KR20210005602A

KR20210005602A - 막-결합된 IL-10을 발현하는 유전자 리프로그래밍된 Treg

Info

Publication number: KR20210005602A
Application number: KR1020207030558A
Authority: KR
Inventors: 기드온 그로스; 하다스 웨인스타인-마롬; 아미트 크로너
Original assignee: 가비쉬-가릴리 바이오 어플리케이션스 리미티드.
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-01-14
Also published as: JP7404331B2; WO2019180724A1; JP2024019533A; CN112088164A; AU2019240370A1; US20210347843A9; SG11202010454PA; EP3768699A1; IL277541A; US20210040169A1; CA3094927A1; AU2019240370B2; JP2021519107A

Abstract

임의적으로, 가요성 힌지를 통해 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 핵산 분자를 포함하고, 그를 발현하는 포유동물 조절 T 세포 (Treg) 및 그의 용도를 제공한다.

Description

막-결합된 IL-10을 발현하는 유전자 리프로그래밍된 Treg

본 발명은 일반적으로 막-결합된 IL10을 발현하는 유전자 리프로그래밍된 조절 T 세포, 및 전신 면역억제를 증가시키고, 면역계의 과도한 활성에서 소견을 보이는 질환을 치료하는 데에서의 그의 용도에 관한 것이다.

국소 염증을 억제시키고, 면역학적 균형을 회복시키기 위해 CD4 조절 T 세포 (Treg)를 이용하는 것은 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 알레르기, 아테롬성동맥경화증, 이식 거부, 이식편대숙주 질환 및 그 이상으로 다양한 병리상태를 치료하는 데 있어서 큰 가능성을 가지고 있다. 그러나, 천연 (nTreg) 또는 유도성 (iTreg) Treg는 전체 인간 CD4 T 세포 집단에서 극히 일부만을 형성한다. 그 결과, 치료의 임상 효능 및 안전성에 중요한 적절한 개수 및 안정한 표현형으로 자가유래 또는 동종이계 Treg를 동원하거나, 유도하거나, 또는 조작하는, Treg 기반의 요법을 개발하는 것이 시급히 요청되고 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에서 mem-IL10으로 지칭되는, 임의적으로, 가요성 힌지를 통해 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

상이한 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의되는 바와 같은 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의되는 바와 같은 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자들 중 어느 하나를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

추가 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자들 중 어느 하나를 포함하는 포유동물 조절 T 세포 (Treg), 또는 상기 정의된 바와 같은 바이러스 벡터를 제공한다.

또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 CD4 T 세포를 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 그를 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시켜, 상기 CD4 T 세포에 안정한 Tr1 표현형을 부여하고, 이에 따라 안정한 Tr1을 갖는 Treg를 제조하는 단계를 포함하는, 안정한 Tr1 표현형을 갖는 동종이계 또는 자가유래 Treg를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 면역 억제 증가를 필요로 하는 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 막-결합된 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 억제 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 억제를 증가시키는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 질환, 장애 또는 병태는 예컨대, 자가면역 질환, 알레르기, 천식, 및 기관 및 골수 이식과 같이, 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 것인, 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1은 막-고정된 동종이량체 IL-10을 개략적으로 나타낸 개략도를 도시한다.
도 2a-2d는 T 세포에서의 memIL-10 발현 및 그가 IL-10 수용체 (IL-10R) 및 CD49b에 미치는 효과의 분석을 보여준다. 인간 주르카트(Jurkat) 또는 1차, 말초 혈액 림프구-유래 CD4 T 세포 (a, b) 및 마우스 B3Z 또는 NOD 비장 CD4 T 세포 (c, d)를 각각 인간 또는 마우스 memIL-10을 코딩하는 시험관내 전사된 mRNA 10 ㎍으로 전기천공시켰다. 세포를 형질감염 후 24시간째 (a-c) 또는 48시간째 (d, 좌측 및 우측)에 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 인간 또는 마우스 memIL-10 및 IL-10R 및 인간 CD49b는 각각의 인간 또는 마우스 단백질에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 각각 분석하였다.
도 3a-d는 그의 세포 표면 수용체에 결합된 천연 IL-10 동종이량체 (a), 및 3개의 막-고정된 IL-10의 유도체 (mem-IL10): (b) 짧은 링커를 갖는 mem-IL10; (c) 긴 링커를 갖는 mem-IL10; 및 (d) IL-10Rβ에 연결된 mem-IL10 (IL-10Rβ 융합체)을 개략적으로 나타낸 개략도를 도시한다.
도 4는 mRNA 전기천공 후 24시간째 주르카트 세포에서의 3개의 memIL-10 유도체의 세포 표면 발현을 보여준다. 인간 주르카트 CD4 T 세포에 각 명시된 mRNA (sL 및 lL은 각각 짧은 링커 및 긴 링커를 나타낸다) 10 ㎍을 전기천공시켰다. 24시간 세포를 유세포 분석법에 의해 IL-10의 표면 발현에 대해 분석하였다.
도 5a-c는 CD4 T 세포에서 memIL-10 발현이 STAT3의 자발적 인산화를 유도한다는 것을 보여준다. 마우스 CD4 T 세포를 비관련 mRNA (Irr. mRNA), 짧은 링커 memIL-10을 코딩하는 mRNA (sLmemIL-10), 긴 링커 memIL-10을 코딩하는 mRNA (lLmemIL-10) 또는 IL-10Rβ 쇄에 연결된 IL-10 (memIL-10Rβ)으로 전기천공시키거나, 또는 가용성 재조합 IL-10 (sIL-10)으로 20 ng/ml로 처리하였다. 24시간 후 세포를 유세포 분석법에 의해 표면 IL-10 (a), 표면 IL-10Rα 쇄 (b)에 대해 또는 세포내로 인산화된 STAT3 (pSTAT3) (c)에 대해 분석하였다.
도 6a-b는 memIL-10을 발현하는 레트로바이러스에 의해 형질도입된 마우스 CD4 T 세포의 분석을 보여준다. 형질도입 후 48시간째 (a) 및 6일째 (b), 짧은-링커 memIL-10-형질도입된 마우스 CD4 T 세포 (v-memIL-10)의 표현형 분석. 병행하여, 동일한 세포 배양물 중에서 성장시키고, LAG-3, CD49b 및 PD-1에 대해 염색하는 분석을 memIL-10(+) 및 memIL-10(-) 세포에 대해서 수행하였다. 양성 대조군으로서, 비-형질도입된 세포를 가용성 IL-10 (sIL-10)으로 처리하였다. 모의 세포의 경우, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 세포와 동일한 프로토콜로 처리하되, 바이러스 입자에는 노출시키지 않았다.
도 7은 활성화된, memIL-10 형질도입된 마우스 CD4 T 세포에 의한 IL-10 분비를 보여준다. 도 6에서의 실험과 동일한 실험으로부터의 세포를 항-TCR-CD3 mAb (2C11)로 자극시켰고, 그의 성장 배지에 대해 IL-10 ELISA를 수행하였다. 모의- 및 GFP-형질도입된 T 세포가 음성 대조군으로서의 역할을 한다.
도 8a-c는 memIL-10 형질도입된 인간 CD4 T 세포의 표현형 특징화를 보여준다. 건강한 공여자의 혈액 샘플로부터 제조된 말초 혈액 단핵 세포로부터 자기 비드에 의해 CD4 T 세포를 단리시켰다. 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체 및 IL-2의 존재하에서 원하는 개수를 수득할 때까지 성장시키고, memIL-10 또는 비관련 유전자 (Irr.)를 코딩하는 재조합 레트로바이러스로 형질도입시키거나, 또는 가용성 IL-10 (sIL-10)으로 처리하였다. 세포를 IL-2의 존재하에서 성장시키고, 1일째 (a), 5일째 (b) 및 18일째 (c), 명시된 세포 표면 마커에 대해 유세포 분석법 분석을 수행하기 위해 샘플을 채취하였다. 18일째, 세포 표면 마커 비교를 위해 비-형질도입된 Treg를 분석에 첨가하였다. 각 시점에, memIL-10을 발현하는 세포 (Pos, 솔리드형 프레임)를 IL-10을 발현하지 않는, 동일한 배양물로부터의 세포 (Neg, 도트형 프레임)와 함께 나란히 분석하였다.
도 9는 memIL-10-형질도입된 인간 CD4 T 세포 표현형을 분석하는 제2 실험을 보여준다. 세포를 제조하고, memIL-10으로 형질도입시키고, 4일 후, 도 8의 범례에 기술된 바와 같은 명시된 마커에 대해 분석하였다. 비-형질도입된 (나이브) 및 모의-형질도입된 (모의) CD4 세포가 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. MemIL-10 양성 세포를 동일한 배양물로부터의 memIL-10 음성 세포 뿐만 아니라, 50, 100 또는 300 ng/ml sIL-10의 존재하에서 성장된 나이브 CD4 T 세포와 비교하였다. 각 샘플에서 양성으로 염색된 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. 이중 pos, LAG-3 및 CD49b에 대해 양성으로 염색된 세포 비율(%).

