JPH10210975A - エステラーゼ遺伝子及びその利用 - Google Patents
エステラーゼ遺伝子及びその利用Info
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- JPH10210975A JPH10210975A JP8344076A JP34407696A JPH10210975A JP H10210975 A JPH10210975 A JP H10210975A JP 8344076 A JP8344076 A JP 8344076A JP 34407696 A JP34407696 A JP 34407696A JP H10210975 A JPH10210975 A JP H10210975A
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Abstract
ルを不斉加水分解し、(R)−体を産生するエステラー
ゼをコードする遺伝子の提供。 【解決手段】一般式 化1 (式中、R1は水素又はメチル基、R2は炭素原子1〜
10個のアルキル基、炭素原子2〜10個のアルケニル
基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭素原子1〜
4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、(R)−体の一般式 化1で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生するエステラーゼをコードするエステラ
ーゼ遺伝子並びにその遺伝子に係るプラスミド、形質転
換体、産生エステラーゼ。
Description
子及びその利用に関する。
素原子1〜10個のアルキル基、炭素原子2〜10個の
アルケニル基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭
素原子1〜4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示され
るシクロペンテノロン類は、医薬や農薬等の中間体とし
て重要である。このシクロペンテノン類は、優れた殺虫
活性を有するいわゆる合成ピレスロイドと呼ばれる一群
のエステル系化合物の重要なアルコール成分として有用
であり、また医薬であるプロスタグランジン誘導体の中
間体としても有用である。例えば、4−ヒドロキシ−3
−メチル−2−(2−プロピニル)シクロペント−2−
エン−1−オンの2、2、3、3−テトラメチルシクロ
プロパンカルボン酸とのエステルである下記式 化5で
示される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死
効力を有する優れた殺虫剤である(例えば、特公昭50
−15843)。
ン類は、その4位に不斉炭素を有するために2種の光学
異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分とし
て有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール
成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差
を生じることが知られており、例えば、上記一般式 化
5で示される化合物において、(S)−4−ヒドロキシ
−3−メチル−2−(2−プロピニル)シクロペント−
2−エン−1−オンからなるエステルは、対応する
(R)−4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロ
ピニル)シクロペント−2−エン−1−オンからなるエ
ステルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明
らかになっている。また、同様に光学活性な4−ヒドロ
キシ−2−(7−ヒドロキシヘプチル)−2−シクロペ
ンテノン、4−ヒドロキシ−2−(6−メトキシカルボ
ニルヘキシル)−2−シクロペンテノン及び4−ヒドロ
キシ−2−(2−プロペニル)−2−シクロペンテノン
等は、医薬であるプロスタグランジン誘導体の中間体と
して有用である。
等の中間体である一般式 化4で示されるシクロペンテ
ノロン類の光学異性体を工業的にも有利に分離取得する
方法の開発が望まれており、また、そのために、例え
ば、該シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステル
に作用して、これを不斉加水分解する能力を有する優れ
たエステラーゼを産生する微生物を遺伝子工学的手法に
より作製するために、上記のようなエステラーゼをコー
ドする遺伝子の探索も強く望まれている。
明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度
の(R)−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 1)一般式 化6
素原子1〜10個のアルキル基、炭素原子2〜10個の
アルケニル基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭
素原子1〜4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示され
るシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不
斉加水分解し、(R)−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、配
列番号1で示される塩基配列にハイブリダイズすること
を特徴とするエステラーゼ遺伝子(以下、本発明遺伝子
と記す。)、 2)配列番号1で示される塩基配列とのホモロジーが9
0%以上であることを特徴とする前項1記載のエステラ
ーゼ遺伝子。 3)配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とする前項1記載のエステラ
ーゼ遺伝子、 4)配列番号1で示される塩基配列を有することを特徴
とする前項1記載のエステラーゼ遺伝子、 5)前項1、2、3又は4記載のエステラーゼ遺伝子を
含有することを特徴とするプラスミド(以下、本発明プ
ラスミドと記す。)、 6)前項5記載のプラスミドにより形質転換されたこと
を特徴とする形質転換体(以下、本発明形質転換体と記
す。)、 7)形質転換体が微生物であることを特徴とする前項6
記載の形質転換体、 8)前項1、2、3又は4記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ
(以下、本発明エステラーゼと記す。)、 9)前項1、2、3又は4記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が前項6記載の形質転換体であることを特
徴とする前項8記載のエステラーゼ、 10)前項6記載の形質転換体を培養することにより、
一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類の有機カ
ルボン酸エステルを不斉加水分解し、(R)−体の一般
式 化6で示されるシクロペンテノロン類を産生する能
力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエ
ステラーゼの製造方法(以下、本発明製造方法と記
