JPH0994092A - ヒト羊膜細胞及びそれから成る遺伝子治療用細胞 - Google Patents
ヒト羊膜細胞及びそれから成る遺伝子治療用細胞Info
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- JPH0994092A JPH0994092A JP8214095A JP21409596A JPH0994092A JP H0994092 A JPH0994092 A JP H0994092A JP 8214095 A JP8214095 A JP 8214095A JP 21409596 A JP21409596 A JP 21409596A JP H0994092 A JPH0994092 A JP H0994092A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来から知られている骨髄細胞やリンパ球と
は異なる、遺伝子治療のドラッグ・デリバリー・システ
ムとして用いることができる新規な遺伝子導入細胞であ
って、他人に移植した場合でも拒絶反応をほとんど起こ
さないものを提供すること。 【構成】 発現させたい所望の遺伝子が導入され、該遺
伝子がコードする産物を発現するヒト羊膜細胞及び該羊
膜細胞から成る遺伝子治療用細胞を提供した。
は異なる、遺伝子治療のドラッグ・デリバリー・システ
ムとして用いることができる新規な遺伝子導入細胞であ
って、他人に移植した場合でも拒絶反応をほとんど起こ
さないものを提供すること。 【構成】 発現させたい所望の遺伝子が導入され、該遺
伝子がコードする産物を発現するヒト羊膜細胞及び該羊
膜細胞から成る遺伝子治療用細胞を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子治療に用いるこ
とができる遺伝子導入ヒト羊膜細胞に関する。
とができる遺伝子導入ヒト羊膜細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】外来遺伝子を患者に導入することにより
遺伝病を治療する、従来の遺伝子治療法の主なものとし
て、細胞をドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）
として使う治療法がある。この遺伝子治療の例として
は、アデノシン・デアミネース欠損症やプリンヌクレオ
チド・ホスホリラーゼ欠損症等の遺伝病の治療のため
に、これらの酵素の遺伝子をレトロウイルスベクターに
組み込み、この組換えベクターを用いて患者から採取し
た骨髄細胞を形質転換し、形質転換骨髄細胞を患者に自
家移植することが行われている。この方法では、移植に
よる拒絶反応を防止するために、患者自身の骨髄細胞を
用いており、また、形質転換細胞も骨髄に移植する必要
があることから、患者の負担が大きい。また、患者のリ
ンパ球に外来遺伝子を導入して患者に戻すことも知られ
ているが、反復治療が必要であり、この方法で治療可能
な遺伝病は限定される。
遺伝病を治療する、従来の遺伝子治療法の主なものとし
て、細胞をドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）
として使う治療法がある。この遺伝子治療の例として
は、アデノシン・デアミネース欠損症やプリンヌクレオ
チド・ホスホリラーゼ欠損症等の遺伝病の治療のため
に、これらの酵素の遺伝子をレトロウイルスベクターに
組み込み、この組換えベクターを用いて患者から採取し
た骨髄細胞を形質転換し、形質転換骨髄細胞を患者に自
家移植することが行われている。この方法では、移植に
よる拒絶反応を防止するために、患者自身の骨髄細胞を
用いており、また、形質転換細胞も骨髄に移植する必要
があることから、患者の負担が大きい。また、患者のリ
ンパ球に外来遺伝子を導入して患者に戻すことも知られ
ているが、反復治療が必要であり、この方法で治療可能
な遺伝病は限定される。
【０００３】一方、羊膜細胞は、その表面にＨＬＡ−
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤＲ抗原並びにβ2 ミクログロブリンを
発現せず、また、リソゾーム酵素を大量に産生するの
で、羊膜細胞を用いて遺伝病であるリソゾーム蓄積疾患
（lysosomal storage diseases)の治療性が示唆されて
いた（Adinolfi, M et al., Nature 295:325-327, 198
2)。このように、羊膜細胞を遺伝子治療におけるＤＤＳ
として用いることも公知である。そしてムコ多糖症、リ
ピドーシスなどの遺伝性代謝病に羊膜組織移植術が施行
され、一部の患者に有効性が認められている（Tyiki-Sz
ymanska A et al.,J Inher Metab Dis 8:101-104, 198
