JPH10210975A - エステラーゼ遺伝子及びその利用 - Google Patents
エステラーゼ遺伝子及びその利用Info
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- JPH10210975A JPH10210975A JP8344076A JP34407696A JPH10210975A JP H10210975 A JPH10210975 A JP H10210975A JP 8344076 A JP8344076 A JP 8344076A JP 34407696 A JP34407696 A JP 34407696A JP H10210975 A JPH10210975 A JP H10210975A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステ
ルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体を産生するエステラー
ゼをコードする遺伝子の提供。 【解決手段】一般式 化１ （式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ２は炭素原子１〜
１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜
４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化１で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生するエステラーゼをコードするエステラ
ーゼ遺伝子並びにその遺伝子に係るプラスミド、形質転
換体、産生エステラーゼ。
ルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体を産生するエステラー
ゼをコードする遺伝子の提供。 【解決手段】一般式 化１ （式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ２は炭素原子１〜
１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜
４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化１で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生するエステラーゼをコードするエステラ
ーゼ遺伝子並びにその遺伝子に係るプラスミド、形質転
換体、産生エステラーゼ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エステラーゼ遺伝
子及びその利用に関する。
子及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般式 化４
【０００３】
【化４】
【０００４】（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭
素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個の
アルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭
素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示され
るシクロペンテノロン類は、医薬や農薬等の中間体とし
て重要である。このシクロペンテノン類は、優れた殺虫
活性を有するいわゆる合成ピレスロイドと呼ばれる一群
のエステル系化合物の重要なアルコール成分として有用
であり、また医薬であるプロスタグランジン誘導体の中
間体としても有用である。例えば、４−ヒドロキシ−３
−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−
エン−１−オンの２、２、３、３−テトラメチルシクロ
プロパンカルボン酸とのエステルである下記式 化５で
示される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死
効力を有する優れた殺虫剤である（例えば、特公昭５０
−１５８４３）。
素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個の
アルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭
素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示され
るシクロペンテノロン類は、医薬や農薬等の中間体とし
て重要である。このシクロペンテノン類は、優れた殺虫
活性を有するいわゆる合成ピレスロイドと呼ばれる一群
のエステル系化合物の重要なアルコール成分として有用
であり、また医薬であるプロスタグランジン誘導体の中
間体としても有用である。例えば、４−ヒドロキシ−３
−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−
エン−１−オンの２、２、３、３−テトラメチルシクロ
プロパンカルボン酸とのエステルである下記式 化５で
示される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死
効力を有する優れた殺虫剤である（例えば、特公昭５０
−１５８４３）。
【０００５】
【化５】
【０００６】一般式 化４で示されるシクロペンテノロ
ン類は、その４位に不斉炭素を有するために２種の光学
異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分とし
て有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール
成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差
を生じることが知られており、例えば、上記一般式 化
５で示される化合物において、（Ｓ）−４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−
２−エン−１−オンからなるエステルは、対応する
（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエ
ステルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明
らかになっている。また、同様に光学活性な４−ヒドロ
キシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペ
ンテノン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボ
ニルヘキシル）−２−シクロペンテノン及び４−ヒドロ
キシ−２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン
等は、医薬であるプロスタグランジン誘導体の中間体と
して有用である。
ン類は、その４位に不斉炭素を有するために２種の光学
異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分とし
て有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール
成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差
を生じることが知られており、例えば、上記一般式 化
５で示される化合物において、（Ｓ）−４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−
２−エン−１−オンからなるエステルは、対応する
（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエ
ステルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明
らかになっている。また、同様に光学活性な４−ヒドロ
キシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペ
ンテノン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボ
ニルヘキシル）−２−シクロペンテノン及び４−ヒドロ
キシ−２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン
等は、医薬であるプロスタグランジン誘導体の中間体と
して有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このため、医薬や農薬
等の中間体である一般式 化４で示されるシクロペンテ
ノロン類の光学異性体を工業的にも有利に分離取得する
方法の開発が望まれており、また、そのために、例え
ば、該シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステル
に作用して、これを不斉加水分解する能力を有する優れ
たエステラーゼを産生する微生物を遺伝子工学的手法に
より作製するために、上記のようなエステラーゼをコー
ドする遺伝子の探索も強く望まれている。
等の中間体である一般式 化４で示されるシクロペンテ
ノロン類の光学異性体を工業的にも有利に分離取得する
方法の開発が望まれており、また、そのために、例え
ば、該シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステル
に作用して、これを不斉加水分解する能力を有する優れ
たエステラーゼを産生する微生物を遺伝子工学的手法に
より作製するために、上記のようなエステラーゼをコー
ドする遺伝子の探索も強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度
の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 １）一般式 化６
明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度
の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 １）一般式 化６
【０００９】
【化６】
【００１０】（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭
素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個の
アルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭
素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示され
るシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不
斉加水分解し、（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、配
列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズすること
を特徴とするエステラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子
と記す。）、 ２）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９
０％以上であることを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子。 ３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子、 ４）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴
とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、 ５）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プ
ラスミドと記す。）、 ６）前項５記載のプラスミドにより形質転換されたこと
を特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記
す。）、 ７）形質転換体が微生物であることを特徴とする前項６
記載の形質転換体、 ８）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ
（以下、本発明エステラーゼと記す。）、 ９）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が前項６記載の形質転換体であることを特
徴とする前項８記載のエステラーゼ、 １０）前項６記載の形質転換体を培養することにより、
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カ
ルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能
力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエ
ステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記
す。）、 １１）前項８記載のエステラーゼを一般式 化６で示さ
れるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに
作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類とそ
の対掌体のエステルとに分割することを特徴とする一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方
法（以下、本発明光学分割方法と記す。）、 １２）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、 １３）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、を提供するものである。
素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個の
アルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭
素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示され
るシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不
斉加水分解し、（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、配
列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズすること
を特徴とするエステラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子
と記す。）、 ２）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９
０％以上であることを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子。 ３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子、 ４）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴
とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、 ５）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プ
ラスミドと記す。）、 ６）前項５記載のプラスミドにより形質転換されたこと
を特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記
す。）、 ７）形質転換体が微生物であることを特徴とする前項６
記載の形質転換体、 ８）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ
（以下、本発明エステラーゼと記す。）、 ９）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が前項６記載の形質転換体であることを特
徴とする前項８記載のエステラーゼ、 １０）前項６記載の形質転換体を培養することにより、
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カ
ルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能
力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエ
ステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記
す。）、 １１）前項８記載のエステラーゼを一般式 化６で示さ
れるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに
作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類とそ
の対掌体のエステルとに分割することを特徴とする一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方
法（以下、本発明光学分割方法と記す。）、 １２）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、 １３）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明遺伝子は、一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、
（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、
かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズ
するエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエス
テラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意
味している。ここで一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力とは、例えば、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−メチルシクロペントー２−エン−１
−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−エチル−２
−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロペニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２、４−ペンタジエニル）−２−シクロペン
ト−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル
−２−（１−メチル−２−プロピニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−
１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（１−メ
チル−２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−
オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２，２，２
−トリフルオロエチル）シクロペント−２−エン−１−
オン、４−ヒドロキシ−２−（７−アセトキシヘプチ
ル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−
（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、
４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシ
ル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−
（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン等のシクロ
ペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分
解し、対応する（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を意味する。一般式 化６で示されるシクロ
