KR20210003810A - Treg 세포의 억제 특성을 향상시키기 위한 방법 - Google Patents

Treg 세포의 억제 특성을 향상시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포(Treg) 집단에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함하는 면역 반응을 억제하는 Treg의 능력을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

TREG 세포의 억제 특성을 향상시키기 위한 방법
발명의 분야
본 발명은 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 능력을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제공되는 조작된 Treg 및 이러한 조작된 Treg의 방법 및 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
조절 T 세포(Treg)는 면역계의 활동을 조절하는 T 세포의 한 유형이다. 일반적으로, Treg는 자극에 대한 면역 반응을 하향 조절하는 면역억제성이다. 특히, Treg는 통상적인 T 세포의 유도 및 증식을 억제하며, 이중 일부 유형은 면역 반응에 직접 관여한다(예를 들어, 세포 독성 T 세포). Treg의 억제 효과는 문제의 항원 내에서 발견되는 에피토프와 일치하는 펩티드를 인식하는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 작제물의 발현에 의해 특정 항원을 향할 수 있다. 유사하게는, Treg의 억제 효과는 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현에 의해 특정 표적을 향할 수 있다. 통상적인 T 세포는 상기 세포에서 FOXP3를 발현함으로써 생체외에서 조절 표현형 쪽으로 분화될 수 있다.
자가면역 및 염증성 중추 신경계(CNS) 질환에서 면역계는 자가-항원을 공격하다. 예를 들어, 젊은 성인들 사이에서 가장 흔한 신경 장애인 다발성 경화증(MS)에서 면역계는 중추 신경계 뉴런의 수초를 공격하다.
자가면역 및 염증성 CNS 질환에 대한 현재 치료법은 일반적으로 면역계를 억제한다. 예를 들어, 한 치료법은 골수 이식과 함께 세포 증식 억제제 및 면역 억제제 투여를 포함한다. 자가 조혈 줄기 세포 이식은 일부 대상체에 대한 지속적인 유익 효과를 가질 수 있으나, 이 절차에는 상당한 독성 및 위험과 관련된 공격적인 골수-절제 요법이 필요하다.
임상 재발 빈도를 줄이기 위해 여러 가지 질병 조절 치료(DMT)가 승인되었지만 대부분의 환자는 현재 치료 일정 하에 임상적으로 계속해서 악화된다. DMT 또는 줄기 세포 이식은 자가면역 및 염증성 CNS 질환의 면역병리학의 CNS-특이적 억제를 매개할 수 없다.
현재 자가면역 및 염증성 CNS 질환에 대한 효과적인 치료법은 존재하지 않는다. 치료는 일반적으로 면역계를 전반적으로 억제하여 단순히 증상을 감소시키는데 중점을 둔다. CNS 질환의 발병 및 진행과 관련된 국소 면역 반응을 특정하게 표적으로 하는 요법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명자들은 놀랍게도 조절 T 세포(Treg)(이미 내인성 FOXP3을 발현함)에서 외인성 FOXP3 발현이 이의 조절 기능을 향상시킴을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 능력을 향상시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 Treg는 천연 Treg 또는 통상적인 T 세포로부터 발생된 유도성 Treg이다. 예를 들어, 본 발명의 Treg는 천연 Treg 또는 통상적인 T 세포로부터 생체내에서 발생하는 유도성 Treg이다. 적합한 Treg 세포는 흉선-유래된 천연 Treg(nTreg) 세포 및 말초 생성되는 유도성 Treg(iTreg) 세포를 포함한다. 즉, 본 발명의 Treg는 내인성 FOXP3을 발현한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 (예를 들어, 외인성 FOXP3을 도입함으로써) 이미 내인성 FOXP3을 발현하는 Treg에서 FOXP3의 발현 증가가 내인성 FOXP3을 발현하지 않는 통상적인 T 세포에서 내인성 FOXP3을 발현함으로써 제공된 조절 기능보다 더 높은 정도로 Treg의 조절 기능을 향상시킨다는 것을 결정하였다.
본 발명자들은 이미 내인성 FOXP3을 발현하는 Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것이 대상체에의 투여 후 생체내에서 Treg 기능성 프로파일의 개선된 보유를 가능하게 함을 추가로 결정하였다. 예를 들어, 외인성 FOXP3을 발현하지 않는 천연 Treg는 대상체에의 투여 후 이의 Treg 프로파일을 손실할 수 있음이 결정되었다 - 예를 들어, 외인성 FOXP를 발현하지 않는 천연 Treg는 FOXP3 발현 수준을 감소시킬 수 있으며, 대상체에의 투여 후 소정 기간 후에 염증유발성의 이펙터 사이토카인을 생성할 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 Treg는 FOXP3 발현을 보유할 수 있으며, 대상체에의 투여 후 소정 기간 후에 염증유발성의 이펙터 사이토카인을 생성할 수 있는 능력이 감소될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 Treg는 천연 Treg이다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 Treg 집단을 제공하고, 제1 Treg 집단에서 FOXP3 발현을 증가시켜 제2 Treg 집단을 생성시키는 것을 포함하는 조절 T 세포(Treg) 집단을 생성하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 억제하는 Treg의 능력을 향상시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 발현은 FOXP3 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 Treg 내에 도입함으로써 증가된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 능력을 향상시키기 위한 방법은
(a) 세포 집단으로부터 Treg를 분리하고;
(b) Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
적합하게는, Treg는 Treg 집단(즉, 복수의 Treg)을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는 조작된 Treg를 제공한다.
본 발명은 또한 조작되지 않은 Treg보다 더 높은 FOXP3 발현을 갖는 조작된 Treg를 제공한다.
일부 구현예에서, 조작된 Treg는 FOXP3 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조작된 Treg를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조작된 Treg 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 의약의 제조에서 본 발명의 조작된 Treg의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에게 본 발명의 조작된 Treg 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
도 1은 펩티드("*"로 표시)가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 Tconv 세포의 증식, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대)의 존재하에 동일한 세포의 증식을 보여준다.
도 2는 펩티드("*"로 표시)가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 Tconv 세포의 IL-2 생산, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대)의 존재하에 동일한 세포의 IL-2 생산을 보여준다.
도 3은 펩티드("*"로 표시)가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 (도 1과 상이한 공여자로부터의) Tconv 세포의 증식, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대)의 존재하에 동일한 세포의 증식을 보여준다.
도 4는 펩티드("*"로 표시)가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 (도 2와 상이한 공여자로부터의) Tconv 세포의 IL-2 생산, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대)의 존재하에 동일한 세포의 증식을 보여준다.
도 5는 모크-형질도입된 Treg 또는 TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 Treg에서 형질도입 후 d7-10에서 흐름세포측정에 의해 분석된 Treg 마커(FOXP3, CD25 및 CTLA-4)의 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다. 점은 개별 실험을 나타낸다. 통계 분석에는 일원 ANOVA가 사용되었다 p <0.05 *, p <0.005 **.
도 6은 형질도입된 Treg에서 FOXP3, CD25 및 CTLA-4의 MFI를 보여준다. 각각의 선은 TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 동일한 Treg 상의 마커의 MFI를 보여주는 단일 실험을 나타낸다.
도 7은 펩티드가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 (도 1 및 3과 다른 공여자로부터의) Tconv 세포의 증식, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대), TCR 작제물과 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Tconv 세포, 즉 유도성 Treg(적색 막대, 각 데이터 세트의 오른쪽 막대)의 존재하에 동일한 세포의 증식을 보여준다.
도 8은 펩티드가 있거나 없는 TCR 작제물로 형질도입된 (도 7과 동일한 공여자로부터의) Tconv 세포의 IL-2 생산 수준, 및 다양한 Treg:Tconv 비율에서 모크-형질도입된 Treg(백색 막대), TCR 작제물로 형질도입된 Treg(흑색 막대), TCR 작제물과 FOXP3으로 형질도입된 Treg(회색 막대) 또는 TCR 작제물 및 FOXP3으로 형질도입된 Tconv, 즉 유도성 Treg(적색 막대, 각 데이터 세트의 오른쪽 막대)의 존재하에 동일한 세포의 IL-2 생산 수준을 보여준다.
도 9 - TCR 형질도입된 조절 T 세포는 조사된 숙주에 생착될 수 있으나, TCR+FOXP3- 세포의 축적을 방지하기 위해 외인성 FOXP3 발현을 필요로 한다.