5; Sakuragawa N et al., Brain & Dev 14:7-11, 199
2)。臨床的にも、これらの患者からは拒絶反応は報告さ
れていない。しかしながら、この術式は、羊膜細胞が本
来的に産生する酵素のＤＤＳとして羊膜細胞を利用する
ことであり、羊膜細胞に外来遺伝子を導入して発現させ
ることは示唆されていないし、また、実際に遺伝子導入
された羊膜細胞は報告されていない。また羊膜細胞の免
疫発現性については、その後詳細に検討されていない。
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤＲ抗原並びにβ2 ミクログロブリンを
発現せず、また、リソゾーム酵素を大量に産生するの
で、羊膜細胞を用いて遺伝病であるリソゾーム蓄積疾患
（lysosomal storage diseases)の治療性が示唆されて
いた（Adinolfi, M et al., Nature 295:325-327, 198
2)。このように、羊膜細胞を遺伝子治療におけるＤＤＳ
として用いることも公知である。そしてムコ多糖症、リ
ピドーシスなどの遺伝性代謝病に羊膜組織移植術が施行
され、一部の患者に有効性が認められている（Tyiki-Sz
ymanska A et al.,J Inher Metab Dis 8:101-104, 198
5; Sakuragawa N et al., Brain & Dev 14:7-11, 199
2)。臨床的にも、これらの患者からは拒絶反応は報告さ
れていない。しかしながら、この術式は、羊膜細胞が本
来的に産生する酵素のＤＤＳとして羊膜細胞を利用する
ことであり、羊膜細胞に外来遺伝子を導入して発現させ
ることは示唆されていないし、また、実際に遺伝子導入
された羊膜細胞は報告されていない。また羊膜細胞の免
疫発現性については、その後詳細に検討されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子治療においてＤ
ＤＳとして利用可能な細胞の種類が増えれば、遺伝子治
療により治療可能な遺伝病の幅が広がるので有利であ
る。また、他人に移植した場合でも拒絶反応が起きなけ
れば、移植細胞を患者から調製する必要がなく、患者の
負担が減るだけでなく、予め作製した細胞を治療に用い
ることができるので迅速かつ効果的に遺伝子治療を行う
ことができる。従って、本発明の目的は、従来から知ら
れている骨髄細胞やリンパ球とは異なる、遺伝子治療の
ＤＤＳとして用いることができる新規な遺伝子導入細胞
であって、他人に移植した場合でも拒絶反応をほとんど
起こさないものを提供することである。
ＤＳとして利用可能な細胞の種類が増えれば、遺伝子治
療により治療可能な遺伝病の幅が広がるので有利であ
る。また、他人に移植した場合でも拒絶反応が起きなけ
れば、移植細胞を患者から調製する必要がなく、患者の
負担が減るだけでなく、予め作製した細胞を治療に用い
ることができるので迅速かつ効果的に遺伝子治療を行う
ことができる。従って、本発明の目的は、従来から知ら
れている骨髄細胞やリンパ球とは異なる、遺伝子治療の
ＤＤＳとして用いることができる新規な遺伝子導入細胞
であって、他人に移植した場合でも拒絶反応をほとんど
起こさないものを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、羊膜細胞が、移植時の拒絶反応において最も
重要な役割を果たすＨＬＡ−class II抗原を発現せず、
また、ＨＬＡ−classI 抗原の発現も僅かであることを
見出し、かつ、羊膜細胞に外来遺伝子を導入することに
初めて成功し、本発明を完成した。
究の結果、羊膜細胞が、移植時の拒絶反応において最も
重要な役割を果たすＨＬＡ−class II抗原を発現せず、
また、ＨＬＡ−classI 抗原の発現も僅かであることを
見出し、かつ、羊膜細胞に外来遺伝子を導入することに
初めて成功し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、発現させたい所望の
遺伝子が導入され、該遺伝子がコードする産物を発現す
るヒト羊膜細胞を提供する。また、本発明は、ある遺伝
子の産物が欠損、不足又は異常である遺伝病の治療のた
めの細胞であって、正常な該遺伝子が導入され、該遺伝
子がコードする産物を発現するヒト羊膜細胞から成る遺
伝子治療用細胞を提供する。
遺伝子が導入され、該遺伝子がコードする産物を発現す
るヒト羊膜細胞を提供する。また、本発明は、ある遺伝
子の産物が欠損、不足又は異常である遺伝病の治療のた
めの細胞であって、正常な該遺伝子が導入され、該遺伝
子がコードする産物を発現するヒト羊膜細胞から成る遺
伝子治療用細胞を提供する。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】下記参考例に具体的に示されるように、本