ペンテノロン類において、Ｒ2で示される炭素原子１〜
１０個のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ペンチル基、ヘプチル基、デシル基等をあげること
ができ、炭素原子２〜１０個のアルケニル基としては、
例えば、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニ
ル基、２，４−ペンタジエニル基、２−ヘプテニル基、
２−デセニル基等をあげることができ、炭素原子２〜１
０個のアルキニル基としては、例えば、２−プロピニル
基、１−メチル−２−プロピニル基、２ーヘプチニル
基、２ーデシニル基等をあげることができ、炭素原子１
〜４個のハロアルキル基としては、例えば、２，２，
２，−トリフルオロエチル基、４，４，４−トリフルオ
ロブチル基等をあげることができ、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基としては、末端のヒドロキシ基が、例え
ば、アルキル基、アルコキシアルキル基等により保護さ
れてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水
素基であり、なかでもその脂肪族炭化水素が直鎖飽和脂
肪族炭化水素である置換基を好ましくあげることができ
る。例えば、７−アセトキシペンチル基、７−ヒドロキ
シペンチル基、７−アセトキシヘプチル基、７−ヒドロ
キシヘプチル基、１０−ヒドロキシノニル基等をあげる
ことができる。末端のカルボキシル基が保護されてもよ
い炭素原子５〜９個の脂肪酸基としては、末端のカルボ
キシル基が、例えば、アルキル基等により保護されても
よい炭素原子５〜９個の脂肪酸基であり、なかでもその
脂肪酸が直鎖飽和脂肪酸である置換基を好ましくあげる
ことができる。例えば、６−メトキシカルボニルヘキシ
ル基、８−メトキシカルボニルオクチル基等をあげるこ
とができる。尚、前記有機カルボン酸エステルに於い
て、有機カルボン酸としては、例えば、炭素原子１〜１
８個の飽和又は不飽和の脂肪酸、ピレスロイド酸等をあ
げることができる。
本発明遺伝子は、一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、
（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、
かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズ
するエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエス
テラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意
味している。ここで一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力とは、例えば、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−メチルシクロペントー２−エン−１
−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−エチル−２
−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロペニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２、４−ペンタジエニル）−２−シクロペン
ト−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル
−２−（１−メチル−２−プロピニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−
１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（１−メ
チル−２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−
オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２，２，２
−トリフルオロエチル）シクロペント−２−エン−１−
オン、４−ヒドロキシ−２−（７−アセトキシヘプチ
ル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−
（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、
４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシ
ル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−
（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン等のシクロ
ペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分
解し、対応する（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産
生する能力を意味する。一般式 化６で示されるシクロ
ペンテノロン類において、Ｒ2で示される炭素原子１〜
１０個のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ペンチル基、ヘプチル基、デシル基等をあげること
ができ、炭素原子２〜１０個のアルケニル基としては、
例えば、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニ
ル基、２，４−ペンタジエニル基、２−ヘプテニル基、
２−デセニル基等をあげることができ、炭素原子２〜１
０個のアルキニル基としては、例えば、２−プロピニル
基、１−メチル−２−プロピニル基、２ーヘプチニル
基、２ーデシニル基等をあげることができ、炭素原子１
〜４個のハロアルキル基としては、例えば、２，２，
２，−トリフルオロエチル基、４，４，４−トリフルオ
ロブチル基等をあげることができ、末端のヒドロキシ基
が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪
族炭化水素基としては、末端のヒドロキシ基が、例え
ば、アルキル基、アルコキシアルキル基等により保護さ
れてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水
素基であり、なかでもその脂肪族炭化水素が直鎖飽和脂
肪族炭化水素である置換基を好ましくあげることができ
る。例えば、７−アセトキシペンチル基、７−ヒドロキ
シペンチル基、７−アセトキシヘプチル基、７−ヒドロ
キシヘプチル基、１０−ヒドロキシノニル基等をあげる
ことができる。末端のカルボキシル基が保護されてもよ
い炭素原子５〜９個の脂肪酸基としては、末端のカルボ
キシル基が、例えば、アルキル基等により保護されても
よい炭素原子５〜９個の脂肪酸基であり、なかでもその
脂肪酸が直鎖飽和脂肪酸である置換基を好ましくあげる
ことができる。例えば、６−メトキシカルボニルヘキシ
ル基、８−メトキシカルボニルオクチル基等をあげるこ
とができる。尚、前記有機カルボン酸エステルに於い
て、有機カルボン酸としては、例えば、炭素原子１〜１
８個の飽和又は不飽和の脂肪酸、ピレスロイド酸等をあ
げることができる。
【００１２】また、「配列番号１で示される塩基配列に
ハイブリダイズする」遺伝子とは、配列番号１で示され
る塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、例えば、
「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌
弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサ
ザンハイブリダイゼーション方法によって視覚的に検出
可能であるような遺伝子を意味し、配列番号１で示され
る塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡにおける１若
しくは複数の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列
からなるＤＮＡ等である。例えば、95℃、1分という条
件の熱処理や、0．5M NaOH、1．5M NaClという条件のア
ルカリ処理により、二本鎖からなるDNAを相補的な一本
鎖DNAに解離させた後、例えば、氷上に1分放置するとい
う条件の放熱や0．5M Tris・HCl（pH7．0）、3．0M NaC
lという条件の中和処理により前記一本鎖DNAに対して相
補性を有する一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二
本鎖状態（ハイブリダイズした状態）になり、このよう
なＤＮＡは、通常、配列番号１で示される塩基配列と高
いホモロジー（活性部位や構造等に強く関与する領域か
否かによっても異なるが、例えば、全体として９０％程
度以上のホモロジー）を有するような塩基配列を有する
遺伝子である。ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発
したホモロジー検索プログラムを用いて計算することが
できる（Pearson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Acad
emic.Sci USA, 85, 2444）。また、Genetyx-Mac（ソフ
トウエア開発（株）製）に含まれているこのプログラム
を用いても計算することができる。また、日本ＤＮＡデ
ータバンク（ＤＤＢＪ）のWorldWideWebサービスにある
ホモロジーサーチ・プログラム(fasta)を用いることも
できる。このような本発明遺伝子のより具体的な例とし
ては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげる
ことができる。もちろん、配列番号１で示される塩基配
列を有するエステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあ
げることができる。
ハイブリダイズする」遺伝子とは、配列番号１で示され
る塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、例えば、
「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌
弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサ
ザンハイブリダイゼーション方法によって視覚的に検出
可能であるような遺伝子を意味し、配列番号１で示され
る塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡにおける１若
しくは複数の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列
からなるＤＮＡ等である。例えば、95℃、1分という条
件の熱処理や、0．5M NaOH、1．5M NaClという条件のア
ルカリ処理により、二本鎖からなるDNAを相補的な一本
鎖DNAに解離させた後、例えば、氷上に1分放置するとい
う条件の放熱や0．5M Tris・HCl（pH7．0）、3．0M NaC
lという条件の中和処理により前記一本鎖DNAに対して相
補性を有する一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二
本鎖状態（ハイブリダイズした状態）になり、このよう
なＤＮＡは、通常、配列番号１で示される塩基配列と高
いホモロジー（活性部位や構造等に強く関与する領域か
否かによっても異なるが、例えば、全体として９０％程
度以上のホモロジー）を有するような塩基配列を有する
遺伝子である。ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発
したホモロジー検索プログラムを用いて計算することが
できる（Pearson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Acad
emic.Sci USA, 85, 2444）。また、Genetyx-Mac（ソフ
トウエア開発（株）製）に含まれているこのプログラム
を用いても計算することができる。また、日本ＤＮＡデ
ータバンク（ＤＤＢＪ）のWorldWideWebサービスにある
ホモロジーサーチ・プログラム(fasta)を用いることも
できる。このような本発明遺伝子のより具体的な例とし
ては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげる
ことができる。もちろん、配列番号１で示される塩基配
列を有するエステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあ
げることができる。
【００１３】本発明遺伝子は、例えば、バークホルデリ
ア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAを鋳型と
し、かつ配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
の一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末
端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオ
チドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配
列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの
組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の
5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌク
レオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側
配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
の組み合わせ）をプライマーとして用いるＰＣＲ法によ
り取得することができる。また、例えば、バークホルデ
リア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAをラムダ
ファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子
ライブラリーを、配列番号２で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される
塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブと
して、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハ
イブリダイゼーションなどの方法によっても取得するこ
とができる。本発明遺伝子が調製される微生物として
は、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア
（Burkholderia cepacia）を特に好ましくあげることが
でき、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株
があげられる。尚、上記にあるBurkholderia cepacia S
C-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であ
り、下記の菌学的性質を有する（表１及び２）。
ア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAを鋳型と
し、かつ配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
の一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末
端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオ
チドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配
列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの
組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の
5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌク
レオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側
配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
の組み合わせ）をプライマーとして用いるＰＣＲ法によ
り取得することができる。また、例えば、バークホルデ
リア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAをラムダ
ファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子
ライブラリーを、配列番号２で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される
塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブと
して、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハ
イブリダイゼーションなどの方法によっても取得するこ
とができる。本発明遺伝子が調製される微生物として
は、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア
（Burkholderia cepacia）を特に好ましくあげることが
でき、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株
があげられる。尚、上記にあるBurkholderia cepacia S
C-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であ
り、下記の菌学的性質を有する（表１及び２）。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】以上の菌学的性質を、バージェイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
１巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V
ol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネティブ・バクテリオロジー第９版（Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,Ninth edition(199
4))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(19
95)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,
(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシ
ア（Burkholderia cepacia）と一致している。
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
１巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V
ol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネティブ・バクテリオロジー第９版（Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,Ninth edition(199
4))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(19
95)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,
(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシ
ア（Burkholderia cepacia）と一致している。
【００１７】また、鋳型としてE.coli JM109/pAL612株
の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡの一部
（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配
