JPH10150985A - 変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 水溶液中において安定性が向上させ、または
ミカエリス定数が小さい優れた変異型Ｌ−α−グリセロ
フォスフェートオキシダーゼ、ならびにその製造法を提
供することにある。 【解決手段】 微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフ
ォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ
酸配列において、少なくとも１ケのアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−α
−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する変
異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、そ
のＤＮＡ断片、ＤＮＡ断片を含有する発現ベクター、発
現ベクターにより形質転換された宿主細胞、変異型Ｌ−
α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、変異型Ｌ−α−グ
リセロフォスフェートオキシダーゼ、それをコードする
ＤＮＡ断片及びその変異型酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼは血清中の中性脂肪や羊水中のフォスファチジル
グリセロールなどを測定する際に用いられる臨床検査薬
用酵素である。Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼを臨床検査薬に応用するに際しては、一般に水溶
液中で用いるが、水溶液中でのＬ−α−グリセロフォス
フェートオキシダーゼの安定性は低く、そのため水溶液
状の臨床検査薬には必要以上の過大な酵素量を必要とす
る。そこで、Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダ
ーゼの水溶液中での安定性を改善することが強く望まれ
ていた。

【０００３】水溶液中のＬ−α−グリセロフォスフェー
トオキシダーゼの安定性を改善するために、種々の安定
化剤を添加したり、酵素を化学修飾する方法がこれまで
に行われてきた（特開昭５７−６８７８８号公報、特開
昭５９−１４７８８号公報、特開昭６０−１２６０８４
号公報、特開平７−１６３３３９号公報）。しかし、こ
れらの方法においては十分な安定性の向上がなされてお
らず、より安定なＬ−α−グリセロフォスフェートオキ
シダーゼが必要とされていた。

【０００４】野生型のＬ−α−グリセロフォスフェート
オキシダーゼはストレプトコッカス属、ラクトバシルス
属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、アエロ
コッカス属に属する細菌に存在することが報告されてお
り（特開昭５３−７２８９２号公報、特開昭５５−１５
７４６号公報）、ストレプトコッカス属由来の野生型Ｌ
−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを遺伝子操
作により、エシェリヒア・コリを形質転換体として製造
する方法が報告されている（特開平２−４５４号公報
（ＵＳ特許第４９６０８７７号明細書））が、野生型Ｌ
−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを遺伝子操
作等により蛋白質工学的に改変し、安定性を向上させた
という例はなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は水溶液
中において安定性が向上させ、またはミカエリス定数が
小さい優れた変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼ、ならびにその製造法を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、野生型Ｌ−α−
グリセロフォスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列の
うち少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入
することによって、安定性が向上させ、またはミカエリ
ス定数が小さい優れたものに改変できることを見いだ
し、本発明を完成させるに至った。

【０００７】即ち、本発明は微生物由来の野生型Ｌ−α
−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋
白質のアミノ酸配列において、少なくとも１ケのアミノ
酸残基が欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列を有し、
かつＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性
を有する変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼ、及び、この変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェ
ートオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片、そのＤＮＡ
断片を含有する発現ベクター、その発現ベクターにより
形質転換された宿主細胞である。

【０００８】本発明は更に、上記の宿主細胞を培養し、
培養物から変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキ
シダーゼを採取することを特徴とする、変異型Ｌ−α−
グリセロフォスフェートオキシダーゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明における変異型
Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼとして
は、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダー
ゼのアミノ酸配列の少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠
失、置換、挿入することによって改変し、Ｌ−α−グリ
セロフォスフェートオキシダーゼ活性を有するものであ
れば特に限定されるものではない。例えば、配列表配列
番号１記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ−α−グリ
セロフォスフェートオキシダーゼに少なくとも１ケのア
ミノ酸残基を欠失、置換、挿入した変異型Ｌ−α−グリ
セロフォスフェートオキシダーゼが挙げられる。例え
ば、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列における１２
位のアスパラギン酸をアラニンに置換（ミカエリス定数
１．９ｍＭ）またはアスパラギンに置換（ミカエリス定
数１．８ｍＭ）、１２のアスパラギン酸を欠損（ミカエ
リス定数１．４９ｍＭ）や１１位のアルギニンから１３
位のグルタミン酸までを欠損（ミカエリス定数１．１８
ｍＭ）が挙げられる。

【０００９】また、少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠
失、置換、挿入した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェ
ートオキシダーゼとして好ましくは、（アルギニン−ア
ルギニン−システイン−グリシンまたはバリンまたはロ
イシン−グルタミン酸またはアスパラギン酸−プロリ
ン）で表される長さ６のアミノ酸配列またはこの配列と
４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる変
異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが挙
げられる。この上記の長さ６のアミノ酸配列の具体例と
しては（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシ
ン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギ
ニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリ
ン）、（アルギニン−アルギニン−システイン−ロイシ
ン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギ
ニン−システイン−グリシン−アスパラギン酸−プロリ
ン）を含むアミノ酸配列が挙げられる。

【００１０】さらにそのＮ末端側には少なくとも１ケの
アミノ酸の付加、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸
を付加することが好ましく、Ｃ末端側には少なくともフ
ェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのいず
れか１ケのアミノ酸、またはこの１ケのアミノ酸に続く
グリシン、セリンまたはトレオニンのいずれか１ケのア
ミノ酸、またはこれらの２ケのアミノ酸に続くリジン、
アルギニン、イソロイシンまたはセリンのいずれか１ケ
のアミノ酸、またはこれら３ケのアミノ酸に続くアラニ
ン、セリン、イソロイシンまたはアルギニンのいずれか
１ケのアミノ酸の１〜４ケのアミノ酸配列、好ましくは
２〜４ケのアミノ酸配列、例えばフェニルアラニン−グ
リシン、フェニルアラニン−セリン、フェニルアラニン
−トレオニン、フェニルアラニン−グリシン−アルギニ
ン、チロシン−グリシン−アルギニン、トリプトファン
−グリシン−アルギニン、フェニルアラニン−グリシン
−リジン−アラニン、フェニルアラニン−トレオニン−
セリン−イソロイシン、フェニルアラニン−グリシン−
アルギニン−セリンまたはフェニルアラニン−グリシン
−リジン−アルギニンの配列が選択され付加されること
が好ましく、さらに具体的には配列表配列番号５〜１３
記載のアミノ酸配列が例示される。