願発明者らは、ヒト羊膜細胞の表面上には、ＨＬＡ−cl
ass II抗原が全く存在せず、また、ＨＬＡ−class Ｉ抗
原の量もごく僅かであることを見出した。ＨＬＡ−clas
s II抗原は、移植時の拒絶反応において最も重要な免疫
原である。これが全く発現していないということは、移
植片として非常に有利なことであり、他人の組織であっ
ても移植可能なことが示唆される。
願発明者らは、ヒト羊膜細胞の表面上には、ＨＬＡ−cl
ass II抗原が全く存在せず、また、ＨＬＡ−class Ｉ抗
原の量もごく僅かであることを見出した。ＨＬＡ−clas
s II抗原は、移植時の拒絶反応において最も重要な免疫
原である。これが全く発現していないということは、移
植片として非常に有利なことであり、他人の組織であっ
ても移植可能なことが示唆される。
【０００９】さらに、単球、フィブロブラスト及び内皮
細胞を包含する種々のタイプの細胞において、γ−イン
ターフェロンによりclass I 及びclass II抗原の発現が
誘起されることがよく知られている。γ−インターフェ
ロンはＴリンパ球により産生されるので、移植部分に侵
入したＴ細胞が産生するγ−インターフェロンにより、
class I 及びclass II抗原が誘起され、局所的な炎症反
応が起きる虞がある。そこで、下記参考例に示すよう
に、ヒト羊膜細胞について、γ−インターフェロンと共
培養して調べたところ、ヒト羊膜細胞の表面にはγ−イ
ンターフェロンによりclass I 及びclass II抗原のいず
れも全く誘起されないことを見出した。これにより、ヒ
ト羊膜細胞を移植しても、局所的な炎症は起きないもの
と考えられる。
細胞を包含する種々のタイプの細胞において、γ−イン
ターフェロンによりclass I 及びclass II抗原の発現が
誘起されることがよく知られている。γ−インターフェ
ロンはＴリンパ球により産生されるので、移植部分に侵
入したＴ細胞が産生するγ−インターフェロンにより、
class I 及びclass II抗原が誘起され、局所的な炎症反
応が起きる虞がある。そこで、下記参考例に示すよう
に、ヒト羊膜細胞について、γ−インターフェロンと共
培養して調べたところ、ヒト羊膜細胞の表面にはγ−イ
ンターフェロンによりclass I 及びclass II抗原のいず
れも全く誘起されないことを見出した。これにより、ヒ
ト羊膜細胞を移植しても、局所的な炎症は起きないもの
と考えられる。
【００１０】以上のように、ヒト羊膜細胞は、移植時の
拒絶反応において最も重要なＨＬＡ−class II抗原を全
く発現せず、class I 抗原の発現も僅かであり、また、
これらの抗原は、γ−インターフェロンによっても誘起
されないから、移植するのに理想的であり、他人への移
植も可能であると考えられる。
拒絶反応において最も重要なＨＬＡ−class II抗原を全
く発現せず、class I 抗原の発現も僅かであり、また、
これらの抗原は、γ−インターフェロンによっても誘起
されないから、移植するのに理想的であり、他人への移
植も可能であると考えられる。
【００１１】本発明のヒト羊膜細胞は、発現させたい所
望の遺伝子が導入され、該遺伝子がコードする産物を発
現するものである。ヒト羊膜細胞は、下記実施例に具体
的に記載するように、ＳＶ４０由来のベクター及びアデ
ノウイルス由来ベクターを用いて遺伝子導入することが
できることを見出した。これらのベクターは市販（また
は供与）されているので、それらのマルチクローニング
部位に常法により所望の遺伝子を挿入し、得られた組換
えベクターでヒト羊膜細胞に遺伝子導入し、所望の遺伝
子産物を産生するクローンを選択することにより本発明
の遺伝子導入細胞を得ることができる。ベクターとして
は、アデノウイルス由来ベクターが特に好ましく、下記
実施例に示されるように、培養ヒト羊膜細胞については
遺伝子導入効率がほぼ１００％という、驚異的な結果が
得られた。なお、遺伝子導入方法は、例えば市販のエレ
クトロポレーション装置を用いて、常法であるエレクト
ロポレーションにより行うことができる。
望の遺伝子が導入され、該遺伝子がコードする産物を発
現するものである。ヒト羊膜細胞は、下記実施例に具体
的に記載するように、ＳＶ４０由来のベクター及びアデ
ノウイルス由来ベクターを用いて遺伝子導入することが
できることを見出した。これらのベクターは市販（また
は供与）されているので、それらのマルチクローニング
部位に常法により所望の遺伝子を挿入し、得られた組換
えベクターでヒト羊膜細胞に遺伝子導入し、所望の遺伝
子産物を産生するクローンを選択することにより本発明
の遺伝子導入細胞を得ることができる。ベクターとして
は、アデノウイルス由来ベクターが特に好ましく、下記
実施例に示されるように、培養ヒト羊膜細胞については
遺伝子導入効率がほぼ１００％という、驚異的な結果が
得られた。なお、遺伝子導入方法は、例えば市販のエレ