列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと
配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相
当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合
わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端
側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチ
ドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に
相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み
合わせ）を用いるＰＣＲ法により取得することができ
る。尚、上記にあるE.coli JM109/pAL612株は、本発明
遺伝子を含有するプラスミドpAL612（本発明プラスミ
ド）をエシェリヒア・コリ(Escherchia coli）JM109株
に導入した形質転換体微生物（本発明形質転換体）は、
FERM-BP 5740として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託（受理日：平成８年１１月７日）されている。
の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡの一部
（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配
列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと
配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相
当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合
わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端
側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチ
ドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に
相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み
合わせ）を用いるＰＣＲ法により取得することができ
る。尚、上記にあるE.coli JM109/pAL612株は、本発明
遺伝子を含有するプラスミドpAL612（本発明プラスミ
ド）をエシェリヒア・コリ(Escherchia coli）JM109株
に導入した形質転換体微生物（本発明形質転換体）は、
FERM-BP 5740として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託（受理日：平成８年１１月７日）されている。
【００１８】取得された本発明遺伝子を、例えば、形質
転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に
通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本
発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例え
ば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いる
ベクターとしては、pUC119（宝酒造（株）製）、pBlues
criptII （ストラタジーン クローニング システム製）
等をあげることができる。構築された本発明プラスミド
により宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させ
る宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法をあげることができる。尚、形質転換体を選
抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質
転換させた宿主細胞をトリブチリン含有ＬＢプレートで
培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に
選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一
般式 化６に示されるシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析すること
により、（Ｒ）−体の一般式 化６に示されるシクロペ
ンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選
抜すればよい。より具体的には、例えば、（ＲＳ）−４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シ
クロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステル0.5gと
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に
入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。
これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させな
がら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを
回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を
停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用い
て同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラ
フィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン D
C-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクシ
ョン温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFI
Dの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分
析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの（Ｒ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを遊離する酵素量を1uni
tとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽
出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により，
（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの光学純度
を測定する。分析には、（株）住化分析センター製OA-4
100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用す
る。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethano
l を100:20:1の割合で混合したものを用いることができ
る。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光
学異性体比を分析すればよい。さらに詳細に、選抜され
た形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを
調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本
発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、
サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダ
イゼーション等の方法で確認することもできる。
転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に
通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本
発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例え
ば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いる
ベクターとしては、pUC119（宝酒造（株）製）、pBlues
criptII （ストラタジーン クローニング システム製）
等をあげることができる。構築された本発明プラスミド
により宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させ
る宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法をあげることができる。尚、形質転換体を選
抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質
転換させた宿主細胞をトリブチリン含有ＬＢプレートで
培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に
選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一
般式 化６に示されるシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析すること
により、（Ｒ）−体の一般式 化６に示されるシクロペ
ンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選
抜すればよい。より具体的には、例えば、（ＲＳ）−４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シ
クロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステル0.5gと
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に
入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。
これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させな
がら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを
回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を
停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用い
て同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラ
フィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン D
C-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクシ
ョン温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFI
Dの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分
析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの（Ｒ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを遊離する酵素量を1uni
tとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽
出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により，
（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの光学純度
を測定する。分析には、（株）住化分析センター製OA-4
100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用す
る。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethano
l を100:20:1の割合で混合したものを用いることができ
る。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光
学異性体比を分析すればよい。さらに詳細に、選抜され
た形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを
調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本
発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、
サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダ
イゼーション等の方法で確認することもできる。
【００１９】このようにして本発明形質転換体を得て、
該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼ
を産生させることができる（本発明製造方法）。形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養され
る。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキ
ストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等
が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、
カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無
機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類
およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウ
ム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カ
リウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。さらに、オリーブ油等のトリグリセライドを培地に
添加することが好ましい。添加量としては、例えば、培
地100ml に対して、約10mg〜約10g程度をあげることが
できる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じ
て行い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復
式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter ）
培養、培養タンク等）いずれも可能である。特に、ジャ
ーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必
要があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気
条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適
宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養
温度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好まし
い。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通
常約1〜約5日間が望ましい。
該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼ
を産生させることができる（本発明製造方法）。形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養され
る。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキ
ストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等
が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、
カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無
機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類
およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウ
ム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カ
リウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。さらに、オリーブ油等のトリグリセライドを培地に
添加することが好ましい。添加量としては、例えば、培
地100ml に対して、約10mg〜約10g程度をあげることが
できる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じ
て行い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復
式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter ）
培養、培養タンク等）いずれも可能である。特に、ジャ
ーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必
要があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気
条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適
宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養
温度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好まし
い。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通
常約1〜約5日間が望ましい。
【００２０】本発明エステラーゼは、 １）分子量（SDS-PAGE）約３．８万ダルトンであり、 ２）等電点（pI）６．０であり、 ３）至適温度は約６０℃で、少なくとも約２０℃〜約７
０℃程度、好ましくは約３０℃〜約４０℃程度の範囲に
おいて反応可能であり、 ４）ｐＨ約４〜約９程度、好ましくはｐＨ約５〜約７程
度の範囲において反応可能であり、 ５）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有
機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生す
る能力を有し、 ６）例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属
する微生物（特に好ましい微生物としては、バークホル
デリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、さらに具
体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換
体を培養することにより得ることもできる。もちろん、
前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形
質転換された形質転換体を培養することによっても得る
ことができる。本発明エステラーゼは、それ自体を含有
する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養
物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利
用してもよい。このような分離の方法としては、例え
ば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等