す。)、 11)前項8記載のエステラーゼを一般式 化6で示さ
れるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに
作用させて、該エステルを不斉加水分解して、(R)−
体の一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類とそ
の対掌体のエステルとに分割することを特徴とする一般
式 化6で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方
法(以下、本発明光学分割方法と記す。)、 12)一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類が
4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロペニル)
シクロペント−2−エン−1−オンである前項11記載
の光学分割方法、 13)一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類が
4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロピニル)
シクロペント−2−エン−1−オンである前項11記載
の光学分割方法、を提供するものである。
本発明遺伝子は、一般式 化6で示されるシクロペンテ
ノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、
(R)−体の一般式 化6で示されるシクロペンテノロ
ン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、
かつ、配列番号1で示される塩基配列にハイブリダイズ
するエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエス
テラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意
味している。ここで一般式 化6で示されるシクロペン
テノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、(R)−体の一般式 化6で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力とは、例えば、4−ヒドロキシ
−3−メチル−2−メチルシクロペントー2−エン−1
−オン、4−ヒドロキシ−3−メチル−2−エチル−2
−シクロペント−2−エン−1−オン、4−ヒドロキシ
−3−メチル−2−(2−プロペニル)−2−シクロペ
ント−2−エン−1−オン、4−ヒドロキシ−3−メチ
ル−2−(2、4−ペンタジエニル)−2−シクロペン
ト−2−エン−1−オン、4−ヒドロキシ−3−メチル
−2−(1−メチル−2−プロピニル)−2−シクロペ
ント−2−エン−1−オン、4−ヒドロキシ−3−メチ
ル−2−(2−プロピニル)シクロペント−2−エン−
1−オン、4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(1−メ
チル−2−プロピニル)シクロペント−2−エン−1−
オン、4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2,2,2
−トリフルオロエチル)シクロペント−2−エン−1−
オン、4−ヒドロキシ−2−(7−アセトキシヘプチ
ル)−2−シクロペンテノン、4−ヒドロキシ−2−
(7−ヒドロキシヘプチル)−2−シクロペンテノン、
4−ヒドロキシ−2−(6−メトキシカルボニルヘキシ
ル)−2−シクロペンテノン、4−ヒドロキシ−2−
(2−プロペニル)−2−シクロペンテノン等のシクロ
ペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分
解し、対応する(R)−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を意味する。一般式 化6で示されるシクロ
ペンテノロン類において、R2で示される炭素原子1〜
10個のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ペンチル基、ヘプチル基、デシル基等をあげること
ができ、炭素原子2〜10個のアルケニル基としては、
例えば、2−プロペニル基、1−メチル−2−プロペニ
ル基、2,4−ペンタジエニル基、2−ヘプテニル基、
2−デセニル基等をあげることができ、炭素原子2〜1
0個のアルキニル基としては、例えば、2−プロピニル
基、1−メチル−2−プロピニル基、2ーヘプチニル
基、2ーデシニル基等をあげることができ、炭素原子1
〜4個のハロアルキル基としては、例えば、2,2,
2,−トリフルオロエチル基、4,4,4−トリフルオ
ロブチル基等をあげることができ、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基としては、末端のヒドロキシ基が、例え
ば、アルキル基、アルコキシアルキル基等により保護さ
れてもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪族炭化水
素基であり、なかでもその脂肪族炭化水素が直鎖飽和脂
肪族炭化水素である置換基を好ましくあげることができ
る。例えば、7−アセトキシペンチル基、7−ヒドロキ
シペンチル基、7−アセトキシヘプチル基、7−ヒドロ
キシヘプチル基、10−ヒドロキシノニル基等をあげる
ことができる。末端のカルボキシル基が保護されてもよ
い炭素原子5〜9個の脂肪酸基としては、末端のカルボ
キシル基が、例えば、アルキル基等により保護されても
よい炭素原子5〜9個の脂肪酸基であり、なかでもその
脂肪酸が直鎖飽和脂肪酸である置換基を好ましくあげる
ことができる。例えば、6−メトキシカルボニルヘキシ
ル基、8−メトキシカルボニルオクチル基等をあげるこ
とができる。尚、前記有機カルボン酸エステルに於い
て、有機カルボン酸としては、例えば、炭素原子1〜1
8個の飽和又は不飽和の脂肪酸、ピレスロイド酸等をあ
げることができる。
ハイブリダイズする」遺伝子とは、配列番号1で示され
る塩基配列を有するDNAをプローブとして、例えば、
「クローニングとシークエンス」(渡辺格監修、杉浦昌
弘編集、1989、農村文化社発行)等に記載されるサ
ザンハイブリダイゼーション方法によって視覚的に検出
可能であるような遺伝子を意味し、配列番号1で示され
る塩基配列を有するDNA又はそのDNAにおける1若
しくは複数の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列
からなるDNA等である。例えば、95℃、1分という条
件の熱処理や、0.5M NaOH、1.5M NaClという条件のア
ルカリ処理により、二本鎖からなるDNAを相補的な一本
鎖DNAに解離させた後、例えば、氷上に1分放置するとい
う条件の放熱や0.5M Tris・HCl(pH7.0)、3.0M NaC
lという条件の中和処理により前記一本鎖DNAに対して相
補性を有する一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二
本鎖状態(ハイブリダイズした状態)になり、このよう
なDNAは、通常、配列番号1で示される塩基配列と高
いホモロジー(活性部位や構造等に強く関与する領域か
否かによっても異なるが、例えば、全体として90%程
度以上のホモロジー)を有するような塩基配列を有する