クトロポレーション装置を用いて、常法であるエレクト
ロポレーションにより行うことができる。
【００１２】本発明の遺伝子導入細胞は、遺伝子治療の
ためのＤＤＳとして用いることができる。すなわち、あ
る遺伝子の産物が欠損、不足又は異常である遺伝病を治
療するために、上記ベクターで正常な該遺伝子を挿入し
たヒト羊膜細胞を患者に移植することにより、移植され
た遺伝子導入ヒト羊膜細胞により産生された遺伝子産物
が患者の体内に供給され、患者の遺伝病の症状が治癒又
は緩和される。本発明の遺伝子治療用細胞により治療可
能な遺伝病は、外来遺伝子の発現により治療可能なあら
ゆる遺伝病であり、好ましい例として、プロリダーゼ欠
損症、糖原病及びムコ多糖症等の遺伝病を挙げることが
できる。
ためのＤＤＳとして用いることができる。すなわち、あ
る遺伝子の産物が欠損、不足又は異常である遺伝病を治
療するために、上記ベクターで正常な該遺伝子を挿入し
たヒト羊膜細胞を患者に移植することにより、移植され
た遺伝子導入ヒト羊膜細胞により産生された遺伝子産物
が患者の体内に供給され、患者の遺伝病の症状が治癒又
は緩和される。本発明の遺伝子治療用細胞により治療可
能な遺伝病は、外来遺伝子の発現により治療可能なあら
ゆる遺伝病であり、好ましい例として、プロリダーゼ欠
損症、糖原病及びムコ多糖症等の遺伝病を挙げることが
できる。
【００１３】本発明の遺伝子治療用細胞を用いた遺伝子
治療は、本発明の細胞を患者の皮下に移植することによ
り行うことができる。移植する部位としては、特に限定
されないが、腹筋鞘下又は腹部皮下等が好ましい。ま
た、移植する細胞の数は、患者の症状や、本発明の細胞
の目的遺伝子産物の産生能に基づき適宜決定されるが、
通常、１０9 〜１０10個程度である。あるいは、所望の
遺伝子産物が透過できる大きさの孔を有する合成樹脂製
の膜で細胞被覆し、これを皮下に埋め込むこともできる
（Experimental Neurology 113, 322-329 (1991)) 。
治療は、本発明の細胞を患者の皮下に移植することによ
り行うことができる。移植する部位としては、特に限定
されないが、腹筋鞘下又は腹部皮下等が好ましい。ま
た、移植する細胞の数は、患者の症状や、本発明の細胞
の目的遺伝子産物の産生能に基づき適宜決定されるが、
通常、１０9 〜１０10個程度である。あるいは、所望の
遺伝子産物が透過できる大きさの孔を有する合成樹脂製
の膜で細胞被覆し、これを皮下に埋め込むこともできる
（Experimental Neurology 113, 322-329 (1991)) 。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１５】参考例 ヒト羊膜細胞の調製及び特徴づけ 帝王切開により得られた胎盤から、羊膜上皮層を公知の
方法（Akle et al., Lancet II: 1003-1005, 1981)によ
り調製した。分離した羊膜を数個の断片に切り、トリプ
シン（トリプシン濃度：０．１２５％）で１５分間処理
して細胞を分離した。細胞を遠心分離により集め、１０
％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％
ＣＯ2 を含む空気雰囲気下、３７℃で培養した。８０ｃ
ｍ2 の組織培養フラスコを用い、コンフルエントに近く
なった細胞を実験に用いた。
方法（Akle et al., Lancet II: 1003-1005, 1981)によ
り調製した。分離した羊膜を数個の断片に切り、トリプ
シン（トリプシン濃度：０．１２５％）で１５分間処理
して細胞を分離した。細胞を遠心分離により集め、１０
％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％
ＣＯ2 を含む空気雰囲気下、３７℃で培養した。８０ｃ
ｍ2 の組織培養フラスコを用い、コンフルエントに近く
なった細胞を実験に用いた。
【００１６】得られたヒト羊膜細胞の抗原性を調べるた
めのマウスモノクローナル抗体として、抗ヒトＨＬＡcl
ass I 抗原モノクローナル抗体（デンマーク、ＤＡＫＯ
Ａ／Ｓ社製、クローンＷ６／３２）及び抗ヒトＨＬＡ
−ＤＲ class II 抗原α鎖モノクローナル抗体（ＤＡＫ
Ｏ社製、クローンTAL.1B5)を用いた。さらに、酵素標識
抗体法を行うために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）−標識ヤギF(ab')2 抗マウスIg's(G+L) 抗
体（米国カリフォルニア州TAGO社製）を用いた。フロー
サイトメトリーにおいてclass I 抗原及びclass II抗原
を検出するために、抗ヒトＨＬＡclass I 抗原モノクロ
ーナル抗体（上述）及び抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクロー
ナル抗体（ＤＡＫＯ社製、クローンＣＲ３／４３）並び
にフルオレッセイン結合抗マウス免疫グロブリンＦ（ａ
ｂ）2 分画（オーストラリア国、ホーソーンビクトリ
ア、Silenus Lab.社製）を用いた。
めのマウスモノクローナル抗体として、抗ヒトＨＬＡcl
ass I 抗原モノクローナル抗体（デンマーク、ＤＡＫＯ
Ａ／Ｓ社製、クローンＷ６／３２）及び抗ヒトＨＬＡ
−ＤＲ class II 抗原α鎖モノクローナル抗体（ＤＡＫ
Ｏ社製、クローンTAL.1B5)を用いた。さらに、酵素標識
抗体法を行うために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）−標識ヤギF(ab')2 抗マウスIg's(G+L) 抗
体（米国カリフォルニア州TAGO社製）を用いた。フロー
サイトメトリーにおいてclass I 抗原及びclass II抗原
を検出するために、抗ヒトＨＬＡclass I 抗原モノクロ
ーナル抗体（上述）及び抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクロー
ナル抗体（ＤＡＫＯ社製、クローンＣＲ３／４３）並び
にフルオレッセイン結合抗マウス免疫グロブリンＦ（ａ
ｂ）2 分画（オーストラリア国、ホーソーンビクトリ
ア、Silenus Lab.社製）を用いた。
【００１７】フローサイトメトリーは次のように行っ
た。すなわち、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により、８０
ｃｍ2 の組織培養フラスコから、コンフルーエントに近
くなったヒト羊膜細胞を採取し、冷ＰＢＳで洗浄した。
次いで細胞を一次抗体と３０分間４℃でインキュベート
し、次いでＦＩＴＣ−結合二次抗体と共に４℃で３０分
間再懸濁した。次いで細胞を直ちにフローサイトメータ
ー（ＦＣＭ−１Ｄ、東京、ジャスコ社製）にかけた。
た。すなわち、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により、８０
ｃｍ2 の組織培養フラスコから、コンフルーエントに近
くなったヒト羊膜細胞を採取し、冷ＰＢＳで洗浄した。
次いで細胞を一次抗体と３０分間４℃でインキュベート
し、次いでＦＩＴＣ−結合二次抗体と共に４℃で３０分
間再懸濁した。次いで細胞を直ちにフローサイトメータ
ー（ＦＣＭ−１Ｄ、東京、ジャスコ社製）にかけた。
【００１８】また、class I 及びclass II抗原の誘起に
ついてのγ−インターフェロンの効果を調べるために、
上記のように調製したヒト羊膜細胞をγ−インターフェ
ロン（ＡＢ型のヒト血清１０％を含む１００Ｕ／ｍｌ、
米国シグマ社製）と３７℃で３日間処理し、上記と同様
にフローサイトメトリーにかけた。
ついてのγ−インターフェロンの効果を調べるために、
上記のように調製したヒト羊膜細胞をγ−インターフェ
ロン（ＡＢ型のヒト血清１０％を含む１００Ｕ／ｍｌ、
米国シグマ社製）と３７℃で３日間処理し、上記と同様
にフローサイトメトリーにかけた。
【００１９】フローサイトメトリーの結果を図１に示
す。図１中、横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。な
お、図１Ｂは１０％ヒト血清と３日間培養したものにつ
いての結果を示す。図１Ａに示されるように、非特異的
マウスＩｇＧ１抗体で染色した細胞との比較から、ヒト
羊膜細胞はclass II抗原を全く発現していないことがわ
かる。また、対照として用いたリンパ球（図示せず）よ
りも蛍光強度が低いことからclass I 抗原は僅かに発現
されていることがわかる。また、γ−インターフェロン
処理により、class I 抗原及びclass II抗原とも、その
発現が誘起されないことがわかった（図１Ｃ）。
す。図１中、横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。な
お、図１Ｂは１０％ヒト血清と３日間培養したものにつ
いての結果を示す。図１Ａに示されるように、非特異的
マウスＩｇＧ１抗体で染色した細胞との比較から、ヒト
羊膜細胞はclass II抗原を全く発現していないことがわ
かる。また、対照として用いたリンパ球（図示せず）よ
りも蛍光強度が低いことからclass I 抗原は僅かに発現
されていることがわかる。また、γ−インターフェロン
処理により、class I 抗原及びclass II抗原とも、その
発現が誘起されないことがわかった（図１Ｃ）。
【００２０】一方、プレパラート上の羊膜上皮細胞標本
を抗class I 又は抗class II一次抗体と共に３７℃で１
時間インキュベートした。次いでこれらをＨＲＰＯ結合
抗体と３７℃で１時間インキュベートし、ジアミノベン
ジジンと室温で５分間反応させることにより発色させ
た。その結果、抗class IIモノクローナル抗体を用いた