본 발명에 따라 막-결합된 IL-10을 구성적으로 발현하도록 T 세포를 유전자 리프로그래밍하는 것이 안정한 Tr1 표현형을 T 세포에 부여한다는 것을 발견하게 되었다.

선택되는 Treg 세포 유형이 성공적인 임상적 실행을 위해서는 매우 중요하다. Tr1 세포는 IL-10의 존재하에 수지상 세포 상의 항원에의 만성 노출시 TCR- 및 항원-특이적 방식으로 말초에서 유도되는 CD4(+) FoxP3(+/-) Treg의 서브세트이다 (1, 2). 이들 세포는 비-증식성 (아네르기) 상태, IL-10 및 TGF-β는 고생산이되, IL-2는 단지 최소 생산 및 IL-4 또는 IL-17은 비생산, 및 세포간 접촉에 비의존적인 방식으로 이펙터 T 세포 (Teff)를 억제시킬 수 있는 능력을 특징으로 한다. 앤돌피(Andolfi) 등은 렌티바이러스 형질도입에 의해 달성된, 인간 CD4 T 세포에서의 강제 IL-10 발현이 자가분비 방식으로 상기 세포에 안정한 Tr1 표현형을 부여하는 데 충분하였다는 것을 입증하였다 (3). 상기 연구에서는 또한 상기 세포의 IL-2에의 노출이 이들 IL-10-유도 Tr1 세포의 아네르기 상태를 일시적으로 역전시킬 수 있는 것으로 나타났다. 중요하게는, 인간 (및 마우스) Tr1 세포에서 안정적으로 및 선택적으로 공동 발현하고, 세포 집단의 순도를 위한 그의 단리 및 유세포 분석법 분석을 허용하는, 2개의 세포 표면 마커, CD49b 및 LAG-3이 확인되었다 (4).

본 발명은 IL-10의 막-고정된 유도체를 코딩하는 유전자 (mem-IL10)를 제공한다. 천연 IL-10은 동종이량체이고 (5, 6), 본원에서는 기능성 동종이량체 구조를 그의 막-고정된 형태에 부여하는 것이, 항원성 자극의 부재하에서는 IL-10 분비를 회피하면서, Tr1 표현형의 영구적인 보존을 보장하는 IL-10-구동 안전 잠금을 제공한다는 것을 발견하게 되었다. 안전한 방식으로, IL-10은 T 세포 증식을 신호전달하지 않으므로, IL-10 신호전달 경로의 자율적 활성화는 비제어된 세포 성장의 위험과는 연관이 없다.

본 발명에서, 본 발명자들은 최초로 막 IL-10을 발현하도록 Treg를 변형시킴으로써 면역 억제 시행을 위한 항-염증성 효과를 달성한다. 추가로, IL-10은 T 세포 증식을 유도하지 않기 때문에, 자율적 세포 증식 및 세포 형질변화를 유도할 위험 없이 안정한 바이러스 형질도입을 통해 구성적으로 발현될 수 있다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 mem-IL-10을 제외한, 추가의 다른 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 추가의 제어 요소, 예컨대, 프로모터 및 종결인자를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 동종이량체 IL-10은 제1 IL-10 단량체의 C-말단이 제1 가요성 링커를 통해 제2 IL-10 단량체의 N-말단에 연결되도록 단일 쇄 구조로 연결된 제1 및 제2 IL-10 단량체를 포함한다.

가요성 펩티드 링커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 연구원들에 의해 디자인된 실험적 링커는 예컨대, 문헌 (7-9) (이들 문헌들은 각각 마치 그가 본원에 완전히 개시된 것과 같이 참조로 포함된다)에서 정의된 바와 같이, 일반적으로 그의 구조에 따라 3가지 카테고리로 분류된다: 가요성 링커, 강성 링커, 및 생체내에서 절단가능한 링커.

상기 언급된 바와 같이, 제1 링커는 가요성 링커이고, 그의 구조는 문헌 (7-9)에 개시된 링커 중 어느 하나로부터 선택된다. 원칙적으로, 가요성을 제공하기 위해서는 링커는 일반적으로 작은, 비-극성 (예컨대, Gly) 또는 극성 (예컨대, Ser 또는 Thr) 아미노산으로, 예컨대, 교번 Gly 및 Ser 잔기의 기본 서열로 구성된다. 링커 및 결합된 동종이량체 IL-10의 가용성은 하전된 잔기; 예컨대, 2개의 양으로 하전된 잔기 (Lys) 및 1개의 음으로 하전된 잔기 (Glu)를 포함시킴으로써 증강될 수 있다. 링커는 길이 상, 링커가 연결된 파트너의 입체구조 또는 상호작용에 대해 어떠한 제약도 가하지 않도록 각 조건에 대해 최적화된 2 내지 31개의 아미노산, 예컨대, 12 내지 18개의 잔기로 달라질 수 있다.

특정 실시양태에서, 제1 가요성 링커는 아미노산 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호(SEQ ID NO:) 1)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 제1 가요성 링커는 예컨대, 서열식별번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

특정 실시양태에서, 가요성 힌지는 하기 폴리펩티드 또는 그의 변이체로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다:

· CD8α의 힌지 영역 (예를 들어, 서열식별번호 3에 기재; 예컨대, 서열식별번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)

· IgG의 중쇄의 힌지 영역 (예를 들어, 서열식별번호 5에 기재; 예컨대, 서열식별번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)

· IgD의 중쇄의 힌지 영역 (예를 들어, 서열식별번호 7에 기재; 예컨대, 서열식별번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)

· IL-10R β 쇄의 세포외 스트레치 (서열식별번호 9에 기재; 예컨대, 서열식별번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩); 및

· 적어도 하나의 Gly4Ser(Gly3Ser)₂ 서열을 포함하는, 예컨대, 하나의 Gly₄Ser(Gly₃Ser) 서열 (서열식별번호 11; 예를 들어, 서열식별번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩), 또는 둘 사이에 1 또는 2개의 Ser 잔기가 삽입되어 있는 2개의 Gly₄Ser(Gly₃Ser) 서열을 포함하는, 최대 28개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 제2 가요성 링커.

