JPH10243785A - 核酸塩基配列決定方法及び、核酸塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ＳＢＨ法においてハイブリダイズに伴うミス
マッチの問題を解決し、高感度迅速な核酸塩基配列決定
方法及び装置の提供。 【解決手段】 一重鎖核酸の塩基配列決定方法におい
て、複数の各領域に種類ごとに配置された一群のオリゴ
ヌクレオチドプローブと前記核酸とのハイブリダイズ体
を形成し、係るハイブリダイズ体の前記プローブをプラ
イマーとして前記核酸を鋳型とする伸張反応を行い、前
記伸張量を検出して被検体核酸の塩基配列を決定する。
塩基配列決定装置は、前記一重鎖核酸の塩基配列決定方
法において、一群のオリゴヌクレオチドプローブを複数
の各領域に種類ごとに配置する手段と、プローブと核酸
とのハイブリダイズ体を形成する手段と、ハイブリダイ
ズ体の前記プローブをプライマーとして前記核酸を鋳型
とする伸張反応を行う手段と、前記伸張量を検出して被
検体核酸の塩基配列を決定する手段を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸塩基配列決定方法
に関するものである。

【０００２】

【従来技術】従来、核酸の塩基配列決定方法としては、
Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシチェーンターミネーター法
及びＭａｘａｍ−Ｇｌｉｂｅｒｔの化学分解法の２つ
が実用化されている。いずれも塩基配列を決定される核
酸（被検核酸、又は被検ＤＮＡ）のいろいろの長さの断
片の末端塩基の種類が同定できるように放射性同位元素
や蛍光色素等でラベルされるようにして合成もしくは分
解した後、ゲル電気泳動することにより、各断片を短い
順に分離し短い方から順番に末端の塩基の種類を読み取
って行くことにより配列を推測する方法である。これら
の方法は改良されて現在に至っているが、いずれも、各
断片の再クローニングや、電気泳動による分離操作が必
要とされ、時間的、精度的な制約がある。

【０００３】他の方法の１つとしてＳＢＨ法（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ）と称さ
れる方法がある。この方法は、連続するｋ塩基数の長さ
の全てのオリゴヌクレオチドの組合せ（組成Ｆ^Kとし、
４^k個ある）からなるオリゴヌクレオチドプローブの群
（セット）のそれぞれと被検核酸をハイブリダイズさせ
ることにより被検体核酸の塩基配列を決定する方法であ
る。この方法では、例えばｋ個の塩基配列からなる上記
のプローブ群を使用することにより４^k種類のプローブ
を用いることとなり、係るプローブ群の使用により決定
され得る被検体の塩基配列数は約２^k塩基数となる。

【０００４】しかし、上記ＳＢＨ法は、ハイブリダイズ
する際のミスマッチの問題があり、完全に相補的でない
プローブでも被検核酸とハイブリダイズし得ることであ
り、このことは被検体の塩基配列の正確で迅速な決定の
上で問題となる。

【０００５】

【発明が解決しょうとする課題】本発明は、上記ＳＢＨ
法においてハイブリダイズに伴う上記ミスマッチの問題
を解決し、高感度でかつ迅速な被検体核酸の塩基配列を
決定する方法を提供するものである。

【０００６】さらに、本発明に係る方法を使用した、高
感度迅速塩基配列決定装置を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、被
検体核酸（ＤＮＡ）たる一重鎖の核酸塩基配列の決定方
法を対象とするものであり、一重鎖の被検核酸の塩基配
列決定方法において、複数の各領域に種類ごとに配置さ
れた一群のオリゴヌクレオチドプローブ（プライマー）
と、前記被検核酸とをハイブリダイズさせ、ハイブリダ
イズ体を形成し、係るハイブリダイズ体の前記プローブ
をプライマーとして前記被検核酸を鋳型とする伸張反応
を行い、前記伸張した量を検出して被検体核酸の塩基配
列を決定するものである。

【０００８】より詳しくは、本発明は、核酸塩基配列の
決定方法に関するものであり、ｋ個の塩基配列の全ての
組合せからなる４^K個のオリゴヌクレオチドプローブを
プライマーとして、分離して（例えばマトリックス状の
場所、それぞれの場所を以下ウエルとする）配置するス
テップと、上記各ウェルに被検体たる一重鎖の核酸を加
え、適当なハイブリダイズ条件とし、前記プライマーと
前記被検核酸とのハイブリダイズ体を形成するステップ
と、さらに上記各ウェルにおいて、前記プライマーの前
記被検核酸を鋳型とする伸長反応を行うステップと、前
記伸長反応により伸長した量を検出するステップと、前
記各プライマーの伸長量に基づき前記被検体の塩基配列
を決定するステップとを含む方法である。

【０００９】また、本発明は、核酸塩基配列の決定方法
に関するものであり、前記各プライマーの伸張量に基づ
き前記被検体の塩基配列を決定するステップが、さらに
つぎの特徴を有するものである。

【００１０】（Ａ） 検出に伴う測定誤差を考慮しなく
てもよい場合： （Ａ−１）同一の前記伸張量（Ｉ_i）を示す前記プライ
マーをグループＧ_iとし、前記グループＧ_i毎に、任意の
プライマーを選択し、前記プライマーの塩基配列と、１
塩基のみ異なるプライマー、２塩基のみ異なるプライマ
ー、３塩基のみ異なるプライマー、さらに４以上異なる
プライマーにそれぞれ分ける。

【００１１】(1) 前記任意のプライマーの塩基配列お
よび前記１塩基のみ異なるプライマーの塩基配列を比較
し、各プライマーの各位置（５’末端から数えて１、
２、・・・番目）毎に塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が最も共通
する塩基を選択し、得られる塩基配列を真の配列とす
る。

【００１２】(2) さらに、前記任意のプライマーの塩
基配列および前記１塩基のみ異なるプライマーの塩基配
列、前記２塩基のみ異なるプライマーの塩基配列を比較
し、各プライマーの各位置（５’末端から数えて１、
２、・・・番目）毎に塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が最も共通
する塩基を選択し、得られる塩基配列を真の配列とす
る。

【００１３】(3) 必要ならば、さらに３塩基のみ異な
るプライマー、さらに４以上異なるプライマーの塩基配
列も考慮する。

【００１４】上記の方法にて、同一の前記伸張量
（Ｉ_i）を示すグループＧ_iの真の塩基配列としてＳ_iを
決定する。

【００１５】（Ａ−２） 同様にして各Ｉ_iを有するＧ_i
から真の塩基配列Ｓ_iを決定する。

【００１６】（Ａ−３） 得られたＳ_iを、Ｉ_iの大きい
ものから小さいものへと並べる。最も大きい値のものを
Ｓ₁とし順次Ｓ₂、Ｓ₃、・・・、Ｓ（最も小さい値）とす
る。

【００１７】（Ａ−４） 得られた塩基配列のそれぞれ
の５’末端及び３’末端近辺の塩基配列が重なるように
Ｓ₁、Ｓ₂、Ｓ₃、・・・、Ｓ（最も小さい値）を比較して並
べて塩基配列を決定する。得られた塩基配列は、被検体
の塩基配列の相補的塩基配列であり、これから被検体の
塩基配列が決定される。

【００１８】（Ｂ） 検出に伴う測定誤差を考慮する場
合：この場合は、（Ａ）の場合と異なり、同一の前記伸
張量（Ｉ_i）を示すプライマーグループＧ_iのみならず同
様の伸張量（Ｉ_iと測定誤差に基づきお互いに区別でき
ない２以上の伸張量Ｉ_i'、Ｉ_i''、Ｉ_i'''、・・・）を示す
プライマーのグループＧ_i'、Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・からな
るグループとし、 （Ｂ−１） 任意の１つのプライマーを選択し、前記プ
ライマーの塩基配列と、１塩基のみ異なるプライマー、
２塩基のみ異なるプライマー、３塩基のみ異なるプライ
マー、さらに４以上異なるプライマーにそれぞれ分け、
係る選択により選択されなかったプライマーと区別す
る。