場合には全く染色されず、抗class I モノクローナル抗
体を用いた場合には極めて僅かに染色された。
を抗class I 又は抗class II一次抗体と共に３７℃で１
時間インキュベートした。次いでこれらをＨＲＰＯ結合
抗体と３７℃で１時間インキュベートし、ジアミノベン
ジジンと室温で５分間反応させることにより発色させ
た。その結果、抗class IIモノクローナル抗体を用いた
場合には全く染色されず、抗class I モノクローナル抗
体を用いた場合には極めて僅かに染色された。
【００２１】実施例１ ＳＶ４０系ベクターを用いたヒ
ト羊膜細胞への遺伝子導入 β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子（ｌａｃＺ）を有し、
ＳＶ４０のプロモーター及びエンハンサーを有する市販
のベクターであるｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクタ
ー（米国ウィスコンシン州、Promega Corp.)を、清澄ラ
イセート変法（Sakuragawa et al., Cell Transplantat
ion 4: 343-346, 1990) により調製した。なお、ｐＳＶ
−β−ガラクトシダーゼベクターの遺伝子地図を図２に
示す。市販のエレクトロポレーション装置（GENE PULSE
R、米国カリフォルニア州、Bio Rad Lab.社製）を用いた
エレクトロポレーション法により、２０μｇのｐＳＶ−
β−ガラクトシダーゼベクターで４ｘ１０6 個のヒト羊
膜細胞をトランスフェクトし、次いで、細胞を６０ｍｍ
のディッシュに接種した。３７℃で４８時間インキュベ
ート後、細胞を固定し、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β，Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）で染
色して評価した。その結果、６０ｍｍのディッシュ１枚
当たり２、３個の細胞がβ−ガラクトシダーゼ活性を有
していた。これにより、ＳＶ４０系ベクターによってヒ
ト羊膜細胞が遺伝子導入可能であることが示された。
ト羊膜細胞への遺伝子導入 β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子（ｌａｃＺ）を有し、
ＳＶ４０のプロモーター及びエンハンサーを有する市販
のベクターであるｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクタ
ー（米国ウィスコンシン州、Promega Corp.)を、清澄ラ
イセート変法（Sakuragawa et al., Cell Transplantat
ion 4: 343-346, 1990) により調製した。なお、ｐＳＶ
−β−ガラクトシダーゼベクターの遺伝子地図を図２に
示す。市販のエレクトロポレーション装置（GENE PULSE
R、米国カリフォルニア州、Bio Rad Lab.社製）を用いた
エレクトロポレーション法により、２０μｇのｐＳＶ−
β−ガラクトシダーゼベクターで４ｘ１０6 個のヒト羊
膜細胞をトランスフェクトし、次いで、細胞を６０ｍｍ
のディッシュに接種した。３７℃で４８時間インキュベ
ート後、細胞を固定し、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β，Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）で染
色して評価した。その結果、６０ｍｍのディッシュ１枚
当たり２、３個の細胞がβ−ガラクトシダーゼ活性を有
していた。これにより、ＳＶ４０系ベクターによってヒ
ト羊膜細胞が遺伝子導入可能であることが示された。
【００２２】実施例２ アデノウイルス系ベクターを用
いたヒト羊膜細胞の遺伝子導入 アデノウイルスベクターであるｐＡＤＥＸ１ＣＡ（「実
験医学」Vol. 12 No.15（増刊）1994、 pp.34-39、東京
大学医科学研究所、遺伝子解析施設、斉藤 泉博士より
入手可能）のマルチクローニング部位にｌａｃＺ遺伝子
を組み込み、ｐＡＤＥＸ１ＣＡ−ＬＡＣＺを調製したも
のを供与された（東京大学医科学研究所、遺伝子解析施
設、斉藤 泉博士より）。なお、この組換えベクターの
遺伝子地図を図３に示す。この組換えベクターを、実施
例１と同様にしてｍｏｉ２０でトランスフェクトし、Ｘ
−ｇａｌを用いてｌａｃＺの発現を調べた。その結果、
ほぼ１００％の細胞がｌａｃＺを発現していた。このこ
とから、ヒト羊膜細胞は、アデノウイルスベクターによ
り驚異的な効率で遺伝子導入されることがわかった。
いたヒト羊膜細胞の遺伝子導入 アデノウイルスベクターであるｐＡＤＥＸ１ＣＡ（「実
験医学」Vol. 12 No.15（増刊）1994、 pp.34-39、東京
