JPH10147515A

JPH10147515A - 皮膚外用剤

Info

Publication number: JPH10147515A
Application number: JP8324531A
Authority: JP
Inventors: Makoto Tsunenaga; 誠常長; Satoshi Amano; 聡天野; Toshio Nishiyama; 敏夫西山
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 1998-06-02
Anticipated expiration: 2016-11-20
Also published as: JP3825514B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ホルモン類を有効成分とする皮膚外用剤に伴い
がちな副作用を伴わないで、かつ皮膚の賦活効果等の代
謝促進性に優れる成分を見出し、これを用いた皮膚や毛
髪を若々しく保つ手段の提供。【解決手段】皮膚内に存在する糖タンパクの一種である
「ラミニン５」を、例えばアフィニティクロマトグラフ
ィー等を用いて製造して、これを有効成分として配合し
た皮膚外用剤を提供すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、皮膚内に存在する
糖タンパクである「ラミニン５」を配合した皮膚外用剤
に関する技術分野に属する。より詳細には、このラミニ
ン５を配合することによって、皮膚賦活効果，保湿効
果，肌荒れ改善効果及び美白効果を有し、さらに頭皮に
対しては養毛効果及び栄養作用を有する皮膚外用剤に関
する技術分野に属する。

【０００２】

【従来の技術】皮膚や頭皮における代謝を促進させて皮
膚や毛髪を若々しく保つことは、皮膚外用剤を使用する
究極的な目的の一つである。そこで、皮膚の代謝促進剤
や養毛剤の有効成分として、例えば卵胞ホルモンや副腎
皮質ホルモン等のホルモン類が、肌を若返らせ，しわを
防ぎ，さらには頭皮における育毛を促す等の効果を付与
する目的から採用されている。しかしながら、これらの
ホルモン類は多量に使用すると全身的な副作用や皮膚の
肥厚化を伴う等の問題点があることも否めなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、上記のホルモン類を有効成分とする皮膚外用剤に
伴いがちな副作用を伴わないで、かつ皮膚の賦活効果等
の代謝促進性に優れる成分を見出し、これを用いた皮膚
や毛髪を若々しく保つ手段を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、皮膚内に存
在する糖タンパクの一種である「ラミニン５」が上記の
条件を満たし、かつ皮膚外用剤の有効成分として配合す
ることも可能であることを見出し本発明を完成した。す
なわち、本発明は、ラミニン５を有効成分として配合し
た皮膚外用剤を提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。Ａ．ラミニン５について：本発明皮膚外用剤中に配合す
る「ラミニン５」は、生体から抽出される糖タンパクの
一種で、別名で「カリニン(kalinin）」「エピリグリン
（epiligrin)」「ニーシン(nicein)」とも呼ばれてい
る。ラミニン５は、少なくとも哺乳動物の皮膚，気管，
食道，角膜及び羊膜の基底膜のアンカリングフィラメン
ト（anchoring filaments ）に局在することや、これら
の皮膚細胞等の培養液中にも放出されることが知られて
いる糖タンパクである。

【０００６】このラミニン５は、４００〜４９５kDa の
分子量を有し、α３，β３及びγ２の３本のポリペプチ
ド鎖により構成される。また、ラミニン５中に存在する
ジスルフィド結合を還元し、ウエスタンブロット法によ
り分離すると、２００又は１６５kDa のα３鎖，１４０
kDa のβ３鎖，１５５又は１０５kDa のγ２鎖に分けら
れる。そして、このラミニン５は、いくつかのドメイン
からなっており〔例えば、回転シャドウ像により、その
両端に球状のドメインを有する１０７nmの長さのさお状
の分子であり、完全な形態では、一端に２つの小さな球
状のドメインを有し、他端により大きい球状のドメイン
を有する非対称構造を呈していることが明らかになって
いる（Rousselle et al.,1991 ）等〕、それぞれのドメ
インが、ヘパリン，コラーゲン，細胞等との間で作用す
る特異構造を有している。

【０００７】Ｂ．ラミニン５の製造：このラミニン５
は、例えばラミニン５に特異的なモノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体をリガンドとして結合したアフィ
ニティクロマトグラフィーにラミニン５を含む画分を接
触させて、ラミニン５をこのアフィニティークロマトグ
ラフィーに選択的に結合させて、これを溶出することに
より製造することができる。

