KR20120122930A

KR20120122930A - ＮＰＭ1 유전자의 ｅｘｏｎ12 변이의 검출용 프로브 및 그 용도

Info

Publication number: KR20120122930A
Application number: KR1020120043790A
Authority: KR
Inventors: 도시야 호소미
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2012-11-07
Also published as: US20120276534A1; KR101660322B1; EP2518164B1; US8877910B2; CN102758007A; EP2518164A1; JP2012235777A; JP5940874B2

Abstract

[과제] 본 발명은, NPM1 유전자의 exon12 변이를 검출하기에 유효한 프로브를 특정하여, NPM1 유전자의 exon12 변이를 검출하는 방법, 및 그를 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결수단] NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P5 및 P5'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브. (P5) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및 (P5') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

Description

ＮＰＭ1 유전자의 ｅｘｏｎ12 변이의 검출용 프로브 및 그 용도{PROBE FOR DETECTING MUTATION IN EXON12 OF NPM1 GENE AND USE THEREOF}

본 발명은, NPM1 유전자의 exon12 변이를 검출하는 방법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트에 관한 것이다.

급성 골수성 백혈병(AML)의 병인(病因)에 관련하는 DNA 변이는 다수 발견되어 있다. NPM1 유전자 변이는 성인의 급성 골수성 백혈병 환자에게 발견되고, FLT3-ITD 유전자 변이의 결과와 조합하여 생각함으로써 예후 예측에 관련하는 것이 보고되어 있다(Blood. 2007;109 : 874-885). NPM1 유전자의 변이 타입으로서는, 예를 들면, New Eng J Med 352 : 254-266, 2005, Blood. 2005;106 : 1419-1422, Blood. 2005;106 : 3740-3746, Blood. 2005;106 : 3733-3739, Blood. 2006;108 : 1999-2005, Blood. 2005;106 : 2854-2861에 기재되어 있어, 보고 증례수(症例數)의 많음이나 변이가 일어나는 염기 서열 개소에서 대표적인 변이로서는, 타입A, 타입B, 타입D, 타입7, 타입Q, 타입10, 타입E, 타입6 등을 들 수 있다.

염기의 다형을 검출하는 방법으로서는, 이하의 방법이 알려져 있다.

Blood. 2005;106 : 2854-2861에는, PCR로 증폭한 후에 전기 영동(泳動)으로 분리하고, 거기에서 잘라낸 겔로부터 증폭 산물을 정제하고, 다이렉트 시퀀스하는 방법이 기재되어 있다. Haematologica 2007;92 : 1268-1269에는, DHPLC법과 시퀀스법에 의해 검출하는 방법이 기재되어 있다.

그러나, 이들의 방법은, (1) 증폭 산물을 취출(取出)하므로, 콘태미네이션(contamination)의 위험성이 있고, (2) 조작이 자동화되어 있지 않고, 또한 각 항목 각각에 대하여 조작이 필요하므로, 수고와 비용을 필요로 하고, (3) 결과 해석에 전문 지식이나 전문 스킬을 필요로 하며, 그리고, (4) 시퀀스 해석의 검출 특이성은 20% 정도로 낮기 때문에, 정상 세포의 비율이 많은 암 세포에서는, 검출이 어렵다는 문제가 있었다.

한편, 변이를 포함하는 영역을 PCR로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 변이를 해석하는 방법이 알려져 있다(일본 특개2001-286300호 공보, 일본 특개2002-119291호 공보). 이들의 문헌에 있어서는, 프로브의 설계에 관하여, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광 프로브가 표적 핵산에 하이브리다이제이션했을 때, 말단 부분에 있어서 프로브-핵산 하이브리드의 복수 염기쌍이 적어도 하나의 G와 C의 페어를 형성하도록 설계한다는 교시는 있다. 그러나, 이들의 방법은 실시하기에 있어서 모든 임의 서열에서 실시 가능하지 않다는 문제가 있었다.

본 발명은, NPM1 유전자의 exon12 변이를 검출하기에 유효한 프로브를 특정하고, NPM1 유전자의 exon12 변이를 검출하는 방법, 및 그것을 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, NPM1 유전자의 exon12 변이를 포함하는 특정한 영역에 의거하여 프로브를 설계하고, 당해 프로브를 사용하는 융해 곡선 분석을 행하는 것에 의해 당해 변이를 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2 및 P2'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

(P5) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P5') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P6) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P6') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P7) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 154번째에 대응하는 염기가 티민이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P7') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 154번째에 대응하는 염기가 티민이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P1) 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 135?150을 포함하는 16?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열이며, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P1') 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 135?150을 포함하는 16?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P2) 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 164?182를 포함하는 19?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열이며, 염기 번호 182에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및

(P2') 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 164?182를 포함하는 19?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 182에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(2) P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 가지고,

P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 갖는, (1) 기재의 프로브.

(3) P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는, (1) 기재의 프로브.

(4) P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 153-156의 어느 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 153-156의 어느 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는, (1) 기재의 프로브.

(5) P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 162를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 155를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 156을 3' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는, (1) 기재의 프로브.

(6) 상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, (1)?(5)의 어느 한 항에 기재된 프로브.

(7) 상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는, (6) 기재의 프로브.

(8) 상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, (1)?(7)의 어느 한 항에 기재된 프로브.

(9) P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12?35이며, P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 16?35이며, P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드가 19?35인, (1)?(8)의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(10) NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, (1)?(9)의 어느 한 항에 기재된 프로브를 적어도 1종 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

(11) NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정(Ⅰ)?(Ⅳ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

(Ⅰ) 핵산을 함유하는 시료에, (1)?(9)의 어느 한 항에 기재된 프로브를 첨가하여 상기 핵산에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,

(Ⅱ) 온도를 변화시켜서 상기 핵산과 상기 프로브의 하이브리드 형성체를 해리시켜, 하이브리드 형성체의 해리에 의거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의 Tm값을 검출하는 공정, 및

(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 공정.

(12) (Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 더 포함하는, (11)에 기재된 방법.

(13) (10)?(12)의 어느 한 항에 기재된 방법에 의해, NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및 다형의 유무를 결정하는 공정을 포함하는, 급성 골수성 백혈병에 걸리기 쉬움, 병태 및/또는 예후를 분석하는 방법.

(14) (1)?(9)의 어느 한 항에 기재된 프로브를 포함하는, NPM1 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트.

(15) NPM1 유전자의 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는, (14)에 기재된 시약 키트.

(16) 상기 프라이머가, 하기 P3 및 P4 및 P3' 및 P4'에서 선택되는 다형 검출용 프라이머인, (14) 또는 (15)에 기재된 시약 키트.