大学医科学研究所、遺伝子解析施設、斉藤 泉博士より
入手可能）のマルチクローニング部位にｌａｃＺ遺伝子
を組み込み、ｐＡＤＥＸ１ＣＡ−ＬＡＣＺを調製したも
のを供与された（東京大学医科学研究所、遺伝子解析施
設、斉藤 泉博士より）。なお、この組換えベクターの
遺伝子地図を図３に示す。この組換えベクターを、実施
例１と同様にしてｍｏｉ２０でトランスフェクトし、Ｘ
−ｇａｌを用いてｌａｃＺの発現を調べた。その結果、
ほぼ１００％の細胞がｌａｃＺを発現していた。このこ
とから、ヒト羊膜細胞は、アデノウイルスベクターによ
り驚異的な効率で遺伝子導入されることがわかった。
【００２３】実施例３ 遺伝子導入ヒト羊膜細胞の移植 実施例２で作製した、ｌａｃＺ遺伝子を導入したヒト羊
膜細胞１０6 個をラットの脳線条体に定位脳手術的に移
植した。１週間後に屠殺して、移植部位の還流固定標本
を常法により作製し、免疫組織化学的に検討した。すな
わち、ｌａｃＺ遺伝子を同定するため、Ｘ−ｇａｌ染色
を施行したところ、脳移植部位に青染する細胞が確認さ
れた。
膜細胞１０6 個をラットの脳線条体に定位脳手術的に移
植した。１週間後に屠殺して、移植部位の還流固定標本
を常法により作製し、免疫組織化学的に検討した。すな
わち、ｌａｃＺ遺伝子を同定するため、Ｘ−ｇａｌ染色
を施行したところ、脳移植部位に青染する細胞が確認さ
れた。
【００２４】青染する生細胞が確認されたことにより、
ヒト羊膜細胞が移植後生着すること及び生着したヒト羊
膜細胞が外来遺伝子を発現することが確認された。すな
わち、本発明の細胞による移植療法が可能であることが
明らかになった。
ヒト羊膜細胞が移植後生着すること及び生着したヒト羊
膜細胞が外来遺伝子を発現することが確認された。すな
わち、本発明の細胞による移植療法が可能であることが
明らかになった。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、遺伝子治療に有用な新規
な遺伝子導入細胞が提供された。本発明により、外来遺
伝子の発現を目的として遺伝子治療におけるＤＤＳとし
て従来用いられていないヒト羊膜細胞が利用可能である
ことが明らかになったので、遺伝子治療可能な遺伝病の
幅が広がる。また、本発明の細胞は他人に移植した場合
でも拒絶反応や局所的炎症を起こさないと考えられるの
で、他人への移植が可能である。従って、細胞を患者自
身から調製する必要がなく、組織培養細胞を用いること
ができるので患者の負担も少なく、また、予め作製して
ある遺伝子導入細胞を治療に用いることができるから治
療を迅速かつ効果的に行うことができる。従って、本発
明は、遺伝子治療に大いに貢献するものと期待される。
な遺伝子導入細胞が提供された。本発明により、外来遺
伝子の発現を目的として遺伝子治療におけるＤＤＳとし
て従来用いられていないヒト羊膜細胞が利用可能である
ことが明らかになったので、遺伝子治療可能な遺伝病の
幅が広がる。また、本発明の細胞は他人に移植した場合
でも拒絶反応や局所的炎症を起こさないと考えられるの
で、他人への移植が可能である。従って、細胞を患者自
身から調製する必要がなく、組織培養細胞を用いること
ができるので患者の負担も少なく、また、予め作製して
ある遺伝子導入細胞を治療に用いることができるから治
療を迅速かつ効果的に行うことができる。従って、本発
明は、遺伝子治療に大いに貢献するものと期待される。
【図１】本発明の細胞又はγ−インターフェロン処理し
た本発明の細胞を抗class I 抗体又は抗class II抗体で
染色したもののフローサイトメトリーの結果を示す図で
ある。
た本発明の細胞を抗class I 抗体又は抗class II抗体で
染色したもののフローサイトメトリーの結果を示す図で
ある。
【図２】ヒト羊膜細胞への遺伝子導入に用いた組換えベ
クターであるｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクターの
遺伝子地図である。
クターであるｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクターの
遺伝子地図である。
【図３】ヒト羊膜細胞への遺伝子導入に用いた組換えベ
クターであるｐＡＤＥＸ１ＣＡ−ＬＡＣＺの遺伝子地図
である。
クターであるｐＡＤＥＸ１ＣＡ−ＬＡＣＺの遺伝子地図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 発現させたい所望の遺伝子が導入され、
該遺伝子がコードする産物を発現するヒト羊膜細胞。 - 【請求項２】 前記遺伝子を担持する組換えアデノウイ
ルスベクターで遺伝子導入された請求項１記載のヒト羊
膜細胞。 - 【請求項３】 ある遺伝子の産物が欠損、不足又は異常
である遺伝病の治療のための細胞であって、正常な該遺
伝子が導入され、該遺伝子がコードする産物を発現する