遺伝子である。ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発
したホモロジー検索プログラムを用いて計算することが
できる(Pearson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Acad
emic.Sci USA, 85, 2444)。また、Genetyx-Mac(ソフ
トウエア開発(株)製)に含まれているこのプログラム
を用いても計算することができる。また、日本DNAデ
ータバンク(DDBJ)のWorldWideWebサービスにある
ホモロジーサーチ・プログラム(fasta)を用いることも
できる。このような本発明遺伝子のより具体的な例とし
ては、例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげる
ことができる。もちろん、配列番号1で示される塩基配
列を有するエステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあ
げることができる。
ア(Burkholderia)属に属する微生物から通常の方法
(例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」(東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年)等に記
載される方法)によって調製された染色体DNAを鋳型と
し、かつ配列番号1で示される塩基配列を有するDNA
の一部(例えば、配列番号1で示される塩基配列の5'末
端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオ
チドと配列番号1で示される塩基配列の3'末端側塩基配
列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの
組み合わせ、または、配列番号1で示される塩基配列の
5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌク
レオチドと配列番号1で示される塩基配列の3 ' 末端側
配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
の組み合わせ)をプライマーとして用いるPCR法によ
り取得することができる。また、例えば、バークホルデ
リア(Burkholderia)属に属する微生物から通常の方法
(例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」(東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年)等に記
載される方法)によって調製された染色体DNAをラムダ
ファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子
ライブラリーを、配列番号2で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列、好ましくは配列番号1に示される
塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブと
して、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハ
イブリダイゼーションなどの方法によっても取得するこ
とができる。本発明遺伝子が調製される微生物として
は、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア
(Burkholderia cepacia)を特に好ましくあげることが
でき、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株
があげられる。尚、上記にあるBurkholderia cepacia S
C-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であ
り、下記の菌学的性質を有する(表1及び2)。
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
1巻(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V
ol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネティブ・バクテリオロジー第9版(Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,Ninth edition(199
4))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(19
95)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,
(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシ
ア(Burkholderia cepacia)と一致している。
の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして
配列番号1で示される塩基配列を有するDNAの一部
(例えば、配列番号1で示される塩基配列の5'末端側配
列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと
配列番号1で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相
当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合
わせ、または、配列番号1で示される塩基配列の5'末端
側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチ
ドと配列番号1で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に
相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み
合わせ)を用いるPCR法により取得することができ
る。尚、上記にあるE.coli JM109/pAL612株は、本発明
遺伝子を含有するプラスミドpAL612(本発明プラスミ
ド)をエシェリヒア・コリ(Escherchia coli)JM109株
に導入した形質転換体微生物(本発明形質転換体)は、
FERM-BP 5740として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託(受理日:平成8年11月7日)されている。
転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に
通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本
発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例え
ば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いる
ベクターとしては、pUC119(宝酒造(株)製)、pBlues
criptII (ストラタジーン クローニング システム製)