(P3) 106번째의 염기T를 3' 말단으로 하고 서열 번호 1에 상동적인 10?50 염기의 올리고뉴클레오티드, 및

(P4) 205번째의 염기T를 3' 말단으로 하고 서열 번호 1의 상보쇄에 상동성을 갖는 10?50 염기의 올리고뉴클레오티드 및

(P3') 106번째의 염기T를 3' 말단으로 하고 서열 번호 1의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 10?50 염기의 올리고뉴클레오티드, 및

(P4') 205번째의 염기T를 3' 말단으로 하고 서열 번호 1의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 10?50 염기의 올리고뉴클레오티드.

본 발명의 프로브를 첨가하여 융해 곡선 분석(Tm 해석)을 행하는 것만으로 NPM1 유전자의 exon12의 변이의 검출이 가능하게 된다. 본 발명의 프로브는, 특이성이 높고, 검출 감도가 높다. 본 발명의 방법을 사용하는 것에 의해, PCR을 행하는 경우에도, 증폭 산물을 취출할 필요가 없기 때문에, 콘태미네이션의 위험성이 거의 없다. 또한, 본 발명의 방법은, 조작이 간단하므로 자동화가 용이하다. 본 발명의 프로브를 사용하면, 현재 보고되어 있는 변이 중 대표적인 8개의 변이 타입 중, 7개의 변이가 식별 가능하다. 또한 대표적인 2개의 변이 타입(타입A, E)에 대해서는, 야생형(野生型)에 포함되는 변이가 10%여도 검출 가능하다.

[도 1] (A) 핵산 혼합물의 융해 곡선, 및 (B) 미분 융해 곡선의 일례를 나타니는 도면이다.
[도 2] 검량선(檢量線)의 일례를 나타내는 도면이다.
[도 3] 본 발명의 프로브의 설계 개략도를 나타낸다. 실시예에 있어서 사용되는 본 발명의 프로브의 위치를 나타낸다. 또한, 비교예에 있어서 사용되는 프로브의 위치를 나타낸다.
[도 4] 실시예1의 WT(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(3T-NPM1-e12-R1)의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 세로축으로 하고, 온도를 가로축으로 하여, 이들의 관계를 나타낸다. 이하의 도에 있어서도, 세로축과 가로축의 관계는 마찬가지이다.
[도 5] 실시예1의 mt typeA(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R1)을 사용했다.
[도 6] 실시예1의 mt typeB(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R1)을 사용했다.
[도 7] 실시예1의 mt typeD(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R1)을 사용했다.
[도 8] 실시예1의 mt type7(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R1)을 사용했다.
[도 9] 실시예1의 WT(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)를 사용했다.
[도 10] 실시예1의 mt typeQ(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)를 사용했다.
[도 11] 실시예1의 mt type10(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)를 사용했다.
[도 12] 실시예1의 mt typeE(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)를 사용했다.
[도 13] 실시예1의 mt type6(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)를 사용했다.
[도 14] 비교예1의 WT(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 15] 비교예1의 mt typeA(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 16] 비교예1의 mt typeB(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 17] 비교예1의 mt typeD(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 18] 비교예1의 mt type7(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 19] 비교예1의 mt typeQ(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 20] 비교예1의 mt type10(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 21] 비교예1의 mt typeE(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 22] 비교예1의 mt type6(상보쇄 올리고뉴클레오티드)에 대한 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 23] 실시예2의 혈액 검체에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 24] 실시예2의 WT 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 25] 실시예2의 mt typeA 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 26] 실시예2의 mt typeA 30%, Wt 70%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 27] 실시예2의 mt typeA 20%, Wt 80%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 28] 실시예2의 mt typeA 10%, Wt 90%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 29] 실시예2의 mt typeE 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 30] 실시예2의 mt typeE 30%, Wt 70%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 31] 실시예2의 mt typeE 20%, Wt 80%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 32] 실시예2의 mt typeE 10%, Wt 90%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(3FL-NPM1-e12-R1)(좌측 도면)과 TAMRA(5T-NPM1-e12-R2)(우측 도면)를 사용했다.
[도 33] 비교예2의 혈액 검체에 관한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 34] 비교예2의 Wt 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 35] 비교예2의 mt typeA 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 36] 비교예2의 mt typeA 20%, Wt 80%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 37] 비교예2의 mt typeE 100%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 38] 비교예2의 mt typeE 20%, Wt 80%(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(3T-NPM1-e12-R3)을 사용했다.
[도 39] 실시예4의 mt typeA(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 Pacific Blue(mtA-R4)을 사용했다.
[도 40] 실시예4의 mt typeA(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 TAMRA(mtB-R5)을 사용했다.
[도 41] 실시예4의 mt typeA(플라스미드)에 대한 PCR 반응 후의 Tm 해석에 있어서, 프로브로 BODIPY FL(mtD-R6)을 사용했다.

<1> 본 발명 프로브 및 본 발명 검출 방법

본 발명 프로브는, NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (P5), (P5'), (P6), (P6'), (P7), (P7'), (P1), (P1'), (P2), 및 (P2')로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브이다.

본 발명 프로브는, 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열(NPM1 유전자의 exon12의 변이 타입A의 염기를 갖는 서열)에 있어서 상기 (P5), (P5'), (P6), (P6'), (P7), (P7')로 특정된 서열을 가지고, (P6), (P6')에 대해서는, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, (P7), (P7')에 대해서는, 또한 염기 번호 154번째에 대응하는 염기가 티민인 것 이외는, 특허문헌 1, 2에 기재된 소광 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다. 또한, 본 발명 프로브는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열(NPM1 유전자의 exon12의 야생형의 염기를 갖는 서열)에 있어서 상기 (P1), (P1'), (P2) 및 (P2')로 특정된 서열을 가지는 것 외에는, 특허문헌 1, 2에 기재된 소광 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다. 또, 본 발명의 서열 번호 1에 나타내는 서열은, GenBank의 액세션 넘버NG_016018의 27689번째?28278번째이다. 또한, 서열 번호 2에 나타내는 서열은, 염기 번호 153?157번째의 4염기가 부가되어 있는 점에서만 서열 번호 1에 나타내는 서열과 다르다.

본 발명의 프로브의 길이로서는, P5, P5', P6, P6', P7, P7'에 대해서는, 예를 들면, 12?50 염기길이, 12?35 염기길이, 또는 12?30 염기길이이다. P1, P1'에 대해서는, 예를 들면, 16?50 염기길이, 16?35 염기길이, 또는 16?30 염기길이이다. P2, P2'에 대해서는, 예를 들면, 19?50 염기길이, 19?35 염기길이, 또는 19?30 염기길이이다.

본 발명 프로브는, 예를 들면, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 153-156(하기 표 1의 gcag)의 어느 염기에 대응하는 염기를 말단으로 하는 프로브이며, P1, P1'에 대해서는, 염기 번호 153-156의 어느 염기를 5' 말단으로 하고, P2, P2'에 대해서는, 염기 번호 153-156의 어느 염기를 3' 말단으로 한다. 본 발명의 프로브는, 예를 들면, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, P1, P1'에 대해서는, 염기 번호 155의 염기를 5' 말단으로 하고, P2, P2'에 대해서는, 염기 번호 156의 염기를 3' 말단으로 한다.