【００１１】さらに、ストレプトコッカス属由来の配列
表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ−α
−グリセロフォスフェートオキシダーゼとして配列表配
列番号２記載の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェート
オキシダーゼが例示され、配列表配列番号２記載のアミ
ノ酸配列においてＮ末端から３９１番目〜４１０番目の
少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入した
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、
特に配列表配列番号２記載のアミノ酸配列においてＮ末
端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列が少なく
とも（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシン
またはバリンまたはロイシン−グルタミン酸またはアス
パラギン酸−プロリン）で表される長さ６のアミノ酸配
列と４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列と置換され
た変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
が挙げられ、より具体的には上記の長さ６のアミノ酸配
列を含む配列表配列番号５〜１３記載のアミノ酸配列と
置換された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキ
シダーゼ、更に望ましくは配列表配列番号３記載のアミ
ノ酸配列にて表される変異型Ｌ−α−グリセロフォスフ
ェートオキシダーゼ（以下、変異型Ｂと記すこともあ
る）が挙げられ、これらの変異型Ｌ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼは野生型Ｌ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼに比べ安定性が向上し、または
ミカエリス定数が小さくなったものであって、酵素的性
能が向上した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼである。

【００１２】変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼをコードするＤＮＡ配列は、例えば微生物由
来の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダー
ゼをコードするＤＮＡ配列に、一般的な部位特異変異導
入技術で変異を導入することで得ることができる。例え
ばＫｕｎｋｅｌ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ 第２版；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ発行）に従って変異を導入する場合には、ｄｕｔ
^-、ｕｎｇ^-のエシェリヒア・コリを用いてＴｈｙｍｉｎ
ｅの一部がｄｅｏｘｙｕｒａｃｉｌに置換された、野生
型酵素の一部または全体をコードするＤＮＡ配列（セン
ス鎖）またはそれに相補的なＤＮＡ配列（アンチセンス
鎖）を含む環状一本鎖ＤＮＡを作製し、この環状一本鎖
ＤＮＡに変異導入用の合成オリゴヌクレオチドをハイブ
リダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により
相補鎖を合成した後、ｕｎｇ⁺のエシェリヒア・コリを
形質転換することで変異を導入することができ、必要な
らば更に遺伝子の組換えを行うことで変異型酵素のＤＮ
Ａ配列を得ることができる。

【００１３】用いる微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列
としては、例えば配列表配列番号２記載の野生型Ｌ−α
−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤ
ＮＡ配列が挙げられ、この野生型Ｌ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．由来であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．ＧＰＯＳ−５３株として得られており、それをコー
ドするＤＮＡ配列で公知であり（特開平２−４５４号公
報（ＵＳ特許４９６０８７７号明細書））、そのＤＮＡ
配列を有する発現ベクターＧＰＯＳ１を保持する形質転
換体エシェリヒア．コリＤＨ１・ｐＧＰＯＳ１株は工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２１
３３、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２９として保存されてお
り、何人も入手可能である。

【００１４】変異導入用の合成オリゴヌクレオチドとし
ては、鋳型となる環状一本鎖ＤＮＡの中にＬ−α−グリ
セロフォスフェートオキシダーゼのアンチセンス鎖の一
部または全部が存在する場合は、目的とするアミノ酸変
異をコードする塩基配列の５’側および３’側に８塩基
以上、好ましくは１０〜３０の相補な塩基をつけたもの
で、例えば配列表配列番号３記載の変異型Ｌ−α−グリ
セロフォスフェートオキシダーゼをコードする変異型Ｄ
ＮＡを配列表配列番号２記載のＤＮＡに変異を導入する
ことで得る場合には配列表配列番号４記載の変異導入用
オリゴヌクレオチドを用いればよく、（アルギニン−ア
ルギニン−システイン−グリシンまたはバリンまたはロ
イシン−グルタミン酸またはアスパラギン酸−プロリ
ン）で表される長さ６のアミノ酸配列またはこの配列と
４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列、また好ましく
はこれらのＮ末端側およびＣ末端側に前記したアミノ酸
配列を付加した配列を含む変異型Ｌ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼをコードする変異型ＤＮＡを得
る場合には該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の
５’側および３’側に上記の適宜な塩基配列をつけたも
のを合成オリゴヌクレオチドとして用いることができ、
例えば配列表配列番号５〜１３記載のアミノ酸配列を含
む変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（例えば変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変
異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）を
コードする変異型ＤＮＡを配列表配列番号２記載のＤＮ
Ａに変異を導入することで得る場合には、同じく配列表
配列番号１４〜２１または２２いずれかに記載の変異導
入用オリゴヌクレオチドを用いればよい。また、鋳型と
なる環状一本鎖ＤＮＡの中にＬ−α−グリセロフォスフ
ェートオキシダーゼのセンス鎖の一部または全部が存在
する場合は前記のアンチセンス鎖が存在するときに用い
る変異導入用オリゴヌクレオチドに相補的になるような
変異導入用オリゴヌクレオチドを用いればよい。

【００１５】変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼをコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクター
は、該ＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２など通常用いられるプ
ラスミドベクターに一般的な遺伝子工学的手法により該
ＤＮＡ断片を連結することで作製することができ、変異
型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを効率
よく発現させるために、トリプトファンプロモーター、
Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、λＰＬプロ
モーター、Ｔ７プロモーター、フォスフォグリセロキナ
ーゼプロモーター、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱
水素プロモーター、ＳＥＶプロモーター等の強力なプロ
モーターの下流に該ＤＮＡ断片を連結した発現ベクター
を作製してもよい。

【００１６】上記発現ベクターをエレクトロポーレーシ
ョン法、Ｈａｎａｈａｎ法、塩化カルシウム法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版；Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ発行）など一般的に
用いられる形質転換法によりエシェリヒア・コリ、酵
母、枯草菌などの宿主細胞に導入することで形質転換体
を得ることができる。

【００１７】変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼを得るためには、上記のようにして形質転換
された宿主細胞を一般的な方法で培養し、例えば、エシ
ェリヒア属に属するエシェリヒア．コリの場合は一般に
エシェリヒア・コリを培養する培地、例えばＬＢ培地に
て、一般にエシェリヒア・コリを培養する方法、例えば
２５〜３７℃において、好気的に培養し、目的とする酵
素が最高力価となる培養時間、例えば８〜３６時間に
て、目的となる酵素を採取すればよい。

【００１８】次いで、培養液から菌体を遠心分離等によ
って分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液
等の緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラス
ビーズ等によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗
酵素液として回収する。このようにして得られた、粗製
の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて
処理することにより、精製された変異型Ｌ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼを得ることができる。例
えば、アセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別
沈澱法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグ
ラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティ
クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等の一般的な酵素精
製法を適宜選択、組み合わせて精製された変異型Ｌ−α
−グリセロフォスフェートオキシダーゼを得ることがで
き、適宜安定化剤例えば０．００１％〜０．１％程度の
アミノ酸、補酵素等、５％〜５０％程度のショ糖、グリ
セロールなどを加えて、凍結保存、ないしは凍結乾燥保
存をしてもよい。