【００１９】（Ｂ−２） （Ｂ−１）で選択されなかっ
たプライマーのうちでさらに、任意のプライマーを選択
し、（Ｂ−１）と同様の操作を行う。

【００２０】（Ｂ−３） 上記（Ｂ−１）および（Ｂ−
２）を繰返し、前記プライマーのグループＧ_i'、
Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・が決定される。

【００２１】（Ｂ−４） 得られたそれぞれのグループ
Ｇ_i'、Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・内で、（Ａ）で記載した方法
によりそれぞれのグループの真の塩基配列（Ｓ_i'、
Ｓ_i''、Ｓ_i'''、・・・）が決定される。

【００２２】（Ｂ−５） 得られたＳ_i'、Ｓ_i''、
Ｓ_i'''、・・・のそれぞれの塩基配列のそれぞれの５’末
端及び３’末端近辺の塩基配列が重なるように並べて塩
基配列Ｓ_iを決定する。

【００２３】（Ｂ−６） 得られたＳ_iから（Ａ）と同
様の方法で被検体の塩基配列の相補的塩基配列であり、
これから被検体の塩基配列が決定される。

【００２４】本発明はさらに、前記伸長反応が、前記各
プライマーとポリメラーゼによる伸長反応であり、前記
伸長量の検出が、前記反応に伴って遊離するピロリン酸
の量を測定することにより行うことを特徴とする核酸塩
基配列の決定方法である。

【００２５】本発明はさらに、前記伸長反応が、前記各
プライマーとポリメラーゼによる伸長反応であり、前記
伸長量の検出が、前記反応で取り込まれる蛍光標識ヌク
レオチドの蛍光を測定することにより行うことを特徴と
する核酸塩基配列の決定方法である。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明は、被検体核酸（ＤＮＡ）
たる一重鎖の核酸塩基配列の決定方法を対象とするもの
であり、ｋ個の塩基配列（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃからなる）の
全ての組合せからなる４^K個のオリゴヌクレオチドプロ
ーブをプライマーとして使用し、分離して（例えばマト
リックス状の場所、それぞれの場所を以下ウエルとす
る）配置し、上記各ウェルに被検体たる一重鎖の核酸を
加え、適当なハイブリダイズ条件で前記プライマーと前
記被検核酸とのハイブリダイズ体を形成させ、さらに、
前記プライマーの前記被検核酸を鋳型とする伸長反応を
行い伸長した量を検出して前記被検体の塩基配列を決定
するものである。

【００２７】従って、係る複数のプライマーと被検体核
酸とのハイブリダイズ体の形成において、完全に相補性
のないプライマーともハイブリダイズするというミスマ
ッチの可能性がある。

【００２８】さらに、被検体が長い場合に、それぞれの
伸張反応により伸張した量の測定手段に応じて測定誤差
が生じ、係る測定誤差に基づき、本来なら、個々区別さ
れるべき各プライマーが、区別できなくなるという可能
性がある。

【００２９】従って、本発明に係る前記伸張反応に基づ
き検出された伸張量の測定値は、通常はこれらの可能性
がともに生じて得られたものであると考えられ、かかる
伸張量の測定値からは被検体の塩基配列を一義的に決定
することは困難となる。

【００３０】この場合、本発明に係る方法を使用するこ
とで、前記のプローブと被検体のミスマッチハイブリダ
イズが生じ、さらに、前記伸張量の測定が測定誤差を有
する場合においても、被検体の塩基配列を決定可能とす
るものである。以下より詳しく説明する。

【００３１】（ミスマッチハイブリダイズ）上記説明し
たように、ＳＢＨ法はハイブリダイズする際のミスマッ
チの問題があり、完全に相補的な塩基配列を有するプロ
ーブのみを被検核酸とハイブリダイズさせるハイブリダ
イズ条件を設定することは極めて困難である。一方、前
記ハイブリダイズに伴うミスマッチを減少させるための
条件として、種々の要因が考えられるが特に、ハイブリ
ダイズの温度、及び被検体、プローブのＧＣ含量の制御
が重要である。一般には、ハイブリダイズの温度が低い
程ミスマッチの確率は高くなる傾向にあり、ある程度高
い温度でハイブリダイズする必要があるが、あまり高い
温度では、ハイブリダイズ体が不安定となる。従って、
ミスマッチを抑制し、かつハイブリダイズ体を安定させ
る適当な温度幅がある。さらに、ＧＣ含量が多いほどハ
イブリダイズ体の安定性は増加することが知られてい
る。従って、本発明に係る方法においては、本発明に係
るプローブと被検体核酸とが完全にミスマッチなくハイ
ブリダイズさせる条件を必要とするものではないが、で
きるがけミスマッチが少なくなるハイブリダイズ条件を
設定することが好ましい。

【００３２】特定の塩基配列の組合せによるミスマッチ
の生じる確率は、種々の方法で見積りが可能であり、そ
れに基づき最適のハイブリダイズ条件を決定することが
可能である。係る条件下では、ほとんどが完全ハイブリ
ダイズし、１塩基配列が異なるプローブがわずかにミス
マッチハイブリダイズし、さらにごくわずかな２塩基配
列が異なるプローブがミスマッチハイブリダイズする。
上記ＧＣ含量及びハイブリダイズ温度を考慮に入れてハ
イブリダイズ条件を設定する際には、プローブのＧＣ含
量に応じて温度が異なる条件を設定することも好まし
い。以下説明するように本発明に係る方法においては、
係るミスマッチが存在することは何等制限とはならない
が、ミスマッチが少ないことはより好ましい。

【００３３】（測定誤差）本発明において測定する伸張
量は、その測定手段に応じて測定誤差が伴う。従って、
被検体が長い場合においては、各プローブに基づく伸張
反応の伸張量の差は小さくなり、前記誤差と区別できな
くなる場合が生じ得る。係る場合には、各プローブを個
々区別することができず、同程度の伸張量を示す複数の
プローブがそれぞれグループに分けられるのみである。
この際、それぞれのグループはしかし、有意の差の伸張
量を示すものである。本発明に係る方法は、係る測定誤
差の存在に何等制限されず、上記のグループ化可能な場
合には、被検体の塩基配列を決定することを可能とする
ものである。

【００３４】（被検体核酸の塩基数及びプローブ塩基
数）本発明に係る方法で決定可能な一重鎖の被検核酸の
塩基配列については制限されず、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４種
類の塩基からなる通常のオリゴヌクレオチド、ポリヌク
レオチドであればよい。決定可能な塩基数については、
プローブを形成する塩基数に依存する。

【００３５】一般に、ＳＢＨ法ではプローブを形成する
ヌクレオチドの数がｋ個の場合には、すべての組合せは
４^k個となり、これを用いて決定可能な被検体核酸の塩
基数の最大値は２^k個となる。例えば、プローブが８〜
１２ヌクレオチドからなる場合は以下の表に示した。本
発明に係る方法では全てのプローブにハイブリダイズし
ても伸張反応に従って整列できるのでシーケンス可能で
あり、最大値は以下右端の数値になる。