【０００８】このモノクローナル抗体又はポリクローナ
ル抗体を製造する際の抗原は、ラミニン５が存在するこ
とが明らかになっている組織、例えば哺乳動物の皮膚，
気管，食道，角膜又は羊膜の抽出物をコラゲナーゼによ
りVII 型コラーゲンのＮＣ−１小球状領域を消化して、
この消化物を抽出精製することにより得ることができる
（例えば、Bachinger et al.,J.Biol.Chem.J.265,10095
(1990)参照のこと）。

【０００９】抽出精製工程は、ラミニン５の物理的、化
学的性質を利用した各種の分離手段を駆使することに行
うことができる。例えば硫酸アンモニウム等のタンパク
沈澱剤による処理，限外濾過，ゲル濾過クロマトグラフ
ィー，遠心分離，電気泳動，イオン交換クロマトグラフ
ィー，アフィニティークロマトグラフィー，透析等を必
要に応じて組み合わせて行うことができる。

【００１０】特に好ましい精製手段の一例としては、精
製の一工程中に「抽出物（又は消化物）をＤＥＡＥ−
セルロース（例えばＤＥ５２，ワットマン社製）と共に
低濃度の塩緩衝液（例えば２M 尿素，２５mM ＮａＣ
ｌ，５mM ＥＤＴＡ及び５０mMトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
７．８等）中でインキュベートし、この未結合部分を
同容量の０．２M ＮａＣｌを含有する緩衝液でＤＥＡＥ
−セルロースを洗浄し、溶出物質を遠心分離（17,000×
ｇ，６０分程度）後に分離し、この試料を、硫酸アン
モニウム沈澱法（５０％飽和）によって、１０倍に濃縮
して、ＰＢＳ中で透析を行って平衡化させる」工程を入
れた精製工程を挙げることができる。このようにして得
られるタンパク質混合物を、上記抗原として用いること
ができる。

【００１１】なお、このようにして得られたタンパク質
混合物に、さらにプロテアーゼ処理等を施したものを上
記抗原とすることもできる。また、上記抗原としては、
後述する方法により精製したラミニン５を得た場合に
は、この精製ラミニン５を用いることは勿論可能であ
り、さらにこの精製ラミニン５ンを２−メルカプトエタ
ノール等で還元してジスルフィド結合を切断して得られ
るサブユニットや、トリプシンやキモトリプシン等のペ
プチド切断剤で切断した精製ラミニン５の断片等をもポ
リクローナル抗体やモノクローナル抗体を製造する上で
の免疫抗原とすることができる。

【００１２】ラミニン５に特異的なポリクローナル抗体
は、例えば上記の工程に従って製造したラミニン５を免
疫抗原として免疫した動物に由来する免疫血清から製造
することができる。

【００１３】ここで使用される免疫抗原としてのラミニ
ン５は、特に限定されるものではなく、上記のごとく調
製されるラミニン５を用い得ることは勿論のこと、この
ラミニン５を２−メルカプトエタノール等で還元してジ
スルフィド結合を切断して得られるサブユニットやトリ
プシンやキモトリプシン等のペプチド切断剤で切断した
ラミニン５の断片等をもポリクローナル抗体を製造する
上での免疫抗原とすることができる。

【００１４】一方、モノクローナル抗体は、ポリクロー
ナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した動物の免疫細
胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、こ
れによりラミニン５を認識する抗体を産生するクローン
を選択し、このクローンを培養することにより製造する
ことができる。

【００１５】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。

【００１６】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹
腔内注射等で投与することにより行うことができる。よ
り具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュ
バントと併用して、免疫の対象とする動物に２〜１４日
毎に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製
造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のため
の免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができ
る。

【００１７】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００１８】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００１９】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００２０】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００２１】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００２２】このようにして得られるラミニン５を認識
する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さ
らに液体窒素中で長時間保存することもできる。

【００２３】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００２４】なお、インビトロで免疫細胞をラミニン５
又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞
融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイ
ブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリ
ーニングすることで所望するモノクローナル抗体を得る
こともできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53, 261
(1982)；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,1149(19
83））。

【００２５】また、上記で得られるポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精
製することができる。このようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、ラミニン５に特
異反応性を有する抗体である。