본원에 있어서의 「상동성」이란, 특정한 염기 서열에 있어서, 염기 서열의 상보쇄에 예를 들면, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 가지고 있는 염기 서열을 가리킨다. 본원에 있어서는, 100%의 동일성을 가지고 있어도 된다.

본원에 있어서의 하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM?약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM?약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을, 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab．Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시키는 것에 의해, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에는, 각각 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

당해 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등 정도의 작용을 나타내면 되고, 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면 1염기?10염기 또는 1염기?5염기를 들 수 있다.

삽입, 결실 또는 치환 중에서도, 본 발명에 있어서의 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 각각 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기가 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 치환의 위치는, 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 검출 감도의 관점에서, 서열 번호 2에 나타내는 서열 중 152번째?166번째의 염기 이외의 위치, 또는 서열 번호 1에 나타내는 서열 중 152번째?162번째의 염기 이외의 위치의 염기가 치환되는 것을 들 수 있다. 치환되는 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있다. 치환되는 염기의 수는, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면 1염기?5염기, 또는 1염기?3염기를 들 수 있다.

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의, 올리고뉴클레오티드로서는, 올리고뉴클레오티드 외에, 수식된 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

상기 올리고뉴클레오티드의 구성 단위로서는, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 인공 핵산 등을 들 수 있다. 상기 인공 핵산으로서는, DNA, RNA, RNA 아날로그인 LNA(Locked Nucleic Acid); 펩티드 핵산인 PNA(Peptide Nucleic Acid); 가교화 핵산인 BNA(Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 구성 단위 중, 1종류로 구성되어도 되고, 복수 종류로 구성되어도 된다.

본 발명에 있어서 사용되는 NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출하기 위한 프로브의 염기 서열의 예로서는, P5로서는, 5'-cactgcCAGAcagagatc-3'(서열 번호 56)를 들 수 있고, P6으로서는, 5'-cactgcCATGcagagatc-3'(서열 번호 57)를 들 수 있고, P7로서는, 5'-cactgcCAGGcagagatc-3'(서열 번호 58)를 들 수 있고, P1로서는, 5'-tgccagagatcttgaatagcc-3'(서열 번호 4)를 들 수 있고, P2로서는, 5'-ctattttcttaaagagacttcctccac-3'(서열 번호 5)를 들 수 있다.

형광 색소로서는, 일본 특개2001-286300호 공보, 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 구체적인 예로서는, Pacific Blue(상표), FAM(상표), TAMRA(상표), BODIPY FL(상표) 등을 들 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드로의 결합 방법은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2001-286300호 공보, 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 방법을 따라 행할 수 있다.

본 발명의 (P5), (P5'), (P6), (P6'), (P7), (P7'), (P1), (P1'), (P2) 또는 (P2')의 어느 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해, 예를 들면, (P5), (P6), (P7) 또는 (P5'), (P6'), (P7')의 3개의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해, 예를 들면, (P1) 및 (P2) 또는 (P1') 및 (P2')의 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해, 본 실시예3, 4에 나타내는 서열 번호 56-58에 나타내는 프로브를 사용하는 것에 의해, 또는, 본 실시예1, 2에 나타내는 서열 번호 4, 5에 나타내는 프로브를 사용하는 것에 의해, NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출할 수 있다(도 3).

본 발명 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광 색소의 형광이 발광하고, 표적 서열에 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 감소 또는 증가하는 것이 바람직하다. 본 발명 프로브는, 예를 들면, 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광 색소의 형광이 발광하고, 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 소광하는, 소광 프로브이다.

또한, 본 발명 프로브는, 5' 또는 3' 말단부터 세어 1?3번째의 염기가 형광 색소에 의해 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 3' 말단이 형광 색소에 의해 표지되어 있는 것이 보다 바람직하다. 또, 본 명세서에 있어서, 「5' 말단부터 세어 1?3번째」라고 하는 경우에는, 5' 말단을 1번째로 세고, 「3' 말단부터 세어 1?3번째」라고 하는 경우에는, 3' 말단을 1번째로 센다.

또, 본 발명 프로브에 있어서 형광 색소에 의해 표지되어 있는 염기는, P5, P5', P6, P6', P7, P7'에 대해서는, 서열 번호 2에 있어서의 145번째의 염기이며, P1, P1'에 대해서는, 서열 번호 1에 있어서의 135번째의 염기이며, P2, P2'에 대해서는, 서열 번호 1에 있어서의 182번째의 염기이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 검출할 수 있는 NPM1 유전자의 exon12의 변이는, 예를 들면, 이하의 표 1에 기재되어 있고, 타입A, 타입B, 타입D, 타입C, 타입E, 타입Gm, 타입Km, 타입Nm, 타입Om, 타입Qm, 타입3, 타입4, 타입6, 타입7, 타입13, 타입10, 타입G+, 타입H+, 타입I+, 및 타입J+, 및 타입I로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개 이상의 변이를 검출할 수 있다.

[표 1]

표 1은, NPM1 유전자의 야생형과 각 변이형에 대한 exon12의 영역의 서열의 비교를 나타낸다.

NPM1 유전자의 exon12에 있어서는 다양한 변이 서열이 보고되어 있다. 몇 개의 문헌에 기재된 변이 보고수를 정리하고, 표의 좌측에 「변이의 증례수」라고 기재했다. A의 변이 서열의 보고는 상당히 많고, 다음으로 B나 D의 변이 서열의 보고가 많다.

표 1의 염기 서열에 있어서, 예를 들면, 변이 타입A는 「tctg」가 ④의 부분에 삽입되어 있다. 또한, 변이 타입E는 ⑨의 부분에 「ctcttgccc」가 삽입되고, ⑩의 「ggagg」이 결실(缺失)하여 있다.

실시예에서 검출을 검토한 변이 타입의 옆에 ☆마크를 기재한다.

(P5), (P5'), (P6), (P6'), (P7), (P7')의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 타입A, 타입B, 타입D, 타입C, 타입Gm, 타입Km, 타입Nm, 타입Om, 타입Qm, 타입3, 타입4, 타입13, 타입G+, 타입H+, 타입I+, 및 타입J+, 및 타입I 등을 검출할 수 있다.

서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 153-156의 영역으로부터 5'측의 서열의 프로브, 예를 들면, (P1), (P1')의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 타입A, 타입B, 타입D, 및 타입7 등을 검출할 수 있다.

서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 153-156의 영역으로부터 3'측의 서열의 프로브, 예를 들면, (P2), (P2')의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 타입10, 타입E, 및 타입6 등을 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 (P5), (P5'), (P6), (P6'), (P7), (P7')의 어느 하나의 올리고뉴클레오티드, 또는 (P1) 혹은 (P1') 및 (P2) 혹은 (P2')의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해, NPM1 유전자의 exon12의 변이의 유무를 검출할 수 있고, 급성 골수성 백혈병의 걸리기 쉬움, 병태 및/또는 예후의 진단이 가능하게 된다.