특정 실시양태에서, 제2 가요성 링커는 아미노산 서열 Gly₄Ser(Gly₃Ser)₂ (본원에서 "짧은 링커"로 지칭; 서열식별번호 13; 예를 들어, 서열식별번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)를 포함하는 21개의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제2 가요성 링커는 아미노산 서열 Gly₄Ser(Gly₃Ser)₂Ser₂(Gly₃Ser)₃ (본원에서 "긴 링커"로 지칭; 서열식별번호 15; 예를 들어, 서열식별번호 22에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩) 및 서열식별번호 16의 연결 펩티드를 포함하는 28개의 아미노산 스페이서를 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나의 제2 가요성 링커는 HLA-A2의 연결 펩티드의 막-근위부로부터 유래된 서열 SSQPTIPI (본원에서 "연결 펩티드"로 지칭; 서열식별번호 17; 예를 들어, 서열식별번호 18에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)의 8개의 아미노산 브릿지를 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, mem-IL10의 막횡단-세포내 스트레치는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 분자, 바람직하게, HLA-A2 (서열식별번호 19에 기재; 예컨대, 서열식별번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩); 인간 CD28 (서열식별번호 21에 기재; 예컨대, 서열식별번호 22에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩); 또는 인간 IL-10R β 쇄 (서열식별번호 23에 기재; 예컨대, 서열식별번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)로부터 선택되는 인간 MHC 클래스 I 분자의 중쇄로부터 유래된 것이다.

특정 실시양태에서, 완전한 mem-IL10의 아미노산 서열은 짧은 제2 가요성 링커 및 연결 펩티드를 통해 HLA-A2의 막횡단-세포내 스트레치에 연결된, 서열식별번호 25에 기재되고; 예컨대, 서열식별번호 26에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 같은, 동종이량체 IL-10을 포함하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.

특정 실시양태에서, 완전한 mem-IL10의 아미노산 서열은 긴 제2 가요성 링커 및 연결 펩티드를 통해 HLA-A2의 막횡단-세포내 스트레치에 연결된, 서열식별번호 27에 기재되고; 예컨대, 서열식별번호 28에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 같은, 동종이량체 IL-10을 포함하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.

특정 실시양태에서, mem-IL-10은 제2 가요성 링커를 통해 IL-10Rβ 세포외 도메인 (예를 들어, 서열식별번호 9에 기재)에, 및 임의적으로, 추가로, IL-10Rβ 막횡단 & 시토졸 도메인 (예를 들어, 서열식별번호 23에 기재)에 융합된다.

특정 실시양태에서, mem-IL-10은 짧은 링커 (서열식별번호 29에 기재; 예컨대, 서열식별번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩)를 통해 본질적으로 완전한 IL-10R β 쇄의 N-말단에 융합된다.

본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 본 발명의 mem-IL10을 구성하는 폴리펩티드는 특정 아미노산 서열에 의해 본원에서 정의된 것으로 제한하지만, 이는 또한 이들 올리고펩티드의 변이체일 수 있거나, 또는 상기 개시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 참조 서열과 상이하며, 특히, 상기 치환은 분자의 활성 부위가 아닌 부위에서 발생한 경우에 그러하되, 단, 폴리펩티드는 본질적으로 그의 기능성 특성을 유지하는 것인 서열을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환은 예를 들어, 한 아미노산을 같은 부류의 또 다른 아미노산으로 치환하고, 예컨대, 한 소수성 아미노산을 또 다른 소수성 아미노산으로 치환하고, 극성 아미노산을 또 다른 극성 아미노산으로 치환하고, 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로 치환하고, 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로 치환한다. 하나 이상의 아미노산이 펩티드로부터 결실되어, 그의 생물학적 활성은 실질적으로 변경시키지 않는, 그의 단편을 수득할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 완전한 막-결합된 IL-10, 또는 막-결합된 IL-10의 다양한 서브영역 각각의 것, 즉, 제1 및 제2 IL-10 단량체가 제1 가요성 링커를 통해 단일 쇄 구조로 연결되는 동종이량체 IL-10; 제1 가요성 링커 그 자체, 가요성 힌지; 및 막횡단-세포내 스트레치의 아미노산 서열은 서열식별번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 또는 29와 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98% 동일하다.

특정 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 완전한 막-결합된 IL-10, 또는 막-결합된 IL-10의 다양한 서브영역 각각의 것, 즉, 제1 및 제2 IL-10 단량체가 제1 가요성 링커를 통해 단일 쇄 구조로 연결되는 동종이량체 IL-10; 제1 가요성 링커 그 자체, 가요성 힌지; 및 막횡단-세포내 스트레치 뿐만 아니라, 전체 구축물의 아미노산 서열은 서열식별번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 또는 29와 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 또는 99% 동일하다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98% 동일한, 상기 개시된 바와 같은 완전한 막-결합된 IL-10, 또는 막-결합된 IL-10의 다양한 서브영역 각각의 것, 즉, 제1 및 제2 IL-10 단량체가 제1 가요성 링커를 통해 단일 쇄 구조로 연결되는 동종이량체 IL-10; 제1 가요성 링커 그 자체, 가요성 힌지; 및 막횡단-세포내 스트레치 뿐만 아니라, 전체 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30 중 어느 하나와 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 또는 99% 동일한, 상기 개시된 바와 같은 완전한 막-결합된 IL-10, 또는 막-결합된 IL-10의 다양한 서브영역 각각의 것, 즉, 제1 및 제2 IL-10 단량체가 제1 가요성 링커를 통해 단일 쇄 구조로 연결되는 동종이량체 IL-10; 제1 가요성 링커 그 자체, 가요성 힌지; 및 막횡단-세포내 스트레치 뿐만 아니라, 전체 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30 중 하나에 기재된 것과 같은, 상기 개시된 바와 같은 완전한 막-결합된 IL-10, 또는 막-결합된 IL-10의 다양한 서브영역 각각의 것, 즉, 제1 및 제2 IL-10 단량체가 제1 가요성 링커를 통해 단일 쇄 구조로 연결되는 동종이량체 IL-10; 제1 가요성 링커 그 자체, 가요성 힌지; 및 막횡단-세포내 스트레치 뿐만 아니라, 전체 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

상이한 측면에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 핵산 분자는 조성물 중의 단일 핵산 분자이고, 즉, 조성물은 추가의 다른 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 핵산 분자는 포함하지 않는다.

본 발명의 핵산 분자는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 안정한 Tr1 표현형을 실행시키기 위한 목적으로 T 세포 내로 전달된다: 예를 들어, 마투스코바(Matuskova) 및 무리니코바(Durinikova) (10)는 트랜스진을 세포 내로 전달하는 데에는 2가지 시스템 - 바이러스 및 비-바이러스 시스템이 존재한다고 교시하고 있다. 비-바이러스 접근법은 대표적으로 중합체 나노입자, 지질, 인산칼슘, 전기천공/뉴클레오펙션 또는 DNA 코팅된 미세입자의 유전자총 전달이다.

DNA가 숙주 세포의 크로마틴 내로 통합되는지 여부에 의존하여 본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터에는 2가지 주요 유형이 존재한다. 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유래된 것은 통합된 프로바이러스로서 핵내 계속 지속되고, 세포 분열과 함께 재생산된다. 다른 유형의 벡터 (예컨대, 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스로부터 유래된 것)는 에피솜 형태 그대로 세포에서 유지된다.

따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.