【００２６】現在報告されているラミニン５に特異的な
モノクローナル抗体としては、ＢＭ１６５（Rousselle
et al.,1991 ），Ｋ１４０（Sakai et al.,1986 ），Ｇ
Ｂ３（Marinkovich et al.,1993 ）等を挙げることがで
きる。また、ポリクローナル抗体としては、抗ラミニン
５ウサギ血清（Marinkovich et al.,1992 ）等を挙げる
ことができる。

【００２７】このようにして調製したモノクローナル抗
体やポリクローナル抗体をリガンドとして担体に結合さ
せて、所望するラミニン５を特異的に結合するアフィニ
ティクロマトグラフィーを調製することができる。この
ラミニン５特異的アフィニティクロマトグラフィーの調
製方法は、通常公知の方法を用いて調製することができ
る。

【００２８】すなわち、アガロース，セルロース，ポリ
アクリルアミド，磁気多孔性ガラスビーズ等の担体表面
に、上記のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
結合させることのできる手段を設けて、所望するラミニ
ン５特異的アフィニティクロマトグラフィーを調製する
ことができる。

【００２９】上記抗体を担体表面上に結合させることの
できる手段としては、例えば免疫グロブリンを特異的に
凝集させることが可能な免疫凝集素の担体粒子表面への
コーティング〔このコーティングは、担体粒子の表面
に、アミノプロピル基，臭化シアノ基，カルボキシル
基，長鎖アミノアルキル基，アミノアリル基，ヒドラジ
ド基等を導入したリンカーを導入して、これに所望する
免疫グロブリン凝集素（例えばプロテインＧ，プロテイ
ンＡ等）を接触させることにより行うことができる。〕
して、この凝集素を介して上記抗体を固定することを挙
げることができる。

【００３０】なお、上記抗体を担体表面上に固定する際
に、これらの凝集素を予めその表面にコーティングした
担体粒子の市販品を用いることも可能である。すなわち
例えば、UltraLink （商標）Protein Ａ，Ｇ，Ａ／Ｇシ
リーズ（フナコシ社製）等を用いることができる。

【００３１】また、上記のリンカーを導入後、これに直
接上記抗体を結合させて、所望するアフィニティクロマ
トグラフィーを調製することができる。なお、各種のリ
ンカーを予め導入した担体粒子が市販されており、これ
らの市販品に所望する凝集素をコーティングしたり、上
記抗体を固定することが可能である。

【００３２】さらに、架橋用試薬を用いて、担体粒子表
面の官能基と抗体凝集素や上記抗体における官能基を架
橋させることにより、スペーサーを導入した上記抗体を
固定したアフィニティクロマトグラフィーを調製するこ
とができる。

【００３３】このようにして調製した、ラミニン５を特
異的に結合するアフィニティクロマトグラフィーに、ラ
ミニン５を含む画分を接触させて、その画分中のラミニ
ン５を上記アフィニティークロマトグラフィーに選択的
に結合させて、これを溶出することにより製造すること
ができる。

【００３４】ラミニン５を含む画分は、その中にラミニ
ン５が含まれている限り特に限定されないが、可能な限
り多くのラミニン５が含まれているものを用いることが
好ましく、上記抗体の抗原として調製したものを用いる
ことも可能であり、また上記のラミニン５が存在する組
織の培養物を用いることも可能である。

【００３５】例えば、ヒトの包皮のケラチン細胞を通常
公知の方法〔Boyce et al.,J.Tiss.Cult.Meth.J.,9,83
(1985) 等〕に従って調製して、これを培養した培養培
地をプロテーアーゼ活性を最小にしたものを用いること
も可能である。

【００３６】このようにして調製したラミニン５を含む
画分を、上記のラミニン５を特異的に結合するアフィニ
ティクロマトグラフィーに、ラミニン５を含む画分を接
触させて、ラミニン５をこのクロマトグラフィーに特異
的に結合させる。そして、この結合物のみを溶出させ
て、所望する精製されたラミニン５を得ることができ
る。なお、画分中にラミニン５が存在するか否かは、２
８０nmの吸光度測定を行うことにより特定することがで
きる。

【００３７】なお、このようにして得たラミニン５を、
さらに還元処理を施すことにより、ラミニン５を構成す
るサブユニットを得ることができる。

【００３８】後述する皮膚外用剤中には、上記ラミニン
５のみならず、そのサブユニットを配合することも可能
である（以下、本明細書においては、特に断らない限り
ラミニン５及びこのラミニン５のサブユニットを「ラミ
ニン５」と総称する。）。