により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用
いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機
ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法を
あげることができる。必要に応じて、これらの方法を組
み合わせて用いることができる。さらにまた、本発明エ
ステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担
体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに
閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、
容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反
応に利用することもできる。
０℃程度、好ましくは約３０℃〜約４０℃程度の範囲に
おいて反応可能であり、 ４）ｐＨ約４〜約９程度、好ましくはｐＨ約５〜約７程
度の範囲において反応可能であり、 ５）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有
機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生す
る能力を有し、 ６）例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属
する微生物（特に好ましい微生物としては、バークホル
デリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、さらに具
体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換
体を培養することにより得ることもできる。もちろん、
前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形
質転換された形質転換体を培養することによっても得る
ことができる。本発明エステラーゼは、それ自体を含有
する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養
物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利
用してもよい。このような分離の方法としては、例え
ば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等
により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用
いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機
ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法を
あげることができる。必要に応じて、これらの方法を組
み合わせて用いることができる。さらにまた、本発明エ
ステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担
体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに
閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、
容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反
応に利用することもできる。
【００２１】本発明エステラーゼは、例えば、一般式
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に
利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式 化
６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エ
ステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、
（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類とその対掌体である（Ｓ）−体のエステルとに分割
する方法に利用でき、かかる分割方法に於いて、通常
は、ラセミのエステルが原料として用いられる。具体的
には、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２
−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シ
クロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−２
−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノ
ン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘ
キシル）−２−シクロペンテノン又は４−ヒドロキシ−
２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノンをあげ
ることができる。反応温度は、例えば、約20℃〜約70
℃、好ましくは、約30℃〜約40℃を、反応pHは、例えば
約4〜約9、好ましくは、約5〜約7を、反応時間は、例え
ば、約5分間〜約96時間を挙げることができる。反応液
からの（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類とその対掌体のエステルの回収は、一般に知
られている任意の方法で行うことができる。例えば、溶
媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの操
作を、適宜採用することができる。具体的には、反応液を
エーテル、酢酸エチル、ベンゼンなどの有機溶媒で抽出
し、この抽出物を分別蒸留し、（Ｒ）−体のシクロペンテ
ノロン類とその対掌体のエステルを分離取得するか、抽
出物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、分離
し、抽出することによっても得ることができる。このよう
にして、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン
誘導体を取得することができる。また、このようにし
て、回収した上記の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類
は、目的に応じて、そのままで、または、これを、例え
ば、特開昭５２−１５６８４０号公報、特公平４−５０
１９号公報、特公平５−３６４２９号公報等に記載の方
法に準じて、一旦トシル化又はメシル化した後、加水分
解することにより光学的に反転させ、対応する対掌体に
変換し、合成ピレスロイドのアルコール中間体やプロス
タグランジン誘導体の中間体として重要である（Ｓ）−
体の一般式化６で示されるシクロペンテノロン類に容易
に導くことができる。そしてここで得られたシクロペン
テノロン類を例えばエステル化することにより、所望の
合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造す
ることができる。一方、不斉水解反応に於いて残存する
（Ｓ）−体のエステルは、そのまま、もしくは、これを
一旦加水分解するか、または特公平５−７９６５６号公
報の記載に準じて、不斉水解反応後の反応生成物のま
ま、トシル化またはメシル化反応に付した後、加水分解
することにより、（Ｓ）−体の一般式 化６で示される
シクロペンテノロン類に導くことができ、これを前記と
同様に例えばエステル化することにより、所望の合成ピ
レスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造すること
ができる。このように本発明により、一般式 化６で示
されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸エ
ステルを最終的にはすべて（Ｓ）−体の一般式 化６で
示されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸
エステルに変換することも可能になり、本発明は工業的
にもきわめて有効な方法である。
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に
利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式 化
６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エ
ステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、
（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類とその対掌体である（Ｓ）−体のエステルとに分割
する方法に利用でき、かかる分割方法に於いて、通常
は、ラセミのエステルが原料として用いられる。具体的
には、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２
−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シ
クロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−２
−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノ
ン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘ
キシル）−２−シクロペンテノン又は４−ヒドロキシ−
２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノンをあげ
ることができる。反応温度は、例えば、約20℃〜約70
℃、好ましくは、約30℃〜約40℃を、反応pHは、例えば
約4〜約9、好ましくは、約5〜約7を、反応時間は、例え
ば、約5分間〜約96時間を挙げることができる。反応液
からの（Ｒ）−体の一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類とその対掌体のエステルの回収は、一般に知
られている任意の方法で行うことができる。例えば、溶
媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの操
作を、適宜採用することができる。具体的には、反応液を
エーテル、酢酸エチル、ベンゼンなどの有機溶媒で抽出
し、この抽出物を分別蒸留し、（Ｒ）−体のシクロペンテ
ノロン類とその対掌体のエステルを分離取得するか、抽
出物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、分離
し、抽出することによっても得ることができる。このよう
にして、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン
誘導体を取得することができる。また、このようにし
て、回収した上記の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類
は、目的に応じて、そのままで、または、これを、例え
ば、特開昭５２−１５６８４０号公報、特公平４−５０
１９号公報、特公平５−３６４２９号公報等に記載の方
法に準じて、一旦トシル化又はメシル化した後、加水分
解することにより光学的に反転させ、対応する対掌体に
変換し、合成ピレスロイドのアルコール中間体やプロス
タグランジン誘導体の中間体として重要である（Ｓ）−
体の一般式化６で示されるシクロペンテノロン類に容易
に導くことができる。そしてここで得られたシクロペン
テノロン類を例えばエステル化することにより、所望の
合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造す
ることができる。一方、不斉水解反応に於いて残存する
（Ｓ）−体のエステルは、そのまま、もしくは、これを
一旦加水分解するか、または特公平５−７９６５６号公
報の記載に準じて、不斉水解反応後の反応生成物のま
ま、トシル化またはメシル化反応に付した後、加水分解
することにより、（Ｓ）−体の一般式 化６で示される
シクロペンテノロン類に導くことができ、これを前記と
同様に例えばエステル化することにより、所望の合成ピ
レスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造すること
ができる。このように本発明により、一般式 化６で示
されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸エ
ステルを最終的にはすべて（Ｓ）−体の一般式 化６で
示されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸
エステルに変換することも可能になり、本発明は工業的
にもきわめて有効な方法である。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。
するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。
【００２３】実施例１ （染色体DNA の調製） バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia) S
C-20株 を、LB培地（Bacto tryptone(Difco Laboratori
es Incorporated製） 10g、Bacto yeast extract(Difco
Laboratories Incorporated 社製） 5g、NaCl 5g/ L、
以下LB培地と略)で、30℃、12時間培養した後、遠心分
離（6000rpm 、10min ）により集菌し、菌体を回収し
た。回収された菌体を1mg/mlの塩化リゾチーム（生化学
工業（株）製）、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリ
ッチ ジャパン（株）製）を含むTEN溶液（10mM Tris-H
Cl(pH8.0)、1mM EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下
TENと略）に懸濁し、３７℃、20分間インキュベートし
た。その後、終濃度が1%(w/v）になるようにドデシル硫
酸ナトリウム を加え、55℃、10分間インキュベートし
た。次に、等量のTE［10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA
(pH8.0)］飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜ
た後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収
した。回収された上層に、等量のTE飽和フェノール・ク
ロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分
離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収さ
れた上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加
えた後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDN
Aをガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v）エタ
ノールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパ
ン（株）製）、20μg/mlのPrteinase K （ベーリンガー
・マンハイム（株）製）を含むTEN溶液に懸濁し、37
℃、12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和
フェノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混
ぜた後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回
収した。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた
後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるＤＮＡ
をガラス棒で巻き取った。このＤＮＡを70% (v/v）エタ
ノールでリンスし、次に80%(v/v）エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseAを加えた10mlTE溶液に溶解した
後、2LのTE溶液に対して２回透析を行った。このように
して100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を得た。
C-20株 を、LB培地（Bacto tryptone(Difco Laboratori
es Incorporated製） 10g、Bacto yeast extract(Difco
Laboratories Incorporated 社製） 5g、NaCl 5g/ L、
以下LB培地と略)で、30℃、12時間培養した後、遠心分
離（6000rpm 、10min ）により集菌し、菌体を回収し
た。回収された菌体を1mg/mlの塩化リゾチーム（生化学
工業（株）製）、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリ
ッチ ジャパン（株）製）を含むTEN溶液（10mM Tris-H
Cl(pH8.0)、1mM EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下
TENと略）に懸濁し、３７℃、20分間インキュベートし
た。その後、終濃度が1%(w/v）になるようにドデシル硫
酸ナトリウム を加え、55℃、10分間インキュベートし
た。次に、等量のTE［10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA
(pH8.0)］飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜ
た後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収
した。回収された上層に、等量のTE飽和フェノール・ク
ロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分
離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収さ
れた上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加
えた後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDN
Aをガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v）エタ
ノールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパ
ン（株）製）、20μg/mlのPrteinase K （ベーリンガー
・マンハイム（株）製）を含むTEN溶液に懸濁し、37
℃、12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和
フェノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混
ぜた後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回
収した。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた
後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるＤＮＡ
をガラス棒で巻き取った。このＤＮＡを70% (v/v）エタ
ノールでリンスし、次に80%(v/v）エタノール、100%エ
タノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseAを加えた10mlTE溶液に溶解した
後、2LのTE溶液に対して２回透析を行った。このように
して100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を得た。
【００２４】実施例２ （染色体DNA ライブラリの作
製） 得られた染色体50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間
分解し、アガロース電気泳動（0.7%濃度）を行った。9.