【００３６】 =================================================================== プローブヌクレオチド数（ｋ） プローブ数 決定可能塩基数 ＳＢＨ法 本発明 ------------------------------------------------------------------ 7 16384 128 16384 8 65536 256 65536 9 262144 512 262144 10 1048576 1024 1048576 11 4194304 2048 4194304 12 16777216 4096 16777216 ================================================================== （プローブ）前記ｋ個の塩基配列の全ての組合せからな
る４^K個のオリゴヌクレオチドプローブをプライマーと
して用いる場合に、上の表で示すように極めて多数の分
離した場所（ウエル）が必要となるが、本発明はその形
状、装置には特に制限はない（例えば、特開平7-203998
参照のこと）。具体的には、適当なサイズの反応試験管
（ガラス製等の）を必要量並べる方法や、さらに、ガラ
ス製もしくはシリコン製の材料から構成されるキャピラ
リープレート等が好ましく使用される。より具体的には
係るキャピラリープレート形状としては、被検核酸のシ
ーケンシングの観点からはコラムがマトリックス状に配
列しており、方形状のが有用であるが、本発明ではこの
形状として円形や三角形のものでも適用される。また、
このようなキャピラリープレートのコラムは、一般的に
は直径数ないし数百μｍ程度の円筒穴で規定されるの
で、コラム内にプライマーや被検核酸などの液体を導入
する際には、表面張力を考慮してキャピラリープレート
の厚み方向への電気泳動を用いることも望ましい。ま
た、ＤＮＡチップも本発明において好ましく用いること
もできる（SCIENCE １９９１年９月２７日 RESEARCH NE
WS 1489）。

【００３７】さらに、操作の容易性からは、本発明に係
るプライマーが、前記ウエル内に固定されるほうが望ま
しいが、磁気ビーズに結合したプライマーをそれぞれの
ウエル内に設けてもよい。前記ウエル内に固定する方法
についても特に制限はなく通常の公知の化学反応による
処理、蛋白質蛋白質相互作用による結合等が好ましく使
用される。

【００３８】（ハイブリダイズ条件）本発明に係る方法
は、前記プローブと被検体核酸とのハイブリダイズが必
要であるが、その条件についても特に制限はない。被検
体核酸の大体の長さ（塩基数）、ＧＣ含量等の推定に基
づき、プローブの塩基数を決定し、通常公知のハイブリ
ダイズ条件を設定することは容易である。本発明におい
ては、ミスマッチによるハイブリダイズ体の存在は問題
としないが、少ない方が好ましい。従って、あらかじめ
適当な手段にてハイブリダイズ条件を設定することは好
ましい。例えば、各プローブをＧＣ含量に応じてハイブ
リダイズ温度を設定することが好ましい。これにより、
よりミスマッチの少ないハイブリダイズ体を得ることが
可能となる。

【００３９】具体的には、ＰＣＲ反応を利用して、鋳型
ＤＮＡと完全相補的プライマーのみならず、任意（塩基
の種類と位置および数を変えた）のミスマッチさせた不
完全相補的プライマーを用いて条件の最適化を行うこと
も可能である。

【００４０】（プローブをプライマーとして前記被検核
酸を鋳型とする伸張反応）本発明に係る方法では、プロ
ーブとハイブリダイズした被検体核酸を鋳型として、前
記プローブをプライマーとするポリメラーゼ反応により
伸張反応させるものであるが、使用可能なポリメラーゼ
の種類、その反応条件についても特に制限はない。被検
体核酸の長さは、例えばプライマーとして１０個の塩基
からなる場合には被検体の決定可能な塩基数は約100000
0となり、この場合、完全に伸張反応が起こることが必
要であるが、係るポリメラーゼ反応条件、又はポリメラ
ーゼの種類の選択は当業者にとって可能である（具体的
にはエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使
用する等）。（伸張量の測定）本発明に係る方法では、
前記伸張反応による伸張量をできるだけ正確に検出する
ことが必要であるが、その方法には特に制限はない。具
体的には、伸張反応に伴って遊離するピロリン酸をＡＰ
Ｓ（アデノシン５’−ホスホ硫酸）と反応させてＡＴＰ
（アデノシン５’−三リン酸）を生成し、このＡＴＰの
ルシフェラーゼ反応に伴う発光量を検出することにより
行うことが可能である。この場合測定される発光量は伸
張量に比例する。または、伸張反応に蛍光ラベル化デオ
キシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いて行
い、蛍光ラベルからの発光量を検出することにより行う
ことも可能である。この場合測定される傾向量は伸張量
に比例する。さらには、伸張反応が終了した後に、ＴＯ
ＴＯ、ＹＯＹＯ等のインターカレータ型の色素で染色
し、その蛍光量を測定する方法も好ましく使用可能であ
る。

【００４１】（伸張量から被検体核酸の塩基配列決定）
本発明に係る方法は、上記説明した、各プローブについ
て測定された伸張量に基づき被検体の塩基配列を決定す
るものである。ここでミスマッチなく、完全相補的なプ
ローブのみが被検体とハイブリダイズ体を形成する場合
には、各プローブはそれぞれ異なる伸張量を有し、同じ
伸張量を示すプローブが複数存在することはない。図１
に模式的に示されるように、この場合には各完全に相補
的なプローブのみがハイブリダイズ可能であり、従っ
て、伸張反応による伸張量は単一の値を示す。被検体核
酸がＮ個の塩基数からなる場合、ｋ塩基数のプライマー
により最も大きな伸張量は（Ｎ−ｋ）であり、次に大き
な伸張量は（Ｎ−ｋ−１）と順に１ずつ小さな伸張量を
示す。一方ミスマッチが生じた場合には、図２、又は３
に示すように、数塩基が異なるプローブであるにも拘ら
ず完全相補的プローブと同様にハイブリダイズし、従っ
て、同じ伸張量を示すことになる。通常のハイブリダイ
ズ条件、及びポリメラーゼ伸張反応条件下では、上記の
ミスマッチに基づくハイブリダイズ体の形成は完全には
避けることが困難である。図２に示すようにミスマッチ
塩基が１つある場合には同じ伸張量を示すプローブ数は
ｋx３通りあり、この場合特定の位置の塩基がミスマッ
チである確率は（１／ｋ）となる。同様に図３には２つ
の塩基がミスマッチする場合を示す。この場合には同じ
伸張量を示すプローブの数は_kＣ₂x３²通りあり、この場
合特定の位置の塩基がミスマッチである確率は（２／
ｋ）となる。図には示されていないが、ｋ塩基のプロー
ブのｉ個がミスマッチの場合において、特定の位置の塩
基がミスマッチである確率は（ｉ／ｋ）となる。

【００４２】本発明に係る方法では、上記ミスマッチに
よるハイブリダイズが各塩基の種類に大きく依存せずに
ランダムに生じ、また、伸張反応の条件を適当に設定す
ることにより、上記ミスマッチを抑制し、３個以上のミ
スマッチが実質的に生じない条件とすることは容易であ
る。従って、プローブ塩基数が８〜１２個程度であれ
ば、特定の位置でのミスマッチする確率は、最も悪い場
合でも３／８であり、最も低い場合には１／１２とな
る。この程度の確率であれば、最も確からしい塩基を選
択することは極めて容易となる。すなわち、被検体の核
酸塩基配列を決定可能とする。

【００４３】さらに、上記説明した伸張量の測定に伴う
測定誤差が存在する場合においても、係る誤差内で同じ
伸張量と判断されるプローブが存在する。すなわち、伸
張量が極めて大きくなると、それぞれのプローブの伸張
量の差が、測定誤差に比較して有意差と判別不可能とな
る場合がある。係る場合には、区別不可能な複数のプロ
ーブが同一の伸張量を示すものとして取り扱わなければ
ならない。本発明に係る方法を使用すると、係る場合に
おいても被検体核酸の塩基配列を決定することが可能と
なる。