특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 감마바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스 바이러스, 알파바이러스, 및 헤르페스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스, 예컨대, 변형된 감마바이러스, 렌티바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 및 스푸마바이러스이다. 실제로, 문헌 (11)의 고형 종양에서 CAR-T 세포를 평가하는 52개의 임상 시험 중 24개는 레트로바이러스 벡터를 이용하고, 9개의 렌티바이러스 벡터를 이용한다. B 세포 악성 종양 치료용으로 FDA 승인을 받은 2개의 CAR 제품은 킴리아(Kymriah)™ (렌티바이러스 벡터) 및 예스카타(Yescarta)™ (감마-레트로바이러스 벡터)라는 점에도 또한 주의한다. 따라서, 본 발명의 바이러스 벡터에 대해 우수한 후보물질은 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 감마-레트로바이러스 벡터이다. 예를 들어, 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스 서열 (감마-레트로바이러스 벡터)로부터 유래된 것일 수 있다.

특정 실시양태에서, 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단일 폴리펩티드이고, 즉, 바이러스 벡터의 핵산 분자는 추가의 다른 단백질은 코딩하지 않지만, 추가의 제어 요소, 예컨대, 프로모터 및 종결인자를 포함할 수 있다.

추가 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 상기 정의된 바와 같은 바이러스 벡터 중 어느 하나를 포함하는 포유동물 조절 T 세포 (Treg)를 제공한다.

특정 실시양태에서, 포유동물 Treg는 그의 표면 상에 임의적으로, 가요성 힌지를 통해 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 발현한다.

특정 실시양태에서, 포유동물 Treg는 인간 Treg이다.

특정 실시양태에서, 포유동물 Treg는 세포 표면 마커 CD49b 및 LAG-3을 나타내는 안정한 Tr1 표현형 (즉, 그의 조절 활성을 잃지 않는 것, 문헌 (12))을 갖는다.

CD4 T 세포를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 예컨대, 하기 실시예 섹션에 개시된 방법에 의해 수행될 수 있다.

재조합 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 생성하고, T 세포를 형질도입하기 위해 그를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 일반적으로는 인비트로겐(Invitrogen)®, 시그마(Sigma)®, 클론테크(Clontech)®, 셀 바이오랩스(Cell Biolabs)®, SBI®, 진코포에이아(Genecopoeia)® 및 그외 다수를 비롯한, 다수의 회사에 의해 제공되는, 패키징 세포, 플라스미드 및 형질감염 시약을 포함하는 상업적 키트를 사용하여 수행된다. 따라서, 본 방법은 상업적 키트와 함께 공급된 가이드라인을 따라 수행된다.

간략하면, 애드진(Addgene)의 웹사이트 상의 γ-레트로바이러스 가이드에 의해 교시된 비-제한적인 예에 따라, 하기 성분들이 요구된다: (a) 관심 트랜스진을 코딩하는 γ-레트로바이러스 전달 플라스미드: 트랜스진 서열은, 전달 플라스미드 서열의 숙주 게놈 내로의 통합을 촉진시키는, 긴 말단 반복 (LTR) 서열에 플랭킹된다. 전형적으로, 바이러스 형질도입시 숙주 게놈 내로 통합되는, LTR을 포함하여, 그 사이에 있는 서열이다; (b) 패키징 유전자 (바이러스 Gag-Pol): Gag는 구조적 전구체 단백질이고, Pol은 폴리머라제이다; 및 (c) 인벨럽 유전자 (감염도 변경을 위해 슈도타이핑될 수 있다).

비-제한적인 예로서, 상기 기술된 3가지 요소 (인벨럽, 패키징, 및 전달)는 3가지 유형의 플라스미드에 의해 공급되고, 이는 293T 패키징 세포주로 공동 형질감염된다. 상기 시스템은 상이한 인벨럽을 이용하여 γ-레트로바이러스를 슈도타이핑하여 친화성을 변형시키는 데 가장 큰 유연성을 제공한다. 간략하면, 상이한 인벨럽 플라스미드는 다양한 친화성을 가진 바이러스의 생산을 지시할 수 있다. 재조합 레트로바이러스 스톡 제조 방법 및 인간 CD4 T 세포의 레트로바이러스 형질도입에 관한 상세하되, 비-제한적인 예를 하기 실시예 섹션에서 살펴볼 수 있다.

특정 실시양태에서, 대상체는 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 질환, 장애 또는 병태에 의해 유발되는 증상 때문에 면역 억제를 증가시키는 것을 필요로 한다.

따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 질환, 장애 또는 병태는 예컨대, 자가면역 질환, 알레르기, 천식, 및 기관 및 골수 이식과 같이, 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 것인, 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 억제 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 억제를 증가시키기 위해 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 동종이량체 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg는 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 것인, 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 실시양태에서, 포유동물 Treg는 인간 대상체를 치료하기 위한 것이고, 포유동물 Treg는 인간 Treg이다.

자가면역 질환으로 정의된 구체적인 질환은 예를 들어, 문헌 [The Encyclopedia of Autoimmune Diseases, Dana K. Cassell, Noel R. Rose, Infobase Publishing, 14 May 2014] (상기 문헌은 마치 그 전체가 본원에 개시된 것과 같이 그 전문이 참조로 포함된다)에 개시되어 있는 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병; 류마티스 관절염; 건선; 건선성 관절염; 다발성 경화증; 전신 홍반성 루프스; 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 결장염; 애디슨병; 그레이브스병; 쇼그렌 증후군; 하시모토 갑상선염; 중증 근무력증; 혈관염; 악성 빈혈; 셀리악병; 및 아테롬성동맥경화증으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 상기 포유동물 Treg는 인간이다.

일부 실시양태에서, Treg는 동종이계 Treg이다.

정제된 CD4⁺ CD25⁺ Treg의 입양 전달이 자가면역 질병의 다양한 모델에서 질환을 억제 또는 예방할 수 있다는 것을 입증한 임상전 연구로 명백하게 나타나는 바와 같이, 본 발명의 안정한 Tr1 세포는 추가의 유전자 조작 없이도, 면역 억제를 증가시키고, 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이는 전신 홍반성 루프스, 염증성 장 질환, 자가면역성 뇌척수염, 제1형 당뇨병, 자가면역 간염 및 콜라겐 유발 관절염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 상기 세포의 입양 전달은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 유도된 동종이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환으로부터 보호할 수 있다 (13). 추가로, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 동종이식편 거부반응 및 제1형 당뇨병을 비롯한, 다수의 병태 및 질환의 면역요법에서 생체외 확장된, 비-항원-특이적 Treg의 입양 전달의 안전성 및 효능을 평가하는 임상 시험 (리뷰를 위해 문헌 (13) 참조)이 점점 증가하고 있으며, 이는 상기 접근법이 유망하다는 것을 보여준다.

이들 연구에서 관찰된 유익한 임상 반응은 그의 내인성 TCR을 통한 항원과 Treg의 결합이 면역 억제를 증진시킨다고 주장하는 누적된 증거에 비추어 볼 때 개선될 수 있다 (14-16).

본 발명의 발명자들은 조직-표적화 단백질을 발현하도록 Tr1 세포를 조작하는 접근법을 구상한다. 예를 들어, 레티노산 (RA)은 T 세포에서 장-귀소 수용체 인테그린 α4β7 및 케모카인 수용체 CCR9의 발현을 유도하고, 생체외에서의 사전 인큐베이션 이후에 생체내에서 그의 기능을 발휘할 수 있다 (17, 18). RA는 또한 Treg에 의한 TGF-β-매개 억제의 중요한 조절인자이고, Treg 분화를 촉진시킨다 (19). RA는 또한 나이브 CD4 Teff 세포의 유도된 Treg로의 전환을 증진시키고 (20, 21), 염증성 환경에서 IL-6의 존재하에 Treg 안정성 및 기능을 지속시키는 것으로 밝혀졌다 (18). 모든-트랜스 RA와의 사전 인큐베이션은 장 귀소 능력을 리프로그래밍된 Tr1 세포에 장착시키기 위한 실현가능하고, 간단한 방법인 것으로 나타난다. 상기 정의된 바와 같은 질환을 치료하는 방법에서 사용되는 Treg는 리프로그래밍된 Tr1 세포에 장 귀소 능력을 장착시키고, 염증성 환경에서 IL-6의 존재하에 Treg 안정성 및 기능을 지속시키기 위해, 대상체에게 투여하기 전, 레티노산과 접촉시킬 수 있다.