4kb から6.6kb までの大きさのDNA画分と 7.5bから5.5k
b までの大きさのDNA画分をアガロースゲルから切り出
し、GeneClean（BIO101社製）で精製した。精製されたD
NA画分とλZAPII DNA （スタラタジーン クローニング
システム製）を、キット付属の説明書に従い、DNA リ
ガーゼを用い結合した。結合したDNA は、ギガパックゴ
ールドパッケージングキット（スタラタジーン クロー
ニング システム製）を用いて、キット付属の説明書に
従い、λ粒子中にインビトロ・パッケージングをした。
製） 得られた染色体50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間
分解し、アガロース電気泳動（0.7%濃度）を行った。9.
4kb から6.6kb までの大きさのDNA画分と 7.5bから5.5k
b までの大きさのDNA画分をアガロースゲルから切り出
し、GeneClean（BIO101社製）で精製した。精製されたD
NA画分とλZAPII DNA （スタラタジーン クローニング
システム製）を、キット付属の説明書に従い、DNA リ
ガーゼを用い結合した。結合したDNA は、ギガパックゴ
ールドパッケージングキット（スタラタジーン クロー
ニング システム製）を用いて、キット付属の説明書に
従い、λ粒子中にインビトロ・パッケージングをした。
【００２５】実施例３ （プローブDNA の作製） （１）エステラーゼ酵素の精製 土壌から単離したバークホルデリア・セパシア(Burkhol
deria cepacia)SC-20株を培地（大豆粉抽出液100ml、、
コーンスチープリカー 1g、ダイズ油 5g）で、30℃、48
時間培養した。尚、大豆粉抽出液は、大豆粉10gに0.3%
NaOHを250ml加え、70℃で１時間加熱し、ろ紙でろ過す
ることにより調製された。培養終了後、遠心分離(14,00
0 rpm 、20min ）により上清を回収した。回収された上
清液にエタノールを濃度が80%になるまで加えた後、再
び遠心分離(14,000 rpm 、20min）により沈殿を回収し
た。沈殿を乾燥後、５０mMリン酸緩衝液（pH7.0)で懸濁
し、硫安濃度が20%から60%において沈殿する画分を回収
した。回収した画分を20mM Tris-HCl(pH8.0)溶液 5mlに
懸濁し、該懸濁を20mM Tris-HCl (pH8.0)溶液で平衡化
したDEAE-Sepharose FastFlowカラム（2.6 x 5cm、ファ
ルマシバイオテク（株）製）にチャージした後、20mM T
ris-HCl(pH8.0)溶液で十分に洗浄した。洗浄後、0Mから
0.5MのNaClの濃度勾配溶出により目的とする蛋白質を溶
出し、活性画分を得た。得られた活性画分を10mM Tris-
HCl(pH7.5)溶液で平衡化したDEAE-Sepharose FastFlow
カラム（2.6 x 5cm、ファルマシバイオテク（株）製）
を用いた上記同様の操作により精製を行い、再び活性画
分を得た。得られた活性画分は、150mM NaClを含む50mM
リン酸緩衝液(pH7.5)とで平衡化したSuperose12 HR10/3
0カラム（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過クロマ
トグラフィーにより精製した。得られた活性画分（メイ
ンピーク）は、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル
−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１
−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有し
た。また、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２
−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オ
ンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−ヒド
ロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペ
ント−２−エン−１−オンを産生する能力を有した。
尚、該活性画分を、SDS 電気泳動［PhastGel Gradient
10-15とPhastGel SDS buffer stripを用いた自動電気泳
動装置ファストシステム（ファルマシバイオテク（株）
製）による］で解析したところ、蛋白質としては単一な
状態であり、該蛋白質は単一のサブユニットから構成さ
れ、その分子量は約３．８万ダルトンであることが明ら
かになった。 （２）プローブDNAの作製 このようにして得られた蛋白質を、分子量１万ダルトン
以下の蛋白質をカットする限外濾過（グレースジャパン
（株）製）で濃縮し、水で平衡化した脱塩カラム（Fast
Desalting Colum、ファルマシバイオテク（株）製）で
脱塩した後、減圧濃縮した。減圧濃縮された蛋白質をプ
ロテインシークエンサー470A（（株）パーキンエルマー
ジャパン製）を用いてＮ末端側から切断した後、PTH-An
alyzer120A（（株）パーキンエルマージャパン製）で分
析し、そのＮ末端側のアミノ酸配列を決定した。決定さ
れたアミノ酸配列を配列番号３に示す。上記のようにし
て決定されたＮ末端側のアミノ配列をもとに配列番号４
で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。尚、オリゴ
ヌクレオチドの合成には、DNA自動合成装置モデル380A
（（株）パーキンエルマージャパン製）が用いられた。
合成されたDNAをMEGALABEL キット（宝酒造（株）製）
を用いて放射性同位元素で標識した。
deria cepacia)SC-20株を培地（大豆粉抽出液100ml、、
コーンスチープリカー 1g、ダイズ油 5g）で、30℃、48
時間培養した。尚、大豆粉抽出液は、大豆粉10gに0.3%
NaOHを250ml加え、70℃で１時間加熱し、ろ紙でろ過す
ることにより調製された。培養終了後、遠心分離(14,00
0 rpm 、20min ）により上清を回収した。回収された上
清液にエタノールを濃度が80%になるまで加えた後、再
び遠心分離(14,000 rpm 、20min）により沈殿を回収し
た。沈殿を乾燥後、５０mMリン酸緩衝液（pH7.0)で懸濁
し、硫安濃度が20%から60%において沈殿する画分を回収
した。回収した画分を20mM Tris-HCl(pH8.0)溶液 5mlに
懸濁し、該懸濁を20mM Tris-HCl (pH8.0)溶液で平衡化
したDEAE-Sepharose FastFlowカラム（2.6 x 5cm、ファ
ルマシバイオテク（株）製）にチャージした後、20mM T
ris-HCl(pH8.0)溶液で十分に洗浄した。洗浄後、0Mから
0.5MのNaClの濃度勾配溶出により目的とする蛋白質を溶
出し、活性画分を得た。得られた活性画分を10mM Tris-
HCl(pH7.5)溶液で平衡化したDEAE-Sepharose FastFlow
カラム（2.6 x 5cm、ファルマシバイオテク（株）製）
を用いた上記同様の操作により精製を行い、再び活性画
分を得た。得られた活性画分は、150mM NaClを含む50mM
リン酸緩衝液(pH7.5)とで平衡化したSuperose12 HR10/3
0カラム（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過クロマ
トグラフィーにより精製した。得られた活性画分（メイ
ンピーク）は、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル
−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１
−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有し
た。また、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２
−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オ
ンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−ヒド
ロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペ
ント−２−エン−１−オンを産生する能力を有した。
尚、該活性画分を、SDS 電気泳動［PhastGel Gradient
10-15とPhastGel SDS buffer stripを用いた自動電気泳
動装置ファストシステム（ファルマシバイオテク（株）
製）による］で解析したところ、蛋白質としては単一な
状態であり、該蛋白質は単一のサブユニットから構成さ
れ、その分子量は約３．８万ダルトンであることが明ら
かになった。 （２）プローブDNAの作製 このようにして得られた蛋白質を、分子量１万ダルトン
以下の蛋白質をカットする限外濾過（グレースジャパン
（株）製）で濃縮し、水で平衡化した脱塩カラム（Fast
Desalting Colum、ファルマシバイオテク（株）製）で
脱塩した後、減圧濃縮した。減圧濃縮された蛋白質をプ
ロテインシークエンサー470A（（株）パーキンエルマー
ジャパン製）を用いてＮ末端側から切断した後、PTH-An
alyzer120A（（株）パーキンエルマージャパン製）で分
析し、そのＮ末端側のアミノ酸配列を決定した。決定さ
れたアミノ酸配列を配列番号３に示す。上記のようにし
て決定されたＮ末端側のアミノ配列をもとに配列番号４
で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。尚、オリゴ
ヌクレオチドの合成には、DNA自動合成装置モデル380A
（（株）パーキンエルマージャパン製）が用いられた。
合成されたDNAをMEGALABEL キット（宝酒造（株）製）
を用いて放射性同位元素で標識した。
【００２６】実施例４ （本発明遺伝子含有ファージの
単離） 実施例２で調製された染色体DNA ライブラリからの本発
明遺伝子のスクリーニングは、Colony/Plaque Screen
（NEN Research Products製）を用いて添付の説明書に
従って行われた。具体的には、大腸菌XL1-BlueをLB培地
で培養した後、遠心分離(8000 rpm、15min）により集菌
した。集菌された菌体を10mM MgSO4溶液に懸濁した後、
該菌懸濁液に実施例２で調製された染色体DNA ライブラ
リを含むλファージを感染させた。感染後、50℃に加温
した0.7%アガロースを含むNZY培地（NaCl 5g/L、MgSO4-
H2O 2g/L、Bacto yeast extract(Difco Laboratories I
ncorporated製） 5g/L、NZアミン 10g/L、以下NZY培地
と略）と混合し、これを直径150mm のNZY寒天プレート
の上に重層した。１枚のプレートに約２万個程度のファ
ージをまき、37℃でプラークが出現するまでインキュベ
ートした。インキュベート後、プレート上に発生したプ
ラークをプレート当たり２枚の割合でColony/Plaque Sc
reenメンブレンに移し取った後、0.5M NaOHを含む溶液
で５分間、２回処理し、1.0M Tris-HCl(pH8.0)溶液で5
分間、２回中和した後、2xSSC溶液でColony/Plaque Scr
eenメンブレンをリンスし、濾紙上で風乾した。（但
し、ｎxSSC溶液とは、20xSSC溶液をn/20倍希釈したもの
を指し、20xSSC溶液は、175.3g NaCl、88.2gクエン酸３
ナトリウム／Ｌ(pH7.0)である。以下、n x SSCと略。）
得られたColony/Plaque Screenメンブレンを2xSSCに浸
した後、68℃に加温した6xSSC、0.5%(w/v)ドデシル硫酸