Thy1.1+CD4+CD25+ Treg를 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 마우스의 림프절 및 비장 세포에서 비드 정렬에 의해 분리하였다. Treg에 TCR, TCR+뮤린 FOXP3을 형질도입하거나 바이러스-비함유 상청액(모크)과 함께 배양하였다. 형질도입 후 1일차에 TCR 또는 TCR+FOXP3 형질도입된 세포를 4Gy 조사로 컨디셔닝된 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 숙주에 주입하였다. 7주 후 흐름세포측정을 이용하여 형질도입된 Treg의 생착을 결정하였다 A. 형질도입 효율은 형질도입 후 d1에서 인간 가변 2.1 및 뮤린 Foxp3의 발현을 통해 결정하였다 B. TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 Treg를 받은 마우스의 비장 세포를 Thy1.1로 염색하여 전달된 세포(상단 패널) 및 FOXP3 및 TCR(하단 패널)을 확인하였다 C. 누적 데이터는 TCR 또는 TCR+FOXP3로 형질도입된 Treg에 있어서 주입 일에 대한 형질도입 효율의 배수 변화(왼쪽 패널) 및 형질도입된 세포의 절대 수의 배수 변화(오른쪽 패널)를 보여준다 (n = 3). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 보여준다. 독립표본 t 테스트에 의한 통계 분석 D. 전달 후 7주차에 형질도입된 세포 내에서 FOXP3의 대표적인 발현. 그래프는 7주차에 형질도입된 집단 내 FOXP3+ 세포의 누적 백분율(왼쪽) 및 주입 일에 대한 FOXP3+ 세포의 배수 변화(n=3)를 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 보여준다. * p => 0.05, ** p => 0.01은 독립표본 t 테스트에 의해 결정된다.
도 10 - 외인성 FOXP3을 발현하는 Treg는 생체내에서 7주 후에 Treg 기능을 보유하는 반면, 외인성 FOXP3을 발현하지 않는 Treg는 이펙터 사이토카인을 생성하는 능력을 획득한다.
A 비장 세포는 무관한 펩티드 또는 10uM MBP로 펄싱된 CD86+HLA-DR4+CHO 세포와 함께 4시간 동안 배양하였다. IL-2 및 IFNg의 생산은 흐름세포측정에 의해 결정되었다. FACS 플롯은 TCR 단독 발현 Treg를 함유하는 CD45.1 세포(상단 패널) 및 TCR+FOXP3을 발현하는 Treg를 함유하는 Thy1.1 세포를 보여준다. B 그래프는 TCR-발현(짙은 회색) 및 TCR+FOXP3-발현(연회색) Treg에 의한 누적 IL-2 및 IFNg 생산을 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 보여준다(n = 3).
도 11 - (A) TCR 알파 및 베타 사슬 및 (B) FOXP3+TCR 알파 및 베타 사슬을 인코딩하는 예시적인 레트로바이러스 벡터의 개략도를 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 능력을 향상시키기 위한 방법을 제공한다.
조절 T 세포
용어 "조절 T 세포"(Treg)는 마커 CD4, CD25 및 FOXP3를 발현하는 T 세포(CD4+CD25+FOXP3+)를 의미한다. Treg는 표면 단백질 CD127의 부재하에 또는 저수준 발현(CD4+CD25+CD127- 또는 CD4+CD25+CD127저)과 조합하여 세포 표면 마커 CD4 및 CD25를 이용하여 확인될 수 있다. Treg는 또한 세포 표면에서 높은 수준의 CTLA-4(세포독성 T-림프구 관련 분자-4) 또는 GITR(글루코코르티코이드-유도 TNF 수용체)을 발현할 수 있다. 통상적인 T 세포와 달리 Treg는 IL-2를 생산하지 않으며, 따라서 기준선에서 무력 상태이다.
용어 "천연 Treg"는 흉선-유래된 Treg를 의미한다. 천연 Treg는 CD4+CD25+FOXP3+헬리오스+뉴로필린1+이다. 용어 "천연 Treg"는 흉선 외부의 통상적인 T 세포에서 발생하는 "유도성 Treg"로부터 흉선 유래된 Treg를 구별한다. 유도성 Treg와 비교하여, 천연 Treg는 PD-1(프로그래밍된 세포 사멸-1, pdcd1), 뉴로필린 1(Nrp1), 헬리오스(Ikzf2) 및 CD73의 발현이 더 높다. 천연 Treg는 개별적으로 헬리오스 단백질 또는 뉴로필린 1(Nrp1)의 발현을 기준으로 하여 유도성 Treg와 구별될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유도성 조절 T 세포"(iTreg)는 흉선 외부의 성숙한 CD4+ 통상적 T 세포로부터 발생하는 CD4+CD25+FOXP3+헬리오스-뉴로필린 1- T 세포를 의미한다. 예를 들어, iTreg는 IL-2 및 TGF-β의 존재하에 CD4+CD25-FOXP3- 세포로부터 시험관내에서 유도될 수 있다.
적합하게는, Treg는 세포의 내인성 FoxP3 유전자로부터 FOXP3을 발현한다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+ Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+CD127- Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+CD127저 Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+CD127-CD45RA+ Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+CD127저CD45RA+ Treg일 수 있다
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+CD127- Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+CD127저 Treg일 수 있다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+ 헬리오스+ Treg이다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+ 뉴로필린 1+ Treg이다.
적합하게는, Treg는 CD4+CD25+FOXP3+ 헬리오스+ 뉴로필린 1+ Treg이다.
적합하게는, Treg는 인간 Treg이다. 적합하게는, Treg는 인간 Treg이고, FOXP3는 인간 FOXP3이다.
통상적인 T 세포를 의미하는 용어 "Tconv 세포"는 Treg가 아닌 T 세포를 지칭한다.
한 양태에서, 본 발명의 Treg는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 특히, 본 발명의 Treg는 시험관내에서 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포는 전구 세포이다.
본원에 사용된 용어 "줄기 세포"는 동일한 유형의 더 많은 줄기 세포를 무한정 생성할 수 있고, 분화에 의해 다른 특수화된 세포가 생성될 수 있는 미분화된 세포를 의미하다. 줄기 세포는 다능성이다. 줄기 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전구 세포"는 분화하여 하나 이상의 유형의 세포를 형성할 수 있지만 시험관내에서 제한된 자가-재생력을 갖는 세포를 의미한다.
적합하게는, 세포는 Treg와 같은 T 세포로 분화될 수 있다.
적합하게는, 세포는 Treg와 같이 FOXP3을 발현하는 T 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는다.
적합하게는, 세포는 배아 줄기 세포(ESC)일 수 있다. 적합하게는, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포이다. 적합하게는, 세포는 유도성 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 적합하게는, 세포는 제대혈로부터 수득될 수 있다. 적합하게는, 세포는 성체 말초혈로부터 수득될 수 있다.
일부 양태에서, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)는 제대혈로부터 수득될 수 있다. 제대혈은 당업계에 공지된 기술에 따라 채취될 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,147,626 및 7,131,958).
한 양태에서, HSPC는 만능 줄기 세포 공급원, 예를 들어 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 및 배아 줄기 세포(ESC)로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 및 전구 세포" 또는 "HSPC"는 항원 마커 CD34(CD34+) 및 이러한 세포의 집단을 발현하는 세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "HSPC"는 항원 마커 CD34의 존재(CD34+) 및 계통(lin) 마커의 부재에 의해 확인된 세포를 지칭한다. CD34+ 및/또는 Lin(-) 세포를 포함하는 세포 집단은 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포를 포함한다.
HSPC는 대퇴골, 고관절, 갈비뼈, 흉골 및 기타 뼈를 포함하는 성체의 골수에서 얻거나 분리할 수 있다. HSPC를 포함하는 골수 흡입물은 바늘과 주사기를 사용하여 고관절에서 직접 얻거나 분리할 수 있다. HSPC의 다른 공급원에는 제대혈, 태반혈, 가동화된 말초혈, 와튼 젤리, 태반, 태아 혈액, 태아 간 또는 태아 비장이 포함된다. 특정 구현예에서, 치료 적용에 사용하는데 충분한 양의 HSPC를 채취하는 것은 대상체에서 줄기 및 전구 세포를 가동화하는 것을 필요로 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도성 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 만능 상태로 재프로그래밍된 비-만능 세포를 지칭한다. 대상체의 세포가 만능 상태로 재프로그래밍되면, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(각각 HSC 및 HPC)와 같은 원하는 세포 유형으로 프로그래밍될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍"은 세포의 효능을 덜 분화된 상태로 증가시키는 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "프로그래밍"은 세포의 효능을 감소시키거나 세포를 보다 분화된 상태로 분화시키는 방법을 지칭한다.
면역 반응
표현 "면역 반응을 억제하는 능력을 향상시키는"은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)의 억제 효과와 비교하여 면역 반응에 대한 Treg (또는 이러한 Treg 집단)의 억제 효과를 증가시키는 것을 의미한다.