관심의 대상이 되는 대안적 해결안은 키메라 항원 수용체, 또는 CAR을 사용하여 선택되는 세포 표면 항원에 대해 다수의 T 세포를 유전적으로 재지시할 수 있는 잘 확립된 방법을 이용한다 (22).

원칙적으로, CAR은 또한 Treg를 리프로그래밍하는 데 사용될 수 있다. 실제로, 여러 연구소에서는 최근 상이한 실험 환경에서 기능성 마우스 및 인간 CAR-Treg를 생성하는 것에 관하여 기술하였다 (문헌 (23-29) 및 리뷰를 위해 문헌 (13, 16, 30, 31) 참조). 외인성 TCR 유전자의 전달을 통해 Treg를 재지시하는 것 또한 보고되었다 (32-34).

관련 기술분야의 최근 연구 (28)에서는 HLA-A2⁺ 이펙터 T 세포에 의해 유발된 면역결핍 마우스에서 이종발생성 GvHD를 예방하기 위한 수단으로서 HLA-A2-특이적 인간 CAR-Treg를 생성하기 위해 렌티바이러스 형질도입을 사용하였다. 실제로, 생체내에서 이들 CAR-Treg는 GvHD를 억제시키는 데 있어서 비관련 특이성을 갖는 동일한 개수의 CAR-Treg보다 현저히 우수하였다. 수혜자 마우스의 혈액 중에서 검출가능한 HLA-A2 CAR-Treg의 개수는 투여 후 1주째에 최고치였고, 추가 한 주 동안 안정한 상태 그대로 유지되었고, 이어서, 3주째 종료시에는 0에 가깝게 감소되었다.

혈우병 A에 대한 대체 요법에서 항원 반응을 억제시키기 위한 시도로 레트로바이러스에 의해 형질도입된 인간 Treg를 응고 인자 VIII (FVIII)에서 재지시한 CAR-Treg의 의도된 임상적 용도를 위한 또 다른 예가 최근에 보고되었다 (29). 비록 도입된 CAR-Treg가 전달 후 2주째에 이미 검출불가능하였지만, 이종발생성 면역능력이 있는 마우스 모델을 이용하였을 때, 면역화 후 8주째 항원 반응이 강력하게 억제되었다는 것이 명백하다.

따라서, 본원에 정의된 바와 같이 그의 표면 상에 막-결합된 동종이량체 IL-10을 발현하고, 안정한 Tr1 표현형을 갖는 포유동물 Treg는 면역 억제를 증가시키고, 면역계의 과도한 활성 또는 다르게는 원치않는 활성의 소견을 보이는 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 효율적인 작용제; 및 효능 증가를 위해 관련 기술에 널리 공지된 기술을 사용하여 쉽게 조작될 수 있는 작용제이다. 추가로, 생체외 확장된, 비항원 특이적 Treg 뿐만 아니라, 재지시된 항원-특이적 Treg의 입양 전달을 이용하는 방법은 면역요법 분야에 널리 공지되어 있다.

정의

"Tr1 세포"라는 용어는 본원에서 "iTreg" 또는 "유형 1 세포"라는 용어와 상호교환적으로 사용되고, 2개의 세포 표면 마커, CD49b 및 LAG-3의 발현, FoxP3의 저발현 또는 비발현, 비-증식성 (아네르기) 상태, IL-10 및 TGF-β는 고생산이되, IL-2는 단지 최소 생산 및 IL-4 또는 IL-17은 비생산, 및 세포간 접촉에 비의존적인 방식으로 이펙터 T 세포 (Teff)를 억제시킬 수 있는 능력을 특징으로 하는 CD4 T 세포를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "치료하는"이라는 용어는 원하는 생리적 효과를 수득하기 위한 수단을 지칭한다. 효과는 질환 및/또는 질환에 기인하는 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 점에서 치료적인 것일 수 있다. 상기 용어는 질환을 억제시키는 것, 즉, 그의 발생을 정지시키거나; 또는 질환을 호전시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 일으키는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"이라는 용어는 그를 위한 진단, 예후, 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체, 특히, 포유동물 대상체, 예를 들어, 인간을 지칭한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상의 방식으로 제제화될 수 있다. 담체(들)는 조성물의 나머지 다른 성분들과 화합성이고, 그를 받은 수혜자에게 유해하지 않다는 점에서 "허용되는" 것이어야 한다.

담체, 투여 모드, 투여 형태 등에 관한 하기 예시는 그로부터 담체, 투여 모드, 투여 형태 등이 본 발명에서의 사용을 위해 선택될 수 있는 공지의 가능한 것으로서 열거된 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선택된 임의의 주어진 제제 및 투여 모드는 먼저 그가 원하는 결과를 달성할 수 있는지 여부를 측정하는 시험이 진행되어야 함을 이해할 것이다.

투여 방법은 비경구적, 예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 점막 (예컨대, 경구, 비내, 협측, 질, 직장, 안구내), 경막내, 국부 및 진피내 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 경구 투여용으로 적합화된다.

"담체"라는 용어는 활성제와 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는 각각 하나 이상의 염기쌍, 코돈, 인트론, 엑손, 또는 아미노산 잔기에서 변형된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서, 자연적으로 발생된 서열의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 그대로 보유하는 것을 지칭한다.

본원에서 달리 명시되지 않는 한, 동일성 또는 유사성 또는 임의의 다른 파라미터를 표현하는 모든 수치는 모든 경우에서 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 반대로 명시되지 않는 한, 본 설명 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 의존하여 최대 ±10%만큼 달라질 수 있는 근사치이다.

이제, 본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 예시될 것이다.

실시예

물질 및 방법

인간 CD4 T 세포 분리

표준 피콜-플라크(Ficoll-Paque) (시그마) 분리 방법을 사용하여 전혈 샘플 또는 혈액 성분채집술 생성물로부터 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 제조하였다. 분리 후 (또는 세포 해동 후) 24시간째, 가용성 항-CD28 및 재조합 인간 IL-2의 존재하에서 플레이트-결합 항-CD3 Ab (OKT3)에 의해 PBMC를 72시간 동안 활성화시켰다. 이어서, 자기 비드 (BD IMag™)를 이용하는 양성 선별을 사용하여 CD4 T 세포를 분리시킨 후, 실험에 사용하기 전 24시간 휴지를 위해 완전 배지에 놓아 두었다.

재조합 레트로바이러스 스톡 제조

memIL-10 유전자를 BamHI-EcoRI 제한 부위를 통해 보편적으로 사용되는 MSGV1 레트로바이러스 벡터로 클로닝하였다. gag/pol을 보유하는 플라스미드 및 env를 보유하는 플라스미드와 함께, 생성된 플라스미드를 제조사의 설명서에 따라 형질 감염 시약, 예컨대, 리포펙타민(Lipofectamine) (써모 피셔 사이언티픽®) 또는 퓨진(Fugene) HD® (프로메가®)를 사용하여, 항생제를 함유하지 않는 OptiMEM™ 배지 (HEPES 및 중탄산나트륨으로 완충처리되고, 히포크산틴, 티미딘, 피루브산나트륨, L-glutamine, 미량원소, 및 성장 인자로 보충된, 이글즈 최소 필수 배지의 변형물) 중 10 cm 폴리-D-리신-코팅된 플레이트에 배치된 3x10⁶ HEK293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 항생제를 함유하는 완전 배지로 옮기고, 그 다음날, 상청액을 수집하고, 분취물로 냉동건조시키거나, 또는 레트로바이러스 형질도입에 직접 사용하였다.