【００１９】

【発明実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。

【００２０】

【参考例１】 Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活性測
定法 測定試薬 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５） １０ｍＭ Ｄ，Ｌ−α−グリセロフォスフェート（シ
グマ社製、米国） ０．０３％ ４−アミノアンチピリン ０．０２％ ＴＯＯＳ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ社製、米国） （ＰＩＰＥＳ：Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ
（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）） （ＴＯＯＳ：Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ
ａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄ
ｒａｔｅ 同仁化学研究所製、日本国） 酵素希釈液 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５） ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 測定試薬１ｍｌを試験管に入れ３７℃で５分間予備加温
した後、０．０２ｍｌの酵素液を加えて、３７℃で５分
間加温し、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ加えて反応を停止
させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定す
る。また、試薬ブランクとして酵素液の代わりに０．０
２ｍｌの酵素希釈液を加えたものの吸光度（Ａｂ）も測
定する。吸光度（Ａａ）が０．５以上になるときは酵素
を酵素液を適宜、酵素希釈液で希釈して測定するものと
する。酵素活性１単位はこの条件下で１分間に１μモル
の過酸化水素を生成する酵素量とし、計算式は下記の通
りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａａ−Ａｂ）ｘ１．５４ｘ酵
素の希釈倍率

【００２１】

【参考例２】 野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを
コードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１
０１及び変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８の構築 野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを
コードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１
０１の構築は図１に記載の流れに沿って構築した。すな
わち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＰＯＳ−
５３株の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐ
ＧＰＯＳ１をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＧＰＯＳ１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１３３、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２
９）からアルカリ−ＳＤＳ法により抽出した後に制限酵
素ＣｌａＩで完全切断してできた野生型Ｌ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含
む約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドベクター
ｐＵＣ１２を制限酵素ＰｓｔＩで切断したのちＤＮＡ
Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製、日本国）で末端
平滑化してセルフライゲーションしてできたｐＵＣ１２
ｄＰを制限酵素ＡｃｃＩで切断したものとをＤＮＡ Ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本
国）を用いて連結することでｐＧＰＯ１００を得た。こ
のｐＧＰＯ１００を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全切断
してできる野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキ
シダーゼをコードする遺伝子を含む約２．３ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩとで切断してＤＮＡ Ｂｌｕｎ
ｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製、日本国）で末端平滑化し
てセルフライゲーションしてできたｐＵＣ１１８ｄＥＳ
を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとをＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日
本国）を用いて連結することでプラスミドベクターｐＧ
ＰＯ１０１を得た。

【００２２】変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８の構
築は図２に記載の流れに沿って構築した。すなわち、上
記のように作製したｐＧＰＯ１０１を制限酵素Ｈｉｎｃ
ＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断して得た約０．７ｋｂｐ
のフラグメントとファージベクターＭ１３ｍｐ１８を同
じく制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断し
たものとをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．２（宝酒造製、日本国）を用いて連結することでｐ
ＧＰＯｍｐ１８を得た。（配列表配列番号２記載のＤＮ
Ａ配列においてＰｓｔＩの位置は５５１番目、Ｈｉｎｃ
ＩＩの位置は１２６６番目に存在する。） 尚、上記のプラスミドＤＮＡの制限酵素切断反応はすべ
てＤＮＡ約０．２μｇ、制限酵素（宝酒造製）１０Ｕ、
反応液量２０μｌ、反応液組成は制限酵素製造元推奨の
組成すなわち、ＣｌａＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＨｉｎｃＩＩは１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトー
ル、５０ｍＭ塩化ナトリウムで、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｐｈＩは５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトー
ル、１００ｍＭ塩化ナトリウムで、３７℃で９０分反応
させた。

【００２３】

【実施例１】 変異型ＢをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクター
ｐＧＰＯ１０１Ｂの構築とそれを含む形質転換体の作製 配列表配列番号３記載の変異型ＢのＤＮＡ配列は図３に
示すようにｐＧＰＯｍｐ１８上の配列表配列番号２記載
の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
の３９１番目〜４１０番目のアミノ酸をコードしている
塩基配列に変異を導入した後、ｐＧＰＯ１０１と組み換
えることで作製する。

【００２４】変異導入用の合成オリゴヌクレオチドは目
的とする変異をコードする塩基配列の５’側に配列表配
列番号２記載のＤＮＡ配列の１１５０番目〜１１６９番
目の相補鎖の塩基に対して相補的になるような塩基を、
３’側には配列表配列番号２記載のＤＮＡ配列の１２３
０番目〜１２５０番目の相補鎖の塩基と相補的になるよ
うな塩基をつけた配列表配列番号４で表される合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた。この合成オリゴヌクレオチド
１０ｐｍｏｌをＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造製、日本
国）をその使用説明書に従って用いて５’末端をリン酸
化した。

【００２５】次にＭｕｔａｎ−Ｋ ｋｉｔ（宝酒造製、
日本国）をその使用説明書に従って用いることにより、
すなわち、ｐＧＰＯｍｐ１８のｄｅｏｘｙｕｒａｃｉｌ
を含んだ環状一本鎖ＤＮＡをエシェリヒア．コリＣＪ２
３６株（Ｆ’、ｄｕｔ^-、ｕｎｇ^-）を用いて作製し、上
記リン酸化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、
ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により相補鎖を合成し
てエシェリヒア．コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株
（Ｆ’、ｍｕｔＳ）にトランスフェクションして変異を
導入するＫｕｎｋｅｌ法により、変異が導入されたｐＧ
ＰＯｍｐ１８Ｂを得た。

【００２６】つぎに、図３のようにこのｐＧＰＯｍｐ１
８Ｂを制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断
して得た約０．７ｋｂｐのフラグメントとｐＧＰＯ１０
１を制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断し
て得た約４．７ｋｂｐのフラグメントとをＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本
国）を用いて連結することで配列表配列番号３記載の変
異型ＢをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐ
ＧＰＯ１０１Ｂを得た。このｐＧＰＯ１０１Ｂでエシェ
リヒア・コリＤＨ１株をｈａｎａｈａｎ法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ発行）に従って形質転換
し、その形質転換体を以下のように命名し、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。なお、かっこ内は
国際寄託機関の寄託番号を示す。