용어 "면역 반응"은 병원체 또는 자가항원과 같은 자극에 반응하여 면역계에 의해 촉진되는 다수의 생리학적 및 세포적 효과를 지칭한다. 이러한 효과의 예는 Tconv 세포의 증식 증가 및 사이토카인의 분비를 포함한다. 임의의 이러한 효과는 면역 반응의 강도의 지표로서 사용될 수 있다. 비-변형된 Treg와 비교하여 변형된 Treg의 존재하에 Tconv에 의한 상대적으로 더 약한 면역 반응은 면역 반응을 억제하는 변형된 Treg의 상대적 향상을 나타낼 것이다. 예를 들어, 사이토카인 분비의 상대적인 감소는 더 약한 면역 반응을 나타내며, 따라서 면역 반응을 억제하는 Treg의 능력 향상을 나타낸다.
면역 반응 강도의 지표 및 이에 따른 Treg의 억제 능력을 측정하기 위한 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 특히, 항원-특이적 Tconv 세포는 Treg와 공동-배양될 수 있는데, Tconv 세포로부터의 반응을 자극하기 위해 상응하는 항원의 펩티드가 공동-배양물에 첨가될 수 있다. Tconv 세포의 증식 정도 및/또는 펩티드 첨가에 반응하여 이들이 분비하는 사이토카인 IL-2의 양은 공동-배양된 Treg의 억제 능력의 지표로 사용될 수 있다.
FOXP3 발현이 증가된 본 발명의 Treg와 공동 배양된 항원-특이적 Tconv 세포는 FOXP3 발현이 증가되지 않은 상응하는 Treg와 공동-배양된 동일한 Tconv 세포보다 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40% 적게 증식할 수 있다.
FOXP3 발현이 증가된 본 발명의 Treg와 공동-배양된 항원-특이적 Tconv 세포는 FOXP3 발현이 증가되지 않은 상응하는 Treg와 공동-배양된 상응하는 Tconv 세포보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 더 큰 이펙터 사이토카인의 감소를 보여줄 수 있다.
FOXP3 발현이 증가된 본 발명의 Treg와 공동-배양된 항원-특이적 Tconv 세포는 FOXP3 발현이 증가되지 않은 상응하는 Treg와 공동-배양된 상응하는 Tconv 세포보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이하로 더 적게 이펙터 사이토카인을 생성할 수 있다.
이펙터 사이토카인은 IL-2, IL-17, TNFα, GM-CSF, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 이펙터 사이토카인은 IL-2, IL-17, TNFα, GM-CSF 및 IFN-γ로부터 선택될 수 있다.
FOXP3 발현이 증가된 본 발명의 Treg와 공동-배양된 항원-특이적 Tconv 세포는 FOXP3 발현이 증가하지 않은 상응하는 Treg의 세포 수의 ½, 1/4, 1/8, 1/10 또는 1/20로 IL-2 생산 억제를 달성할 수 있다.
FOXP3
"FOXP3"은 포크헤드 박스 P3 단백질의 약칭이다. FOXP3은 전사 인자의 FOX 단백질 계열의 구성원이며, 조절 T 세포의 발달 및 기능에서 조절 경로의 마스터 조절인자로서 기능한다.
"FOXP3 발현 증가"는 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)와 비교하여 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 FOXP3 mRNA 및/또는 단백질의 수준을 증가함을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 FOXP3 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 FOXP3 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg의 집단)에서의 수준보다 적어도 1.5배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 FOXP3 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg의 집단)에서의 수준보다 적어도 2배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 FOXP3 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg의 집단)에서의 수준보다 적어도 5배 크게 증가될 수 있다.
특정 mRNA 및 단백질 수준을 측정하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. Treg와 같은 세포 집단의 mRNA 수준은 Affymetrix ebioscience 프라임 플로우 RNA 검정, 노던 블롯팅, 유전자 발현의 순차적 분석(SAGE) 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다. 세포 집단의 단백질 수준은 흐름 세포 측정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC/MS), 웨스턴 블롯팅 또는 효소-결합 면역 흡착 검정(ELISA)과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 발현은 FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리된 Treg 내에 도입함으로써 증가된다.
용어 "도입"은 형질감염 및 형질도입 방법 둘 모두를 포함하는 외래 DNA를 세포에 삽입하기 위한 방법을 지칭한다. 형질감염은 비-바이러스 방법으로 핵산을 세포 내에 도입하는 공정이다. 형질도입은 바이러스 벡터를 통해 외래 DNA를 세포내에 도입하는 공정이다.
"FOXP3 폴리펩티드"는 FOXP3 활성을 갖는 폴리펩티드, 즉 FOXP3 표적 DNA에 결합할 수 있고 Treg의 발생 및 기능을 조절하는 전사 인자로서 기능할 수 있는 폴리펩티드이다. 전사 인자 활성을 측정하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 전사 인자 DNA-결합 활성은 ChIP로 측정될 수 있다. 전사 인자의 전사 조절 활성은 전사 인자가 조절하는 유전자의 발현 수준을 정량화하여 측정할 수 있다. 유전자 발현은 노던 블롯팅, SAGE, qPCR, HPLC, LC/MS, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA와 같은 기술을 사용하여 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준을 측정하여 정량화될 수 있다. FOXP3에 의해 조절되는 유전자는 IL-2, IL-4 및 IFN-γ와 같은 사이토카인을 포함한다(Siegler et al. Annu. Rev. Immunol. 2006, 24: 209-26, 본원에 참조로 포함됨).
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 동의어인 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드는 합성 RNA/DNA 서열, cDNA 서열 또는 부분 게놈 DNA 서열과 같은 임의의 적합한 유형의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 "단백질"과 동의어이며, 전형적으로 인접 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 의미한다.
다수의 상이한 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드의 퇴화의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들어 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형은 당업계에 공지되어 있다. 여기에는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 추가가 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 분리된 형태 또는 재조합 형태일 수 있다. 이는 벡터에 혼입될 수 있고 벡터는 숙주 세포에 혼입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화될 수 있다. 상이한 세포는 이들의 특정 코돈의 사용이 상이하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 풍부함의 편향에 해당한다. 서열의 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적 풍부도와 일치하도록 맞춤화함으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 뮤린 질환 모델에서 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 인간 대상체에서 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다.
HIV 및 기타 렌티바이러스를 포함하는 많은 바이러스는 많은 희귀 코돈을 사용하며, 이들을 일반적으로 사용되는 포유동물 코돈에 상응하게 변경함으로써, 포유동물 생산자 세포에서 패키징 성분의 증가된 발현이 달성될 수 있다. 포유동물 세포뿐만 아니라 다양한 다른 유기체에 대한 코돈 사용 표는 당업계에 알려져 있다. 코돈 최적화는 또한 mRNA 불안정성 모티프 및 숨겨진 슬라이스 부위의 제거를 포함할 수 있다.
FOXP3 폴리펩티드 서열
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 인간 FOXP3의 폴리펩티드 서열, 예컨대 UniProtKB 수탁 Q9BZS1 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다:
Figure pct00001
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3과 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 변이체, 예를 들어 천연 변이체일 수 있다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아이소형이다. 예를 들어, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3에 비해 아미노산 위치 72-106의 결실을 포함할 수 있다. 대안적으로, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3에 비해 아미노산 위치 246-272의 결실을 포함할 수 있다.
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4 또는 이의 기능적 단편을 포함한다:
Figure pct00002
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 적합하게는, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4와 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4의 변이체, 예를 들어 천연 변이체일 수 있다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아이소형 또는 이의 기능적 단편이다. 예를 들어, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4에 비해 아미노산 위치 72-106의 결실을 포함할 수 있다. 대안적으로, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4에 비해 아미노산 위치 246-272의 결실을 포함할 수 있다.
FOXP3 폴리뉴클레오티드 서열
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다:
Figure pct00005
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
적합하게는, FOXP3 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화될 수 있다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
서열 비교
서열 비교는 육안으로 또는 보다 일반적으로 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 공개되고 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열간의 서열 동일성을 계산할 수 있다.
서열 동일성은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있으며, 즉, 한 서열이 다른 서열과 정렬되고 한 서열의 각 아미노산이 다른 서열의 상응하는 아미노산과 한 번에 하나의 잔기 씩 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는(ungapped)" 정렬로 불린다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 상대적으로 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다(예를 들어, 50개 미만의 연속 아미노산).
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어 다른 동일한 서열 쌍에서, 한 번의 삽입 또는 결실이 다음 아미노산 잔기가 정렬되지 못하게 할 것이라는 점을 고려하지 않았으며, 따라서 포괄 정렬이 수행될 때 상동성 %가 잠재적으로 크게 감소하게 된다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 과도하게 불이익을 주지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 보다 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 동일한 수의 동일한 아미노산에 있어서 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬(비교된 두 서열 간의 더 높은 관련성을 반영)이 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 스코어를 획득할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트를 부과하고 갭의 각 후속 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "아핀 갭 코스트(affine gap cost)"가 일반적으로 사용된다. 이것이 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램에서는 갭 페널티를 수정할 수 있다. 그러나, 이러한 소프트웨어를 서열 비교에 사용할 경우 기본 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지(하기 참조)를 사용할 경우, 아미노산 서열에 대한 기본 갭 패널티는 갭에 있어서 -12이며, 각 확장의 경우 -4이다.