인간 CD4 T 세포의 레트로바이러스 형질도입

비-코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 형질도입을 수행하였다. 웰을 밤새도록 유전자 형질도입 증강제 (레트로넥틴(RetroNectin)®; 다카라(Takara)®)로 코팅하였다. 레트로넥틴®은 렌티바이러스- 및 레트로바이러스-매개 유전자 형질도입의 효율을 증강시키는 재조합 인간 피브로넥틴 단편 (이는 또한 rFN-CH-296으로도 지칭됨)의 63 kD 단편이다. 레트로넥틴®을 제거하고, 웰을 세척하고, 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에서 2.5% 멸균 소혈청 알부민 (BSA)으로 차단하고, 다시 세척하였다. 형질감염 시약, 예컨대, 폴리브렌 (머크(Merck)®)을 함유하는 둘베코스 변형 이글즈 배지 (DMEM) 중에서 바이러스 상청액을 희석시키고, 4 ml/웰로 레트로넥틴®-코팅된 웰로 옮겼다. 플레이트를 32℃에서 2시간 동안 2,000xg로 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 50/50 AIM-V/RPMI 배지 + 300 IU/ml 재조합 IL-2 중에 5x105 세포/ml로 4 ml의 CD4 T 세포를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 15분 동안 1,000xg로 원심분리하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, CD4 T 세포를 새로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트로 옮기고, 1 ml의 신선한 50/50 배지 + 300 IU/ml rIL-2를 각 웰에 첨가하였다. 다음날 배지를 교체하고, 세포를 필요에 따라 분할하였다.

실시예 1. 가요성 링커에 의해 탠덤으로 함께 연결되고, 짧은 힌지 영역을 통해 막횡단 - 세포내 스트레치에 연결된 2개의 IL-10 단량체.

본원에서 사용되는 구체적인 구축물에서, 2개의 IL-10 단량체를 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG의 가요성 링커에 의해 탠덤으로 함께 연결하여 동종이량체를 생성하고, 이어서, 이를 가요성 링커를 포함하는 21개의 아미노산 스페이서를 갖는 가요성 힌지 영역에 의해 HLA-A2 중쇄로부터 유래된 막횡단-세포내 스트레치에 연결시켰다.

Gly₄Ser(Gly₃Ser)₂ 및 HLA-A2의 연결 펩티드의 막-근위부로부터 유래된 서열 SSQPTIPI의 추가의 8개의 아미노산 브릿지 (도 1). 이어서, 인간 및 마우스 CD4 T 세포 상의 memIL-10 및 IL-10R의 표면 발현을 확인하였다 (도 2).

CD49b 인테그린의 상승을 (a)에서 확인할 수 있었고, IL-10 수용체 (IL-10R)의 상향조절은 재조합 IL-10 (rIL-10, (b))에 의해 유도된 것과 유사하였다. 마우스 memIL-10은 형질감염 후 48시간째에 명확하게 발현되었고 (d, 좌측), 예상대로, memIL-10은 본 발명자들이 사용한 항-마우스 IL-10R mAb의 결합을 차단시켰으며, 이는 시스 결합임을 제안한다 (35).

실시예 2. 가요성 링커에 의해 탠덤으로 함께 연결되고, 긴 힌지 영역 또는 IL-10R β 쇄를 통해 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 2개의 IL-10 단량체.

본 발명자들의 원래의, 인간 및 마우스, 둘 모두의 memIL-10 구축물은 8개의 아미노산-긴 강성 스페이서에 추가로 21개의 아미노산으로 이루어진 가요성 링커를 포함하는 힌지를 도입하였다 (이제 본원에서 SmemIL-10 (S는 짧은 링커, 하기 참조)으로도 지칭).

본 발명자들의 memIL-10을 최적화시키기 위한 시도로, 본 발명자들은 상기 막 시토카인의 2개의 새로운 버전을 조작하고, 클로닝하였다: 한 클로닝된 첫 번째 것에서, 본 발명자들은 IL-10R과의 최적의 체결을 촉진시키기 위해 더욱 긴 링커 펩티드 (30개의 아미노산으로 이루어짐, 긴 것에 대해 LmemIL-10으로 명명)를 memIL-10에 제공하였다 (도 3, 좌측 하단). 또 다른 유도체를 생성하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 이량체 IL-10을, IL-10R α 쇄 상에 위치하는 IL-10 결합 부위에 직접 접근할 수 있게 디자인된 새로운 스캐폴드로서 IL-10R β 쇄의 N-말단에 융합시켰고, 이는 memIL-10RB로 명명되었다 (도 3, 우측 하단). 실제로, 도 4에서 인간 주르카트 세포에서의 3가지 생성물의 표면 발현이 확인된다. 특히, memIL-10RB 융합 단백질의 표면 발현 수준은 IL-10Rα 쇄의 이용가능성에 의존할 것으로 예상된다. 3가지 상이한 memIL-10 구조체의 발현 및 기능을 평가하기 위해, 마우스 CD4 T 세포를 3가지 구축물을 코딩하는 mRNA로 형질감염시키고, 표면 발현 (도 5a), 표면 IL-10R의 하향조절 (도 5b) 및 STAT3의 자발적 인산화 (도 5c)에 대해 검정하였다. 실제로, 주르카트 세포에서 수득된 결과와 일치하여, 표면 IL-10R의 더욱 큰 감소 및 pSTAT3의 더욱 강력한 유도로 입증되는 바와 같이, 짧은 및 긴 링커를 보유하는 구축물은 memILL-10Rβ보다 훨씬 더 높은 수준으로 발현되고, 우수한 기능을 나타낸다. 반복된 실험에서도 또한 pSTAT3을 유도할 수 있는 그의 능력에 있어서 짧은 링커 구축물 (sLmemIL-10)이 긴 링커 구축물 (lLmemIL-10)보다 우수하였는 바, 추가 실험을 위해 상기 짧은 링커 구축물을 선택하였다.

실시예 4. 레트로바이러스에 의해 형질도입된 마우스 CD4 T 세포의 memIL -10의 발현 및 특징화

레트로바이러스에 의해 형질도입된 T 세포에서 memIL-10의 발현 및 기능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 자기 비드를 이용하여 C57BL/6 (B6) 마우스로부터 정제된 비장 CD4 T 세포를 사용하였다. memIL-10 형질도입된 세포에 대한 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 모의-형질도입된 세포 (모의)를 사용하였다. 가용성 IL-10 (sIL-10)은 본 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 6은 동일한 배양물 중에서 성장한 형질도입된 세포 대 비-형질도입된 세포, 및 모의-형질도입된 세포의, 형질감염 후 48시간 및 6일째의 3가지 Tr1-연관 마커 LAG-3, CD49b 및 PD-1의 발현에 대한 유세포 분석법 분석 결과를 보여준다. 실제로, 3가지 마커는 이미 2일째에 뚜렷하게 상승한 것을 관찰할 수 있었고, 이는 6일째에도 지속되었으며, 이는 예상된 표현형을 나타내는 것이다. TCR-매개 활성화시, IL-10을 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포의 능력을 통해 Tr1-유사 기능적 특성의 획득을 확인할 수 있다 (도 7).