等をあげることができる。構築された本発明プラスミド
により宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させ
る宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、
「モレキュラー・クローニング」(J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年)等に記載される
通常の方法をあげることができる。尚、形質転換体を選
抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質
転換させた宿主細胞をトリブチリン含有LBプレートで
培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に
選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一
般式 化6に示されるシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析すること
により、(R)−体の一般式 化6に示されるシクロペ
ンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選
抜すればよい。より具体的には、例えば、(RS)−4
−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロペニル)シ
クロペント−2−エン−1−オンの酢酸エステル0.5gと
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に
入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。
これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させな
がら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを
回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を
停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用い
て同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラ
フィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン D
C-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクシ
ョン温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFI
Dの条件で、GC-14A((株)島津製作所製)を用いて分
析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの(R)−4−
ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロペニル)シク
ロペント−2−エン−1−オンを遊離する酵素量を1uni
tとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽
出した後、該抽出物についてHPLC分析により,
(R)−4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロ
ペニル)シクロペント−2−エン−1−オンの光学純度
を測定する。分析には、(株)住化分析センター製OA-4
100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用す
る。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethano
l を100:20:1の割合で混合したものを用いることができ
る。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光
学異性体比を分析すればよい。さらに詳細に、選抜され
た形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを
調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば
「モレキュラー・クローニング」(J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年)等に記載される
通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本
発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、
サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダ
イゼーション等の方法で確認することもできる。
該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼ
を産生させることができる(本発明製造方法)。形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養され
る。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキ
ストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等
が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー(Corn Steep Liquor )、綿実粉、乾燥酵母、
カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無
機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類
およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウ
ム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カ
リウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。さらに、オリーブ油等のトリグリセライドを培地に
添加することが好ましい。添加量としては、例えば、培
地100ml に対して、約10mg〜約10g程度をあげることが
できる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じ
て行い、固体培養、液体培養(試験管振盪式培養、往復
式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter )
培養、培養タンク等)いずれも可能である。特に、ジャ
ーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必
要があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気
条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適
宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養
温度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好まし
い。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通
常約1〜約5日間が望ましい。
0℃程度、好ましくは約30℃〜約40℃程度の範囲に
おいて反応可能であり、 4)pH約4〜約9程度、好ましくはpH約5〜約7程
度の範囲において反応可能であり、 5)一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類の有
機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、(R)−体の
一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類を産生す
る能力を有し、 6)例えば、バークホルデリア(Burkholderia)属に属
する微生物(特に好ましい微生物としては、バークホル
デリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、さらに具
体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換
体を培養することにより得ることもできる。もちろん、
前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形
質転換された形質転換体を培養することによっても得る
ことができる。本発明エステラーゼは、それ自体を含有
する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養
物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利
用してもよい。このような分離の方法としては、例え
ば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等
により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用
いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機
ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法を
あげることができる。必要に応じて、これらの方法を組
み合わせて用いることができる。さらにまた、本発明エ
ステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担
体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに
閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、
容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反
応に利用することもできる。
化6で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に
利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式 化
6で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エ
ステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、
(R)−体の一般式 化6で示されるシクロペンテノロ
ン類とその対掌体である(S)−体のエステルとに分割
する方法に利用でき、かかる分割方法に於いて、通常
は、ラセミのエステルが原料として用いられる。具体的
には、例えば、4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2
−プロペニル)シクロペント−2−エン−1−オン、4
−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロピニル)シ
クロペント−2−エン−1−オン、4−ヒドロキシ−2
−(7−ヒドロキシヘプチル)−2−シクロペンテノ
ン、4−ヒドロキシ−2−(6−メトキシカルボニルヘ
キシル)−2−シクロペンテノン又は4−ヒドロキシ−
2−(2−プロペニル)−2−シクロペンテノンをあげ
ることができる。反応温度は、例えば、約20℃〜約70
℃、好ましくは、約30℃〜約40℃を、反応pHは、例えば
約4〜約9、好ましくは、約5〜約7を、反応時間は、例え
ば、約5分間〜約96時間を挙げることができる。反応液
からの(R)−体の一般式 化6で示されるシクロペン
テノロン類とその対掌体のエステルの回収は、一般に知
られている任意の方法で行うことができる。例えば、溶
媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの操
作を、適宜採用することができる。具体的には、反応液を
エーテル、酢酸エチル、ベンゼンなどの有機溶媒で抽出
し、この抽出物を分別蒸留し、(R)−体のシクロペンテ
ノロン類とその対掌体のエステルを分離取得するか、抽
出物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、分離
し、抽出することによっても得ることができる。このよう
にして、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン
誘導体を取得することができる。また、このようにし
て、回収した上記の(R)−体のシクロペンテノロン類
は、目的に応じて、そのままで、または、これを、例え
ば、特開昭52−156840号公報、特公平4−50
19号公報、特公平5−36429号公報等に記載の方
法に準じて、一旦トシル化又はメシル化した後、加水分
解することにより光学的に反転させ、対応する対掌体に
変換し、合成ピレスロイドのアルコール中間体やプロス
タグランジン誘導体の中間体として重要である(S)−
体の一般式化6で示されるシクロペンテノロン類に容易
に導くことができる。そしてここで得られたシクロペン
テノロン類を例えばエステル化することにより、所望の
合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造す
ることができる。一方、不斉水解反応に於いて残存する
(S)−体のエステルは、そのまま、もしくは、これを
一旦加水分解するか、または特公平5−79656号公
報の記載に準じて、不斉水解反応後の反応生成物のま
ま、トシル化またはメシル化反応に付した後、加水分解
することにより、(S)−体の一般式 化6で示される
シクロペンテノロン類に導くことができ、これを前記と
同様に例えばエステル化することにより、所望の合成ピ
レスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造すること
ができる。このように本発明により、一般式 化6で示
されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸エ
ステルを最終的にはすべて(S)−体の一般式 化6で
示されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸
エステルに変換することも可能になり、本発明は工業的
にもきわめて有効な方法である。
するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。
C-20株 を、LB培地(Bacto tryptone(Difco Laboratori
es Incorporated製) 10g、Bacto yeast extract(Difco
Laboratories Incorporated 社製) 5g、NaCl 5g/ L、
以下LB培地と略)で、30℃、12時間培養した後、遠心分
離(6000rpm 、10min )により集菌し、菌体を回収し
た。回収された菌体を1mg/mlの塩化リゾチーム(生化学
工業(株)製)、25μg/mlのRNaseA(シグマ アルドリ
ッチ ジャパン(株)製)を含むTEN溶液(10mM Tris-H
Cl(pH8.0)、1mM EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下
TENと略)に懸濁し、37℃、20分間インキュベートし
た。その後、終濃度が1%(w/v)になるようにドデシル硫
酸ナトリウム を加え、55℃、10分間インキュベートし
た。次に、等量のTE[10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA
(pH8.0)]飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜ
た後、遠心分離(10,000rpm 、10min )し、上層を回収
した。回収された上層に、等量のTE飽和フェノール・ク
ロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分
離(10,000rpm 、10min )し、上層を回収した。回収さ
れた上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加
えた後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDN
Aをガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v)エタ
ノールでリンスし、次に80% (v/v)エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseA(シグマ アルドリッチ ジャパ
ン(株)製)、20μg/mlのPrteinase K (ベーリンガー
・マンハイム(株)製)を含むTEN溶液に懸濁し、37
℃、12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和
フェノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混
ぜた後、遠心分離(10,000rpm 、10min )し、上層を回
収した。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた
後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDNA
をガラス棒で巻き取った。このDNAを70% (v/v)エタ
ノールでリンスし、次に80%(v/v)エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseAを加えた10mlTE溶液に溶解した
後、2LのTE溶液に対して2回透析を行った。このように
して100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を得た。
製) 得られた染色体50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間
分解し、アガロース電気泳動(0.7%濃度)を行った。9.
4kb から6.6kb までの大きさのDNA画分と 7.5bから5.5k
b までの大きさのDNA画分をアガロースゲルから切り出
し、GeneClean(BIO101社製)で精製した。精製されたD
NA画分とλZAPII DNA (スタラタジーン クローニング
システム製)を、キット付属の説明書に従い、DNA リ
ガーゼを用い結合した。結合したDNA は、ギガパックゴ
ールドパッケージングキット(スタラタジーン クロー
ニング システム製)を用いて、キット付属の説明書に
従い、λ粒子中にインビトロ・パッケージングをした。
deria cepacia)SC-20株を培地(大豆粉抽出液100ml、、
コーンスチープリカー 1g、ダイズ油 5g)で、30℃、48
時間培養した。尚、大豆粉抽出液は、大豆粉10gに0.3%
NaOHを250ml加え、70℃で1時間加熱し、ろ紙でろ過す
ることにより調製された。培養終了後、遠心分離(14,00
0 rpm 、20min )により上清を回収した。回収された上
清液にエタノールを濃度が80%になるまで加えた後、再
び遠心分離(14,000 rpm 、20min)により沈殿を回収し
た。沈殿を乾燥後、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で懸濁
し、硫安濃度が20%から60%において沈殿する画分を回収
した。回収した画分を20mM Tris-HCl(pH8.0)溶液 5mlに
懸濁し、該懸濁を20mM Tris-HCl (pH8.0)溶液で平衡化
したDEAE-Sepharose FastFlowカラム(2.6 x 5cm、ファ
ルマシバイオテク(株)製)にチャージした後、20mM T
ris-HCl(pH8.0)溶液で十分に洗浄した。洗浄後、0Mから
0.5MのNaClの濃度勾配溶出により目的とする蛋白質を溶
出し、活性画分を得た。得られた活性画分を10mM Tris-
HCl(pH7.5)溶液で平衡化したDEAE-Sepharose FastFlow
カラム(2.6 x 5cm、ファルマシバイオテク(株)製)
を用いた上記同様の操作により精製を行い、再び活性画
分を得た。得られた活性画分は、150mM NaClを含む50mM
リン酸緩衝液(pH7.5)とで平衡化したSuperose12 HR10/3
0カラム(ファルマシア社製)を用いたゲル濾過クロマ
トグラフィーにより精製した。得られた活性画分(メイ
ンピーク)は、(RS)−4−ヒドロキシ−3−メチル
−2−(2−プロペニル)シクロペント−2−エン−1
−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、(R)−4−
ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロペニル)シク
ロペント−2−エン−1−オンを産生する能力を有し
た。また、(RS)−4−ヒドロキシ−3−メチル−2
−(2−プロピニル)シクロペント−2−エン−1−オ
ンの酢酸エステルを不斉加水分解し、(R)−4−ヒド
ロキシ−3−メチル−2−(2−プロピニル)シクロペ
ント−2−エン−1−オンを産生する能力を有した。
尚、該活性画分を、SDS 電気泳動[PhastGel Gradient
10-15とPhastGel SDS buffer stripを用いた自動電気泳
動装置ファストシステム(ファルマシバイオテク(株)
製)による]で解析したところ、蛋白質としては単一な
状態であり、該蛋白質は単一のサブユニットから構成さ
