20 °c 80 Lidský sérový albumin - 30 °C 90 Lidský sérový albumin - 60 °C větší než 99 Lidský gama-globulin - 20 °C 82 Lidský gama-globulin - 30 °C 94 Lidský gama-globulin - 60 °C větší než 99 •

Claims

- <91. - T> x>< v 73 co 2 C> “< ’< 71 ^ y> > o '<= σ<1 o o CO · CD1 CD a . o o co» ) I C o , c-. oc o< ---P- A-T É N *1' ΖΓΧΓΕ “ NÁROKY 1. Látka obsahující zesítěnou polyhydroxypolykarboxy-lovou kyselinu nerozpustnou ve vodě, připravitelná zesíténím polymeru obecného vzorce ( - CH, - R i i CH CH — CH I I 0 = C i C = O ), \ / 0 ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl a q představuje celé číslo od 7 do 10 000, α,αο-diaminohydroxyalkanem obecného vzorce H2N.C(H)p(CH)z.(0H)m].NH2, ve kterém z znamená celé číslo od 1 do 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, 32 - a hydrolýzou nezreagovaných anhydridových skupin, přičemž poměr na počátku nadávkovaného diaminohydroxyalkanu k na počátku nadávkovanému poly(alkylenmaleinanhydridu) je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 1, uvedeno molárně.
2. Produkt připravitelný zpracováním látky podle nároku 1 s vodnou alkálií.
3. Látka podle nároku 1, obsahující zesítěnou poly-hydroxypolykarboxylovou kyselinu nerozpustnou ve vodě, zvolená ze souboru zahrnujícího takové kyseliny, které obsahují alespoň dva řetězce, z nichž každý má řetězcovou kostru vzorce III - CH, - R i I CH O = CH i I C CH I I C (III) ve kterém jedna karbonylová skupina alespoň jedné její maleoylové části v každém řetězci je kovalentně vázána k části vzorce -HN.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH-, aby se dosáhlo přítomnosti zesítěné části vzorce 33 a R 1 ch2 - CH — CH — I CH- 1 1 0 = C 1 1 C = 0 1 HN 1 OH Hp“ [ CH ] j [OH]m HN 1 OH 1 0 = C 1 1 C o 0 1 • ch2 - CH - CH — l 1 CH- 1 R R | R 1 ch2 - CH — CH — I CH- 1 (- CH2 - CH — CH — 1 CH- 1 1 0 = c l 1 C = 0 1 1 0 = C 1 1 C = 0 1 HN OH 1 0η) y 1 Hp“ [ CH ] j 1 HN 1 OH 1 1 0 = C 1 1 C = 0 1 • ch2 - CH - CH — I 1 CH- 1 R ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl, y znamená celé číslo až do m, z znamená celé číslo od 1 do 4, 34 p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, a jejich esterů s anhydridem odpovídajícím řetězcové kostře vzorce III, přičemž poměr příčného zesítění k řetězcům poly(alkylen-karboxylové kyseliny) je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 2.
4. Zesítěná polyhydroxypolykarboxylová kyselina nerozpustná ve vodě, obsahují alespoň dva řetězce, z nichž každý má řetězcovou kostru vzorce III R - CH, - CH — CH — CH - (III) ! í o = c c = o \ / ve kterém jedna karbonylová skupina alespoň jedné její maleoylové části v každém řetězci je kovalentně vázána k části vzorce aby se dosáhlo přítomnosti alespoň jedné zesítěné části vzorce 35 R 1 CH — CH — 1 I CH- 1 1 o H - O- - ΟΝ O HN 1 1 OH HP-[CH],— i [0H]m HN I OH 1 1 0 = C 1 1 C = 0 CH - CH — l ! CH- R ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkylenovou skupinu nebo nižší alkoxyskupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl, z znamená celé číslo od 1 do 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, přičemž poměr příčného zesítění k řetězcům poly(alkylen-karboxylové kyseliny) je od přibližné l do zhruba 200 ku 2.
5. Způsob přípravy látky podle nároku 3, obsahující zesítěnou polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu nerozpustnou ve vodě, vyznačující se tím, že se zesítí polymer obecného vzorce 36 R (- ch2 i I CH O CH 1 — CH -)q 1 C 1 C = 0 \ / O ve kterém R znamená atom vodíku, nižší alkoxyskupinu nebo nižší alkylenovou skupinu s 1 až 4 atomů uhlíku nebo fenyl a q představuje celé číslo od 7 do 10 000, a ,«J“diaminohydroxyalkanem obecného vzorce H2N.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH2, ve kterém z znamená celé číslo od 1 do 4, p představuje nulu nebo celé číslo až do z - 1, m znamená 1 nebo celé číslo až do z, a nezreagované anhydridové skupiny se hydrolýzují, přičemž poměr na počátku nadávkovaného diaminohydroxyalkanu k na počátku nadávkovanému poly(alkylenmaleinanhydridu) je od přibližně 1 do zhruba 200 ku 1, uvedeno molárně.
6. Způsob přípravy zesítěné polyhydroxypolykarboxylové kyseliny nerozpustné ve vodě podle nároku 4, vyznaču- 37 jící se tím, že se směs podle nároku 3 zpracuje se zředěnou vodnou alkálií.
7. Způsob srážení proteinu z vodného prostředí s jeho obsahem, vyznačující se tím, že se k tomuto prostředí přidá účinné množství látky obsahující polyhydroxy-polykarboxylovou kyselinu podle nároku 3, aby se dostala základní hmota obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu s proteinem.