【００４４】以下、（Ａ）前記測定誤差がない場合、及
び（Ｂ）測定誤差がある場合の本発明に係る方法につい
て説明する。

【００４５】（Ａ） 検出に伴う測定誤差を考慮しなく
てもよい場合：この場合においてはミスマッチに基づく
同じ伸張量を示す複数のプライマーが存在するが、それ
ぞれの伸張量の値自体には誤差は含まれていない。この
場合、本発明において好ましく使用可能な被検体核酸の
塩基配列決定方法の一例を以下に示す。

【００４６】（Ａ−１）まず、図４に示すように、同一
の前記伸張量（Ｉ_i）を示す前記プライマーが複数ある
場合にそのプライマーからなるグループをＧ_iとし、前
記グループＧ_i毎に以下の手順を行う。ここで同一の伸
張量を示すことは、被検体核酸の同一の部分にハイブリ
ダイズしたことを意味する。

【００４７】すなわち、そのグループに属する任意のプ
ライマーを選択し、選択されてプライマーの塩基配列
と、そのグループに属する他の全てのプライマーの塩基
配列を比較して、１塩基のみ異なるプライマー、２塩基
のみ異なるプライマー、３塩基のみ異なるプライマー、
さらに４以上異なるプライマーにそれぞれ分ける。この
際、本発明においてはハイブリダイズ条件を選択するこ
とにより、ミスマッチの確率を低くすることが可能であ
り、上記の分け方は任意である。

【００４８】例えば、前記任意のプライマーの塩基配列
および前記１塩基のみ異なるプライマーの塩基配列を比
較すると、各プライマーの各位置（５’末端から数えて
１、２、・・・番目）毎に塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が共通
するプライマーと、その共通する塩基とは異なる塩基で
あるプライマーが存在する。従って、最も共通する塩基
を選択することは容易である。この操作を続けることで
最も確からしい塩基配列を有するプライマー、すなわ
ち、完全相補的プローブを見出すことが可能となる。係
る塩基配列を真の配列とする。

【００４９】同様の手順を、前記任意のプライマーの塩
基配列および前記１塩基のみ異なるプライマーの塩基配
列及び前記２塩基のみ異なるプライマーの塩基配列を比
較し、各プライマーの各位置（５’末端から数えて１、
２、・・・番目）毎に塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が最も共通
する塩基を真の塩基とすることも可能である。また、必
要ならば、さらに３塩基のみ異なるプライマー、さらに
４以上異なるプライマーの塩基配列も考慮することで、
上記得られた配列を確認することが可能となる。実際に
は、前記任意のプライマーの塩基配列および前記１塩基
のみ異なるプライマーの塩基配列を比較することで充分
完全相補的塩基配列に到達可能である。

【００５０】上記の方法にて、同一の前記伸張量
（Ｉ_i）を示すグループＧ_iの真の塩基配列としてＳ_iを
決定することが可能となる。

【００５１】（Ａ−２） 同様にして他のＩ_iを有する
Ｇ_iから真の塩基配列Ｓ_iを決定可能である。

【００５２】（Ａ−３） 得られたＳ_iを、Ｉ_iの大きい
ものから小さいものへと並べ、最も大きい値のものをＳ
₁とし順次Ｓ₂、Ｓ₃、・・・、Ｓ（最も小さい値）とする。

【００５３】（Ａ−４） 図５に示されるように、得ら
れた塩基配列のそれぞれの５’末端及び３’末端近辺の
塩基配列が重なるようにＳ₁、Ｓ₂、Ｓ₃、・・・、Ｓ（最も
小さい値）を比較して並べて塩基配列を決定する。この
場合、Ｓ₂はＳ₁に比較して１塩基分ずれていることにな
り、また、Ｓ₃はＳ₂に比較して１塩基分ずれていること
になり、以下順に１塩基ずつずれた配列となっているの
でこれらから塩基配列を決定することが可能となる。得
られた塩基配列は被検体の塩基配列の相補的塩基配列で
あり、これから被検体の塩基配列が決定される。

【００５４】実際には、種々の原因で、いくつかのプラ
イマーの伸張反応が起こらず、その部分の塩基配列が１
塩基以上離れた形で連続することも有り得る。この場合
には、少なくとも適当な数の塩基配列が重なり合うよう
にすべての配列を並べることで決定することが可能とな
る。

【００５５】（Ｂ） 検出に伴う測定誤差も考慮する場
合：係る測定誤差の本発明において許容される程度は特
に制限はないが、当該測定方法及び、その繰返し測定回
数、測定時間に依存するが、ＣＶ値で５％以下が好まし
くより好ましくは１％以下である。ここで１％のＣＶ値
を有する測定条件では最大の測定値が任意単位で1000の
場合には10〜30程度の測定値は有意差なしとして同じ値
のグループに分けられることとなる。上で説明したよう
に遊離リン酸を用いて測定する場合、ＣＶ値は約１〜５
％程度になる。

【００５６】この場合は、（Ａ）の場合と異なり、図６
に示すように、同一の前記伸張量（Ｉ_i）を示すプライ
マーグループＧ_iのみならず同様の伸張量と判断される
伸張量（Ｉ_iと測定誤差に基づきお互いに区別できない
２以上の伸張量Ｉ_i'、Ｉ_i''、Ｉ_i'''、・・・）を示す複数
のプライマーのグループＧ_i'、Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・から
なるグループを、他のプライマーから選別することが可
能となる。

【００５７】（Ｂ−１） 得られるＧ_i'、Ｇ_i''、
Ｇ_i'''、・・・からなるグループＧ_iを構成するすべてのプ
ライマーについて、任意の１つのプライマーを選択し、
そのプライマーの塩基配列と、１塩基のみ異なるプライ
マー、２塩基のみ異なるプライマー、３塩基のみ異なる
プライマー、さらに４以上異なるプライマーにそれぞれ
分け、係る選択により選択されなかったプライマーと区
別する。

【００５８】（Ｂ−２） さらに、（Ｂ−１）で選択さ
れなかったプライマーのうちでさらに、任意のプライマ
ーを選択し、（Ｂ−１）と同様の操作を行う。

【００５９】（Ｂ−３） 上記（Ｂ−１）および（Ｂ−
２）の操作を繰返すことで、プライマーのグループ
Ｇ_i'、Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・が決定される。

【００６０】（Ｂ−４） 上記の操作で得られたそれぞ
れのグループＧ_i'、Ｇ_i''、Ｇ_i'''、・・・においては、す
でに説明した上記（Ａ）で説明した方法により真の塩基
配列（Ｓ_i'、Ｓ_i''、Ｓ_i'''、・・・）が決定されることに
なる。

【００６１】（Ｂ−５） 得られたＳ_i'、Ｓ_i''、
Ｓ_i'''、・・・のそれぞれの塩基配列のそれぞれの５’末
端及び３’末端近辺の塩基配列が重なるように並べて塩
基配列Ｓ_iを決定する。

【００６２】（Ｂ−６） 得られたＳ_iから（Ａ）と同
様の方法で被検体の塩基配列の相補的塩基配列であり、
これから被検体の塩基配列が決定される。

【００６３】前記測定に伴う誤差は、測定方法に依存す
る。例えば、測定方法として上で説明したピロリン酸法
を用いた場合、被検体核酸が1000塩基からなり、またプ
ローブの塩基数が10個とすると、ピロリン酸は最大で99
0個放出される。従って、測定方法がいま５％程度とす
ると50個程度の差のピロリン酸の放出の差は区別され
ず、同じ数の放出と判断される。従って、この場合に
は、50個ずつの差を持ったグループに分けるとすると、
990-940個のプローブを１グループ、940-890個のプロー
ブを１グループ、・・・と分けることとなる。この各グル
ープ内にはさらにミスマッチによるプローブも含まれ
る。