ナトリウム（以下、SDSと略）、5XDenhart's液（0.1g F
icoll、0.1g polyvinylpyrrolidone, 0.1g bovine seru
m albumin / 100ml）、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのプレハイブリダイゼーション溶液
に３時間浸した。このように前処理されたメンブレンを
6xSSC、0.5%(w/v)SDS、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのハイブリダイゼーション溶液に浸
し、これに実施例３で作製されたプローブDNAを加え、
さらに６３℃で、18時間振とうしながら放置した。その
後、メンブレンを2XSSC、0.5%SDS液で５分間室温にて洗
浄した。さらに、（１）2XSSC、0.1%SDS液で１５分間室
温で振盪しながら洗浄し、（２）0.1XSSC、0.5%SDS液で
６０分間３７℃で振盪しながら洗浄し、（３）0.1XSS
C、0.5%SDS液で６０分間６８℃で振盪しながら洗浄する
ことにより余分なプローブDNAを除去した。メンブレン
上に吸着したプローブDNAに相当する位置からファージ
をパスツールピペットで吸い取り、単一のプラークとし
て分離できるまで上記の作業を繰り返し、目的とするDN
A断片（本発明遺伝子）が含まれるファージを単離し
た。このようにして約４万個のプラークをスクリーニン
グし、３株のファージを単離した。
単離） 実施例２で調製された染色体DNA ライブラリからの本発
明遺伝子のスクリーニングは、Colony/Plaque Screen
（NEN Research Products製）を用いて添付の説明書に
従って行われた。具体的には、大腸菌XL1-BlueをLB培地
で培養した後、遠心分離(8000 rpm、15min）により集菌
した。集菌された菌体を10mM MgSO4溶液に懸濁した後、
該菌懸濁液に実施例２で調製された染色体DNA ライブラ
リを含むλファージを感染させた。感染後、50℃に加温
した0.7%アガロースを含むNZY培地（NaCl 5g/L、MgSO4-
H2O 2g/L、Bacto yeast extract(Difco Laboratories I
ncorporated製） 5g/L、NZアミン 10g/L、以下NZY培地
と略）と混合し、これを直径150mm のNZY寒天プレート
の上に重層した。１枚のプレートに約２万個程度のファ
ージをまき、37℃でプラークが出現するまでインキュベ
ートした。インキュベート後、プレート上に発生したプ
ラークをプレート当たり２枚の割合でColony/Plaque Sc
reenメンブレンに移し取った後、0.5M NaOHを含む溶液
で５分間、２回処理し、1.0M Tris-HCl(pH8.0)溶液で5
分間、２回中和した後、2xSSC溶液でColony/Plaque Scr
eenメンブレンをリンスし、濾紙上で風乾した。（但
し、ｎxSSC溶液とは、20xSSC溶液をn/20倍希釈したもの
を指し、20xSSC溶液は、175.3g NaCl、88.2gクエン酸３
ナトリウム／Ｌ(pH7.0)である。以下、n x SSCと略。）
得られたColony/Plaque Screenメンブレンを2xSSCに浸
した後、68℃に加温した6xSSC、0.5%(w/v)ドデシル硫酸
ナトリウム（以下、SDSと略）、5XDenhart's液（0.1g F
icoll、0.1g polyvinylpyrrolidone, 0.1g bovine seru
m albumin / 100ml）、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのプレハイブリダイゼーション溶液
に３時間浸した。このように前処理されたメンブレンを
6xSSC、0.5%(w/v)SDS、100μg/mlのdenatured sonicate
d sermon sperm DNAのハイブリダイゼーション溶液に浸
し、これに実施例３で作製されたプローブDNAを加え、
さらに６３℃で、18時間振とうしながら放置した。その
後、メンブレンを2XSSC、0.5%SDS液で５分間室温にて洗
浄した。さらに、（１）2XSSC、0.1%SDS液で１５分間室
温で振盪しながら洗浄し、（２）0.1XSSC、0.5%SDS液で
６０分間３７℃で振盪しながら洗浄し、（３）0.1XSS
C、0.5%SDS液で６０分間６８℃で振盪しながら洗浄する
ことにより余分なプローブDNAを除去した。メンブレン
上に吸着したプローブDNAに相当する位置からファージ
をパスツールピペットで吸い取り、単一のプラークとし
て分離できるまで上記の作業を繰り返し、目的とするDN
A断片（本発明遺伝子）が含まれるファージを単離し
た。このようにして約４万個のプラークをスクリーニン
グし、３株のファージを単離した。
【００２７】実施例５ （形質転換体の取得と塩基配列
の解析） 実施例４により得られたファージをλZAPIIのマニュア
ル（ストラタジーンクローニング システム製）に従っ
てプラスミドに組み換えた。得られたプラスミドをpAL6
01と命名した。pAL601を制限酵素により解析した結果、
約7.0kbpのEcoRI断片が挿入されていた（図１参照）。p
AL601のうち約2kbpのSmaI断片（エステラーゼ遺伝子の
領域）についてPRISMkit （（株）パーキンエルマージ
ャパン製）と自動塩基配列解析装置373A（（株）パーキ
ンエルマージャパン製）を用いてその塩基配列を決定し
た。尚、解析はGenetyx-Mac/ATSQ（ソフトウエア開発
（株）製）と、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発（株）
製）により行い、そのエステラーゼ遺伝子の塩基配列を
配列番号２に示した。決定された塩基配列から予想され
るアミノ酸配列の中に、配列番号3に示したアミノ酸配
列と完全に一致する領域が存在し、上記DNA断片上に目
的とするエステラーゼ遺伝子が存在することが確認でき
た。
の解析） 実施例４により得られたファージをλZAPIIのマニュア
ル（ストラタジーンクローニング システム製）に従っ
てプラスミドに組み換えた。得られたプラスミドをpAL6
01と命名した。pAL601を制限酵素により解析した結果、
約7.0kbpのEcoRI断片が挿入されていた（図１参照）。p
AL601のうち約2kbpのSmaI断片（エステラーゼ遺伝子の
領域）についてPRISMkit （（株）パーキンエルマージ
ャパン製）と自動塩基配列解析装置373A（（株）パーキ
ンエルマージャパン製）を用いてその塩基配列を決定し
た。尚、解析はGenetyx-Mac/ATSQ（ソフトウエア開発
（株）製）と、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発（株）
製）により行い、そのエステラーゼ遺伝子の塩基配列を
配列番号２に示した。決定された塩基配列から予想され
るアミノ酸配列の中に、配列番号3に示したアミノ酸配
列と完全に一致する領域が存在し、上記DNA断片上に目
的とするエステラーゼ遺伝子が存在することが確認でき
た。
【００２８】実施例６ （エステラーゼの光学選択性
１） pAL601を制限酵素SmaIで切断しサブクローニングするこ
とによりpAL612を得た。得られたpAL612を大腸菌JM109
株に形質転換した。このようにして得られた得られた形
質転換体E.coli JM109/pAL612株を、各々50mg/Lのアン
ピシリンと1mMのisopropyl thio-β-D-galactoside（以
下IPTGと略）を含む100mlのＬＢ培地で、37℃、16時間
培養した後、遠心分離（6000rpm、10min）により集菌
し、菌体を回収した。得られた菌体を20mlの200mMリン
酸緩衝液に懸濁した。（RS）−４−ヒドロキシ−３−メ
チル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン
−１−オンのメチルエステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(p
H7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌
させながら40℃、10分間予熱した。これに1.0mlの上記
懸濁液を加え、撹拌子で撹拌させながら40℃で反応を行
った。30分間後、該反応液を50μlを回収し、1mlのエタ
ノールを添加することにより反応を停止させた。ブラン
クは、培養物の代わりに精製水を用いて同様な方法で試
験した。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度150℃、インジェクション温度170
℃、ディテクション温度170℃、検出器はFIDの条件で、
GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分析した。さら
に反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽
出物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。
分析には、（株）住化分析センター製OA-4100 (4.0mmI.
D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用した。溶出液
は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:
20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速
は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光学異性体
比を分析した。上記の分析結果に基づき、加水分解率、
光学選択性を算出し、表３に示した。表３から明らかな
ように、2kb SmaI断片が挿入された形質転換体である大
腸菌JM109/pAL612株が（RS）−４−ヒドロキシ−３−メ
チル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エン
−１−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺニル）
シクロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有
するエステラーゼを産生することを確認できた。
１） pAL601を制限酵素SmaIで切断しサブクローニングするこ
とによりpAL612を得た。得られたpAL612を大腸菌JM109
株に形質転換した。このようにして得られた得られた形
質転換体E.coli JM109/pAL612株を、各々50mg/Lのアン
ピシリンと1mMのisopropyl thio-β-D-galactoside（以
下IPTGと略）を含む100mlのＬＢ培地で、37℃、16時間
培養した後、遠心分離（6000rpm、10min）により集菌
し、菌体を回収した。得られた菌体を20mlの200mMリン
酸緩衝液に懸濁した。（RS）−４−ヒドロキシ−３−メ
チル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン
−１−オンのメチルエステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(p
H7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌
させながら40℃、10分間予熱した。これに1.0mlの上記
懸濁液を加え、撹拌子で撹拌させながら40℃で反応を行
った。30分間後、該反応液を50μlを回収し、1mlのエタ
ノールを添加することにより反応を停止させた。ブラン
クは、培養物の代わりに精製水を用いて同様な方法で試
験した。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度150℃、インジェクション温度170