본 실시예에 나타내는 서열 번호 56, 57, 58, 4, 5의 프로브를 사용하는 것에 의해, NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출할 수 있다. 서열 번호 56-58, 4에 나타내는 프로브에 대해서는, 3' 말단이 형광 색소로 표지되고, 서열 번호 5에 나타내는 프로브에 대해서는, 5' 말단이 형광 색소로 표지되어 있다.

본 발명의 검출 방법은, 상기와 같은 본 발명의 프로브를 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 검출 방법은, 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 157-160의 영역(서열 번호 1의 염기 번호 153-156에 대응)을 포함하는 1개 이상의 프로브를 사용할 수도 있고, 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7'의 1개 이상의 프로브를 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 153-156의 영역을 말단으로 하는 1개 이상의 프로브를 사용할 수도 있고, 상기 P1, P1', P2 및 P2'의 1개 이상의 프로브를 사용할 수도 있다.

본 발명의 검출 방법은, 예를 들면, 본 발명의 프로브를 사용하고, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(Ⅰ) 핵산을 함유하는 시료에, 본 발명의 프로브를 첨가하여 상기 핵산에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,

본 발명 검출 방법은, 본 발명 프로브를 사용하는 것 외에는, 통상의 핵산 증폭 및 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법을 따라 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 상기 공정(Ⅰ) 전 또는 공정(Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 포함하고 있어도 된다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 폴리머라제를 사용하는 방법이 바람직하고, 그 예로서는, PCR, ICAN, LAMP 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우에는, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 따라, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석할 뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다. 따라서, 자동화도 용이하다.

또, 공정(Ⅲ)에서 Tm값을 결정하는 것에는, Tm의 온도를 결정하는 것뿐만 아니라, Tm의 피크의 높이를 결정하는 것도 포함한다. 피크의 높이에 의해, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정할 수 있다. 또, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 보다 정량적으로 결정하기 위해서는, 하기에 나타낸 바와 같은 검량선을 작성하고, 그에 의거하여 존재비를 결정하는 것이 바람직하다.

다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 정량적으로 결정하는 방법에 대해서, 야생형과 특정한 변이형의 존재비의 결정을 예로 들어서 이하에 나타낸다. 단, 이 방법은 일례에 지나지 않고, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비의 결정의 방법은 이에 한정되지 않는다.

우선, 야생형의 핵산Wt와 변이형의 핵산Mt의 2종류의 핵산의 존재비를 각각 다르게 한 복수의 핵산 혼합물을 제작하고, 복수의 핵산 혼합물의 각각에 대해서, 융해 곡선 해석 장치 등을 사용하여 융해 곡선을 얻는다.

도 1(A)에, 어느 하나의 핵산 혼합물의 온도와 형광 강도의 관계로 나타낸 융해 곡선, 및 도 1(B)에 온도와 형광 강도의 미분값의 관계로 나타낸 융해 곡선(미분 융해 곡선이라고도 한다)을 나타낸다. 이 미분 융해 곡선으로부터 피크를 검출하는 것에 의해, 핵산Wt의 융해 온도Tm_W 및 핵산Mt의 융해 온도Tm_M을 검출하고, Tm_W 및 Tm_M을 포함하는 온도 범위의 각각을 설정한다. Tm_W를 포함하는 온도 범위 ΔT_W로서는, 예를 들면, Tm_W와 Tm_M의 사이에서 형광 강도의 미분값이 최소가 되는 온도를 하한, 형광 강도의 피크의 산자락(foot of a mauntain)에 대응하는 온도를 상한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한, Tm_M을 포함하는 온도 범위 ΔT_M으로서는, 예를 들면, Tm_W와 Tm_M의 사이에서 형광 강도의 미분값이 최소가 되는 온도를 상한, 형광 강도의 피크의 산자락에 대응하는 온도를 하한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또, 온도 범위 ΔT_W 및 온도 범위 ΔT_M은, 동일한 폭(예를 들면, 10℃) 또는 다른 폭(예를 들면, 온도 범위 ΔT_W가 10℃, 온도 범위 ΔT_M이 7℃)이 되도록 설정할 수 있다. 또한, 온도 범위 ΔT_W 및 온도 범위 ΔT_M은, 각각의 융해 온도Tm으로부터 +X℃, -X℃의 폭(X℃는 예를 들면 15℃ 이내, 바람직하게는 10℃ 이내)으로 설정할 수 있다.

다음으로, 온도 범위 ΔT_W 및 온도 범위 ΔT_M의 각각에 대해서, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 지나는 직선과 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적(도 1(B)의 사선 부분)을 구한다. 면적의 구하는 법의 일례로서, 구체적으로 이하와 같이 구할 수 있다. 온도T에 있어서의 형광 강도의 미분값을 f(T)로 하고, 온도T에 있어서의 베이스값을 B(T)로 하여, 하기 (1)식에 의해 구한다.

면적S={f(T_s ₊₁)-B(T_s ₊₁)}+{f(T_s ₊₂)-B(T_s ₊₂)}

＋…＋｛f(T_e _-1)-B(T_e _-1)} …(1)

단, T_s는 각 온도 범위에 있어서의 하한값, T_e는 상한값이다. 또한, 각 온도T에 있어서의 베이스값B(T)는, 하기 (2)식에 의해 구해지는 값이며, 형광 강도의 검출 신호에 포함되는 백그라운드 레벨을 나타내는 것이다. 이 베이스값을 형광 강도의 미분값으로부터 감산하는 것에 의해, 형광 강도의 검출 신호에 포함되는 백그라운드의 영향을 제거한다.

B(T)=a×(T-T_s)+f(T_s) …(2)

단, a={f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)이다.

상기 (1)식 및 (2)식을 따라, 각 핵산 혼합물에 대해서, 온도 범위 ΔT_W에 있어서의 면적S_W 및 온도 범위 ΔT_W에 있어서의 면적S_M을 구하고, 면적비와 각 핵산 혼합물의 존재비의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다. 도 2에, 가로축에 존재비(핵산 혼합물의 총량에 대한 핵산Mt의 비율)를 취하고, 세로축에 면적비(S_M/S_W)를 취한 검량선의 일례를 나타낸다. 또, 면적비는 S_W/S_M으로 정해도 된다.

실제의 시료를 사용하여 얻어진 융해 곡선과 미분 융해 곡선으로부터 면적비를 산출하고, 상기한 바와 같이 하여 미리 작성한 검량선에 의거하여, 실제의 시료 중에 포함되는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 DNA는, 1본쇄 DNA여도 되며 2본쇄 DNA여도 된다. 상기 DNA가 2본쇄 DNA인 경우에는, 예를 들면, 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 해리하는 것에 의해, 다음 하이브리다이즈 공정에 있어서, 검출용 프로브와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA에 대한, 본 발명의 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있으므로, 시료 중의 DNA에 대해서 1배 이하가 바람직하고, 0.1배 이하가 보다 바람직하다. 이때, 시료 중의 DNA란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 DNA와 상기 다형이 발생하고 있지 않은 비검출 대상 DNA의 합계여도 되며, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하고 있지 않은 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다. 또, 시료 중의 DNA에 있어서의 상기 검출 대상 DNA의 비율은, 통상, 불명확하지만, 결과적으로, 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 DNA(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해서 예를 들면, 10배 이하, 5배 이하, 또는 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이차이며, 또는 0.1배 이차이다.