【００３９】また、さらに遺伝子工学的手法、例えばラ
ミニン５をコードする遺伝子を単離して、それを適切な
宿主に導入して、そのラミニン５をコードする遺伝子を
導入した宿主が産生する組換えラミニン５を後述する皮
膚外用剤中に配合することも可能である。

【００４０】Ｃ．本発明皮膚外用剤：本発明皮膚外用剤
は、上記のラミニン５を含んでなる皮膚外用剤であり、
このラミニン５を配合することにより、皮膚賦活効果，
保湿効果，肌荒れ改善効果及び美白効果が付与され、さ
らに頭皮に対しては養毛効果及び栄養作用が付与され
る。

【００４１】本発明皮膚外用剤におけるラミニン５の配
合量は、その具体的用途等に応じて適宜選択することが
可能であり、特に限定されず、少なくとも皮膚外用剤の
１０^-6重量％以上，０．１重量％以下という非常に広い
範囲で配合され得る。

【００４２】また、本発明皮膚外用剤中には、本発明の
所期の効果を損なわない範囲内で、必要に応じて皮膚外
用剤一般に用いられている薬剤や基剤成分等を配合する
ことができる。すなわち、紫外線吸収剤，保湿剤，ビタ
ミン類，ホルモン類，アミノ酸類，抗炎症剤，美白剤，
収斂剤，清涼剤，各種の動植物抽出物等の薬効成分を、
上記ラミニン５と共に本発明皮膚外用剤中に配合するこ
とができる。

【００４３】また、油脂，ロウ類，エステル油，炭化水
素油，シリコーン，界面活性剤，低級アルコール，ステ
ロール類，水溶性高分子，金属イオン封鎖剤，中和剤，
ｐＨ調整剤，酸化防止剤，抗菌剤，香料，色素，顔料等
の基剤成分等もラミニン５と共に本発明皮膚外用剤中に
配合することができる。

【００４４】本発明皮膚外用剤は、医薬品，医薬部外品
（軟膏剤，歯磨剤等）及び化粧品〔洗顔料、乳液、クリ
ーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク
等の基礎化粧品；ファンデーション、口紅等のメーキャ
ップ化粧品；口腔化粧品，芳香化粧品，毛髪化粧品，ボ
ディ化粧品等〕の形態に広く適用可能である。そして、
これらの形態に、本発明皮膚外用剤の採り得る形態が限
定されるものではない。

【００４５】また、剤型も水溶液系、可溶化系、乳化
系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、
水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を採
り得る。本発明皮膚外用剤の具体的処方については、後
述する実施例において記載する。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いて説明する。た
だし、本発明の技術的範囲がこの実施例によって限定的
に解釈されるべきものではない。なお、皮膚外用剤にお
ける配合量は、特に断らない限り皮膚外用剤における重
量％である。〔製造例〕ラミニン５の製造（１）モノクローナル抗体の調製ヒト胎盤の羊膜から精製したラミニン５（『Marinkovic
h et al., J.Biol. Chem. 17900-17906, 1992 』の記載
に従い製造した）を抗原とし、これをBalb/cマウスにフ
ロインド完全アジュバンドと１：１のエマルジョンとし
て感作し、フロインドの不完全アジュバンドとの１：１
のエマルジョンでブーストした。この感作を行った上記
マウスから免疫細胞を分離し、ＮＳ−１ミエローマ細胞
との細胞融合を行いハイブリドーマを作出した。

【００４７】作出したこれらのハイブリドーマから抗体
産生ハイブリドーマのスクリーニングは、ヒト包皮凍結
組織に対する間接蛍光抗体法を用い、真皮表皮ジャンク
ションの基底膜を染色する抗体産生ハイブリドーマを陽
性クローンと判定した。限界希釈法で抗体産生ハイブリ
ドーマをモノクローンになるようにクローニングした。
そして、モノクローンとなった抗体産生ハイブリドーマ
を大量に培養し、その培養上清からプロテインＧセファ
ロースを用いてＩｇＧ抗体を精製して、所望するラミニ
ン５に対するモノクローナル抗体を調製した。

【００４８】（２）モノクローナル抗体をリガンドとし
たアフィニティクロマトグラムの調製上記（１）で得たラミニン５に対するモノクローナル抗
体をＣＮＢｒ活性化セファロース（ファルマシア社製）
に、ファルマシア社のプロトコールに従って共有結合さ
せた。非結合ＩｇＧを除いた後に、ゲルをカラムに詰め
て、アフィニティカラムを調製した。