℃、ディテクション温度170℃、検出器はFIDの条件で、
GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分析した。さら
に反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽
出物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。
分析には、（株）住化分析センター製OA-4100 (4.0mmI.
D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用した。溶出液
は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:
20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速
は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光学異性体
比を分析した。上記の分析結果に基づき、加水分解率、
光学選択性を算出し、表３に示した。表３から明らかな
ように、2kb SmaI断片が挿入された形質転換体である大
腸菌JM109/pAL612株が（RS）−４−ヒドロキシ−３−メ
チル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エン
−１−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺニル）
シクロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有
するエステラーゼを産生することを確認できた。
【００２９】実施例７ （エステラーゼの光学選択性
２） （RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果
を、表４に示す。
２） （RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果
を、表４に示す。
【００３０】実施例８ （エステラーゼの光学選択性
３） （RS）−４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチ
ル）−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルを基質と
して、実施例４と同様な検討を行った結果を表５に示
す。尚、緩衝液には100mMリン酸緩衝液(pH6.0)を用い
た。４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）
−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルの分解率は、
ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラム
は、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度2
40℃、インジェクション温度260℃で分析した。さらに
反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出
物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。４
−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−
シクロペンテノンの分析には、（株）住化分析センター
製OA-4500 光学異性体分析カラムを２本連結して使用し
た。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノ
ールを100:4:4の割合で混合したものを用いることがで
きる。流速は1.5ml/minで、235nmの吸光度を指標にして
光学異性体比を分析した。
３） （RS）−４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチ
ル）−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルを基質と
して、実施例４と同様な検討を行った結果を表５に示
す。尚、緩衝液には100mMリン酸緩衝液(pH6.0)を用い
た。４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）
−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルの分解率は、
ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラム
は、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度2
40℃、インジェクション温度260℃で分析した。さらに
反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出
物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。４
−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−
シクロペンテノンの分析には、（株）住化分析センター
製OA-4500 光学異性体分析カラムを２本連結して使用し
た。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノ
ールを100:4:4の割合で混合したものを用いることがで
きる。流速は1.5ml/minで、235nmの吸光度を指標にして
光学異性体比を分析した。
【００３１】実施例９ （エステラーゼの光学選択性
４） （RS）−４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニ
ルヘキシル）−２−シクロペンテノンの酢酸エステルを
基質として、実施例４と同様な検討を行った結果を表６
に示す。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度240℃、インジェクション温度260℃
で分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで
抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により光学
純度を測定した。４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシ
カルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノンの分析に
は、（株）住化分析センター製OA-4500 光学異性体分析
カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロ
エタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したものを
用いることができる。流速は1ml/minで、235nmの吸光度
を指標にして光学異性体比を分析した。
４） （RS）−４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニ
ルヘキシル）−２−シクロペンテノンの酢酸エステルを
基質として、実施例４と同様な検討を行った結果を表６
に示す。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測し
た。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長
を用い、カラム温度240℃、インジェクション温度260℃
で分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで
抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により光学
純度を測定した。４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシ
カルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノンの分析に
は、（株）住化分析センター製OA-4500 光学異性体分析
カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロ
エタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したものを
用いることができる。流速は1ml/minで、235nmの吸光度
を指標にして光学異性体比を分析した。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表5】
【００３５】
【表6】
【００３６】
【発明の効果】本発明により、一般式 化6で示されるシク
ロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、不斉加水分
解し、高い光学純度の(R)-体の一般式 化6で示される
(R)-シクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコー
ドする遺伝子を提供することが可能になった。
ロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、不斉加水分
解し、高い光学純度の(R)-体の一般式 化6で示される
(R)-シクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコー
ドする遺伝子を提供することが可能になった。
【００３７】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:1089 配列の型:直鎖状 鎖の数:二本鎖ト ポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 生物名：Burkholderia cepacia 株名：SC-20 配列 ATG AGC AGA TCG ATA CGA GCG AAG GCA GTG GCG ACC GTG GTG GCG ATC 48 AAC GCG GCC CCG GCC GCG AGT GTT GGA ACC GTT CTG GCC ATG TCG CTG 96 GCC GGC GCA CAG GCC GCT TCC GCC GCG ACG ACC GCC GTT GAC GAC TAC 144 GCG GCG ACC CGG TAC CCG ATC ATT CTC GTG CAC GGG CTG ACC GGC ACC 192 GAC AAG TAC GGT GGC GTC GTC GAG TAC TGG TAT CGC ATT CCG GAG GAC 240 CTG CGG GCG CAC GGC GCG GCG GTA TAC GTT GCC AAC CTG TCC GGC TTC 288 CAG AGC GAC GAT GGC CCG AAC GGG CGT GGC GAG CAA TTG CTT GCA TTC 336 GTG AAG CAG GTG CTC GCG GCG ACG GGC GCG CAG AAG GTG AAT CTG ATC 384 GGC CAT AGC CAG GGC GGC CTG ACA TCG CGT TAT GTT GCG TCC GTT GCA 432 CCG GAA CTG GTC GCA TCG GTG ACG ACG ATC AGT ACG CCG CAC TGG GGC 480 TCG CAA TTC GCG GAC TTC GTC CAG CAA CTG TTG CAG ACG GAC CCG ACC 528 GGC CTG TCG TCG ACC GTG CTC GGC GCA TTC GCG AAT GCG CTC GGC ACG 576 TTG ACG AGC AGC AAC TTC AAT ACG AAC CAG AAT GCG ATT CAG GCG TTG 624 TCG GTG CTG ACG ACG GCA AAG GCC GCC GCA TAC AAC CAG AAA TTC CCG 672 AGC GCC GGT CTC GGT GCG CCG GGC TCG TGT CAA ACC GGC GCG CCA ACG 720 GAG ACT GTC GGC GGC AAT ACG CAT CTG CTT TAT TCG TGG GGC GGC ACG 768 GCG ATC CAG CCG ACA GCG ACG GTG GCC GGC GTG ACA GGG GCC GTC GAT 816 ACG AGC GTG AGC GGG GTC ACC GAT CCG GCG AAC GCG CTC GAT CCG TCA 864 ACG CTG GCA CTC CTC GGC AGC GGC ACG GTG ATG ATC AAT CGC AGC GCC 912 GGT CCG AAC GAT GGC GTC GTG TCG CAA TGC AGC GCG CGG TTT GGC CAG 960 GTG CTC GGC ACG TAT CAC TGG AAT CAC ACC GAT GCG ATC AAC CAG ATC 1008 CTC GGC GTG CTC GGC GCG AAT GTG GAG GAT CCG GTT GCG GTA ATC CGC 1056 ACG GAC GCG AAC CGG TTG AAG CTC GCA GGC GTG 1089