상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 DNA에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 DNA에 대한 몰비여도 된다.

Tm값에 대해서 설명한다. 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어지고, 1본쇄 DNA에 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전(全)상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

본 발명에 있어서, 상기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 하이브리다이즈한 경우의 Tm값과, 비상보적인 DNA와 하이브리다이즈한 경우의 Tm값과의 차는, 예를 들면 5℃ 이상을 들 수 있다. 상기 Tm값의 차가 5℃ 이상임으로써, 상술한 변이를 보다 고감도로 검출할 수 있다.

또한, 상기 Tm값의 차로서는, 5℃ 이상, 또는 7℃ 이상 등을 들 수 있다.

상기 Tm값의 차를 크게하는 방법으로서는, 프로브 서열에 있어서 그 하이브리다이즈하는 염기 서열에 대하여 미스매치가 되는 염기를 포함하는 방법이나, 예를 들면 NatureBiotech(1997) vol15 p.331-335에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 수반하는 시그널 변동의 측정은, 상술과 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서 DNA와 프로브의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 상술의 표지화 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하며, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하며, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널을 나타내도록 되거나, 시그널이 증가한다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의거하는 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡광도 등)으로 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질은, 예를 들면, 상술과 같지만 형광 색소 표지화 프로브가 바람직하다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산으로서는, 핵산을 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변(改變)하기 위해 전(前)처리한 후에 사용할 수 있다.

이하, PCR을 사용하는 경우를 예로서, 또한 설명한다. PCR에 사용하는 프라이머 쌍은, 본 발명 프로브가 하이브리다이제이션할 수 있는 영역이 증폭되도록 하는 외에는, 통상의 PCR에 있어서의 프라이머 쌍의 설정 방법과 같이 하여 설정할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 통상으로는, 12mer?40mer에서 40?70℃, 또는 16mer?30mer에서 55?60℃이다. 프라이머 쌍의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양(兩)프라이머의 Tm은 거의 동일(통상으로는, 차이가 2℃ 이내)인 것이 바람직하다. 또, Tm값은 최근접 염기쌍(Nearest Neighbor)법에 따라 산출한 값이다. 프라이머 쌍의 예로서는, 서열 번호 16, 17에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 것을 들 수 있다.

PCR은, 본 발명에서 사용되는 본 발명 프로브의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이에 의해, 증폭 반응 종료 후에 증폭 산물을 정제 등 하지 않고 Tm 해석을 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 프라이머의 Tm값이나 PCR의 반응 조건을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다.

Tm 해석의 결과에 의거하는 NPM1 유전자의 exon12의 변이의 검출은 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 검출이란, 변이의 유무의 검출 및 다형을 갖는 핵산의 존재비의 결정을 포함한다.

또, 본 발명의 프로브 및 다형 검출 방법에 의해, NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출할 수 있고, 검출된 변이의 유무에 의거하여 급성 골수성 백혈병의 되기 쉬움, 병태 및/또는 예후를 진단할 수 있다.

<2> 본 발명 키트

본 발명 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 키트는, 급성 골수성 백혈병의 걸리기 쉬움, 병태 및/ 예후를 판단하는데도 사용할 수 있다.

프로브에 대해서는, 본 발명 프로브에 관하여, 상기에서 설명한 대로이다.

본 발명 검출 키트는, 프로브 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데 필요한 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한 상술의 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다.

본 발명 검출 키트에 있어서 프로브, 프라이머 및 기타의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되며, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서, 검출 대차이 되는 시료 중의 시료 핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특별히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대해서 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대해서 상보적인 당해 서열에 대해서 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 이들의 실시예는 예시이며, 이들에 한정되지 않는다.

[실시예]

실시예1(상보쇄 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, P1, P2 프로브를 사용하는 경우)

NPM1 유전자의 exon12의 염기 서열(서열 번호 1(야생형))에 의거하여, 표 2에 나타내는, 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 2 중, 프로브의 위치는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. 3' 말단의 P는, 인산화되어 있는 것을 나타낸다. TAMRA에 의한 표지은, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 상보쇄 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 2에 나타낸다. 표 2 중, 올리고뉴클레오티드의 위치는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다.

[표 2]

NPM1 유전자의 Exon12 영역의 변이를 2개의 프로브로 검출하기 위해 설계한 프로브의 성능을 확인하기 위해, NPM1 exon12 영역의 야생형 서열과 각종 변이 서열의 상보쇄를 준비하고, 프로브와 상보쇄 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이하의 시약 용액을 조제했다.

프로브 3T-NPM1-e12-R1에 대해 상보쇄 올리고뉴클레오티드는 WT, mt typeA, B, D, 또는 7을, 프로브 5T-NPM1-e12-R2에 대해 상보쇄 올리고뉴클레오티드는 WT, mt typeQ, 10, E, 또는 6을 첨가했다.

[표 3]

Tm 해석의 조건은 하기와 같다. Tm 해석에 있어서의 여기(勵起) 파장 및 검출 파장은, 각각 520?555㎚ 및 585?700㎚(TAMRA)이었다.

조제한 시약 용액을 i-densy 반응 튜브에 첨가하고, 시약이 증발하지 않도록 미네랄 오일 30μL를 중층(重層)하고, 이하의 반응 조건에서 Tm 해석을 실시하여 TAMRA의 형광값의 변화량을 해석했다.

[표 4]

표 2의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 3T-NPM1-e12-R1(서열 번호 4)에 대해서는, TAMRA의 피크가, 65℃(WT), 59℃(타입A), 60℃(타입B), 60℃(타입D), 55℃(타입7) 부근에서 보였다(도 4?8).

이렇게, WT, 각 변이에서 검출 피크를 확인할 수 있었다. 또한, WT와 각 변이의 Tm값의 차(ΔTm)는 5?10℃이며, 변이를 검출하기 위하여 충분한 Tm값의 차가 있는 것을 알 수 있고, 변이를 검출하는 것에 적합한 프로브인 것을 알 수 있었다.

결과를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

또한, 5T-NPM1-e12-R2(서열 번호 5)에 대해서는, TAMRA의 피크가, 64℃(WT), 62℃(타입Q), 52℃(타입10), 52℃(타입E), 49℃(타입6) 부근에서 보였다(도 9?13).

이렇게, WT, 각 변이에서 검출 피크를 확인할 수 있었다. 또한, WT와 변이 타입Q의 Tm값의 차(ΔTm)는 2℃였지만, 다른 변이 타입에서는 충분한 Tm값의 차가 있는 것을 알 수 있고, 변이를 검출하는 것에 적합한 프로브인 것을 알 수 있었다.