【００２７】エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＧＰＯ１０
１Ｂ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７３０）

【００２８】

【実施例２】配列表配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ
末端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列が表１
および表２にて示される配列表配列番号５〜１３記載の
のアミノ酸配列と置換された変異型Ｌ−α−グリセロフ
ォスフェートオキシダーゼ（変異型Ａ、変異型Ｃ、変異
型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異
型Ｉ、変異型Ｊ）をコードするＤＮＡ断片を含むプラス
ミドベクター（ｐＧＰＯ１０１Ａ、ｐＧＰＯ１０１Ｃ、
ｐＧＰＯ１０１Ｄ、ｐＧＰＯ１０１Ｅ、ｐＧＰＯ１０１
Ｆ、ｐＧＰＯ１０１Ｇ、ｐＧＰＯ１０１Ｈ、ｐＧＰＯ１
０１Ｉ、ｐＧＰＯ１０１Ｊ）の構築とそれを含む形質転
換体の作製。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】表１および表２に、各変異型に対応する置
換配列と、その変異を導入する為の変異導入用オリゴヌ
クレオチドが明示されている。この変異導入用オリゴヌ
クレオチドを用いて実施例１と同様にして各変異型Ｌ−
α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ａ、
変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、
変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）をコードするＤＮＡを
含むプラスミドベクター（ｐＧＰＯ１０１Ａ、ｐＧＰＯ
１０１Ｃ、ｐＧＰＯ１０１Ｄ、ｐＧＰＯ１０１Ｅ、ｐＧ
ＰＯ１０１Ｆ、ｐＧＰＯ１０１Ｇ、ｐＧＰＯ１０１Ｈ、
ｐＧＰＯ１０１Ｉ、ｐＧＰＯ１０１Ｊ）を作製した。ま
た、これらのベクターでエシェリヒア．コリＨＢ１０１
を形質転換し、その形質転換体を得た。

【００３２】

【実施例３】 変異型Ｂの製造方法 ３．７％のＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎ
ｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製、米国）を１００ｍｌ含
む５００ｍｌ容三角フラスコ２０ケを１２０℃、２０分
間加熱滅菌した後、濾過滅菌したアンピシリン液を終濃
度５０μｇ／ｍｌになるように加え、エシェリヒア・コ
リＤＨ１・ｐＧＰＯ１０１Ｂ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７
３０）をコロニーより植菌し、撹拌させながら３７℃で
１８時間培養し、培養力価０．２５Ｕ／ｍｌの培養液２
ｌを得た。

【００３３】得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分
間遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）３０ｍｌを加えて懸濁して、超
音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を１５００
０ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、３７ｍｌ（酵素活性５
００Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝かしたＤＥＡＥ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製、
スウェーデン国）１００ｍｌ（２．６ｘ２０ｃｍ）のカ
ラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエ
ントで溶出を行い、酵素活性画分（４８０Ｕ）を得た。

【００３４】この得られた酵素活性画分にＮａＣｌ濃度
が４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、４ＭのＮａＣｌで平衡
化されたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４
Ｂ（ファルマシアバイオテク社製、スウェーデン国）２
０ｍｌ（１．５ｘ１２ｃｍ）のカラムに通し、４〜０Ｍ
のＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行い活性画分
（２９０Ｕ）を回収し、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯ
Ｈ（ｐＨ６．５）に対して透析した後、Ｃｅｎｔｒｉｆ
ｌｏ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｏｎｅｓ Ｔｙｐｅ ＣＦ
２５（アミコン社製、米国）で濃縮し、酵素標品を得
た。この標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質であることが確
認され、Ａ２８０は１０．１、２８０Ｕ／ｍｌであっ
た。

【００３５】

【実施例４】 変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、
変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊの製造方法 ３．７％のＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎ
ｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製、米国）を１００ｍｌ含
む５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃、２０分間加熱
滅菌した後、濾過滅菌したアンピシリン液を終濃度５０
μｇ／ｍｌになるように加え、実施例２記載の各変異型
酵素を生産する形質転換体をコロニーより植菌し、撹拌
させながら３７℃で１８時間培養し、それぞれ培養液１
００ｍｌを得た。

【００３６】それぞれの変異型において、得られた培養
液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、得られた
菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）７
ｍｌを加えて懸濁して、超音波により菌体を破砕した。
この菌体破砕液を１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
し、上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．５）で緩衝かしたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製、スウェ
ーデン国）２０ｍｌ（１．５ｘ１２ｃｍ）のカラムに通
し、０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶
出を行い、酵素活性画分を得た。得られた精製酵素液の
Ａ２８０と活性（Ｕ／ｍｌ）と液量（ｍｌ）を表３に示
した。

【００３７】

【表３】

【００３８】また、表３には比較のため野生型酵素にお
いても同様の精製を行い、その結果も示した。

【００３９】

【実施例５】 変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（変異型Ｂ）の液状安定性およびミカエリス定数の評価 野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（実施例３と同様の方法で精製された標品）と実施例３
で得られた変異型Ｂの酵素標品を用いて下記のような保
存条件で残存活性を測定し、液状安定性を評価した。

【００４０】保存条件 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５） ０．０５％ アジ化ナトリウム １０Ｕ／ｍｌ Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼ ３７℃ 図４で示されるようにに野生型（□−□）に比べ、変異
型Ｂ（■−■）は安定性が向上していた。

【００４１】また、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェ
ートオキシダーゼ（実施例３と同様の方法で精製された
標品）と実施例３で得られた変異型Ｂの酵素標品を用い
てＬ−α−グリセロフォスフェートに対するミカエリス
定数を活性測定法と同様の測定法でＬ−α−グリセロフ
ォスフェート濃度を変化させて測定したところ、以下の
ように野生型に比べ、変異型Ｂはミカエリス定数が低下
し、酵素的性能が向上していた。

【００４２】 野生型 ２．５ｍＭ 変異型Ｂ ０．５ｍＭ

【００４３】

【実施例６】 変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（変異型Ｂ）の至適ｐＨ、至適温度 参考例１記載の活性測定法において５０ｍＭのＰＩＰＥ
Ｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）の代わりに各ｐＨの５０ｍ
ＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ＭＥＳ：２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉ
ｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ， ｍｏ
ｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液を用いて変異型Ｂの至適ｐＨを測定し
た。その結果を図５に示した。図中、○−○はＭＥＳ−
ＮａＯＨ、●−●はＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、□−□はＴ
ｒｉｓ−塩酸の場合を示す。また、参考例１記載の活性
測定法において５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ
６．５）の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ
８．０）緩衝液を用いて変異型Ｂの至適温度を測定し
た。その結果を図６に示した。