따라서, 최대 서열 동일성 %의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성해야 한다. 이러한 정렬을 수행하는데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387, 본원에 참조로 포함됨). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 비제한적으로 BLAST 패키지(문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18] 참조), FASTA(본원에 참조로 포함된 Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 GENEWORKS 슈트의 비교 도구를 포함한다. BLAST와 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 사용할 수 있다(본원에 참조로 포함된 문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다.
적합하게는, 서열 동일성은 서열 전체에 걸쳐 결정될 수 있다. 적합하게는, 서열 동일성은 본원에 언급된 서열과 비교되는 후보 서열 전체에 걸쳐 결정될 수 있다.
최종 서열 동일성은 동일성 측면에서 측정될 수 있지만, 정렬 공정 자체는 일반적으로 올-오어-낫씽 페어 비교(all-or-nothing pair comparison)를 기반으로 하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 하는 각 쌍별 비교에 스코어를 할당하는 척도화된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다(BLAST 슈트 프로그램에 대한 기본 매트릭스). GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 제공되는 경우 공개 기본값 또는 사용자 정의 기호 비교 표를 사용한다(자세한 내용은 사용자 설명서 참조). 바람직하게는, GCG 패키지에 대한 공개 기본값, 또는 다른 소프트웨어의 경우, 기본 매트릭스, 예컨대 BLOSUM62가 사용된다.
일단 소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면, 서열 동일성 %를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 일반적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고, 수치 결과를 생성한다.
벡터
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 인접 부분이다.
용어 "발현 벡터"는 FOXP3 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 작제물을 의미한다. 적합하게는, 발현 벡터는 클로닝 벡터이다.
적합한 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 트랜스포존, 또는 폴리펩티드와 복합체화되거나 고체상 입자 상에 고정된 핵산을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 발현 벡터는 숙주 세포에서 높은 수준의 발현을 지속할 수 있다.
발현 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 MP71 벡터 백본에 기초하거나 이로부터 유래될 수 있다. 발현 벡터에는 우드척 간염 반응 요소(Woodchuck Hepatitis Response Element(WPRE))의 전장 또는 절두된 버전이 결여될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 또한 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩한다.
TCR은 면역 반응을 지시하는 일부로서 항원 제시 세포 상의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 단편에 결합하는 세포 표면 분자이다. 적합하게는, TCR은 재조합 단백질일 수 있고, 즉 TCR은 본 발명의 현 Treg에 의해 자연적으로 발현되지 않는 외인성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩한다.
CAR은 면역 반응을 지시하는 일부로서 다른 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 조작된 T 세포에 의해 발현되는 재조합 세포 표면 분자이다. 보다 구체적으로, CAR은 단일클론 항체(mAb)와 같은 항원 결합제의 특이성을 T-세포의 이펙터 기능에 접목된 단백질이다. 이들의 일반적인 형태는 T-세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 화합물 엔도도메인에 모두 연결된 트랜스멤브레인 도메인, 스페이서, 항원 인지 아미노 말단을 갖는 타입 I 트랜스멤브레인 도메인 단백질의 형태이다.
벡터가 FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 더하여 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우; 벡터는 5' FOXP3 - TCR/CAR 3'의 방향을 가질 수 있다. 따라서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR 또는 TCR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 있을 수 있다.
적합하게는, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 FOXP3을 인코딩하는 핵산 서열과 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열 둘 모두가 동일한 mRNA 전사체로부터 발현될 수 있게 하는 핵산 서열에 의해 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 (i) FOXP3 및 (ii) TCR 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열들 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. IRES는 mRNA 서열의 중간에서 번역 개시를 허용하는 뉴클레오티드 서열이다.
폴리뉴클레오티드는 내부 자가-절단 서열에 의해 연결된 (i) FOXP3 및 (ii) TCR 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 벡터는 5' 스트롱 프로모터(예를 들어, LTR)-FoxP3-2A-CAR/TCR-3'LTR 구조를 가질 수 있다. 여기서 FOXP3 발현은 최적의 발현을 위해 강력한 LTR 프로모터에 의해 직접 구동된다. CAR/TCR은 2A 서열이 선행되고, 따라서 CAR/TCR의 발현은 LTR 프로모터 활성 및 2A 절단 활성 둘 모두에 의존적이다. 중요하게는, FOXP3가 5'에서 3' 방향으로 CAR/TCR보다 선행하는 구성은 CAR/TCR 발현이 FOXP3가 발현된 경우에만 발생할 수 있고 FOXP3 없는 CAR/TCR의 발현이 발생하지 않도록 보장하다. 이는 조작된 Treg의 현 맥락에서 특히 이로운데, 조작된 Treg가 이펙터 표현형을 획득할 위험을 감소시키고/거나 CAR 또는 TCR을 시작 집단에 존재하는 T 이펙터 세포 내에 도입하는 것과 관련된 위험을 감소시키기 때문이다.
내부 자가-절단 서열은 (i) FOXP3 및 (ii) TCR 또는 CAR을 포함하는 폴리펩티드가 분리될 수 있게 하는 임의의 서열일 수 있다.
절단 부위는 자가-절단될 수 있어서, 폴리펩티드가 생성될 때 이는 임의의 외부 절단 활성에 대한 필요 없이 즉시 개별 펩티드로 절단된다.
용어 "절단"은 편의를 위해 본원에서 사용되지만, 절단 부위는 펩티드가 고전적 절단 이외의 메커니즘에 의해 개별 실체로 분리되게 할 수 있다. 예를 들어, 구제역 바이러스(FMDV) 2A 자가 절단 펩티드에 있어서, "절단" 활성을 설명하기 위해 다양한 모델이 제안되었다: 숙주-세포 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해, 자가 단백질 분해 또는 번역 효과(본원에 참조로 포함된 문헌 [Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041]). 이러한 "절단"의 정확한 메커니즘은 절단 부위가 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 사이에 위치할 때 단백질이 별도의 실체로서 발현되게 하는 한 본 발명의 목적상 중요하지 않다.
자가-절단 펩티드는 아프토바이러스 또는 카디오바이러스로부터의 2A 자가-절단 펩티드일 수 있다.
변이체는 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 측면에서 고려될 수 있으며, 바람직하게는 변이체는 서열 동일성 측면에서 발현된다.
서열 비교는 육안으로 또는 보다 일반적으로 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 공개되고 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열간의 서열 동일성을 계산할 수 있다.
적합하게는, 본 벡터로부터 발현된 FOXP3 폴리펩티드는 자가-절단 펩티드, 예를 들어 2A 자가-절단 펩티드의 N-말단에 위치할 수 있다. 이러한 FOXP3-2A 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 6으로 나타낸 서열; 또는 이와 적어도 80% 동일한 SEQ ID NO: 5 또는 6의 변이체를 포함할 수 있다. 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:5 또는 6과 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일할 수 있다.
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바이러스 형질도입
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입에 의해 분리된 Tregs 내에 도입된다.
바이러스 전달 시스템은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 형질도입에 의해 분리된 Treg 내에 도입된다.
레트로바이러스는 용해성 바이러스의 수명주기와 상이한 수명 주기를 갖는 RNA 바이러스이다. 이와 관련하여, 레트로바이러스는 DNA 중간체를 통해 복제되는 감염성 실체이다. 레트로바이러스가 세포를 감염시키면, 이의 게놈은 역전사 효소에 의해 DNA 형태로 전환된다. DNA 복사체는 감염성 바이러스 입자의 조립에 필요한 새로운 RNA 게놈과 바이러스로 인코딩된 단백질의 생산을 위한 주형 역할을 한다.
많은 레트로바이러스, 예를 들어 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적혈아구증 바이러스(AEV) 및 렌티바이러스를 포함하는 모든 다른 레트로바이러스가 존재한다.
레트로바이러스의 자세한 목록은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Coffin et al. “Retroviruses” 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 찾아볼 수 있다.
레트로바이러스는 또한 레트로바이러스 패밀리에 속하지만, 이들은 분열 및 비-분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있다(본원에 참조로 포함된 문헌 [Lewis et al. 1992 EMBO J. 3053-3058]).
인간 세포의 효율적인 감염을 위해 바이러스 입자는 양쪽성 외피 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 외피로 패키징될 수 있다.