결과를 표 6에 나타낸다.

[표 6]

실시예1의 결과에서, P1(서열 번호 4) 및 P2(서열 번호 5)의 프로브를 사용했을 때, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형(타입A, 타입B, 타입D, 타입7, 타입10, 타입E, 타입6)에 대해서, Tm 해석으로 분석 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 즉, 변이형은, 야생형의 피크에 더하여, 다른 피크를 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 따라서, P1(서열 번호 4) 및 P2(서열 번호 5)의 프로브를 사용하는 것에 의해, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형을 검출할 수 있다.

비교예1(상보쇄 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 할 경우)

NPM1 유전자의 Exon12 영역의 변이를 1개의 프로브로 검출하기 위해 설계한 프로브의 성능을 확인하기 위하여, NPM1 exon12 영역의 야생형 서열과 각종 변이 서열의 상보쇄를 준비하고, 프로브와 상보쇄를 포함하는 이하의 시약 용액을 조제했다.

시약 용액은 실시예1과 같이 하여, 프로브만 이하의 프로브를 사용했다. 또한 Tm 해석도 실시예1과 같이 실시했다.

또한, 변이의 검출을 위해 사용한 프로브의 서열을 표 7에 나타낸다. 표 7 중, 프로브의 위치는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다.

[표 7]

WT나 몇 개의 변이 타입에서는 문제없이 검출할 수 있었지만, 변이 타입A, D, 7에서는 검출 피크를 확인할 수 없고, 다양한 변이의 검출에 적합하지 않은 프로브인 것을 알 수 있었다(도 14-22).

결과를 표 8에 나타낸다.

[표 8]

실시예2(혈액 검체 또는 인공 핵산 플라스미드를 검출 대상으로서 사용하는 경우)

핵산 증폭한 후, Tm 해석에 의한 검출이 가능한지를 검토하기 위해, 혈액 검체를 사용하여 반응을 행했다. 또한, NPM1 유전자의 exon12 변이가 어느 정도 섞인 검체까지 검출이 가능한지, 야생형 서열과 변이 서열(A타입과 E타입)의 인공 핵산 플라스미드의 혼합 비율을 섞어, 그 검출 파형을 확인했다. 인공 핵산은 pUC 플라스미드 벡터에 NPM1 유전자의 exon12 주변 서열의 야생형 서열(590bp, 서열 번호 1), 변이 타입A(594bp, 서열 번호 2), 변이 타입E(594bp, 서열 번호 3)를 삽입한 플라스미드를 사용했다.

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기의 표 11과 같다.

또한, 변이의 검출에 사용한 프로브 및 프라이머의 서열을 표 12에 나타낸다. 표 12 중, 프로브 및 프라이머의 위치는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다.

Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 420?485㎚ 및 520?555㎚(BODIPY FL), 또는, 각각 520?555㎚ 및 585?700㎚(TAMRA)으로 했다.

시약 용액은 이하와 같다.

[표 9]

<전혈의 조제>

전혈 10㎕를 희석액(1) 70㎕에 가해, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10㎕를 희석액(2) 70㎕에 가했다. 이 혼합액 17㎕를 95℃에서 10분 가열하여 4㎕의 전처리된 전혈를 얻었다. 이를 1test당의 템플레이트(template)로서 사용했다.

[표 10]

<인공 핵산 플라스미드>

임의의 비율로 야생형과 변이형을 혼합한 500카피/㎕의 인공 핵산 플라스미드를 4㎕ 사용했다.

[표 11]

[표 12]

혈액 검체를 사용하여 i-densy로 측정한 결과, 문제없이 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 23).

인공 핵산 플라스미드를 사용한 검출 파형을 확인한 바, BODIPY FL은 63℃, TAMRA도 63℃에 야생형의 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 24).

변이 타입A의 경우, BODIPY FL의 56-57℃에 검출 피크가 확인되고(도 25의 좌측 도면), 변이 타입E의 경우, TAMRA의 50-51℃에 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 29의 우측 도면). 임의의 비율로 혼합시킨 플라스미드의 경우, 변이 타입A와 E의 양쪽에서 10%의 변이 서열이 혼합된 상태에서도 변이의 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 28의 좌측 도면, 도 32의 우측 도면).

실시예2의 결과에서, P1(서열 번호 4) 및 P2(서열 번호 5)의 프로브를 사용했을 때, 혈액 검체를 사용한 경우, 그리고, 10%의 변이 서열이 혼합되는 경우에도, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형(타입A, 타입E)에 대해서, Tm 해석으로 해석 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 따라서, P1(서열 번호 4) 및 P2(서열 번호 5)의 프로브를 사용하는 것에 의해, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형을 검출할 수 있다.

비교예2

비교예로서, 3T-NPM1-e12-R3 프로브를 사용했다. 이하의 용액을 사용하여 핵산 증폭한 후, Tm 해석에 의한 검출이 가능한지를 검토했다. 프라이머 서열이나 반응 조건은 실시예2와 같이 했다. 플라스미드 용액(500카피/μL)을 4μL 반응 튜브에 첨가하여, 이하의 반응 조건에서 i-densy로 반응했다. Tm 해석에서는 TAMRA의 형광값의 변화량을 해석했다.

[표 13]

[표 14]

혈액을 사용한 경우와 인공 핵산 플라스미드의 야생형과 변이 타입E를 검체로서 사용한 경우에는, 문제없이 검출 피크를 얻을 수 있었다(도 33, 34, 37). 그러나, 변이 타입A 100%를 검체로 한 경우에는 검출 피크를 확인할 수 없었다(도 35). 또한, 변이 타입A 또는 E를 20% 혼합시킨 인공 핵산을 반응시킨 경우, 변이 타입의 검출 피크를 확인할 수 없고, 야생형의 검출 피크밖에 확인할 수 없었다(도 36, 38). 이들의 결과에서, 실시예2의 결과와 비교하여, 3T-NPM1-e12-R3의 프로브는 NPM1의 exon12의 변이의 검출에 적합하지 않는다고 판단된다.

실시예3(상보쇄 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, P5, P6, P7프로브를 사용하는 경우)

NPM1 유전자의 exon12 변이는 다종의 서열이 보고되어 있지만, 그 대부분은 타입A, B, D이다(표 1 참조). 그 때문에, 타입A, B, D가 명확하게 검출하는 것이, NPM1 유전자의 exon12 변이 검출용 프로브로서 유용하다.

NPM1 유전자의 exon12의 염기 서열(서열 번호 2(변이 타입A))에 의거하여, 표 15에 나타내는, 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 15 중, 프로브의 위치는, 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. Pacific Blue, TAMRA 및 BODIPY FL에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

시약 용액은 실시예1과 같이하고, 프로브만 이하의 프로브를 사용했다. 또한 Tm 해석도 실시예1과 같이 실시했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 상보쇄 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 기재하고 있고, 표 1에 기재된 4의 부분에 삽입 변이를 갖는 서열이다.