【００６４】（実施例）ＰＣＲ法によるミスマッチの発
生率測定 被検体核酸と完全には相補的でないオリゴヌクレオチド
プローブが、特定の条件下でもハイブリダイズするし伸
張反応する確率を推定するために、ＰＣＲ法を用いた以
下の測定を行った。すなわち、被検体核酸としてpBlues
criptIIを鋳型として使用し、１２塩基配列からなるＰ
ＣＲReverseプライマー（５’−ＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧ
ＣＧ−３’）、及びForwardプライマーとして完全相補
的な１２塩基プライマー及び種々の塩基置換されたミス
マッチプライマー（下表）を合成して用いた。この場合
ＰＣＲ反応の増幅物は777塩基数を有する核酸であり、
この産物生成は電気泳動法に基づいて確認した。

【００６５】ミスマッチプライマーを使用しても前記増
幅産物を得られた場合は、当該プライマーは被検体核酸
とミスマッチにも拘らずハイブリダイズしＰＣＲ反応が
進行したことを意味する。ＰＣＲ反応の反応温度に依存
してミスマッチプライマーによるＰＣＲ増幅反応の増加
減少を観察することで、ハイブリダイズ温度とミスマッ
チの頻度を推定できる。

【００６６】ＰＣＲ増幅反応条件： 10xPCR buffer 5μｌ dNTPミックス 5μｌ 実験プライマ(10pmol/μｌ) 5μｌ 共通プライマ(10pmol/μｌ) 5μｌ テンプレート(0.5ng/μｌ) 10μｌ AmpliTaqポリメラーゼ 0.3U 全量 50μｌ 温度サイクルは、94℃、1分；アニーリング温度（パラ
メータ）、1分；72℃、1分を３０サイクル行った。

【００６７】表は、完全塩基配列のうち１塩基のみミス
マッチさせた塩基配列を有するプローブを用いた結果
（F-Primer を5’側から1塩基ずつ、他の3種の塩基に変
える,Reverse Primer : pBS R12 5'-ATACCGTCGACC-3、
Forward Primer : pBS800-7 5'-TAAGGCGCAGCG-3'、PCR
Product : 777bp）を示す。

【００６８】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ プライマー ＰＣＲアニーリング温度 51.4 53.4 55.4 57.4 59.4 61.4 63.4 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− pBS 800-7 5'-TAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-1A 5'-AAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-1B 5'-CAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-1C 5'-GAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-2A 5'-TCAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × ○ × pBS7-2B 5'-TGAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-2C 5'-TTAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-3A 5'-TACGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-3B 5'-TAGGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-3C 5'-TATGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-4A 5'-TAAAGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × × × × pBS7-4B 5'-TAACGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × × × pBS7-4C 5'-TAATGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × × × pBS7-5A 5'-TAAGACGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-5B 5'-TAAGCCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-5C 5'-TAAGTCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × × × pBS7-6A 5'-TAAGGTGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × × × pBS7-6B 5'-TAAGGGGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-6C 5'-TAAGGAGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-7A 5'-TAAGGCACAGCG-3' ○ ○ ○ × ○ ○ × pBS7-7B 5'-TAAGGCCCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-7C 5'-TAAGGCTCAGCG-3' ○ ○ ○ × ○ × × pBS7-8A 5'-TAAGGCGAAGCG-3' ○ ○ ○ ○ × × × pBS7-8B 5'-TAAGGCGGAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-8C 5'-TAAGGCGTAGCG-3' ○ ○ ○ × × × × pBS7-9A 5'-TAAGGCGCCGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-9B 5'-TAAGGCGCGGCG-3' ○ ○ ○ × ○ ○ × pBS7-9C 5'-TAAGGCGCTGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-10A 5'-TAAGGCGCAACG-3' ○ × ○ ○ ○ × × pBS7-10B 5'-TAAGGCGCACCG-3' ○ ○ ○ ○ × ○ × pBS7-10C 5'-TAAGGCGCATCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ ○ × pBS7-11A 5'-TAAGGCGCAGAG-3' ○ ○ × ○ × × × pBS7-11B 5'-TAAGGCGCAGGG-3' ○ ○ ○ ○ ○ × × pBS7-11C 5'-TAAGGCGCAGTG-3' ○ ○ ○ ○ × ○ × pBS7-12A 5'-TAAGGCGCAGCA-3' ○ ○ × × × × × pBS7-12B 5'-TAAGGCGCAGCC-3' ○ × × × × × × pBS7-12C 5'-TAAGGCGCAGCT-3' ○ ○ × ○ × × × PCRのかからなかった数 0 2 4 7 14 19 36 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 得られた結果は、一般的に、低温であるほどミスマッチ
に基づくハイブリダイズが生じていることを示す。さら
に、通常のＰＣＲ反応温度条件では１塩基ミスマッチプ
ローブは高い確率で被検体核酸にハイブリダイズ可能で
あることを示す。

【００６９】さらに、表は、完全塩基配列のうち２塩基
のをミスマッチさせた塩基配列のいくつかを有するプロ
ーブを用いた結果(5’側から1,2 or 2,3 or 3,4 or 4,5
or8,9 or 9,10 or 10,11 番目の2塩基ずつがミスマッ
チになるようにプライマーを作製。

【００７０】,Reverse Primer : pBS R12 5'-ATACCGTC
GACC-3'、Forward Primer : pBS800-75'-TAAGGCGCAGCG-
3'、PCR Product : 777bp）を示す。