【００４９】（３）ラミニン５の製造ラミニン５は、培養ヒト表皮角化細胞又はヒト有棘細胞
癌由来細胞を牛胎児血清を培地重量の１０％の割合で含
むＤＭＥＭ培地を用いて培養した。定期的に培養上清を
回収し、これに各種タンパク質分解酵素の阻害剤を添加
し、冷却し、ラミニン５の分解を阻止した。この培養上
清を直接プレカラムであるゼラチンセファロースカラム
に通して共存するフィブロネクチンを除去し、次に直列
に結合させた前記（２）で調製したアフィニティカラム
に通してラミニン５を結合させた。アフィニティカラム
に結合しないタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗い流した。このアフィニティカラムに結合した
ラミニン５は、１Ｎ酢酸溶液等の溶出剤を用いて溶出
し、２８０nmの吸光度を指標としてタンパクピークを検
討し、ピーク周囲に溶出したタンパク質をＰＢＳで透析
した。得られたタンパク質を電気泳動法で解析し、その
純度を推定した。その結果、９５％以上の純度のラミニ
ン５が得られたことが判明した。以下の試験例及び実施
例におけるラミニン５は、この製造例で製造した精製ラ
ミニン５を用いた。

【００５０】皮膚細胞接着促進試験ラミニン５を配合した皮膚外用剤の皮膚賦活効果を示す
ために、次の皮膚細胞接着促進効果を、通常の培養シャ
ーレを用いた細胞培養系で試験した。ヒト皮膚より得た
表皮角化細胞を、ＫＧＭ（Keratinocyte grown medium
）培養液に牛脳下垂体エキスを含む培地で培養し、こ
の試験に必要な細胞を得た。

【００５１】ラミニン５を生理食塩水に溶解し、これを
細胞培養シャーレに注ぎ入れ、シャーレ表面をラミニン
５でコートした。細胞をトリプシンで分散させて単一細
胞とし、細胞培養シャーレに１×１０⁵個の細胞を接着
させた。３時間５％ＣＯ₂インキュベーター内で培養し
た後、シャーレに接着していない細胞を生理食塩液で洗
って除く。その後、シャーレに接着している細胞をトリ
プシンで分散し、細胞数を計測した。なお、牛血清アル
ブミンを含む生理食塩水溶液で、細胞培養シャーレをコ
ートしたものをコントロールとした。接着細胞数の多い
ものほど接着促進効果があるものとする。

【００５２】本試験を行った結果、コントロールにおけ
る接着細胞数は０．１８（×１０⁵）であったが、ラミ
ニン５においては０．７９（×１０⁵）であった。その
結果、ヒト表皮角化細胞の接着は、ラミニン５により著
しく促進され、ラミニン５の皮膚賦活効果の一側面が明
らかになった。

【００５３】皮膚細胞運動促進試験ラミニン５を配合した皮膚外用剤の皮膚賦活効果を示す
ために、次の皮膚細胞運動促進効果を、通常の培養シャ
ーレを用いた細胞培養系で試験した。ラミニン５を生理
食塩水に溶解し、これを細胞培養シャーレに注ぎ入れ、
シャーレ表面をラミニン５をコートした。細胞をトリプ
シンで分散させて単一細胞とし、細胞培養シャーレに１
×１０⁵個の細胞を接着させた。３時間５％ＣＯ₂イン
キュベーター内で培養した後、細胞の運動を顕微鏡下、
レーザービデオディスクレコーダーで記録した。１時間
当りに細胞が移動した距離をコンピューターで解析し
た。なお、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）を含むＰＢ
Ｓで細胞培養シャーレをコートしたものをコントロール
とした。移動距離の多いほど、細胞運動促進効果がある
ものとする。

【００５４】本試験を行った結果、コントロールにおけ
る細胞の移動距離は、３．４（μm／時間）であった
が、ラミニン５では２２．８（μm ／時間）であった。
その結果、ヒト表皮角化細胞の運動は、ラミニン５によ
り著しく促進され、ラミニン５の皮膚賦活効果の一側面
が明らかになった。