[표 15]

Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 365?415nm 및 445?480nm(Pacific Blue), 520?555nm 및 585?700nm(TAMRA), 420?485nm 및 520?555nm(BODIPY FL)이었다.

상기에 나타낸 프로브를 사용하여, 실시예1과 같이 Tm 해석에 의한 검출 피크(Tm값)의 확인을 행했다. 또한, 야생형의 상보쇄에 대한 Tm값과 각 변이 서열에 대한 Tm값의 차를 확인했다.

3PB-NPM1-mtA-R4(서열 번호 56)에 대해서는, WT와 변이 타입M, N, Gm, 12, I와의 Tm값의 차(ΔTm)는 4℃ 이하이었지만, 다른 변이 타입에서는 충분한 Tm값의 차가 있음을 알 수 있어, 변이를 검출하기에 적합한 프로브임을 알 수 있었다.

3T-NPM1-mtB-R5(서열 번호 57)에 대해서는, WT와 변이 타입M, N, 12와의 Tm값의 차(ΔTm)는 4℃ 이하이었지만, 다른 변이 타입에서는 충분한 Tm값의 차가 있음을 알 수 있어, 변이를 검출하기에 적합한 프로브임을 알 수 있었다.

3FL-NPM1-mtD-R6(서열 번호 58)에 대해서는, WT와 변이 타입M, N, 3, 12, I와의 Tm값의 차(ΔTm)는 4℃ 이하이었지만, 다른 변이 타입에서는 충분한 Tm값의 차가 있음을 알 수 있어, 변이를 검출하기에 적합한 프로브임을 알 수 있었다.

결과를 표 16에 나타낸다.

[표 16]

mtA-R4프로브는, WT 서열(14mer)에 더하여 타입A에 특유의 「tctg」 서열을 4mer 삽입한 염기 서열에 상보적인 프로브이다. mtA-R4프로브는, 타입A 서열과 18mer 일치, 타입B 서열과 16mer 일치, 타입D 서열과 17mer 일치하기 때문에, WT 상보쇄의 (14mer 일치)보다도 높은 Tm값(높은 친화성)이 얻어져, 이들 변이 서열을 검출할 수 있다.

마찬가지로, 타입B 서열에 상보적인 mtB-R5프로브는, 타입A 서열과 16mer 일치, 타입B 서열과 18mer 일치, 타입D 서열과 17mer 일치하여, WT 상보쇄보다도 높은 Tm값이 얻어진다.

마찬가지로, 타입D 서열에 상보적인 mtD-R6프로브는, 타입A 서열과 17mer 일치, 타입B 서열과 17mer 일치, 타입D 서열과 18mer 일치하여, WT 상보쇄보다도 높은 Tm값이 얻어진다.

실시예4(상보쇄 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하여 검출 감도를 확인하는 경우)

NPM1 유전자의 exon12 변이의 타입A가 어느 정도 섞인 검체까지 검출이 가능한가, 야생형 서열과 변이 서열의 인공 핵산 플라스미드의 혼합 비율을 매겨, 그 검출 파형을 확인했다. 인공 핵산은 pUC 플라스미드 벡터에 NPM1 유전자의 exon12 주변 서열의 야생형 서열(590bp, 서열 번호 1), 변이 타입A(594bp, 서열 번호 2)를 삽입한 플라스미드를 사용했다.

[표 17]

PCR 및 Tm 해석의 조건은 실시예2의 표 11과 같이 했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은 , 각각 365?415nm 및 445?480nm(Pacific Blue), 520?555nm 및 585?700nm(TAMRA), 420?485nm 및 520?555nm(BODIPY FL)이었다.

표 15의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, mtA-R4 프로브는, mtA 10%나 3%일 때에 61-62℃에(도 39), mtB-R5 프로브는, mtA 10%일 때에 53℃에(도 40), mtD-R6프로브는, mtA 10%나 3%일 때에 59-60℃에(도 41), 변이 타입A로 생각되는 검출 피크를 확인할 수 있었다.

실시예4의 결과로부터, mtA-R4(서열 번호 56), mtB-R5(서열 번호 57), mtD-R6(서열 번호 58)의 프로브를 사용했을 때, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형(타입A)에 대해, Tm 해석으로 분석 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 즉, 변이형은, 야생형의 피크에 더하여, 다른 피크를 갖는 것이며, 고유의 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 따라서, mtA-R4(서열 번호 56), mtB-R5(서열 번호 57), mtD-R6(서열 번호 58)의 프로브를 사용함으로써, NPM1 유전자의 exon12 변이의 다형(타입A)이 소량 혼재하는 검체로부터 당해 변이를 높은 감도로 검출 가능한 것이 이해된다.