【実施例７】 変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型
Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）の液状
安定性およびミカエリス定数の評価 野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（実施例４において変異型と同様に精製された標品）と
実施例４で得られた各変異型の酵素標品を用いて下記の
ような条件で熱処理を行い、前記活性測定法に沿って残
存活性を測定し、液状安定性を評価した結果を上記表３
に示した。

【００４４】熱処理条件 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） 約０．５Ｕ／ｍｌ Ｌ−α−グリセロフォスフェート
オキシダーゼ ４２℃ １０分間加温 野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
（実施例４で変異型と同様に精製された標品）と実施例
４で得られた各変異型の酵素標品を用いて下記のような
反応条件でＤ，Ｌ−α−グリセロフォスフェートの濃度
を変化させ、Ｄ，Ｌ−α−グリセロフォスフェートに対
するミカエリス定数を測定した結果を表４に示した。

【００４５】

【表４】

【００４６】ミカエリス定数測定法 反応液 ２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５） ０．０６％ ４ＡＡ ０．０４％ ＴＯＯＳ ５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ 酵素希釈液 ５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５） 反応液０．５ｍｌに０〜１０００ｍＭのＤ，Ｌ−α−グ
リセロフォスフェート溶液０．０５ｍｌ加えて３７℃で
５分間予備加温した後、希釈酵素液を０．０５ｍｌ加え
て反応を開始し、５分後に０．５％ＳＤＳを１ｍｌ加え
て反応を停止させ吸光度５５５ｎｍを測定した。

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば野生型のＬ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼよりも安定性の優れ、酵
素的性能のよい変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェート
オキシダーゼを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はストレプトコッカス属由来の野生型のＬ
−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの遺伝子を
含むプラスミドｐＧＰＯ１０１作製の工程を示す。