Treg 분리
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은
(a) 세포 집단으로부터 Treg를 분리하고;
(b) Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
표현 "세포 집단으로부터 Treg를 분리하고"는 여러 상이한 유형의 세포의 이종 혼합물로부터 Treg를 분리하는 것을 의미한다. 적합한 세포 집단은 인간 대상체의 샘플로부터 얻은 것이다.
적합하게는, Treg는 Treg 집단으로 분리된다.
적합하게는, Treg 집단은 적어도 70% Treg, 예를 들어 75%, 85%, 90% 또는 95% Treg를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 세포 집단은 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 포함하거나 이로 구성된다.
PBMC는 골수, 간, 비장 또는 림프계에 격리되기 보다는, 순환하는 혈액 풀에서 발견되는 둥근 핵을 가진 임의의 혈액 세포이다. PBMC는 단핵구와 림프구(T 세포, B 세포 및 NK 세포)로 구성된다. 전혈로부터 PBMC를 분리하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, PBMC는 Ficoll(GE Healthcare)과 같은 밀도 구배 배지를 추가한 다음 원심분리하여 혈액 샘플로부터 분리될 수 있다. 혈액 중의 다양한 유형의 세포는 PBMC를 함유하는 층을 포함하는 다양한 층으로 분리된다.
본 발명의 일부 구현예에서, Treg를 분리하는 것은 CD4+ T 세포를 분리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Treg를 분리하는 것은 CD4+ T 세포를 분리한 후 CD4+ T 세포로부터 Treg를 분리하는 것을 포함한다.
CD4(분화 클러스터 4)는 다양한 유형의 T 세포에 의해 발현되는 T 세포 수용체의 공동-수용체이다. CD4+ 세포의 분리는 초기 세포 집단에서 Treg를 포함한 T 세포를 분리한다. 그런 다음 이러한 T 세포 풍부 집단에서 Treg가 분리될 수 있다.
이종 세포 집단으로부터 특정 세포 유형을 분리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예로는 면역-자기 비드 및 형광-활성화된 세포 분류의 사용을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, Treg 집단을 분리하는 것은 면역-자기 비드를 사용하는 것을 포함한다. 다양한 회사(예를 들어, Miltenyi Biotec, Stem Cell Technologies, ThermoFisher Scientific)에서 특정 유형의 T 세포 분리를 위한 면역-자기 비드를 포함하는 키트를 제공한다(예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Fallarino et al. (2003) Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat. Immunol. 4: 1206-1212] 참조). 이러한 분리 키트는 CD8, CD25, CD49b 등과 같은 T 세포 표면 단백질에 대해 당업계에서 널리 이용 가능한 항체를 사용한다. 예를 들어, CD4+ 세포는 비-CD4+ 세포(예를 들어, CD8)의 마커에 대한 바이오틴-컨쥬게이션된 항체와 함께 세포 집단을 인큐베이션하고, 항-비오틴 자기 비드를 사용하여 이들 세포를 제거함으로써 먼저 음성으로 선택될 수 있다. 그 후, 항-CD25-표지된 비드와 함께 인큐베이션하여 Treg를 양성으로 선택할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, Treg 집단을 분리하는 것은 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다. 일부 구현예에서, Treg는 이의 CD4+CD25고CD127- 표현형에 따라 분류된다.
천연 Treg는 헬리오스 단백질 또는 뉴로필린 1의 발현을 기반으로 하여 유도성 Treg로부터 분류될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 천연 Treg는 이의 CD4+CD25+FOXP3+헬리오스+뉴로필린1+ 표현형에 따라 분류될 수 있다.
FACS는 당업계에 잘 알려진 흐름세포측정의 한 형태이다. FACS 동안 세포는 유체에 부유되고 다양한 특성을 분석하는 검출 시스템을 통해 스트리밍된다. 이 방법을 사용하여 이들의 특성에 따라 세포를 분류할 수 있다. 특히, FACS에서 분자는 특정 분자의 발현 수준을 나타내는 이의 형광 정도에 따라 분류된 세포 및 형광 항체를 사용하여 표시된다(본원에 참조로 포함된 문헌 [Adan et al. Flow cytometry: basic principles and applications Crit. Rev. Biotechnol. 2017 Mar;37(2):163-176] 참조).
조작된 Treg
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 조작된 Treg와 같은 조작된 Treg를 제공한다.
용어 "조작된 Treg"는 이의 유전자 발현이 변경되도록 인간 개입에 의해 조작된 Treg를 의미한다.
본 발명은 또한 조작되지 않은 Treg보다 더 높은 FOXP3 발현을 갖는 조작된 Treg를 제공한다.
본 발명은 또한 상응하는 조작되지 않은 Treg보다 더 높은 FOXP3 발현을 갖는 Treg를 제공한다.
"더 높은 FOXP3 발현"은 조작된 Treg에서의 FOXP3 mRNA 또는 단백질의 수준이 Treg가 이의 유전자 발현을 변경하기 위해 인간 개입에 의해 조작되기 전보다 높음을 의미하다.
"더 높은 FOXP3 발현"은 본원에 기재된 바와 같이 정의되고 결정될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CD25 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 1.5배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CD25 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 2배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CD25 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 5배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CTLA-4 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 1.5배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CTLA-4 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 2배 크게 증가될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서 CTLA-4 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 본 발명의 방법에 의해 변형되지 않은 상응하는 Treg (또는 이러한 Treg 집단)에서의 수준보다 적어도 5배 크게 증가될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 조작된 Treg는 FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"외인성 폴리뉴클레오티드"는 Treg 외부에서 기원하는 폴리뉴클레오티드이다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 일부로서 Treg 내에 도입될 수 있다. 따라서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 같은 발현 벡터 요소와 인접할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 적합하게는, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 4와 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, FOXP3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 4 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2와 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2와 동일하다.
본 발명의 일부 구현예에서, FOXP3을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 벡터의 인접 부분이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 또한 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 5와 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 5와 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 조작된 Treg를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
이러한 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들) 및 기타 운반체로서 (또는 이에 추가하여) 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정되어야 한다. 비경구 투여용 제형은 비제한적으로, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀젼, 페이스트 및 이식 가능한 서방형 또는 생분해성 제형을 포함한다. 멸균성 주사용 제형은 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 분산제, 습윤제, 현탁제, 등장제, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 담체, 부형제, 염, 또는 안정화제를 포함할 수 있으며, 이는 사용되는 투여량 및 농도에서 대상체에 비독성이다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 비경구(예를 들어, 피하, 근내 또는 정맥내 주입) 또는 척수강내 투여의 경우 투여 부위 및/또는 주어진 방법과 양립가능한 질환 치료에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 현재의 우수한 제조 관행(cGMP)을 이용하여 생산될 수 있다.
적합하게는, 조작된 Treg를 포함하는 약학적 조성물은 유기 용매, 예컨대 비제한적으로, 메틸 아세테이트, 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메톡시에탄(DME) 및 디메틸아세트아미드를 포함할 수 있으며, 이들의 혼합물 또는 조합물을 포함한다.
적합하게는, 약학적 조성물은 내독소가 없다.
질병의 예방 및/또는 치료
본 발명은 또한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조작된 Treg 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 조작된 Treg의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에게 본 발명의 조작된 Treg 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
바람직하게는, 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
용어 "치료하다/치료/치료하는"은 질병과 관련된 적어도 하나의 증상을 약화, 감소 또는 개선하기 위해 및/또는 질병의 진행을 감속, 감소 또는 차단하기 위해 기존의 질병 또는 질환을 갖는 대상체에게 본 발명의 조작된 Treg 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 나타낸다.
"예방"/"예방하는"(또는 예방)은 질병의 증상 발생을 지연 또는 예방하는 것을 나타낸다. 예방은 (질병이 발생하지 않도록) 절대적일 수 있거나 일부 개체에게만 또는 제한된 시간 동안만 효과적일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 방법의 대상체는 포유 동물, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니 피그이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 활성 성분을 생체이용가능하게 만드는 임의의 다양한 경로를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 조작된 Treg 또는 약학적 조성물은 정맥내, 경막내, 경구 및 비경구 경로에 의해, 비강내, 복강내, 피하, 경피 또는 근육내 투여될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 조작된 Treg 또는 약학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 Treg 또는 약학적 조성물은 경막내로 투여된다.
일반적으로, 의사는 개별 대상체에게 가장 적합한 투여량을 결정할 것이며, 투여량은 특정 대상체의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 투여량은 질병 증상을 감소시키고/거나 예방하는데 충분할 정도이다.