【００７１】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ プライマー ＰＣＲ反応温度 59.4 60.4 61.4 62.4 63.4 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− pBS800-7 5'-TAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12A 5'-AGAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12B 5'-ATAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12C 5'-ACAGGCGCAGCG-3' ○ × × × × pBS800-12D 5'-CGAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12E 5'-CTAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × ○ pBS800-12F 5'-CCAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × ○ pBS800-12G 5'-GGAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12H 5'-GTAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-12J 5'-GCAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × ○ pBS800-23A 5'-TCGGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-23B 5'-TCTGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-23C 5'-TCCGGCGCAGCG-3' ○ ○ × ○ × pBS800-23D 5'-TGGGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-23E 5'-TGTGGCGCAGCG-3' ○ ○ × ○ × pBS800-23F 5'-TGCGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-23G 5'-TTGGGCGCAGCG-3' ○ ○ × ○ × pBS800-23H 5'-TTTGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ ○ ○ pBS800-23J 5'-TTCGGCGCAGCG-3' ○ ○ × ○ × pBS800-34A 5'-TACTGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × × pBS800-34B 5'-TACCGCGCAGCG-3' × × × × × pBS800-34C 5'-TACAGCGCAGCG-3' ○ × × × × pBS800-34D 5'-TAGTGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × × pBS800-34E 5'-TAGCGCGCAGCG-3' ○ × ○ × × pBS800-34F 5'-TAGAGCGCAGCG-3' △ × × × × pBS800-34G 5'-TATTGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × × pBS800-34H 5'-TATCGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ × × pBS800-34J 5'-TATAGCGCAGCG-3' ○ ○ × × × pBS800-45A 5'-TAAATCGCAGCG-3' × × × × × pBS800-45B 5'-TAAACCGCAGCG-3' × ○ ○ × × pBS800-45C 5'-TAAAACGCAGCG-3' × × × × × pBS800-45D 5'-TAACTCGCAGCG-3' × ○ × × × pBS800-45E 5'-TAACCCGCAGCG-3' ○ ○ × × × pBS800-45F 5'-TAACACGCAGCG-3' × ○ × × × pBS800-45G 5'-TAATTCGCAGCG-3' × × × × × pBS800-45H 5'-TAATCCGCAGCG-3' × × × × × pBS800-45J 5'-TAATACGCAGCG-3' × × × × × pBS800-89A 5'-TAAGGCGAGGCG-3' × ○ × × × pBS800-89B 5'-TAAGGCGATGCG-3' × × × × × pBS800-89C 5'-TAAGGCGACGCG-3' △ × × × × pBS800-89D 5'-TAAGGCGGGGCG-3' ○ × × × × pBS800-89E 5'-TAAGGCGGTGCG-3' × × × ○ ○ pBS800-89F 5'-TAAGGCGGCGCG-3' × × × × × pBS800-89G 5'-TAAGGCGTGGCG-3' × × × × × pBS800-89H 5'-TAAGGCGTTGCG-3' × × × × × pBS800-89J 5'-TAAGGCGTCGCG-3' × ○ × × × pBS800-910A 5'-TAAGGCGCGTCG-3' × × × × × pBS800-910B 5'-TAAGGCGCGCCG-3' × × × × × pBS800-910C 5'-TAAGGCGCGACG-3' × × × × × pBS800-910D 5'-TAAGGCGCTTCG-3' × × × × × pBS800-910E 5'-TAAGGCGCTCCG-3' × × × × × pBS800-910F 5'-TAAGGCGCTACG-3' × × × × × pBS800-910G 5'-TAAGGCGCCTCG-3' × × × × × pBS800-910H 5'-TAAGGCGCCCCG-3' × × × × × pBS800-910J 5'-TAAGGCGCCACG-3' × × × × × pBS800-1011A 5'-TAAGGCGCATAG-3' × × × × × pBS800-1011B 5'-TAAGGCGCATGG-3' × × × × × pBS800-1011C 5'-TAAGGCGCATTG-3' × × × × × pBS800-1011D 5'-TAAGGCGCACAG-3' ○ × × × × pBS800-1011E 5'-TAAGGCGCACGG-3' × × × × × pBS800-1011F 5'-TAAGGCGCACTG-3' × × × × × pBS800-1011G 5'-TAAGGCGCAAAG-3' × × × × × pBS800-1011H 5'-TAAGGCGCAAGG-3' × × × × × pBS800-1011J 5'-TAAGGCGCAATG-3' × × × × × PCRのかからなかった数（63サンプル中） 35 37 44 48 48 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 得られた結果は、一般的に、低温であるほどミスマッチ
に基づくハイブリダイズが増加する傾向が同じく見ら
れ、さらに３’末端部近辺ミスマッチがあるプライマが
５’末端部近辺にミスマッチがあるプライマーよりもＰ
ＣＲ反応が進行しないのは、ミスマッチハイブリダイズ
にみならず、ポリメラーゼ反応が進行しないことも原因
と考えられる。５’末端部近辺にミスマッチのあるプロ
ーブは高い確率でハイブリダイズ可能であることを示
す。シーケンス可能なアニーリング温度は、当プローブ
では61.4℃が限界だと考えられる。ＧＣ含量によりこの
温度は変化する。

【００７２】さらに、表は、完全塩基配列のうち３塩基
をミスマッチさせた塩基配列のいくつかを有するプロー
ブを用いた結果(F-Primer の5'末端側から3つの塩基を
各々、ミスマッチに変えたプライマーを使用した）を示
す。

【００７３】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ プライマー ＰＣＲ反応温度 59.4 60.4 61.4 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− pBS 800-7 5'-TAAGGCGCAGCG-3' ○ ○ ○ pBS 777-1 5'-ATCGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-2 5'-ATTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-3 5'-ATGGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-4 5'-ACCGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-5 5'-ACTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-6 5'-ACGGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-7 5'-AGCGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-8 5'-AGTGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-9 5'-AGGGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-10 5'-CTCGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-11 5'-CTTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-12 5'-CTGGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-13 5'-CCCGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-14 5'-CCTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-15 5'-CCGGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-16 5'-CGCGGCGCAGCG-3' × × × pBS 777-17 5'-CGTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-18 5'-CGGGGCGCAGCG-3' × × × pBS 777-19 5'-GTCGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-20 5'-GTTGGCGCAGCG-3' ○ ○ × pBS 777-21 5'-GTGGGCGCAGCG-3' × ○ × pBS 777-22 5'-GCCGGCGCAGCG-3' × × × pBS 777-23 5'-GCTGGCGCAGCG-3' × × × pBS 777-24 5'-GCGGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-25 5'-GGCGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-26 5'-GGTGGCGCAGCG-3' ○ × × pBS 777-27 5'-GGGGGCGCAGCG-3' ○ × × PCRのかからなかった数 5 20 27 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 得られた結果は、一般的に、低温であるほどミスマッチ
に基づくハイブリダイズが増加する傾向が同じく見ら
れ、さらに１２塩基のうち３塩基ミスマッチがあるプラ
イマでさえもＰＣＲ反応が進行することは、３塩基ミス
マッチがあるプローブでさえも被検体核酸とハイブリダ
イズ可能であることを示す。

【００７４】以上の結果に基づき、被検体核酸と通常の
ハイブリダイズ条件でミスマッチハイブリダイズする可
能性があるのは、１塩基のみならず、２塩基、さらには
条件により３塩基のミスマッチプローブでも可能である
ことが示される。さらに、ミスマッチハイブリダイズ
は、ハイブリダイズ条件、特に温度に大きく依存するこ
とが見出される。さらに、ハイブリダイズ体の安定性
は、ＧＣ含量にも依存することは知られている。

【００７５】（実施例）本発明に係る方法に基づいて、
最も確からしい塩基配列情報から、被検体核酸の塩基配
列決定を、pBluescriptII（Stratagene社）の一部を用
いて実施した。

【００７６】使用した、被検体核酸のプローブ側の塩基
配列は、5'-ACCggATAAggCgCAgCggTCgggCTgAACggggggTTC
gTgCACACAgCCCAgCTTggAgCgAACgA-3' であり、これに対
し１塩基ずつずれた１２塩基配列プローブを以下のよう
に合成して用いた。これらのプライマー及び約750塩基
下流部分に対するリバースプライマ（以下表中に示す）
を使用することで約730〜780塩基の伸張反応を起こす。
得られたＰＣＲ増幅産物はABIシーケンサーのゲル電気
泳動し、バンド位置を標準マーカの位置を規準に測定し
た。