8. Způsob srážení proteinu z vodného prostředí s jeho obsahem, vyznačující se tím, že se k tomuto prostředí přidá účinné množství polyhydroxypolykarboxylové kyseliny podle nároku 4, aby se dostala základní hmota obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu s proteinem.
9. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že se použije hmotnostní množství látky obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu, které je přinejmenším rovno odhadovanému množství proteinu, který je obsažen ve vodném prostředí s jeho obsahem.
10. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že se použije hmotnostní množství polyhydroxypolykarboxylové kyseliny, které je přinejmenším rovno odhadovanému množství proteinu, který je obsažen ve vodném prostředí s jeho obsahem.
11. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že se látka obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu použije ve vodném prostředí.
12. Způsob podle nároku 8,vyznačující se 38 tím, že se polyhydroxypolykarboxylová kyselina použije ve vodném prostředí.
13. Způsob podle nároku 11, vyznačuj íci se t i m, že hmotnostní koncentrace proteinu a látky obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu ve svých vodných prostředích má poměr od přibližně 3:1 do zhruba 1:3.
14. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se t í m, že hmotnostní koncentrace proteinu a polyhydro-xypolykarboxylové kyseliny ve svých vodných prostředích má poměr od přibližně 3:1 do zhruba 1:3.
15. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že hmotnostní koncentrace proteinu a látky obsahující polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu ve svých vodných prostředích jsou v podstatě ekvivalentní.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že hmotnostní koncentrace proteinu a polyhydro-xypolykarboxylové kyseliny ve svých vodných prostředích je v podstatě ekvivalentní.
17. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že pokud R znamená atom vodíku a hodnota pH prostředí obsahujícího polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu je od přibližně 3 do zhruba 6,2, dosáhne se prostředí po smíchání složek, u kterého nepřevyšuje hodnota pH přibližně 6,5.
18. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že pokud R znamená atom vodíku a hodnota pH prostředí obsahujícího polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu je od přibližně 3 do zhruba 6,2, dosáhne se prostředí po smíchání 39 složek, u kterého nepřevyšuje hodnota pH přibližně 6,5.
19. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že pokud R znamená fenyl a hodnota pH prostředí obsahujícího polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu je od přibližně 5,5 do zhruba 7,5, dosáhne se prostředí po smíchání složek, u kterého nepřevyšuje hodnota pH přibližně 7,5.
20. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že pokud R znamená fenyl a hodnota pH prostředí obsahujícího polyhydroxypolykarboxylovou kyselinu je od přibližně 5,5 do zhruba 7,5, dosáhne se prostředí po smíchání složek, u kterého nepřevyšuje hodnota pH přibližně 7,5.
21. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že zahrnuje další stupeň odstřeďování reakční směsi a tím získání základní hmoty ve formě pelet.
22. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že zahrnuje další stupeň odstřelování reakční směsi a tím získání základní hmoty ve formě pelet.
23. Způsob oddělování proteinu ze základní hmoty podle nároku 7, bez denaturace proteinu, vyznačující se t í i, že se základní hmota zpracuje s pufrem při hodnotě pH od přibližně 8,6 do zhruba 9,5.
24. Způsob oddělování proteinu ze základní hmoty podle nároku 8, bez denaturace proteinu, vyznačuj ící se t í m, že se základní hmota zpracuje s pufrem při hodnotě pH od přibližně 8,6 do zhruba 9,5.
25. Způsob podle nároku 19,vyznačuj ící - 40 - I se t í m, že se použije přibližně 1 až zhruba 5 objemů pufru, o hodnotě pH od přibližně 8,6 do zhruba 9,5, na objem pelet základní hmoty.
26. Způsob podle nároku 21, vyznačuj ící se t í m, že pufrem je Tris pufr.
27. Způsob oddělování látky obsahující polyhydroxy-polykarboxylovou kyselinu ze základní hmoty, podle nároku 7, určené k jejímu získání, vyznačující se tím, že se základní hmota zpracuje s vodným roztokem laurylsulfátu sodného.
28. Způsob oddělování látky obsahující polyhydroxy-polykarboxylovou kyselinu ze základní hmoty, podle nároku 8, určené k jejímu získání, vyznačující se tím, že se základní hmota zpracuje s vodným roztokem laurylsulfátu sodného.
29. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje další stupeň odstředění základní hmoty, která se zpracovala s roztokem laurylsulfátu sodného, a získání polyhydroxypolykarboxylové kyseliny z výsledných pelet.
30. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že se používá přibližně 1 až zhruba 3 objemů laurylsulfátu sodného o koncentraci od přibližně 0,5 do zhruba 2 % (hmotnost/hmotnost) na objem výsledných pelet.
31. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje další stupeň promývání získaného zbytku polyhydroxypolykarboxylové kyseliny a její opětovné - 41 - ( suspendování ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem.
32. Způsob podle nároku 26, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje použití fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem při hodnotě pH od 7,1 do 7,5.
33. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m, že vodné prostředí obsahující protein dále obsahuje nukleovou kyselinu nebo směs proteinu a nukleové kyseliny.
34. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m, že vodné prostředí obsahující protein dále obsahuje nukleovou kyselinu nebo směs proteinu a nukleové kyseliny.
35. Způsob podle nároku 28, vyznačuj ící se t í m, že zdrojem nukleových kyselin nebo jejich směsí je buněčný lyzát, který je suspendován ve vodném guanidinium-thiokyanátu.