れ、その分子量は約3.8万ダルトンであることが明ら
かになった。 (2)プローブDNAの作製 このようにして得られた蛋白質を、分子量1万ダルトン
以下の蛋白質をカットする限外濾過(グレースジャパン
(株)製)で濃縮し、水で平衡化した脱塩カラム(Fast
Desalting Colum、ファルマシバイオテク(株)製)で
脱塩した後、減圧濃縮した。減圧濃縮された蛋白質をプ
ロテインシークエンサー470A((株)パーキンエルマー
ジャパン製)を用いてN末端側から切断した後、PTH-An
alyzer120A((株)パーキンエルマージャパン製)で分
析し、そのN末端側のアミノ酸配列を決定した。決定さ
れたアミノ酸配列を配列番号3に示す。上記のようにし
て決定されたN末端側のアミノ配列をもとに配列番号4
で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。尚、オリゴ
ヌクレオチドの合成には、DNA自動合成装置モデル380A
((株)パーキンエルマージャパン製)が用いられた。
合成されたDNAをMEGALABEL キット(宝酒造(株)製)
を用いて放射性同位元素で標識した。
単離) 実施例2で調製された染色体DNA ライブラリからの本発
明遺伝子のスクリーニングは、Colony/Plaque Screen
(NEN Research Products製)を用いて添付の説明書に
従って行われた。具体的には、大腸菌XL1-BlueをLB培地
で培養した後、遠心分離(8000 rpm、15min)により集菌
した。集菌された菌体を10mM MgSO4溶液に懸濁した後、
該菌懸濁液に実施例2で調製された染色体DNA ライブラ
リを含むλファージを感染させた。感染後、50℃に加温
した0.7%アガロースを含むNZY培地(NaCl 5g/L、MgSO4-
H2O 2g/L、Bacto yeast extract(Difco Laboratories I
ncorporated製) 5g/L、NZアミン 10g/L、以下NZY培地
と略)と混合し、これを直径150mm のNZY寒天プレート
の上に重層した。1枚のプレートに約2万個程度のファ
ージをまき、37℃でプラークが出現するまでインキュベ
ートした。インキュベート後、プレート上に発生したプ
ラークをプレート当たり2枚の割合でColony/Plaque Sc
reenメンブレンに移し取った後、0.5M NaOHを含む溶液
で5分間、2回処理し、1.0M Tris-HCl(pH8.0)溶液で5
分間、2回中和した後、2xSSC溶液でColony/Plaque Scr
eenメンブレンをリンスし、濾紙上で風乾した。(但
し、nxSSC溶液とは、20xSSC溶液をn/20倍希釈したもの
を指し、20xSSC溶液は、175.3g NaCl、88.2gクエン酸3
ナトリウム/L(pH7.0)である。以下、n x SSCと略。)
得られたColony/Plaque Screenメンブレンを2xSSCに浸
した後、68℃に加温した6xSSC、0.5%(w/v)ドデシル硫酸
ナトリウム(以下、SDSと略)、5XDenhart's液(0.1g F
icoll、0.1g polyvinylpyrrolidone, 0.1g bovine seru
m albumin / 100ml)、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのプレハイブリダイゼーション溶液
に3時間浸した。このように前処理されたメンブレンを
6xSSC、0.5%(w/v)SDS、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのハイブリダイゼーション溶液に浸
し、これに実施例3で作製されたプローブDNAを加え、
さらに63℃で、18時間振とうしながら放置した。その
後、メンブレンを2XSSC、0.5%SDS液で5分間室温にて洗
浄した。さらに、(1)2XSSC、0.1%SDS液で15分間室
温で振盪しながら洗浄し、(2)0.1XSSC、0.5%SDS液で
60分間37℃で振盪しながら洗浄し、(3)0.1XSS
C、0.5%SDS液で60分間68℃で振盪しながら洗浄する
ことにより余分なプローブDNAを除去した。メンブレン
上に吸着したプローブDNAに相当する位置からファージ
をパスツールピペットで吸い取り、単一のプラークとし
て分離できるまで上記の作業を繰り返し、目的とするDN
A断片(本発明遺伝子)が含まれるファージを単離し
た。このようにして約4万個のプラークをスクリーニン
グし、3株のファージを単離した。
の解析) 実施例4により得られたファージをλZAPIIのマニュア
ル(ストラタジーンクローニング システム製)に従っ
てプラスミドに組み換えた。得られたプラスミドをpAL6
01と命名した。pAL601を制限酵素により解析した結果、
約7.0kbpのEcoRI断片が挿入されていた(図1参照)。p
AL601のうち約2kbpのSmaI断片(エステラーゼ遺伝子の
領域)についてPRISMkit ((株)パーキンエルマージ
ャパン製)と自動塩基配列解析装置373A((株)パーキ
ンエルマージャパン製)を用いてその塩基配列を決定し
た。尚、解析はGenetyx-Mac/ATSQ(ソフトウエア開発
(株)製)と、Genetyx-Mac(ソフトウエア開発(株)
製)により行い、そのエステラーゼ遺伝子の塩基配列を
配列番号2に示した。決定された塩基配列から予想され
るアミノ酸配列の中に、配列番号3に示したアミノ酸配
列と完全に一致する領域が存在し、上記DNA断片上に目
的とするエステラーゼ遺伝子が存在することが確認でき
た。
1) pAL601を制限酵素SmaIで切断しサブクローニングするこ
とによりpAL612を得た。得られたpAL612を大腸菌JM109
株に形質転換した。このようにして得られた得られた形
質転換体E.coli JM109/pAL612株を、各々50mg/Lのアン
ピシリンと1mMのisopropyl thio-β-D-galactoside(以
下IPTGと略)を含む100mlのLB培地で、37℃、16時間
培養した後、遠心分離(6000rpm、10min)により集菌
し、菌体を回収した。得られた菌体を20mlの200mMリン
酸緩衝液に懸濁した。(RS)−4−ヒドロキシ−3−メ
チル−2−(2−プロペニル)シクロペント−2−エン
−1−オンのメチルエステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(p
H7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌
させながら40℃、10分間予熱した。これに1.0mlの上記
懸濁液を加え、撹拌子で撹拌させながら40℃で反応を行
った。30分間後、該反応液を50μlを回収し、1mlのエタ
ノールを添加することにより反応を停止させた。ブラン
クは、培養物の代わりに精製水を用いて同様な方法で試
験した。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度150℃、インジェクション温度170
℃、ディテクション温度170℃、検出器はFIDの条件で、
GC-14A((株)島津製作所製)を用いて分析した。さら
に反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽
出物についてHPLC分析により光学純度を測定した。
分析には、(株)住化分析センター製OA-4100 (4.0mmI.