【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：３６３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源： 生物名：Burkholderia cepacia 株名：SC-20 配列 1 5 10 15 Met Ser Arg Ser Ile Arg Ala Lys Ala Val Ala Thr Val Val Ala Ile 20 25 30 Ala Met Asn Ala Ala Pro Ala Ala Ser Val Gly Thr Val Leu Ser Leu 35 40 45 Ala Gly Ala Gln Ala Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ala Val Asp Asp Tyr 50 55 60 Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Gly Gly Val Val Glu Tyr Trp Tyr Arg Ile Pro Glu Asp 85 90 95 Leu Arg Ala His Gly Ala Ala Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Phe 115 120 125 Val Lys Gln Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Gln Lys Val Asn Leu Ile 130 135 140 Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ser Val Ala 145 150 155 160 Pro Glu Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Ser Thr Pro His Trp Gly 165 170 175 Ser Gln Phe Ala Asp Phe Val Gln Gln Leu Leu Gln Thr Asp Pro Thr 180 185 190 Gly Leu Ser Ser Thr Val Leu Gly Ala Phe Ala Asn Ala Leu Gly Thr 195 200 205 Leu Thr Ser Ser Asn Phe Asn Thr Asn Gln Asn Ala Ile Gln Ala Leu 210 215 220 Ser Val Leu Thr Thr Ala Lys Ala Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Pro 225 230 235 240 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr 245 250 255 Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Gly Gly Thr 260 265 270 Ala Ile Gln Pro Thr Ala Thr Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Val Asp 275 280 285 Thr Ser Val Ser Gly Val Thr Asp Pro Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ser 290 295 300 Thr Leu Ala Leu Leu Gly Ser Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Ser Ala 305 310 315 320 Gly Pro Asn Asp Gly Val Val Ser Gln Cys Ser Ala Arg Phe Gly Gln 325 330 335 Val Leu Gly Thr Tyr His Trp Asn His Thr Asp Ala Ile Asn Gln Ile 340 345 350 Leu Gly Val Leu Gly Ala Asn Val Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg 355 360 363 Thr Asp Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val
【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：Burkholderia cepacia 株名：SC-２０ 配列 1 5 10 15 Ala Val Asp Asp Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val
【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCI GTI GAT GAC TAT GCI GCI ACI CGI TAT CCI ATT ATI CTI GT C C C C （上記式中の I は、イノシンを表す）
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明プラスミドであるpAL601,pAL61
2の制限酵素地図を表す図である。
2の制限酵素地図を表す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (13)
- 【請求項１】一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１
０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜
４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化１で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコード
し、かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダ
イズすることを特徴とするエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】配列番号１で示される塩基配列とのホモロ
ジーが９０％以上であることを特徴とする請求項１記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】配列番号２で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】配列番号１で示される塩基配列を有するこ
とを特徴とする請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項５】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド。 - 【請求項６】請求項５記載のプラスミドにより形質転換
されたことを特徴とする形質転換体。 - 【請求項７】形質転換体が微生物であることを特徴とす
る請求項６記載の形質転換体。 - 【請求項８】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が産生することを特徴とするエ
ステラーゼ。 - 【請求項９】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が請求項６記載の形質転換体で
あることを特徴とする請求項８記載のエステラーゼ。 - 【請求項１０】請求項６記載の形質転換体を培養するこ
とにより、一般式 化２ 【化２】 （式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１
０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜
４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｒ）−体の一般式 化２で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力を有するエステラーゼを産生す
ることを特徴とするエステラーゼの製造方法。 - 【請求項１１】請求項８記載のエステラーゼを一般式
化３ 【化３】 （式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１
０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜
４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護され
てもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素
基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭
素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）で示されるシクロペ
ンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させて、
該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−体の一般式
化３で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエ
ステルとに分割することを特徴とする一般式 化３で示
されるシクロペンテノロン類の光学分割方法。 - 【請求項１２】一般式 化３で示されるシクロペンテノ
ロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンである請求
項１１記載の光学分割方法。 - 【請求項１３】一般式 化３で示されるシクロペンテノ
ロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンである請求
項１１記載の光学分割方法。
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