실시예 5. 형질도입된 세포가 T 이펙터 세포에 미치는 억제 효과 평가.

형질도입된 세포가 이웃 Teff 세포에 대해 그의 억제 효과를 발휘할 수 있는 형질도입된 세포의 능력을 조사하기 위해, 다른 것은 제외하고, 오직 본 발명자들이 의도하는 한 T 세포 집단만을 선택적으로 활성화시킬 수 있도록 공동배양 세팅을 디자인한다 (확실히, 항-TCR/CD3 항체가 공동배양물 중에서 모든 T 세포를 활성화시킬 것이다). 이를 위해, 본 발명자들은 본 발명자들이 생성한, 키메라 H-2K^b-CD3ζ (K^b-CD3ζ) 및 H-2K^d-CD3ζ (K^d-CD3ζ) MHC-I 중쇄를 코딩하는 2개의 유전자를 이용할 것이다. 본 발명자들은 이미 상기 두 유전자가 TCR 교차 결합과 유사한 규모로 Ab-매개 가교 결합 이후에 선택적으로 T 세포를 활성화시킨다고 밝힌 바 있다. 하기의 연속된 기능 실험에서, 이들 도구는 3-4일 동안 상이한 비율로 mRNA-형질감염된 Tr1 및 Teff 세포를 혼합하는 데 및 CFSE 희석 및 세포내 IFN-γ 염색을 사용하여 활성화된 Teff의 증식 및 이펙터 기능, 둘 모두를 억제시킬 수 있는 활성화된 Tr1 세포 (비-활성화된 또는 RFP+ 비-Tr1 세포 대비)의 능력을 평가하는 데 사용된다.

실시예 6. 인간 질환에 대한 마우스 모델에서의 IL-10-형질도입된 세포의 생체내 지속 및 억제 기능 평가.

동계 야생형 마우스에서 IL-10-형질도입된 NOD 또는 B6 CD4 T 세포의 생체내 지속 및 그의 표현형 유지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 최근 본 발명자들의 T1D 실험 시스템에서 확립된 프로토콜 (36)을 사용한다. 간략하면, 10x106 세포를 꼬리 정맥 내로 주사한다. 비장 및 말초 림프절을 주사 후 1, 7, 및 14일째 수거하고, CD4+IL-10+LAG-3+CD49b+ T 세포를 (주사를 맞지 않은 마우스에서의 배경 염색 수준과 비교하여) 유세포 분석법에 의해 확인한다.

이어서, 인간 질환, 예컨대, T1D 또는 IBD에 대한 마우스 모델을 이용하여, 생체내 생리학적 조건하에서 memIL-10-형질도입된 T 세포의 실제 억제 기능을 시험한다.

실시예 7. 레트로바이러스에 의해 형질도입된 인간 CD4 T 세포에서 memIL -10의 발현 및 특징화.

인간 CD4 T 세포의 레트로바이러스 형질도입의 표현형 및 기능적 결과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 마겐 다비드 아돔의 혈액 서비스 센터(Blood Services Center of Magen David Adom: 이스라엘)를 통해 건강한 공여자로부터 수득된 혈액 샘플로부터 CD4 T 세포를 단리시켰다. 2개의 독립 생체외 실험 중 첫 번째 것은 도 8에 제시되어 있다. 본 실험에서는 세포를 형질도입 후 18일 동안 배양물 중에 유지시키고, 마커 LAG-3, CD49b, PD-1, 4-1BB, CD25 및 IL-10Rα에 대한 표현형 분석을 형질도입 후 1, 5, 및 18일째 유세포 분석법에 의해 수행하였다. 본 발명자들의 결과에 따르면, 예상된 Tr1 표현형과 연관이 있는 이들 세포 표면 마커들 모두 전체 실험 기간 동안 동일한 배양 디쉬에서 성장된 memIL-10-음성 세포와 비교하였을 때, memIL-10-발현 세포에서 유의적으로 증가된 것이 확인된다.

상이한 혈액 샘플에 대해 제2 실험을 수행하였고, LAG-3, CD49b 및 PD-1에 대해 수행된 유세포 분석법 (도 9)은 제1 실험에서 수득된 결과와 일치한다. 이들 두 실험으로부터, 레트로바이러스 형질도입을 통한 인간 CD4 T 세포에서의 memIL-10의 장기간 발현이 상기 세포에 TR-1-유사 표현형을 부여한다고 결론지을 수 있다.

참고문헌

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Lys Ile 165 170 175 Arg Asn Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 180 185 190 Ser Thr Lys Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys 195 200 205 Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp 210 215 220 Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp 225 230 235 240 Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu 245 250 255 Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val 260 265 270 Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn 275 280 285 Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys 290 295 300 His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val 305 310 315 320 Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met 325 330 335 Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met 340 345 350 Lys Ile Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly 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cgggagtggt gagggtagta ctaagggtag cccaggccag 600 ggcacccagt ctgagaacag ctgcacccac ttcccaggca acctgcctaa catgcttcga 660 gatctccgag atgccttcag cagagtgaag actttctttc aaatgaagga tcagctggac 720 aacttgttgt taaaggagtc cttgctggag gactttaagg gttacctggg ttgccaagcc 780 ttgtctgaga tgatccagtt ttacctggag gaggtgatgc cccaagctga gaaccaagac 840 ccagacatca aggcgcatgt gaactccctg ggggagaacc tgaagaccct caggctgagg 900 ctacggcgct gtcatcgatt tcttccctgt gaaaacaaga gcaaggccgt ggagcaggtg 960 aagaatgcct ttaataagct ccaagagaaa ggcatctaca aagccatgag tgagtttgac 1020 atcttcatca actacataga agcctacatg acaatgaaga tacgaaacgg aggtggcgga 1080 tccggaggtg gctccggagg tggctcctcg agccagccca ccatccccat cgtgggcatc 1140 attgctggcc tggttctctt tggagctgtg atcactggag ctgtggtcgc tgctgtgatg 1200 tggaggagga agagctcaga tagaaaagga gggagctact ctcaggctgc aagcagtgac 1260 agtgcccagg gctctgatgt gtctctcaca gcttgtaaag tgtga 1305 <210> 27 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 180 185 190 Ser Thr Lys Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys 195 200 205 Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp 210 215 220 Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp 225 230 235 240 Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu 245 250 255 Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val 260 265 270 Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn 275 280 285 Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys 290 295 300 His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val 305 310 315 320 Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met 325 330 335 Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met 340 345 350 Lys Ile Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val 385 390 395 400 Leu Phe Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp 405 410 415 Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala 420 425 430 Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys 435 440 445 <210> 28 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60 ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120 cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180 ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240 caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300 caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360 ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420 caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480 tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaacggcagt 540 acttcgggca gtggtaagcc cgggagtggt gagggtagta ctaagggtag cccaggccag 600 ggcacccagt ctgagaacag ctgcacccac ttcccaggca acctgcctaa catgcttcga 660 gatctccgag atgccttcag cagagtgaag actttctttc aaatgaagga tcagctggac 720 aacttgttgt taaaggagtc cttgctggag gactttaagg gttacctggg ttgccaagcc 780 ttgtctgaga tgatccagtt ttacctggag gaggtgatgc cccaagctga gaaccaagac 840 ccagacatca aggcgcatgt gaactccctg ggggagaacc tgaagaccct caggctgagg 900 ctacggcgct gtcatcgatt tcttccctgt gaaaacaaga gcaaggccgt ggagcaggtg 960 aagaatgcct ttaataagct ccaagagaaa ggcatctaca aagccatgag tgagtttgac 1020 atcttcatca actacataga agcctacatg acaatgaaga tacgaaacgg aggtggcgga 1080 tccggaggtg gctccggagg tggctcctcg agcggaggtg gcggatccgg aggtggctcc 1140 ggaggtggct cctcgagcca gcccaccatc cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt 1200 ctctttggag ctgtgatcac tggagctgtg gtcgctgctg tgatgtggag gaggaagagc 1260 tcagatagaa aaggagggag ctactctcag gctgcaagca gtgacagtgc ccagggctct 1320 gatgtgtctc tcacagcttg taaagtgtga 1350 <210> 29 <211> 677 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 180 185 190 Ser Thr Lys Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys 195 200 205 Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp 210 215 220 Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp 225 230 235 240 Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu 245 250 255 Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val 260 265 270 Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn 275 280 285 Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys 290 295 300 His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val 305 310 315 320 Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met 325 330 335 Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met 340 345 350 Lys Ile Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Ser Ser Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 370 375 380 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 385 390 395 400 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 405 410 415 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 420 425 430 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 435 440 445 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 450 455 460 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His 465 470 475 480 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 485 490 495 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 500 505 510 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 515 520 525 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 530 535 540 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 545 550 555 560 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala 565 570 575 Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly 580 585 590 Cys Phe Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe 595 600 605 Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His 610 615 620 Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu 625 630 635 640 Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser 645 650 655 Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly 660 665 670 Gln Gly Pro Gln Ser 675 <210> 30 <211> 2034 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60 ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120 cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180 ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240 caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300 caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360 ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420 caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480 tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaacggcagt 540 acttcgggca gtggtaagcc cgggagtggt gagggtagta ctaagggtag cccaggccag 600 ggcacccagt ctgagaacag ctgcacccac ttcccaggca acctgcctaa catgcttcga 660 gatctccgag atgccttcag cagagtgaag actttctttc aaatgaagga 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1560 attactcccc agtatgactt tgaggtcctc agaaacctgg agccatggac aacttattgt 1620 gttcaagttc gagggtttct tcctgatcgg aacaaagctg gggaatggag tgagcctgtc 1680 tgtgagcaaa caacccatga cgaaacggtc ccctcctgga tggtggccgt catcctcatg 1740 gcctcggtct tcatggtctg cctggcactc ctcggctgct tcgccttgct gtggtgcgtt 1800 tacaagaaga caaagtacgc cttctcccct aggaattctc ttccacagca cctgaaagag 1860 tttttgggcc atcctcatca taacacactt ctgtttttct cctttccatt gtcggatgag 1920 aatgatgttt ttgacaagct aagtgtcatt gcagaagact ctgagagcgg caagcagaat 1980 cctggtgaca gctgcagcct cgggaccccg cctgggcagg ggccccaaag ctag 2034