D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用した。溶出液
は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:
20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速
は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光学異性体
比を分析した。上記の分析結果に基づき、加水分解率、
光学選択性を算出し、表3に示した。表3から明らかな
ように、2kb SmaI断片が挿入された形質転換体である大
腸菌JM109/pAL612株が(RS)−4−ヒドロキシ−3−メ
チル−2−(2−プロぺニル)シクロペント−2−エン
−1−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、(R)−
4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロぺニル)
シクロペント−2−エン−1−オンを産生する能力を有
するエステラーゼを産生することを確認できた。
2) (RS)−4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロ
ピニル)シクロペント−2−エン−1−オンの酢酸エス
テルを基質として、実施例4と同様な検討を行った結果
を、表4に示す。
3) (RS)−4−ヒドロキシ−2−(7−ヒドロキシヘプチ
ル)−2−シクロペンテノンのジ酢酸エステルを基質と
して、実施例4と同様な検討を行った結果を表5に示
す。尚、緩衝液には100mMリン酸緩衝液(pH6.0)を用い
た。4−ヒドロキシ−2−(7−ヒドロキシヘプチル)
−2−シクロペンテノンのジ酢酸エステルの分解率は、
ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラム
は、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度2
40℃、インジェクション温度260℃で分析した。さらに
反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出
物についてHPLC分析により光学純度を測定した。4
−ヒドロキシ−2−(7−ヒドロキシヘプチル)−2−
シクロペンテノンの分析には、(株)住化分析センター
製OA-4500 光学異性体分析カラムを2本連結して使用し
た。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノ
ールを100:4:4の割合で混合したものを用いることがで
きる。流速は1.5ml/minで、235nmの吸光度を指標にして
光学異性体比を分析した。
4) (RS)−4−ヒドロキシ−2−(6−メトキシカルボニ
ルヘキシル)−2−シクロペンテノンの酢酸エステルを
基質として、実施例4と同様な検討を行った結果を表6
に示す。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度240℃、インジェクション温度260℃
で分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで
抽出した後、該抽出物についてHPLC分析により光学
純度を測定した。4−ヒドロキシ−2−(6−メトキシ
カルボニルヘキシル)−2−シクロペンテノンの分析に
は、(株)住化分析センター製OA-4500 光学異性体分析
カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロ
エタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したものを
用いることができる。流速は1ml/minで、235nmの吸光度
を指標にして光学異性体比を分析した。
ロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、不斉加水分
解し、高い光学純度の(R)-体の一般式 化6で示される
(R)-シクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコー
ドする遺伝子を提供することが可能になった。
2の制限酵素地図を表す図である。
Claims (13)
- 【請求項1】一般式 化1 【化1】 (式中、R1は水素又はメチル基、R2は炭素原子1〜1
0個のアルキル基、炭素原子2〜10個のアルケニル
基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭素原子1〜
4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、(R)−体の一般式 化1で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコード
し、かつ、配列番号1で示される塩基配列にハイブリダ
イズすることを特徴とするエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項2】配列番号1で示される塩基配列とのホモロ
ジーが90%以上であることを特徴とする請求項1記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項3】配列番号2で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有することを特徴とする請求項1記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項4】配列番号1で示される塩基配列を有するこ
とを特徴とする請求項1記載のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項5】請求項1、2、3又は4記載のエステラー
ゼ遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド。 - 【請求項6】請求項5記載のプラスミドにより形質転換
されたことを特徴とする形質転換体。 - 【請求項7】形質転換体が微生物であることを特徴とす
る請求項6記載の形質転換体。 - 【請求項8】請求項1、2、3又は4記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が産生することを特徴とするエ
ステラーゼ。 - 【請求項9】請求項1、2、3又は4記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が請求項6記載の形質転換体で
あることを特徴とする請求項8記載のエステラーゼ。 - 【請求項10】請求項6記載の形質転換体を培養するこ
とにより、一般式 化2 【化2】 (式中、R1は水素又はメチル基、R2は炭素原子1〜1
0個のアルキル基、炭素原子2〜10個のアルケニル
基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭素原子1〜
4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、(R)−体の一般式 化2で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力を有するエステラーゼを産生す
ることを特徴とするエステラーゼの製造方法。 - 【請求項11】請求項8記載のエステラーゼを一般式
化3 【化3】 (式中、R1は水素又はメチル基、R2は炭素原子1〜1
0個のアルキル基、炭素原子2〜10個のアルケニル
基、炭素原子2〜10個のアルキニル基、炭素原子1〜
4個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子5〜9個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子5〜9個の脂肪酸基を表す)で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させて、
該エステルを不斉加水分解して、(R)−体の一般式
化3で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエ
ステルとに分割することを特徴とする一般式 化3で示
されるシクロペンテノロン類の光学分割方法。 - 【請求項12】一般式 化3で示されるシクロペンテノ
ロン類が4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロ
ペニル)シクロペント−2−エン−1−オンである請求
項11記載の光学分割方法。 - 【請求項13】一般式 化3で示されるシクロペンテノ
ロン類が4−ヒドロキシ−3−メチル−2−(2−プロ
ピニル)シクロペント−2−エン−1−オンである請求
項11記載の光学分割方法。
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