본 발명의 프로브를 사용하는 것에 의해, 급성 골수성 백혈병의 걸리기 쉬움, 병태 및/또는 예후를 진단할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY,INC. <120> PROBE FOR DETECTING MUTATION IN EXON 12 OF NPM1 GENE AND USE TEREOF <130> OP-12088 <150> JP2011-102327 <151> 2011-04-28 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 590 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atatctttat ctagagttaa ctctctggtg gtagaatgaa aaatagatgt tgaactatgc 60 aaagagacat ttaatttatt gatgtctatg aagtgttgtg gttccttaac cacatttctt 120 tttttttttt tccaggctat tcaagatctc tggcagtgga ggaagtctct ttaagaaaat 180 agtttaaaca atttgttaaa aaattttccg tcttatttca tttctgtaac agttgatatc 240 tggctgtcct ttttataatg cagagtgaga actttcccta ccgtgtttga taaatgttgt 300 ccaggttcta ttgccaagaa tgtgttgtcc aaaatgcctg tttagttttt aaagatggaa 360 ctccaccctt tgcttggttt taagtatgta tggaatgtta tgataggaca tagtagtagc 420 ggtggtcaga catggaaatg gtggggagac aaaaatatac atgtgaaata aaactcagta 480 ttttaataaa gtagcacggt ttctattgac ttatttaact gctttatact ttgtcaaaga 540 aataattaat gtagttagga atggcaaata gtcttgtaaa attctatgag 590 <210> 2 <211> 594 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atatctttat ctagagttaa ctctctggtg gtagaatgaa aaatagatgt tgaactatgc 60 aaagagacat ttaatttatt gatgtctatg aagtgttgtg gttccttaac cacatttctt 120 tttttttttt tccaggctat tcaagatctc tgtctggcag tggaggaagt ctctttaaga 180 aaatagttta aacaatttgt taaaaaattt tccgtcttat ttcatttctg taacagttga 240 tatctggctg tcctttttat aatgcagagt gagaactttc cctaccgtgt ttgataaatg 300 ttgtccaggt tctattgcca agaatgtgtt gtccaaaatg cctgtttagt ttttaaagat 360 ggaactccac cctttgcttg gttttaagta tgtatggaat gttatgatag gacatagtag 420 tagcggtggt cagacatgga aatggtgggg agacaaaaat atacatgtga aataaaactc 480 agtattttaa taaagtagca cggtttctat tgacttattt aactgcttta tactttgtca 540 aagaaataat taatgtagtt aggaatggca aatagtcttg taaaattcta tgag 594 <210> 3 <211> 594 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atatctttat ctagagttaa ctctctggtg gtagaatgaa aaatagatgt tgaactatgc 60 aaagagacat ttaatttatt gatgtctatg aagtgttgtg gttccttaac cacatttctt 120 tttttttttt tccaggctat tcaagatctc tggcagtctc ttgcccaagt ctctttaaga 180 aaatagttta aacaatttgt taaaaaattt tccgtcttat ttcatttctg taacagttga 240 tatctggctg tcctttttat aatgcagagt gagaactttc cctaccgtgt ttgataaatg 300 ttgtccaggt tctattgcca agaatgtgtt gtccaaaatg cctgtttagt ttttaaagat 360 ggaactccac cctttgcttg gttttaagta tgtatggaat gttatgatag gacatagtag 420 tagcggtggt cagacatgga aatggtgggg agacaaaaat atacatgtga aataaaactc 480 agtattttaa taaagtagca cggtttctat tgacttattt aactgcttta tactttgtca 540 aagaaataat taatgtagtt aggaatggca aatagtcttg taaaattcta tgag 594 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 tgccagagat cttgaatagc c 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 ctattttctt aaagagactt cctccac 27 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 ccaggctatt caagatctct ggcagtggag gaagtctctt taagaaaata gttt 54 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 ccaggctatt caagatctct gtctggcagt ggaggaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 8 ccaggctatt caagatctct gcatggcagt ggaggaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 ccaggctatt caagatctct gcctggcagt ggaggaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 ccaggctatt caagatctat gcctggcagt ggaggaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 ccaggctatt caagatctct ggcagaggat ggaggaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 12 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 ccaggctatt caagatctct ggcagtgctg ctcccaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 ccaggctatt caagatctct ggcagtctct tgcccaagtc tctttaagaa aatagttt 58 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 ccaggctatt caagatctct ggcaagattt cttaaatcgt ctctttaaga aaatagttt 59 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 gagacttcct ccactgccag agatc 25 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gatgtctatg aagtgttgtg gttcct 26 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caactgttac agaaatgaaa taagacggaa a 31 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tggaggaagt ctctttaaga aaatag 56 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtctg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcatg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcgtg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcctg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tctcttgccc aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tccctggaga aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tccctcgccc aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tgcttcgccc aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tgtttttcaa aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tctctttcta aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gaccaagagg ctattcaaga tctctcccgg gcagtaagtc tctttaagaa aatag 55 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tccctttcca aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtagc gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 32 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gaccaagagg ctattcaaga tctctccacg cagtggagga agtctcttta agaaaatag 59 <210> 33 <211> 62 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag cgtttccgga ggaagtctct ttaagaaaat 60 ag 62 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtacc ttcctggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag aggatggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcagg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gaccaagagg ctattcaaga tctctgccgg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gaccaagagg ctattcaaga tctctgccgc ggagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gaccaagagg ctattcaaga tctctgccag gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtttg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtcgg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 42 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tccatggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 43 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtcat gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 44 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcttg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 45 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcaa gatttcttaa atcgtctctt taagaaaata 60 g 61 <210> 46 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gaccaagagg ctattcaaga tctatgcctg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 47 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gaccaagagg ctattcaaga tctctggccc gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 48 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtaag gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag tgctgctccc aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gaccaagagg ctattcaaga tctctggcag ttattttccc aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtttg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcttg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtaag gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 54 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gaccaagagg ctattcaaga tctctgtatg gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gaccaagagg ctattcaaga tctctgcaga gcagtggagg aagtctcttt aagaaaatag 60 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 56 cactgccaga cagagatc 18 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 57 cactgccatg cagagatc 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 58 cactgccagg cagagatc 18

Claims

NPM1 유전자의 exon12의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2 및 P2'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P5) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P5') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7) 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 154번째에 대응하는 염기가 티민이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7') 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 145?156을 포함하는 12?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 153번째에 대응하는 염기가 구아닌이며, 염기 번호 154번째에 대응하는 염기가 티민이며, 염기 번호 145에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P1) 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 135?150을 포함하는 16?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열이며, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P1') 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 135?150을 포함하는 16?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 164?182를 포함하는 19?50 염기길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열이며, 염기 번호 182에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및
(P2') 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 164?182를 포함하는 19?50 염기길이의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지고, 염기 번호 182에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 가지고,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단부터 세어 1?3번째의 위치에 갖는 프로브.
제1항에 있어서,
P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는 프로브.
제1항에 있어서,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 153-156의 어느 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 153-156의 어느 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는 프로브.
제1항에 있어서,
P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 162를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 145에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 155를 5' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 염기 번호 156을 3' 말단으로 하고, 형광 색소로 표지된 염기 번호 182에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖는 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 프로브.
제6항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 프로브.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
P5, P5', P6, P6', P7 및 P7'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12?35이며, P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 16?35이고, P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드가 19?35인 다형 검출용 프로브.
NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 적어도 1종 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정 (Ⅰ)?(Ⅳ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(Ⅰ) 핵산을 함유하는 시료에, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 첨가하여 상기 핵산에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,
(Ⅱ) 온도를 변화시켜서 상기 핵산과 상기 프로브의 하이브리드 형성체를 해리시켜, 하이브리드 형성체의 해리에 의거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의 Tm값을 검출하는 공정, 및
(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 결정하는 공정.
제11항에 있어서,
(Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 더 포함하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해, NPM1 유전자의 exon12에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및 다형의 유무를 결정하는 공정을 포함하는, 급성 골수성 백혈병의 걸리기 쉬움, 병태 및/또는 예후를 분석하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 포함하는, NPM1 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트.
제14항에 있어서,
NPM1 유전자의 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 P5, P5', P6, P6', P7, P7', P1, P1', P2, P2'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 시약 키트.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 프라이머가, 하기 P3 및 P4 또는 P3' 및 P4'에서 선택되는 다형 검출용 프라이머인 시약 키트.
(P3) 106번째의 염기T를 3' 말단으로 하고, 서열 번호 1에 상동적인 10?50염기의 올리고뉴클레오티드, 및
(P4) 205번째의 염기T를 3' 말단으로 하고, 서열 번호 1의 상보쇄에 상동성을 갖는 10?50염기의 올리고뉴클레오티드, 및
(P3') 106 번째의 염기T를 3' 말단으로 하고, 서열 번호 1의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 10?50염기의 올리고뉴클레오티드, 및
(P4') 205번째의 염기T를 3' 말단으로 하고, 서열 번호 1의 염기 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 10?50염기의 올리고뉴클레오티드.