예를 들어, 당업자는 전달 경로(예를 들어, 경구 대 정맥내 대 피하 등)가 필요한 투여량에 영향을 미칠 수 있음 (및 그 반대의 경우)을 인식한다. 예를 들어, 특정 부위 또는 위치 내에서 특히 고농도의 제제가 요구되는 경우, 집중 전달이 바람직할 수 있다. 주어진 치료 요법에 대한 경로 및/또는 투여 일정을 최적화할 때 고려해야할 다른 요인은 예를 들어, 치료할 질병(예를 들어, 유형 또는 단계 등), 대상체의 임상 상태(예를 들어, 연령, 전반적인 건강 등), 병용 요법의 존재 또는 부재, 및 의료진에게 알려진 다른 인자를 포함할 수 있다.
투여량은 질병의 증상을 안정화하거나 개선하기에 충분한 정도이다.
본 발명은 또한 대상체에 본 발명에 따른 세포 예를 들어, T 세포를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
적합하게는, 질병의 예방 및/또는 치료 방법은
(i) Treg를 대상체로부터 분리하고;
(ii) FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 Treg 내에 도입(즉, 조작)하고;
(iii) 조작된 Treg를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
Treg는 혈액 샘플을 채취하고, "Treg 분리"라는 제목으로 본 명세서에 설명된 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 혈액 샘플로부터 Treg를 분리함으로써 분리될 수 있다.
FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 "바이러스 형질도입"이라는 제목으로 본 명세서에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 Treg 내에 도입될 수 있다.
적합하게는, 조작된 Treg는 대상체에게 투여하기 전에 시험관내에서 확장될 수 있다. Treg는 TexMACX® 배지에서 배양하여 시험관내에서 확장될 수 있다.
질병
본 발명의 방법 및 용도에 의해 치료되고/거나 예방될 질병은 병적 면역 반응과 관련된 임의의 질병일 수 있다.
질병은 예를 들어, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 질병은 자가면역 질환이다.
질병은 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 청소년 특발성 관절염, 공피증 및 쇼그렌 증후군과 같은 전신 자가면역 및 염증 질환의 중추신경계(CNS) 관련성을 가질 수 있다.
질병은 MBP가 항원이며, 예를 들어, MBP가 자가-항원인 임의의 질병일 수 있다.
적합하게는, 질병은 자가면역 및 염증성 중추 신경계 질병(예를 들어, 만성 신경 퇴행성 질환)일 수 있다.
적합하게는, 질병은 만성 신경 퇴행성 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 향신경성 바이러스 감염, 뇌졸중, 부신생물 장애 및 외상성 뇌 손상일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 질병은 다발성 경화증이다. 적합하게는, 질병은 만성 진행성 다발성 경화증이다. 적합하게는, 질병은 재발/완화되는 다발성 경화증이다.
적합하게는, 질병은 HLA-DRB1*0401 양성 대상체에 존재한다. 적합하게는, 질병은 다발성 경화증이고 대상체는 HLA-DRB1*0401 양성이다. 적합하게는, 질병은 만성 진행성 다발성 경화증이고 대상체는 HLA-DRB1*0401 양성이다. 적합하게는, 질병은 재발/완화되는 다발성 경화증이고 대상체는 HLA-DRB1*0401 양성이다.
다발성 경화증
다발성 경화증(MS)은 유럽과 미국에서 젊은 성인들 사이에서 가장 흔한 신경 장애이다. MS는 탈수초성 질환으로서 특징지어지며, 뇌 및/또는 척수 전체의 패치에서 수초의 점진적인 파괴가 발생하여 신경 연결을 방해하고 근육 약화, 조정 및 언어 상실, 및 시각 장애를 유발하는 중추 신경계의 만성 퇴행성 질환이다.
임상적으로 고립된 증후군(CIS), 재발 완화 MS(RRMS), 일차 진행성 MS(PPMS) 및 이차 진행성 MS(SPMS)를 포함하여 MS 진행의 여러 유형 또는 패턴이 확인되었다. 일부 대상체에 있어서, 장애의 증가 또는 진행이 매우 점진적이며, 다른 대상체에 있어서 이는 더욱 빨리 발생할 수 있다. 그러나, 일반적으로 공격으로부터의 회복은 점점 덜 완료되고, 증상은 증가하고 장애가 증가하는 경향이 있다.
임상 재발 빈도를 줄이기 위해 여러 가지 질병 조절 치료(DMT)가 승인되었지만 대부분의 대상체는 현재 치료 일정 하에 임상적으로 악화되고 있다. 자가 조혈 줄기 세포 이식은 대상체에게 지속적인 유익 효과를 줄 수 있으나, 이 절차에는 상당한 독성과 관련된 공격적인 골수-절제 컨디셔닝을 필요로 한다. DMT 또는 줄기 세포 이식은 MS의 면역 병리에 대한 항원-특이적 억제를 매개할 수 없다. 이론에 얽매이지 않으면서, 향후 본 발명의 조작된 Treg의 1회 용량의 투여는 전신 부작용 없이 MS 면역 병리의 지속적인 억제를 제공할 수 있다. 이는 MS 환자의 질병 진행에 중대한 영향을 미칠 것이다.
적합하게는, 본 발명의 조작된 Treg 또는 약학적 조성물은 시력 감소 또는 상실, 비틀거리고 고르지 않은 걸음 걸이, 불분명한 언어, 소변 빈도 및 요실금, 기분 변화 및 우울증, 근육 경련 및 마비를 포함하는 MS의 증상 중 하나 이상을 감소시키거나 개선할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 본 발명의 조작된 Treg 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이식물에 대한 내성을 유도하고; 세포 및/또는 체액성 이식 거부를 치료하고/거나 예방하고; 이식편대숙주병(GvHD)을 치료하고/거나 예방하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
본원에 사용된 "이식에 대한 내성 유도"는 수용자에 이식된 장기에 대한 내성을 유도하는 것을 의미한다. 즉, 이식물에 대한 내성을 유도하는 것은 공여자 이식 장기에 대한 수용자의 면역 반응 수준을 감소시키는 것을 의미하다. 이식된 장기에 대한 내성을 유도하는 것은 이식 수용자가 필요로 하는 면역억제 약물의 양을 줄이거나 면역억제 약물을 중단할 수 있다.
일 구현예에서, 대상체는 면역억제 요법을 받고 있는 이식 수용자이다.
이식물은 간, 신장, 심장, 폐, 췌장, 장, 위, 골수, 혈관화 복합 조직 이식편 및 피부 이식물로부터 선택될 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 숫자 범위에는 범위를 규정하는 숫자가 포함된다. 달리 지시되지 않는 한, 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성되고, 임의의 아미노산 서열은 아미노산에서 카르복시-말단 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한 사이에 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한 하한 단위의 10분의 1까지의 각 중간 값이 또한 구체적으로 개시된다. 임의의 언급된 값 사이의 각각의 더 작은 범위 또는 언급된 범위 내의 중간 값, 및 이러한 언급된 범위내의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값은 본 개시 내용에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 이 범위에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있으며, 한계 값 중 하나 또는 둘 모두가 더 작은 범위내에 포함되거나 어느 것도 포함되지 않는 각 범위는 또한 언급된 범위내에 임의의 특정하게 배제된 한계를 제외하고는 이러한 개시 내용에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두는 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 개시 내용에 포함된다.
단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "~를 포함하는"은 "포함하는", "포함하다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이며, 포괄적이거나 개방적이며 추가적인 비-인용된 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "~를 포함하다"는 또한 용어 "~로 구성되는"을 포함한다.
본 발명의 구현예는 조합될 수 있다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개를 위해서만 제공된다. 여기에서 어떤 것도 그러한 출판물이 본원에 첨부된 청구 범위에 대한 선행 기술을 구성함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 이제 실시예를 통해 추가로 설명될 것이며, 이는 당업자가 본 발명을 수행하는데 도움을 주기 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1A - 천연 Treg의 분리
CD4+ T 세포는 CD4+ 양성 선택 키트를 사용하여 분리하였다. 그 후, BD ARIA를 사용하여 FACS 분류 전에 세포를 흐름세포측정 항체 CD4, CD25 및 CD127로 염색하였다. CD4+CD25고CD127- Treg 및 CD4+CD25-CD127+ Tconv를 폴리프로필렌 튜브에 수집하였다. 세포 분류의 순도는 FOXP3 PE 항체를 첨가하여 결정하였다. CD4+CD25+CD127-FOXP3+ 세포의 순도는 관례적으로> 70%였다.