【図２】図２は変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８作
製の工程を示す。

【図３】図３は変異型Ｂをコードする遺伝子を含むプラ
スミドベクターｐＧＰＯ１０１Ｂ作製の工程を示す。

【図４】図４は本発明の変異型酵素と野生型酵素の３７
℃での保存安定性を示す。

【図５】図５は本発明の変異型Ｂの至適ｐＨ曲線を示
す。

【図６】図６は本発明の変異型Ｂの至適温度曲線を示
す。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Asp Val Leu Asn His Leu Glu Asn Ser Arg Asp Glu Lys Ala Pro 1 5 10 15 Ser Thr Ile Ser 20 配列番号：２ 配列の長さ：１８２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源 生物名：ストレプトコッカス・エスピー 株名：ＧＰＯＳ−５３ 配列 ATG TTT TCA AAC AAG ACA AGA CAA GAT AGC ATT CAA AAA ATG CAG CAA 48 Met Phe Ser Asn Lys Thr Arg Gln Asp Ser Ile Gln Lys Met Gln Gln 1 5 10 15 GAA GAA TTG GAT CTG TTG ATC ATC GGT GGC GGA ATC ACT GGT GCC GGT 96 Glu Glu Leu Asp Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Thr Gly Ala Gly 20 25 30 GTG GCA GTC CAG GCA GCA GCA TCA GGA ATC AAA ACA GGA TTG ATC GAA 144 Val Ala Val Gln Ala Ala Ala Ser Gly Ile Lys Thr Gly Leu Ile Glu 35 40 45 ATG CAA GAT TTT GCA GAA GGG ACG TCC TCT CGC TCG ACC AAA CTT GTG 192 Met Gln Asp Phe Ala Glu Gly Thr Ser Ser Arg Ser Thr Lys Leu Val 50 55 60 CAT GGC GGT ATT CGT TAT CTG AAA ACA TTT GAT GTG GAA GTA GTA GCT 240 His Gly Gly Ile Arg Tyr Leu Lys Thr Phe Asp Val Glu Val Val Ala 65 70 75 80 GAC ACA GTT GGT GAA CGT GCA GTC GTA CAA GGT ATT GCC CCA CAC ATC 288 Asp Thr Val Gly Glu Arg Ala Val Val Gln Gly Ile Ala Pro His Ile 85 90 95 CCA AAA CCA GAT CCA ATG CTT TTA CCA ATC TAT GAA GAT GAA GGA GCA 336 Pro Lys Pro Asp Pro Met Leu Leu Pro Ile Tyr Glu Asp Glu Gly Ala 100 105 110 ACA ACC TTC AAT ATG TTC TCT GTC AAA GTA GCA ATG GAC CTT TAC GAC 384 Thr Thr Phe Asn Met Phe Ser Val Lys Val Ala Met Asp Leu Tyr Asp 115 120 125 AAA CTG GCA AAT GTG ACA GGA ACT AAA TAT GAG AAC TAT ACC CTC ACA 432 Lys Leu Ala Asn Val Thr Gly Thr Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Leu Thr 130 135 140 CCA GAA GAA GTA TTG GAA AGA GAA CCA TTT TTG AAA AAA GGA AGG CTA 480 Pro Glu Glu Val Leu Glu Arg Glu Pro Phe Leu Lys Lys Gly Arg Leu 145 150 155 160 AAA GGT GCA GGT GTT TAT CTG GAT TTC CGC AAC AAT GAT GCC CGT TTA 528 Lys Gly Ala Gly Val Tyr Leu Asp Phe Arg Asn Asn Asp Ala Arg Leu 165 170 175 GTG ATC GAT AAT ATC AAA AAG GCT GCA GAA GAT GGG GCT TAT CTA GTA 576 Val Ile Asp Asn Ile Lys Lys Ala Ala Glu Asp Gly Ala Tyr Leu Val 180 185 190 AGT AAA ATG AAA GCG GTT GGC TTT TTA TAT GAG GGC GAT CAA ATC GTT 624 Ser Lys Met Lys Ala Val Gly Phe Leu Tyr Glu Gly Asp Gln Ile Val 195 200 205 GGT GTC AAA GCT CGT GAT CTG CTG ACA GAT GAA GTG ATA GAG ATC AAA 672 Gly Val Lys Ala Arg Asp Leu Leu Thr Asp Glu Val Ile Glu Ile Lys 210 215 220 GCA AAA TTA GTG ATC AAT ACG AGT GGT CCT TGG GTA GAT AAA GTA CGG 720 Ala Lys Leu Val Ile Asn Thr Ser Gly Pro Trp Val Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 AAC TTG AAT TTT ACG CGT CCA GTC TCT CCT AAA ATG CGT CCA ACC AAA 768 Asn Leu Asn Phe Thr Arg Pro Val Ser Pro Lys Met Arg Pro Thr Lys 245 250 255 GGG ATC CAT TTA GTC GTA GAT GCG AAA AAA CTG CCT GTA CCG CAA CCC 816 Gly Ile His Leu Val Val Asp Ala Lys Lys Leu Pro Val Pro Gln Pro 260 265 270 ACA TAC TTC GAT ACA GGA AAA CAA GAT GGG CGG ATG GTT TTT GCT ATC 864 Thr Tyr Phe Asp Thr Gly Lys Gln Asp Gly Arg Met Val Phe Ala Ile 275 280 285 CCA AGA GAA AAC AAG ACT TAC TTT GGT ACG ACA GAT ACG GAT TAC CAA 912 Pro Arg Glu Asn Lys Thr Tyr Phe Gly Thr Thr Asp Thr Asp Tyr Gln 290 295 300 GGA GAC TTT ACG GAT CCA AAA GTC ACA CAA GAA GAC GTG GAT TAT CTA 960 Gly Asp Phe Thr Asp Pro Lys Val Thr Gln Glu Asp Val Asp Tyr Leu 305 310 315 320 TTG GAT GTA ATC ACC CAT CGC TAT CCA GAA GCA AAT ATC ACA TTG GCA 1008 Leu Asp Val Ile Thr His Arg Tyr Pro Glu Ala Asn Ile Thr Leu Ala 325 330 335 GAT ATC GAA GCA AGC TGG GCA GGG CTT CGT CCA CTA TTG ATT GGT AAT 1056 Asp Ile Glu Ala Ser Trp Ala Gly Leu Arg Pro Leu Leu Ile Gly Asn 340 345 350 TCT GGT TCT GAT TAT AAT GGT GGA GAT AAT GGA TCG ATT TCA GAC AAG 1104 Ser Gly Ser Asp Tyr Asn Gly Gly Asp Asn Gly Ser Ile Ser Asp Lys 355 360 365 AGC TTC AAT AAA GTG GTT GAT ACA GTA AGT GAA TAT AAG GAA AAT AAA 1152 Ser Phe Asn Lys Val Val Asp Thr Val Ser Glu Tyr Lys Glu Asn Lys 370 375 380 GTT TCT CGT GCT GAA GTA GAA GAT GTG TTG AAC CAT TTG GAA AAC AGC 1200 Val Ser Arg Ala Glu Val Glu Asp Val Leu Asn His Leu Glu Asn Ser 385 390 395 400 CGC GAC GAA AAA GCA CCT TCT ACG ATT TCC AGA GGT AGT TCT TTA GAA 1248 Arg Asp Glu Lys Ala Pro Ser Thr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Leu Glu 405 410 415 AGA GAA CCA GAT GGC TTG TTG ACT TTA TCA GGT GGG AAA ATC ACT GAT 1296 Arg Glu Pro Asp Gly Leu Leu Thr Leu Ser Gly Gly Lys Ile Thr Asp 420 425 430 TAC CGT AAG ATG GCA GAA GGA GCT TTA CGA TTG ATT CGT CAG CTG TTA 1344 Tyr Arg Lys Met Ala Glu Gly Ala Leu Arg Leu Ile Arg Gln Leu Leu 435 440 445 AAA GAA GAA TAC GGA ATA GAG ACG AAA GAA ATC GAC TCT AAA AAA TAT 1392 Lys Glu Glu Tyr Gly Ile Glu Thr Lys Glu Ile Asp Ser Lys Lys Tyr 450 455 460 CAG ATT TCA GGT GGA AAC TTC GAT CCA ACG AAA TTA GAA GAA ACA GTG 1440 Gln Ile Ser Gly Gly Asn Phe Asp Pro Thr Lys Leu Glu Glu Thr Val 465 470 475 480 ACG GAA TTA GCA AAA GAA GGA GTA GCA GCC GGT TTA GAG GAA GAA GAT 1488 Thr Glu Leu Ala Lys Glu Gly Val Ala Ala Gly Leu Glu Glu Glu Asp 485 490 495 GCT ACT TAT ATC GCT GAT TTT TAC GGG ACT AAT GCT CGA CGT ATC TTT 1536 Ala Thr Tyr Ile Ala Asp Phe Tyr Gly Thr Asn Ala Arg Arg Ile Phe 500 505 510 GAA TTA GCA AAA GAA ATG GCA CCT TAT CCT GGT TTG AGT CTC GCT GAG 1584 Glu Leu Ala Lys Glu Met Ala Pro Tyr Pro Gly Leu Ser Leu Ala Glu 515 520 525 TCA GCT CGG TTA CGT TAT GGC TTA GAA GAA GAA ATG GTT TTA GCT CCA 1632 Ser Ala Arg Leu Arg Tyr Gly Leu Glu Glu Glu Met Val Leu Ala Pro 530 535 545 GGT GAT TAT CTC ATT CGT CGT ACG AAT CAT CTG TTG TTT GAA CGA GAT 1680 Gly Asp Tyr Leu Ile Arg Arg Thr Asn His Leu Leu Phe Glu Arg Asp 545 550 555 560 CAG CTG GAT GAG ATC AAG CAA CCT GTG ATC GAT GCA ATT GCT GAG TAT 1728 Gln Leu Asp Glu Ile Lys Gln Pro Val Ile Asp Ala Ile Ala Glu Tyr 565 570 575 TTT GGG TGG ACA GAA GAA GAG AAG GCG CAA CAG ACT AAA CGT TTA GAA 1776 Phe Gly Trp Thr Glu Glu Glu Lys Ala Gln Gln Thr Lys Arg Leu Glu 580 585 590 GCA TTG ATC GCA GAA TCA GAT CTG CGG GAA CTA AAG GGG GAG AAA TAA 1824 Ala Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Arg Glu Leu Lys Gly Glu Lys 595 600 605 配列番号：３ 配列の長さ：１７９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG TTT TCA AAC AAG ACA AGA CAA GAT AGC ATT CAA AAA ATG CAG CAA 48 Met Phe Ser Asn Lys Thr Arg Gln Asp Ser Ile Gln Lys Met Gln Gln 1 5 10 15 GAA GAA TTG GAT CTG TTG ATC ATC GGT GGC GGA ATC ACT GGT GCC GGT 96 Glu Glu Leu Asp Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Thr Gly Ala Gly 20 25 30 GTG GCA GTC CAG GCA GCA GCA TCA GGA ATC AAA ACA GGA TTG ATC GAA 144 Val Ala Val Gln Ala Ala Ala Ser Gly Ile Lys Thr Gly Leu Ile Glu 35 40 45 ATG CAA GAT TTT