【００７７】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ Formward Primer Reverse Primer 5'-ATACCGTCGACC-3' プライマ番号 プライマ 1 5'-ACCggATAAggC-3' 2 5'-CCggATAAggCg-3' 3 5'-CggATAAggCgC-3' 4 5'-ggATAAggCgCA-3' 5 5'-gATAAggCgCAg-3' 6 5'-ATAAgCggCAgC-3' 7 5'-TAAggCgCAgCg-3' 8 5'-AAggCgCAgCgg-3' 9 5'-AggCgCAgCggT-3' 10 5'-ggCgCAgCggTC-3' 11 5'-gCgCAgCggTCg-3' 12 5'-CgCAgCggTCgg-3' 13 5'-gCAgCggTCggg-3' 14 5'-CAgCggTCgggC-3' 15 5'-AgCggTCgggCT-3' 16 5'-gCggTCgggCTg-3' 17 5'-CggTCgggCTgA-3' 18 5'-ggTCgggCTgAA-3' 19 5'-gTCgggCTgAAC-3' 20 5'-TCgggCTgAACg-3' 21 5'-CgggCTgAACgg-3' 22 5'-gggCTgAACggg-3' 23 5'-ggCTgAACgggg-3' 24 5'-gCTgAACggggg-3' 25 5'-CTgAACgggggg-3' 26 5'-TgAACggggggT-3' 27 5'-gAACggggggTT-3' 28 5'-AACggggggTTC-3' 29 5'-ACggggggTTCg-3' 30 5'-CggggggTTCgT-3' 31 5'-ggggggTTCgTg-3' 32 5'-gggggTTCgTgC-3' 33 5'-ggggTTCgTgCA-3' 34 5'-gggTTCgTgCAC-3' 35 5'-ggTTCgTgCACA-3' 36 5'-gTTCgTgCACAC-3' 37 5'-TTCgTgCACACA-3' 38 5'-TCgTgCACACAg-3' 39 5'-CgTgCACACAgC-3' 40 5'-gTgCACACAgCC-3' 41 5'-TgCACACAgCCC-3' 42 5'-gCACACAgCCCA-3' 43 5'-CACACAgCCCAg-3' 44 5'-ACACAgCCCAgC-3' 45 5'-CACAgCCCAgCT-3' 46 5'-ACAgCCCAgCTT-3' 47 5'-CAgCCCAgCTTg-3' 48 5'-AgCCCAgCTTgg-3' 49 5'-gCCCAgCTTggA-3' 50 5'-CCCAgCTTggAg-3' −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 伸張反応の結果を以下の表に、計算値とともに示した。
いくつかのプライマーはＰＣＲ反応を全く示さないこと
が見出されたが、ＰＣＲ反応条件、またはプローブの構
造に基づくものと考えられる。計算値との差は測定誤差
とするとＣＶとして約2.7％となる。

【００７８】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ プローブ番号 プローブ 伸張反応結果 計算値 差 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 16 gCggTCgggCTg 820.73 768 -52.73 20 TCgggCTgAACg 808.75 764 -44.75 17 CggTCgggCTgA 807.46 767 -40.46 44 ACACAgCCCAgC 778.81 740 -38.81 49 gCCCAgCTTggA 764.93 735 -29.93 26 TgAACggggggT 783.56 758 -25.56 19 gTCgggCTgAAC 790.08 765 -25.08 38 TCgTgCACACAg 770.12 746 -24.12 14 CAgCggTCgggC 792.7 770 -22.7 40 gTgCACACAgCC 765.74 744 -21.74 43 CACACAgCCCAg 759.53 741 -18.53 42 gCACACAgCCCA 760.09 742 -18.09 50 CCCAgCTTggAg 749.78 734 -15.78 2 CCggATAAggCg 797.35 782 -15.35 39 CgTgCACACAgC 758.97 745 -13.97 47 CAgCCCAgCTTg 749.8 737 -12.8 5 gATAAggCgCAg 789.52 779 -10.52 10 ggCgCAgCggTC 782 774 -8 25 CTgAACgggggg 766.4 759 -7.4 41 TgCACACAgCCC 750.19 743 -7.19 28 AACggggggTTC 762.76 756 -6.76 23 ggCTgAACgggg 767.75 761 -6.75 24 gCTgAACggggg 766.4 760 -6.4 30 CggggggTTCgT 759.41 754 -5.41 15 AgCggTCgggCT 773.21 769 -4.21 9 AggCgCAgCggT 779.12 775 -4.12 6 ATAAggCgCAgC 781.63 778 -3.63 1 ACCggATAAggC 786.44 783 -3.44 33 ggggTTCgTgCA 752.81 751 -1.81 7 TAAggCgCAgCg 778.55 777 -1.55 32 gggggTTCgTgC 752.58 752 -0.58 22 gggCTgAACggg 761.53 762 0.47 8 AAggCgCAgCgg 775.43 776 0.57 11 gCgCAgCggTCg 772.29 773 0.71 36 gTTCgTgCACAC 745.14 748 2.86 37 TTCgTgCACACA 739.66 747 7.34 4 ggATAAggCgCA 772.47 780 7.53 35 ggTTCgTgCACA 739.16 749 9.84 13 gCAgCggTCggg 759.54 771 11.46 34 gggTTCgTgCAC 737.04 750 12.96 12 CgCAgCggTCgg 752.15 772 19.85 18 ggTCgggCTgAA 738.57 766 27.43 3 CggATAAggCgC 743.68 781 37.32 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 上で得られた伸張量の順に各プライマーを並べると以下
の表に示す結果となる。

【００７９】前記伸張反応が完全でありかつその測定誤
差が無い場合には、上記の順は各プライマー１から５０
になることとなるが、実際は上で見られるように伸張反
応が不完全でありまた、その測定誤差もあることに基づ
くものである。

【００８０】さらに、上記の各プローブを、その塩基の
うち６塩基数以上が重なるものであり、かつ前記測定誤
差以内という条件で並べると配列が決定される。

【００８１】さらに、１０塩基が重なり、かつ測定誤差
以内いう条件で並べたものが以下に示されている。

【００８２】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ プロー番号 プローブ 伸張反応 計算値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 1 ACCggATAAggC 786.44 783 2 CCggATAAggCg 797.35 782 3 CggATAAggCgC 743.68 781 4 ggATAAggCgCA 772.47 780 5 gATAAggCgCAg 789.52 779 6 ATAAggCgCAgC 781.63 778 7 TAAggCgCAgCg 778.55 777 8 AAggCgCAgCgg 775.43 776 9 AggCgCAgCggT 779.12 775 10 ggCgCAgCggTC 782 774 11 gCgCAgCggTCg 772.29 773 12 CgCAgCggTCgg 752.15 772 13 gCAgCggTCggg 759.54 771 14 CAgCggTCgggC 792.7 770 15 AgCggTCgggCT 773.21 769 16 gCggTCgggCTg 820.73 768 17 CggTCgggCTgA 807.46 767 18 ggTCgggCTgAA 738.57 766 19 gTCgggCTgAAC 790.08 765 20 TCgggCTgAACg 808.75 764 21 22 gggCTgAACggg 761.53 762 23 ggCTgAACgggg 767.75 761 24 gCTgAACggggg 766.4 760 25 CTgAACgggggg 766.4 759 26 TgAACggggggT 783.56 758 27 28 AACggggggTTC 762.76 756 29 30 CggggggTTCgT 759.41 754 31 ggggggTTCgTg 759.41 754 32 gggggTTCgTgC 752.58 752 33 ggggTTCgTgCA 752.81 751 34 gggTTCgTgCAC 737.04 750 35 ggTTCgTgCACA 739.16 749 36 gTTCgTgCACAC 745.14 748 37 TTCgTgCACACA 739.66 747 38 TCgTgCACACAg 770.12 746 39 CgTgCACACAgC 758.97 745 40 gTgCACACAgCC 765.74 744 41 TgCACACAgCCC 750.19 743 42 gCACACAgCCCA 760.09 742 43 CACACAgCCCAg 759.53 741 44 ACACAgCCCAgC 778.81 740 45 46 47 CAgCCCAgCTTg 749.8 737 48 49 gCCCAgCTTggA 764.93 735 50 CCCAgCTTggAg 749.78 735 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 表から、全てがつながってはいないが、つながったもの
をグループ化すると目視にて被検体核酸を決定すること
が明らかである。この際、ハイブリダイズせずに伸張量
が測定できなかったプローブが存在しても充分他のプロ
ーブからの情報に基づいて決定することが可能であるこ
とを示す。