ヒト羊膜細胞からなる遺伝子治療用細胞。 - 【請求項４】 前記遺伝子を担持する組換えアデノウイ
ルスベクターで遺伝子導入された請求項３記載の遺伝子
治療用細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21409596A JP3806189B2 (ja) | 1995-07-27 | 1996-07-26 | ヒト羊膜細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子治療用細胞の調製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-211193 | 1995-07-27 | ||
| JP21119395 | 1995-07-27 | ||
| JP21409596A JP3806189B2 (ja) | 1995-07-27 | 1996-07-26 | ヒト羊膜細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子治療用細胞の調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0994092A true JPH0994092A (ja) | 1997-04-08 |
| JP3806189B2 JP3806189B2 (ja) | 2006-08-09 |
Family
ID=26518490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21409596A Expired - Fee Related JP3806189B2 (ja) | 1995-07-27 | 1996-07-26 | ヒト羊膜細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子治療用細胞の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3806189B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073421A3 (en) * | 1999-06-02 | 2001-04-26 | Lifebank Services L L C | Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells |
| JP2002201138A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-07-16 | Japan Tissue Engineering:Kk | 血管新生抑制剤 |
| WO2006136114A1 (en) * | 2005-06-24 | 2006-12-28 | Cell Star Bio-Technologies Co., Limited | Amniotic cells and methods for use thereof |
| CN103361302A (zh) * | 2005-03-31 | 2013-10-23 | 斯丹姆涅恩有限公司 | 从高度纯化来自羊膜的细胞群获得的细胞裂解产物的组合物 |
-
1996
- 1996-07-26 JP JP21409596A patent/JP3806189B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073421A3 (en) * | 1999-06-02 | 2001-04-26 | Lifebank Services L L C | Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells |
| JP2002201138A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-07-16 | Japan Tissue Engineering:Kk | 血管新生抑制剤 |
| CN103361302A (zh) * | 2005-03-31 | 2013-10-23 | 斯丹姆涅恩有限公司 | 从高度纯化来自羊膜的细胞群获得的细胞裂解产物的组合物 |
| WO2006136114A1 (en) * | 2005-06-24 | 2006-12-28 | Cell Star Bio-Technologies Co., Limited | Amniotic cells and methods for use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3806189B2 (ja) | 2006-08-09 |
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