【００５５】創傷治癒試験ラミニン５を配合した皮膚外用剤の皮膚賦活効果を示す
ために、次の創傷治癒効果試験を行った。生後７０週齢
のウイスター系ラットを５匹１群として、毛刈り後、創
傷治癒効果試験に供した。ラットは、エーテル麻酔後、
正中線に沿って、約２cm背部皮膚を切開し、切開後直ち
に切開部をミッヘル縫合し、ラミニン５を１０μg ／ml
の濃度で含む生理食塩水を１日１回、０．１mlずつ１０
日間連続塗布した。１０日後、ラットをエーテル麻酔死
させ、縫合針を外し、断面断面１cmとなるように皮膚切
片を作製した。

【００５６】張力測定には、テンシロンＵＴＭ−４（東
洋側器株式会社製）を用い、創傷治癒面切断張力を測定
した。コントロールは、生理食塩溶液を塗布した皮膚切
片を用いた。張力が大きい程、切断面が治癒しているこ
とを示す。本試験を行った結果、コントロールにおける
平均張力は２９３（g ／cm）であったが、ラミニン５で
は４８５（g ／cm）であった。

【００５７】その結果、創傷治癒はラミニン５により著
しく促進され、ラミニン５の皮膚賦活効果の一側面が明
らかになった。上記３試験の結果より、ラミニン５が様
々な側面から皮膚賦活効果を有することが明らかにさ
れ、ラミニン５を配合した本発明皮膚外用剤には皮膚賦
活作用が付与されることが明らかになった。

【００５８】養毛試験Ｃ５７ＢＬマウス５匹を１群とし、マウスの腹部両側か
ら背部にかけて剃毛し、片側にラミニン５を１０μg ／
mlの濃度で含む生理食塩水を塗布し、もう一方にはラミ
ニン５を含まない生理食塩水を塗布した。２週間後に剃
毛部に生えてきた毛の長さを測定した。この数値が大き
い程、養毛効果に優れている。結果を第１表に示す。

【００５９】

【表１】

【００６０】次に、以下に示す処方の化粧水を調製し
て、これについて下記の美白効果試験，肌荒れ改善効果
試験，使用性・安全性試験を行った。

【００６１】〔実施例１〕化粧水配合量（重量％）ラミニン５０．０００１グリセリン３．０１，３−ブチレングリコール４．０エタノール８．０ポリオキシエチレンオレイルアルコール０．５メチルパラベン０．１クエン酸０．０１クエン酸ソーダ０．１香料０．０５精製水８４．２３９９

【００６２】＜製法＞精製水にクエン酸，クエン酸ソー
ダ，グリセリン，ラミニン５、１，３−ブチレングリコ
ールを溶解した。これとは別にエタノールにポリオキシ
エチレンオレイルアルコール，香料及びメチルパラベン
を溶解し、これを前記の水相成分に添加して可溶化し
て、さらに濾過して、所望する化粧水を得た。

【００６３】美白効果試験ラミニン５の美白効果を検討するために、実施例１で得
た化粧水をメラニン生成抑制効果を検討した。まず、実
施例１で得た化粧水を試料として用い、ラミニン５を配
合しないもの（精製水で置換）をブランクとして別に調
製し、それぞれにＬ−チロシン水溶液及びマックルヘイ
ン氏の緩衝液を有効成分とするリニメント剤を添加し、
１０分間恒温槽に入れた。

【００６４】これに、チロシナーゼ水溶液を添加して攪
拌し、分校光度計をセットして４７５nmにおける吸光度
を経時的に測定した。４７５nmの吸光度が上昇すること
は、Ｌ−チロシンが酸化され、メラニンの前駆体である
ドーパクロムが生成していることを示す。すなわち、ド
ーパクロムの生成量が少ないことは、メラニン生成抑制
効果があることを示す。

【００６５】実施例１の本発明皮膚外用剤である化粧水
における、本美白効果試験の結果を第１図に示す。第１
図において、本発明に関わる化粧水は、経時的にドーパ
クロムの生成量がブランクに比べると少なく、この化粧
水を用いることによりメラニンの生成が抑制されること
が判明した。すなわち、本発明皮膚外用剤に美白効果が
認められることが明らかになった。