【００８３】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：68 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ACCggATAAg gCgCAgCggT CgggCTgAAC ggggggTTCg TgCACACAgC CCAgCTTggA 60 gCgAACgA 68 配列番号：2 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATACCGTCGA CC 12 配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ACCggATAAg gC 12 配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CCggATAAgg Cg 12 配列番号：4 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CggATAAggC gC 12 配列番号：5 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggATAAggCg CA 12 配列番号：6 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gATAAggCgC Ag 12 配列番号：7 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATAAgCggCA gC 12 配列番号：8 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TAAggCgCAg Cg 12 配列番号：9 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AAggCgCAgC gg 12 配列番号：10 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AggCgCAgCg gT 12 配列番号：11 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggCgCAgCgg TC 12 配列番号：12 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCgCAgCggT Cg 12 配列番号：13 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CgCAgCggTC gg 12 配列番号：14 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCAgCggTCg gg 12 配列番号：15 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CAgCggTCgg gC 12 配列番号：16 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AgCggTCggg CT 12 配列番号：17 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCggTCgggC Tg 12 配列番号：18 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CggTCgggCT gA 12 配列番号：19 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggTCgggCTg AA 配列番号：20 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gTCgggCTgA AC 12 配列番号：21 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TCgggCTgAA Cg 12 配列番号：22 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CgggCTgAAC gg 12 配列番号：23 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gggCTgAACg gg 12 配列番号：24 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggCTgAACgg gg 12 配列番号：25 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCTgAACggg gg 12 配列番号：26 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CTgAACgggg gg 12 配列番号：27 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TgAACggggg gT 12 配列番号：28 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gAACgggggg TT 12 配列番号：29 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AACggggggT TC 12 配列番号：30 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ACggggggTT Cg 12 配列番号：31 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CggggggTTC gT 12 配列番号：32 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggggggTTCg Tg 12 配列番号：33 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gggggTTCgT gC 12 配列番号：34 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggggTTCgTg CA 12 配列番号：35 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gggTTCgTgC AC 配列番号：36 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ggTTCgTgCA CA 配列番号：37 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gTTCgTgCAC AC 12 配列番号：38 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TTCgTgCACA CA 12 配列番号：39 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TCgTgCACAC Ag 12 配列番号：40 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CgTgCACACAgC 12 配列番号：41 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gTgCACACAg CC 12 配列番号：42 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TgCACACAgC CC 12 配列番号：43 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCACACAgCC CA 12 配列番号：44 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CACACAgCCC Ag 12 配列番号：45 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ACACAgCCCA gC 12 配列番号：46 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CACAgCCCAg CT 12 配列番号：47 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ACAgCCCAgC TT 12 配列番号：48 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CAgCCCAgCT Tg 12 配列番号：49 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AgCCCAgCTT gg 12 配列番号：50 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 gCCCAgCTTg gA 12 配列番号：51 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CCCAgCTTgg Ag 12

【図面の簡単な説明】

【図１】ミスマッチなく、完全相補的なプローブのみが
被検体とハイブリダイズ体を形成する場合における本発
明に係る方法を示す模式図である。

【図２】１塩基のみミスマッチが生じたにもかかわらず
被検体とハイブリダイズ体を形成する場合における本発
明に係る方法を示す模式図である。

【図３】２塩基ミスマッチが生じたにもかかわらず被検
体とハイブリダイズ体を形成する場合における本発明に
係る方法を示す模式図である。

【図４】ミスマッチ、及び測定誤差がある場合に、被検
体とハイブリダイズ体を形成する場合における本発明に
係る方法を示す模式図である。

【図５】ミスマッチがある場合に、本発明に係る方法に
より最も確からしい配列の順が決定されることを示す模
式図である。

【図６】ミスマッチ、及び測定誤差がある場合に、本発
明に係る方法により最も確からしい配列の順が決定され
ることを示す模式図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一重鎖の被検核酸の塩基配列決定方法に
   おいて、ｋ個の塩基配列の全ての組合せからなるプライ
   マーとしての４^K個のオリゴヌクレオチドプローブを分
   離して配置する第１のステップと、前記プローブと前記
   被検核酸とをハイブリダイズしてハイブリダイズ体を形
   成する第２のステップと、前記被検核酸を鋳型とし、前
   記プローブをプライマーとする伸長反応を行う第３のス
   テップと、前記伸長反応により前記プライマーの伸長量
   を測定する第４のステップと、前記伸長量に基づき前記
   被検体の塩基配列を決定する第５のステップとを含む方
   法。
2. 【請求項２】 前記第４のステップにおけるプライマー
   の伸張量の測定を、前記第３のステップの伸張反応に伴
   う遊離ピロリン酸と、ＡＰＳとの反応に基づくＡＴＰの
   ルシフェラーゼ反応に伴う発光量を検出することにより
   行うことを特徴とする請求項１に記載の核酸塩基配列決
   定方法。
3. 【請求項３】 前記第４のステップにおけるプライマー
   の伸張量の測定を、前記伸張反応に伴い取り込まれた蛍
   光ラベルしたデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮ
   ＴＰ）の蛍光発光量を検出することにより行うことを特
   徴とする請求項１に記載の核酸塩基配列決定方法。
4. 【請求項４】 前記第５のステップが、さらに同一の前
   記伸張量（Ｉ_i）を有する前記プライマーからなるグル
   ープＧ_iに属する任意のプライマーを選択し、前記選択
   されたプライマーの塩基配列と、前記グループＧ_iに属
   する他の全てのプライマーの塩基配列とを比較して、１
   塩基のみ異なるプライマーを選択し、前記任意のプライ
   マーの塩基配列および前記１塩基のみ異なるプライマー
   の塩基配列を比較して、対応する各位置で最も出現頻度
   の高い塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，又はＣ）を選択して、前記グ
   ループＧ_iの真の塩基配列を決定するステップと、前記
   決定されたＧ_iの真の塩基配列を、前記伸張量の順に並
   べることにより被検体核酸の塩基配列を決定するステッ
   プとを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   に記載の核酸塩基配列決定方法。
5. 【請求項５】 前記第５のステップが、さらに同一の前
   記伸張量（Ｉ_i）を有する前記プライマーからなるグル
   ープＧ_iにおいて、前記Ｇ_iに属する任意の１つのプライ
   マーの塩基配列と、前記グループＧ_iに属する他の全て
   のプライマーの塩基配列とを比較して、１塩基のみ異な
   るプライマーを選別し、前記任意のプライマーの塩基配
   列および前記１塩基のみ異なるプライマーの塩基配列を
   比較して、対応する各位置で最も出現頻度の高い塩基
   （Ａ，Ｔ，Ｇ，又はＣ）を選択して決定された真の塩基
   配列を有するプライマーを見出す第６のステップと、前
   記ステップ６で選別されなかった全てのプライマーにつ
   いて前記ステップ６を繰りかえすことにより、前記グル
   ープＧ_iに属するプライマーの真の塩基配列を有するプ
   ライマーを選択するステップ７と、前記ステップ７で選
   択されたプライマーの塩基配列が最も重なるように並べ
   て前記グループＧ_iの真の塩基配列を決定するステップ
   ８と、前記ステップ８で得られた各グループＧ_iの真の
   塩基配列を塩基配列が最も重なるように並べて被検体核
   酸の塩基配列を決定するステップ９とを有することを特
   徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸塩基配列
   決定方法。
6. 【請求項６】 一重鎖の被検核酸の塩基配列決装置にお
   いて、プライマー（オリゴヌクレオチド）を複数の領域
   に種類ごとに分離して配置する手段と、前記プライマー
   と前記被検核酸とをハイブリダイズしてハイブリダイズ
   体を形成する手段と、前記被検核酸を鋳型にした前記プ
   ライマーの５´から３´方向への伸張反応を行う手段
   と、前記伸張反応に基づき前記プライマーの伸張量を測
   定する手段と、前記伸張量から前記被検体核酸の塩基配
   列を決定する手段とを有することを特徴とする核酸塩基
   配列決定装置。