Claims

막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 포함하는 막-결합된 동종이량체 IL-10 (mem-IL10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 동종이량체 IL-10이 가요성 힌지를 통해 상기 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 것인 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동종이량체 IL-10이 단일 쇄 구조로 연결된 제1 및 제2 IL-10 단량체를 포함하고, 이에 따라 제1 IL-10 단량체의 C-말단이 제2 IL-10 단량체의 N-말단에 제1 가요성 링커를 통해 연결된 것인 핵산 분자.
제3항에 있어서, 상기 제1 가요성 링커가 아미노산 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호 1)을 갖는 것인 핵산 분자.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가요성 힌지가 CD8α의 힌지 영역, IgG의 중쇄의 힌지 영역, IgD의 중쇄의 힌지 영역; IL-10R β 쇄의 세포외 스트레치; 및 적어도 하나의 Gly4Ser(Gly3Ser)₂ 서열을 포함하는 최대 28개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 제2 가요성 링커로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 핵산 분자.
제5항에 있어서, 상기 제2 가요성 힌지가 아미노산 서열 Gly₄Ser(Gly₃Ser)₂를 포함하는 21개의 아미노산 서열 (본원에서 "짧은 링커"로 지칭; 서열식별번호 13)을 포함하는 것인 핵산 분자.
제5항에 있어서, 상기 제2 가요성 링커가 아미노산 서열 Gly₄Ser(Gly₃Ser)₂Ser₂(Gly₃Ser)₃을 포함하는 28개의 아미노산 서열 (본원에서 "긴 링커"로 지칭; 서열식별번호 15)을 포함하는 것인 핵산 분자.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 SSQPTIPI (서열식별번호 17)의 아미노산 브릿지를 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단-세포내 스트레치가 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 분자, 바람직하게, HLA-A2; 인간 CD28; 또는 인간 IL-10R β 쇄로부터 선택되는 인간 MHC 클래스 I 분자의 중쇄로부터 유래된 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 mem-IL10의 아미노산 서열이 서열식별번호 25에 기재된 바와 같은 HLA-A2의 막횡단-세포내 스트레치에 짧은 제2 가요성 링커 및 연결 펩티드를 통해 연결된 동종이량체 IL-10을 포함하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 mem-IL10의 아미노산 서열이 서열식별번호 27에 기재된 바와 같은 HLA-A2의 막횡단-세포내 스트레치에 긴 제2 가요성 링커 및 연결 펩티드를 통해 연결된 동종이량체 IL-10을 포함하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 동종이량체 IL-10이 서열식별번호 29에 기재된 바와 같은 짧은 링커를 통해 본질적으로 완전한 인간 IL-10R β 쇄의 N-말단에 연결된 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터.
제14항에 있어서, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 감마바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스 바이러스, 알파바이러스, 및 헤르페스 바이러스로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스인 바이러스 벡터.
제14항 또는 제15항의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제14항 또는 제15항의 바이러스 벡터를 포함하는 포유동물 조절 T 세포 (Treg).
제17항에 있어서, 막횡단-세포내 스트레치에 연결된 동종이량체 IL-10을 그의 표면 상에서 발현하는 포유동물 Treg.
제17항 또는 제18항에 있어서, 인간 Treg인 포유동물 Treg.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 마커 CD49b 및 LAG-3을 나타내는 안정한 Tr1 표현형을 갖는 포유동물 Treg.
제20항에 있어서, PD-1, 4-1BB, CD25 및 IL-10Rα를 추가로 나타내는 포유동물 Treg.
CD4 T 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 그를 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시켜, 상기 CD4 T 세포에 안정한 Tr1 표현형을 부여하고, 이에 따라 안정한 Tr1 표현형을 갖는 Treg를 제조하는 단계를 포함하는, 안정한 Tr1 표현형을 갖는 동종이계 또는 자가유래 Treg를 제조하는 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 억제를 필요로 하는 대상체에서 면역 억제를 증가시키는 데 사용하기 위한 포유동물 Treg.
제23항에 있어서, 면역계의 과도한 활성 또는 원치않는 활성의 소견을 보이는 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 포유동물 Treg.
제24항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 자가면역 질환, 알레르기, 천식, 및 기관 및 골수 이식으로부터 선택되는 것인 포유동물 Treg.
제25항에 있어서, 자가면역 질환이 제1형 당뇨병; 류마티스 관절염; 건선; 건선성 관절염; 다발성 경화증; 전신 홍반성 루프스; 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 결장염; 애디슨병; 그레이브스병; 쇼그렌 증후군; 하시모토 갑상선염; 중증 근무력증; 혈관염; 악성 빈혈; 셀리악병; 및 아테롬성동맥경화증으로부터 선택되는 것인 포유동물 Treg.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 Treg가 인간 Treg이고, 인간 대상체에서 상기 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용되는 것인 포유동물 Treg.
제27항에 있어서, 상기 인간 Treg가 동종이계 Treg인 포유동물 Treg.