【００６６】肌荒れ改善効果試験実施例１で得た、ラミニン５を含む化粧水とブランク
（ラミニン５を精製水で置換）を用いて、ヒトパネルで
肌荒れ改善効果試験を行った。すなわち、女性健常人パ
ネルの顔面の皮膚表面の形態をミリスン樹脂によるレプ
リカ法を用いて、肌のレプリカを採り、顕微鏡（１７
倍）で観察する。皮紋の状態及び角層の剥離状態から、
下記第２表に示す基準に基づいて、肌荒れ評価１，２と
判定された者（肌荒れパネル）３０名を用い、顔面左右
半々に、実施例１で得た化粧水とブランク化粧水を１日
１回、２週間塗布した。２週間後、再び上述のレプリカ
法で、肌の状態を観察し、下記第３表に示す判定基準に
従って評価した。

【００６７】

【表２】

【００６８】

【表３】

【００６９】使用性・安全性試験実施例１の化粧水とブランク（ラミニン５を精製水に置
換したもの）のそれぞれに対する使用感の官能テストを
行った。その結果を、第４表に示す。

【００７０】

【表４】

【００７１】＊：使用性試験は、２０人の女性パネルに
試料となる化粧料を使用させ、この女性パネルの８０％
が「しっとりしている」と評価した場合のみ、第４表に
おける「しっとりしている」という評価を与えた。な
お、同パネルの４０％〜８０％未満が「しっとりとして
いる」と評価した場合は「ふつう」で、それよりも「し
っとりしている」という評価が少ない場合には「劣る」
と判定した。＊＊：連用試験は、上記の女性パネルに１か月感連用試
験をした結果である。＊＊＊：動物皮膚刺激テストは、ＦＤＡＤｒａｉｚｅ
の方法に従って行った。

【００７２】また、下記の処方において調製した本発明
皮膚外用剤（クリーム：実施例２，乳液：実施例３）に
おいて、上記実施例１と同様に美白効果試験，肌荒れ改
善効果試験及び使用性・安全性試験を行った。その結
果、実施例２及び実施例３共、美白効果試験において
はドーパクロムの経時的生成抑制作用が認めらることに
よる美白効果が認められ、実施例２及び実施例３共、
レプリカ評点が４又は５に殆ど分布して、顕著な肌荒れ
改善効果が認められ、実施例２及び実施例３共、しっ
とりとした使用感を伴い、安全性テストも全ての評価項
目で「問題なし」又は「安全」であった（実施例４及び
実施例５のヘアトニックもこの安全性試験においては
「問題なし」又は「安全」という評価が全項目において
得られた。）。また、実施例４及び実施例５のヘアトニ
ックについて、上記と同様の養毛効果試験を行ったとこ
ろ、いずれの実施例のヘアトニックもコントロールに比
べると有意に養毛効果が認められた。なお、後述する実
施例４までの皮膚外用剤は、すべて常法で調製した。

【００７３】〔実施例２〕クリーム配合量（重量％）ラミニン５０．０００１１，３−ブチレングリコール５．０セチルアルコール４．０還元ラノリン５．０スクワラン３．５ステアリン酸グリセライド２．０ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸エステル２．０メチルパラベン０．１エチルパラベン０．１５ミツロウ５．０香料適量精製水残余

【００７４】〔実施例３〕乳液配合量（重量％）ラミニン５０．０１ステアリン酸１．５セチルアルコール０．５ポリオキシエチレン（１０モル）モノオレイン酸エステル１．０グリセリンモノアステアリン酸エステル１．０クインスシード抽出液２０．０プロピレングリコール５．０エタノール３．０エチルパラベン０．３ミツロウ２．０香料適量精製水残余

【００７５】〔実施例４〕ヘアトニック配合量（重量％）ラミニン５０．０００１センブリエキス０．５サリチル酸０．３エチニルエストラジオール０．０００５エタノール４０．０香料適量色素適量精製水残余

【００７６】〔実施例５〕ヘアトニック配合量（重量％）ラミニン５０．００１グリチルリチン酸０．１レゾルシン０．８ニコチン酸ベンジル０．５Ｌ−メントール０．１エタノール７０．０香料適量色素適量精製水残余

【００７７】

【発明の効果】本発明により、ホルモン類を有効成分と
する皮膚外用剤に伴いがちな副作用を伴わないで、かつ
皮膚の賦活効果等の代謝促進性に優れる成分を見出し、
これを用いた皮膚や毛髪を若々しく保つ手段が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】メラニンの前駆体であるドーパクロムが生成量
を指標とした美白効果試験の結果を示した図面。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＡＣ０７Ｋ 14/47 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラミニン５を有効成分として配合した皮膚
外用剤。