GCA GAA GGG ACG TCC TCT CGC TCG ACC AAA CTT GTG 192 Met Gln Asp Phe Ala Glu Gly Thr Ser Ser Arg Ser Thr Lys Leu Val 50 55 60 CAT GGC GGT ATT CGT TAT CTG AAA ACA TTT GAT GTG GAA GTA GTA GCT 240 His Gly Gly Ile Arg Tyr Leu Lys Thr Phe Asp Val Glu Val Val Ala 65 70 75 80 GAC ACA GTT GGT GAA CGT GCA GTC GTA CAA GGT ATT GCC CCA CAC ATC 288 Asp Thr Val Gly Glu Arg Ala Val Val Gln Gly Ile Ala Pro His Ile 85 90 95 CCA AAA CCA GAT CCA ATG CTT TTA CCA ATC TAT GAA GAT GAA GGA GCA 336 Pro Lys Pro Asp Pro Met Leu Leu Pro Ile Tyr Glu Asp Glu Gly Ala 100 105 110 ACA ACC TTC AAT ATG TTC TCT GTC AAA GTA GCA ATG GAC CTT TAC GAC 384 Thr Thr Phe Asn Met Phe Ser Val Lys Val Ala Met Asp Leu Tyr Asp 115 120 125 AAA CTG GCA AAT GTG ACA GGA ACT AAA TAT GAG AAC TAT ACC CTC ACA 432 Lys Leu Ala Asn Val Thr Gly Thr Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Leu Thr 130 135 140 CCA GAA GAA GTA TTG GAA AGA GAA CCA TTT TTG AAA AAA GGA AGG CTA 480 Pro Glu Glu Val Leu Glu Arg Glu Pro Phe Leu Lys Lys Gly Arg Leu 145 150 155 160 AAA GGT GCA GGT GTT TAT CTG GAT TTC CGC AAC AAT GAT GCC CGT TTA 528 Lys Gly Ala Gly Val Tyr Leu Asp Phe Arg Asn Asn Asp Ala Arg Leu 165 170 175 GTG ATC GAT AAT ATC AAA AAG GCT GCA GAA GAT GGG GCT TAT CTA GTA 576 Val Ile Asp Asn Ile Lys Lys Ala Ala Glu Asp Gly Ala Tyr Leu Val 180 185 190 AGT AAA ATG AAA GCG GTT GGC TTT TTA TAT GAG GGC GAT CAA ATC GTT 624 Ser Lys Met Lys Ala Val Gly Phe Leu Tyr Glu Gly Asp Gln Ile Val 195 200 205 GGT GTC AAA GCT CGT GAT CTG CTG ACA GAT GAA GTG ATA GAG ATC AAA 672 Gly Val Lys Ala Arg Asp Leu Leu Thr Asp Glu Val Ile Glu Ile Lys 210 215 220 GCA AAA TTA GTG ATC AAT ACG AGT GGT CCT TGG GTA GAT AAA GTA CGG 720 Ala Lys Leu Val Ile Asn Thr Ser Gly Pro Trp Val Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 AAC TTG AAT TTT ACG CGT CCA GTC TCT CCT AAA ATG CGT CCA ACC AAA 768 Asn Leu Asn Phe Thr Arg Pro Val Ser Pro Lys Met Arg Pro Thr Lys 245 250 255 GGG ATC CAT TTA GTC GTA GAT GCG AAA AAA CTG CCT GTA CCG CAA CCC 816 Gly Ile His Leu Val Val Asp Ala Lys Lys Leu Pro Val Pro Gln Pro 260 265 270 ACA TAC TTC GAT ACA GGA AAA CAA GAT GGG CGG ATG GTT TTT GCT ATC 864 Thr Tyr Phe Asp Thr Gly Lys Gln Asp Gly Arg Met Val Phe Ala Ile 275 280 285 CCA AGA GAA AAC AAG ACT TAC TTT GGT ACG ACA GAT ACG GAT TAC CAA 912 Pro Arg Glu Asn Lys Thr Tyr Phe Gly Thr Thr Asp Thr Asp Tyr Gln 290 295 300 GGA GAC TTT ACG GAT CCA AAA GTC ACA CAA GAA GAC GTG GAT TAT CTA 960 Gly Asp Phe Thr Asp Pro Lys Val Thr Gln Glu Asp Val Asp Tyr Leu 305 310 315 320 TTG GAT GTA ATC ACC CAT CGC TAT CCA GAA GCA AAT ATC ACA TTG GCA 1008 Leu Asp Val Ile Thr His Arg Tyr Pro Glu Ala Asn Ile Thr Leu Ala 325 330 335 GAT ATC GAA GCA AGC TGG GCA GGG CTT CGT CCA CTA TTG ATT GGT AAT 1056 Asp Ile Glu Ala Ser Trp Ala Gly Leu Arg Pro Leu Leu Ile Gly Asn 340 345 350 TCT GGT TCT GAT TAT AAT GGT GGA GAT AAT GGA TCG ATT TCA GAC AAG 1104 Ser Gly Ser Asp Tyr Asn Gly Gly Asp Asn Gly Ser Ile Ser Asp Lys 355 360 365 AGC TTC AAT AAA GTG GTT GAT ACA GTA AGT GAA TAT AAG GAA AAT AAA 1152 Ser Phe Asn Lys Val Val Asp Thr Val Ser Glu Tyr Lys Glu Asn Lys 370 375 380 GTT TCT CGT GCT GAA GTC CAG CGA CGA TGT GTT GAA CCA TAT GGA CGT 1200 Val Ser Arg Ala Glu Val Gln Arg Arg Cys Val Glu Pro Tyr Gly Arg 385 390 395 400 AGC AGA GGT AGT TCT TTA GAA AGA GAA CCA GAT GGC TTG TTG ACT TTA 1248 Ser Arg Gly Ser Ser Leu Glu Arg Glu Pro Asp Gly Leu Leu Thr Leu 405 410 415 TCA GGT GGG AAA ATC ACT GAT TAC CGT AAG ATG GCA GAA GGA GCT TTA 1296 Ser Gly Gly Lys Ile Thr Asp Tyr Arg Lys Met Ala Glu Gly Ala Leu 420 425 430 CGA TTG ATT CGT CAG CTG TTA AAA GAA GAA TAC GGA ATA GAG ACG AAA 1344 Arg Leu Ile Arg Gln Leu Leu Lys Glu Glu Tyr Gly Ile Glu Thr Lys 435 440 445 GAA ATC GAC TCT AAA AAA TAT CAG ATT TCA GGT GGA AAC TTC GAT CCA 1392 Glu Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Gln Ile Ser Gly Gly Asn Phe Asp Pro 450 455 460 ACG AAA TTA GAA GAA ACA GTG ACG GAA TTA GCA AAA GAA GGA GTA GCA 1440 Thr Lys Leu Glu Glu Thr Val Thr Glu Leu Ala Lys Glu Gly Val Ala 465 470 475 480 GCC GGT TTA GAG GAA GAA GAT GCT ACT TAT ATC GCT GAT TTT TAC GGG 1488 Ala Gly Leu Glu Glu Glu Asp Ala Thr Tyr Ile Ala Asp Phe Tyr Gly 485 490 495 ACT AAT GCT CGA CGT ATC TTT GAA TTA GCA AAA GAA ATG GCA CCT TAT 1536 Thr Asn Ala Arg Arg Ile Phe Glu Leu Ala Lys Glu Met Ala Pro Tyr 500 505 510 CCT GGT TTG AGT CTC GCT GAG TCA GCT CGG TTA CGT TAT GGC TTA GAA 1584 Pro Gly Leu Ser Leu Ala Glu Ser Ala Arg Leu Arg Tyr Gly Leu Glu 515 520 525 GAA GAA ATG GTT TTA GCT CCA GGT GAT TAT CTC ATT CGT CGT ACG AAT 1632 Glu Glu Met Val Leu Ala Pro Gly Asp Tyr Leu Ile Arg Arg Thr Asn 530 535 540 CAT CTG TTG TTT GAA CGA GAT CAG CTG GAT GAG ATC AAG CAA CCT GTG 1680 His Leu Leu Phe Glu Arg Asp Gln Leu Asp Glu Ile Lys Gln Pro Val 545 550 555 560 ATC GAT GCA ATT GCT GAG TAT TTT GGG TGG ACA GAA GAA GAG AAG GCG 1728 Ile Asp Ala Ile Ala Glu Tyr Phe Gly Trp Thr Glu Glu Glu Lys Ala 565 570 575 CAA CAG ACT AAA CGT TTA GAA GCA TTG ATC GCA GAA TCA GAT CTG CGG 1776 Gln Gln Thr Lys Arg Leu Glu Ala Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Arg 580 585 590 GAA CTA AAG GGG GAG AAA TAA 1797 Glu Leu Lys Gly Glu Lys 595 配列番号：４ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CCAGCGACGA TGTGTTGAAC CATATGGACG TAGCAGAGGT 60 AGTTCTTTAG AAAG 74 配列番号：５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：７ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：９ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１０ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１２ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Arg Arg Cys Gly Glu Pro Phe Gly Lys Ala Asp Glu Lys Ala Pro 1 5 10 15 Ser Thr Ile Ser 20 配列番号：１４ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGTTGAAC CATTTGGACG TTCCAGAGGT 60 AGTTCTTTAG 70 配列番号：１５ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGAACGACGA TGTGTTGAAC CATTTGGAAA AGCTAGAGGT 60 AGTTCTTTAG AAAG 74 配列番号：１６ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGTTGAAC CATTTAGTAT TTCCAGAGGT 60 AGTTCTTTAG 70 配列番号：１７ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGTTGAAC CATTTACCAG TATTTCCAGA 60 GGTAGTTCTT TAG 73 配列番号：１８ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGGTGATC CATTTGGAAA AGCTAGAGGT 60 AGTTCTTTAG AAAG 74 配列番号：１９ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTCTTGAAC CATTTGGAAA AGCTAGAGGT 60 AGTTCTTTAG AAAG 74 配列番号：２０ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGTTGAAC CATGGGGACG TTCCAGAGGT 60 AGTTCTTTAG 70 配列番号：２１ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGTTGAAC CATTTGGAAA ACGTAGAGGT 60 AGTTCTTTAG AAAG 74 配列番号：２２ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGTTTCTC GTGCTGAAGT CGATCGACGA TGTGGTGAAC CATTTGGAAA AGCCGACGAA 60 AAAGCACCTT CTAC 74