실시예 1B - FOXP3으로의 천연 Treg의 형질도입
0일째에 FACS 분류된 Treg 및 Tconv를 항-CD3 및 항-CD28 비드로 1:1 배양하여 48시간 동안 개별적으로 활성화시켰다. 2일째에 세포를 계수하고 완전한 RPMI(Tconv) 또는 Texmacs 배지(Treg)에 1x106/mL로 재현탁하였다. 비조직 배양 처리된 24-웰 플레이트를 레트로넥틴으로 코팅하여 사전 준비한 다음 PBS 중의 2% 소 혈청 알부민으로 차단하고 PBS로 2회 세척하였다. IL-2의 최종 농도는 Tconv의 경우 300 μ/ml이고 Treg의 경우 1000 μ/ml이다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 상청액을 제거하고 신선한 완전 배지 및 IL-2를 보충하였다. 배지를 격일로 교체하였다.
Tconv 세포는 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청; 100 Unit/mL 페니실린; 100 μg/mL 스트렙토마이신; 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640(Gibco)에서 성장시켰다. 조절 T 세포는 100 Unit/mL 페니실린; 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Texmacs 배지(Miltenyi)에서 배양하였다.
뮤린 TCR 불변 영역 및 FOXP3의 발현을 통한 형질도입 수준을 평가하기 위해 흐름세포측정 분석을 7-10일째에 수행하였다.
실시예 1C - FOXP3-형질도입된 천연 Treg의 존재하에 자극된 Tconv 세포의 증식 및 IL-2 생산
10일째에 인간 HLA-DR4 및 CD80 또는 CD86으로 형질도입된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 MBP111-129(LSRFSWGAEGQRPGFGYGG)(10 μM/ml)를 로딩하였다. 현탁액을 표준 조직 배양 조건에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 조사하고, 세척하고, 적절한 농도로 재현탁하였다.
형질도입된 반응자 T 세포를 3분 동안 37℃에서 가온된 PBS 중의 CFSE 세포 추적 염료로 염색한 후 동일한 부피의 가온 FBS를 첨가하고 추가로 3분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5x 부피의 완전 RPMI 배지로 세척한 후, 계수하고 1x106 형질도입된 세포/ml로 재현탁하였다. 조절 T 세포를 배양물에서 제거하고, 세척하고, 완전 RPMI에서 1x106 형질도입된 세포/ml로 재현탁하였다. 세포를 4일 동안 1 Treg:0.1 CHO 세포:다양한 비율의 Tconv에 플레이팅하였다.
4일째에 세포를 생존성 염료로 염색하고 흐름세포측정으로 분석하였다. 증식 백분율은 '생' 세포에 게이팅한 다음 펩티드 부재하에 배양한 세포와 비교하여 CFSE 형광이 더 낮은 세포 집단에 의해 결정하였다.
도 1은 펩티드가 있거나 없는 TCR 형질도입된 Tconv 세포의 증식(청색 막대) 및 모크 Treg(백색 막대), TCR 형질도입된 Treg 또는 TCR+FOXP3 형질도입된 Treg의 존재하에서 동일한 세포의 증식을 보여준다.
4일째에 상청액을 수집하고 ELISA에 의해 IL-2 생산에 대해 검정하였다.
도 2는 펩티드가 있거나 없는 TCR 형질도입된 Tconv 세포의 IL-2 생산(청색 막대) 및 모크 Treg(백색 막대), TCR 형질도입된 Treg 또는 TCR+FOXP3 형질도입된 Treg의 존재하에서 동일한 세포의 증식을 보여준다.
실시예 2 - 상이한 공여자로부터의 T 세포
실시예 1에 기술된 실험은 상이한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 반복하였다.
도 3은 TCR 형질도입 T 세포의 증식 백분율을 보여준다.
도 4는 공동-배양 실험으로부터 수집된 상청액 중 IL-2의 농도를 보여준다.
실시예 3 - 형질도입된 천연 Treg에서 Treg 마커의 발현
모크-형질도입된 Treg 또는 TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 Treg를 7-10일째에 Treg 마커(FOXP3, CD25 및 CTLA-4)의 발현에 대해 흐름세포측정에 의해 분석하였다.
도 5는 각 마커의 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다. 점은 개별 실험을 나타낸다. 통계 분석에는 일원 ANOVA가 사용되었다 p <0.05 *, p <0.005 **.
도 6은 동일한 데이터를 상이하게 나타낸다. 각각의 선은 TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 동일한 Treg 상의 마커의 MFI를 보여주는 단일 실험을 나타낸다.
실시예 4 - 유도성 Treg와 비교한 형질도입된 천연 Treg
CD80+CD86+DR4+ CHO 세포에 펩티드를 로딩하고 실시예 1C에 기재된 바와 같이 조사한 후 0.1x106 세포/ml로 재현탁하였다. 형질도입된 반응자 T 세포를 3분 동안 37℃에서 가온된 PBS 중의 CFSE 세포 추적 염료로 염색한 후 동일한 부피의 가온 FBS를 첨가하고 추가로 3분 동안 인큐베이션하였다.
세포를 5x 부피의 완전 배지로 세척한 후, 계수하고 1x106 형질도입된 세포/ml로 재현탁하였다. Tconv 및 Treg의 형질도입 효율은 흐름세포측정에 의해 결정하였다. Treg를 배양물에서 제거하고, 세척하고, 완전 RPMI에서 1x106 형질도입된 세포/ml로 재현탁하였다. 세포를 1 Treg:0.1 CHO 세포:다양한 부분 Tconv에 플레이팅하였다. 증식은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)-염색된 Tconv의 희석을 분석하여 결정되었다.
도 7의 데이터는 TCR+FOXP3-형질도입된 천연 Treg가 TCR+FOXP3-형질도입된 Tconv 세포(즉, 유도성 Treg)보다 더 효과적으로 증식을 억제함을 보여준다.
상청액을 배양 배지로부터 수집하고 ELISA에 의해 IL-2에 대해 검정하였다. 도 8에 제시된 데이터는 TCR+FOXP3-형질도입된 천연 Treg가 TCR+FOXP3-형질도입된 Tconv 세포(즉, 유도성 Treg)보다 더 효과적으로 IL-2 생산을 억제함을 보여준다.
실시예 6A - 외인성 FOXP3 생착을 발현하고, FoxP3, CD25 및 TCR 발현을 지속 및 유지하는 Treg
Thy1.1+CD4+CD25+ 또는 CD45.1+CD4+CD25+ Treg를 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 마우스의 림프절 및 비장 세포로부터 비드 정렬에 의해 분리하였다. CD45.1+ Treg는 TCR로 형질도입하고, Thy1.1+ Treg는 TCR+뮤린 FOXP3으로 형질도입하였다. 형질도입 후 1일째에 TCR 또는 TCR+FOXP3 형질도입된 세포를 4Gy 조사로 컨디셔닝된 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 숙주에 1:1 비율로 주입하였다. FACS 플롯은 주입된 세포의 CD45.1:Thy1.1의 비율과 이들의 각각의 FOXP3 발현을 보여준다.
7주 후 세포흐름측정을 이용하여 TCR 염색에 의해 생착된 세포를 확인하였다. TCR+ 집단 내 CD45.1:Thy1.1의 비율을 결정하고, 생착된 CD45.1(TCR로 형질도입된 Treg) 또는 Thy1.1(TCR+FOXP3으로 형질도입된 Treg) 세포의 표현형을 FOXP3 및 CD25에 대해 염색하여 검사하였다.
Thy1.1+CD4+CD25+ Treg를 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 마우스의 림프절 및 비장세포에서 비드 정렬에 의해 분리하였다. Treg를 TCR, TCR+뮤린 FOXP3으로 형질도입하거나 바이러스-비함유 상청액(모크)과 함께 배양하였다. 형질도입 후 1일째에 TCR 또는 TCR+FOXP3 형질도입된 세포를 4Gy 조사로 컨디셔닝된 HLA-DRB*0401 트랜스제닉 숙주에 주입하였다. 7주 후 흐름세포측정을 이용하여 형질도입된 Treg의 생착을 결정하였다. 도 9a는 형질도입 후 d1에서 인간 가변 2.1 및 뮤린 Foxp3의 발현을 통해 결정된 형질도입 효율을 보여준다. 도 9b는 전달된 세포(상단 패널) 및 FOXP3와 TCR(하단 패널)을 확인하기 위해 Thy1.1로 염색된 TCR+FOXP3 또는 TCR로 형질도입된 Treg를 받은 마우스의 비장 세포를 보여준다. 도 9c는 TCR 또는 TCR+FOXP3으로 형질도입된 Treg에 대한 주입 일과 관련하여 형질도입 효율의 배수 변화(왼쪽 패널) 및 형질도입된 세포의 절대 수의 배수 변화(오른쪽 패널)를 보여주는 누적 데이터를 나타낸다. 도 9d는 전달 7주 후 형질도입된 세포 내에서 FOXP3의 대표적인 발현을 보여준다. 그래프는 7주차에 형질도입된 집단 내 FOXP3+ 세포의 누적 백분율(왼쪽) 및 주입 일에 대한 FOXP3+ 세포의 배수 변화를 보여준다.