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフ
   ォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ
   酸配列において、少なくとも１ケのアミノ酸残基が欠
   失、置換、挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−α
   −グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する変
   異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
2. 【請求項２】 少なくとも１ケのアミノ酸残基が欠失、
   置換、挿入されたアミノ酸配列において、少なくとも
   （アルギニン−アルギニン−システイン−グリシンまた
   はバリンまたはロイシン−グルタミン酸またはアスパラ
   ギン酸−プロリン）で表される長さ６のアミノ酸配列ま
   たはこの配列と４ケ以上の相同性を有する請求項１記載
   の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダー
   ゼ。
3. 【請求項３】 微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフ
   ォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ
   酸配列において、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列
   を、少なくとも（アルギニン−アルギニン−システイン
   −グリシンまたはバリンまたはロイシン−グルタミン酸
   またはアスパラギン酸−プロリン）で表される長さ６の
   アミノ酸配列またはこの配列と４ケ以上の相同性を有す
   るをアミノ酸配列含むアミノ酸配列に置換した請求項１
   記載の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダ
   ーゼ。
4. 【請求項４】 微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフ
   ォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ
   酸配列が、ストレプトコッカス属由来の野生型Ｌ−α−
   グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白
   質のアミノ酸配列である請求項１記載の変異型Ｌ−α−
   グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
5. 【請求項５】 微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフ
   ォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ
   酸配列が、配列表配列番号２である請求項１記載の変異
   型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
6. 【請求項６】 配列表配列番号２記載のアミノ酸配列に
   おいて、そのＮ末端から３９１番目〜４１０番目のアミ
   ノ酸配列が、少なくとも（アルギニン−アルギニン−シ
   ステイン−グリシンまたはバリンまたはロイシン−グル
   タミン酸またはアスパラギン酸−プロリン）で表される
   長さ６のアミノ酸配列またはこの配列と４ケ以上の相同
   性を有するアミノ酸配列と置換された請求項５記載の変
   異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
7. 【請求項７】 変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェート
   オキシダーゼが、配列表配列番号３記載のアミノ酸配列
   である請求項６記載の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフ
   ェートオキシダーゼ。
8. 【請求項８】 請求項１記載の変異型Ｌ−α−グリセロ
   フォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片。
9. 【請求項９】 請求項８記載のＤＮＡ断片を含有する発
   現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の発現ベクターにより形
    質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】 エシェリヒア・コリである請求項１０
    記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載の宿主細胞を培地で培
    養し、培養物から変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェー
    トオキシダーゼを採取することを特徴とする変異型Ｌ−
    α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの製造法。