실시예 6B - 외인성 FOXP3을 발현하는 Treg는 생체내에서 7주 후에 Treg 기능을 유지하는 반면, 외인성 FOXP3을 발현하지 않는 Treg는 이펙터 사이토카인을 생성하는 능력을 획득한다.
비장 세포는 무관한 펩티드 또는 10uM MBP로 펄싱된 CD86+HLA-DR4+CHO 세포와 함께 4시간 동안 배양하였다. 외인성 FOXP3을 발현하는 Treg는 이펙터 사이토카인 생산의 결여로 입증된 바와 같이 생체내에서 7주 후에 Treg 기능을 보유하는 반면, 외인성 FOXP3을 발현하지 않는 Treg는 이펙터 사이토카인을 생산하는 능력을 획득한다(도 10).
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 구현예로 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 다음의 청구 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCL Business PLC <120> METHOD <130> P114191PCT <150> GB 1806331.3 <151> 2018-04-18 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 polynucleotide sequence <400> 1 atgcccaacc ccaggcctgg caagccctcg gccccttcct tggcccttgg cccatcccca 60 ggagcctcgc ccagctggag ggctgcaccc aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc 120 ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc 180 ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag ctgcccacac tgcccctagt catggtggca 240 ccctccgggg cacggctggg ccccttgccc cacttacagg cactcctcca ggacaggcca 300 catttcatgc accagctctc aacggtggat gcccacgccc ggacccctgt gctgcaggtg 360 caccccctgg agagcccagc catgatcagc ctcacaccac ccaccaccgc cactggggtc 420 ttctccctca aggcccggcc tggcctccca cctgggatca acgtggccag cctggaatgg 480 gtgtccaggg agccggcact gctctgcacc ttcccaaatc ccagtgcacc caggaaggac 540 agcacccttt cggctgtgcc ccagagctcc tacccactgc tggcaaatgg tgtctgcaag 600 tggcccggat gtgagaaggt cttcgaagag ccagaggact tcctcaagca ctgccaggcg 660 gaccatcttc tggatgagaa gggcagggca caatgtctcc tccagagaga gatggtacag 720 tctctggagc agcagctggt gctggagaag gagaagctga gtgccatgca ggcccacctg 780 gctgggaaaa tggcactgac caaggcttca tctgtggcat catccgacaa gggctcctgc 840 tgcatcgtag ctgctggcag ccaaggccct gtcgtcccag cctggtctgg cccccgggag 900 gcccctgaca gcctgtttgc tgtccggagg cacctgtggg gtagccatgg aaacagcaca 960 ttcccagagt tcctccacaa catggactac ttcaagttcc acaacatgcg accccctttc 1020 acctacgcca cgctcatccg ctgggccatc ctggaggctc cagagaagca gcggacactc 1080 aatgagatct accactggtt cacacgcatg tttgccttct tcagaaacca tcctgccacc 1140 tggaagaacg ccatccgcca caacctgagt ctgcacaagt gctttgtgcg ggtggagagc 1200 gagaaggggg ctgtgtggac cgtggatgag ctggagttcc gcaagaaacg gagccagagg 1260 cccagcaggt gttccaaccc tacacctggc ccctga 1296 <210> 2 <211> 1352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 polynucleotide sequence <400> 2 gaattcgtcg acatgcccaa ccccagaccc ggcaagcctt ctgccccttc tctggccctg 60 ggaccatctc ctggcgcctc cccatcttgg agagccgccc ctaaagccag cgatctgctg 120 ggagctagag gccctggcgg cacattccag ggcagagatc tgagaggcgg agcccacgcc 180 tctagcagca gcctgaatcc catgccccct agccagctgc agctgcctac actgcctctc 240 gtgatggtgg cccctagcgg agctagactg ggccctctgc ctcatctgca ggctctgctg 300 caggaccggc cccactttat gcaccagctg agcaccgtgg acgcccacgc cagaacacct 360 gtgctgcagg tgcaccccct ggaaagccct gccatgatca gcctgacccc tccaaccaca 420 gccaccggcg tgttcagcct gaaggccaga cctggactgc cccctggcat caatgtggcc 480 agcctggaat gggtgtcccg cgaacctgcc ctgctgtgca ccttccccaa tcctagcgcc 540 cccagaaagg acagcacact gtctgccgtg ccccagagca gctatcccct gctggctaac 600 ggcgtgtgca agtggcctgg ctgcgagaag gtgttcgagg aacccgagga cttcctgaag 660 cactgccagg ccgaccatct gctggacgag aaaggcagag cccagtgcct gctgcagcgc 720 gagatggtgc agtccctgga acagcagctg gtgctggaaa aagaaaagct gagcgccatg 780 caggcccacc tggccggaaa gatggccctg acaaaagcca gcagcgtggc cagctccgac 840 aagggcagct gttgtatcgt ggccgctggc agccagggac ctgtggtgcc tgcttggagc 900 ggacctagag aggcccccga tagcctgttt gccgtgcgga gacacctgtg gggcagccac 960 ggcaactcta ccttccccga gttcctgcac aacatggact acttcaagtt ccacaacatg 1020 aggcccccct tcacctacgc caccctgatc agatgggcca ttctggaagc ccccgagaag 1080 cagcggaccc tgaacgagat ctaccactgg tttacccgga tgttcgcctt cttccggaac 1140 caccccgcca cctggaagaa cgccatccgg cacaatctga gcctgcacaa gtgcttcgtg 1200 cgggtggaaa gcgagaaggg cgccgtgtgg acagtggacg agctggaatt tcggaagaag 1260 cggtcccaga ggcccagccg gtgtagcaat cctacacctg gccctgaggg cagaggaagt 1320 ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cc 1352 <210> 3 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 polypeptide sequence - UniProtKB accession Q9BZS1 <400> 3 Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met 50 55 60 Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala 65 70 75 80 Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His 100 105 110 Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met 115 120 125 Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe 195 200 205 Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu 210 215 220 Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln 225 230 235 240 Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met 245 250 255 Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val 260 265 270 Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln 275 280 285 Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser 290 295 300 Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met 325 330 335 Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu 340 345 350 Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr 355 360 365 Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala 370 375 380 Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser 385 390 395 400 Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys 405 410 415 Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro 420 425 430 <210> 4 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 polypeptide sequence <400> 4 Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met 50 55 60 Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala 65 70 75 80 Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His 100 105 110 Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met 115 120 125 Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe 195 200 205 Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu 210 215 220 Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln 225 230 235 240 Ser Leu Glu Gln Val Glu Glu Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala 245 250 255 Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys 260 265 270 Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro 275 280 285 Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg 290 295 300 Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu 305 310 315 320 His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr 325 330 335 Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln 340 345 350 Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe 355 360 365 Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu 370 375 380 Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val 385 390 395 400 Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro 405 410 415 Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu 420 425 430 Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 435 440 <210> 5 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3-2A polypeptide sequence <400> 5 Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met 50 55 60 Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala 65 70 75 80 Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His 100 105 110 Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met 115 120 125 Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe 195 200 205 Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu 210 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Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe 195 200 205 Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu 210 215 220 Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln 225 230 235 240 Ser Leu Glu Gln Val Glu Glu Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala 245 250 255 Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys 260 265 270 Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro 275 280 285 Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg 290 295 300 Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu 305 310 315 320 His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr 325 330 335 Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln 340 345 350 Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe 355 360 365 Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu 370 375 380 Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val 385 390 395 400 Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro 405 410 415 Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu 420 425 430 Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 435 440 445 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser 450 455 460 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP111-129 <400> 7 Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly 1 5 10 15 Tyr Gly Gly

Claims (27)

  1. FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조절 T 세포(Treg) 내에 도입하는 것을 포함하는, 면역 반응을 억제하는 Treg의 능력을 향상시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) FOXP3 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 3 또는 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나;
    (ii) FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 또는 2와 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터의 인접부인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 Treg 내에 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 외인성 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단일 발현 벡터에 의해 제공되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 벡터가 5' FOXP3 - X - TCR/CAR 방향의 핵산을 포함하며, 여기에서 X는 내부 자가-절단 서열인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 형질도입에 의해 분리된 Treg 내에 도입되고; 선택적으로 FOXP3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 레트로바이러스 형질도입에 의해 분리된 Treg 내에 도입되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 세포 집단으로부터 Treg를 분리하고;
    (b) Treg에서 FOXP3 발현을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포 집단이 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 포함하거나 PBMC로 구성되는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, Treg를 분리하는 것이
    CD4+ T 세포를 분리하고;
    CD4+ T 세포로부터 Treg를 분리하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Treg의 분리가 면역-자기 비드 또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 이용한 선택을 포함하는, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Treg가 (i) CD4+CD25+CD127- 및/또는 CD4+CD25+CD127저 세포; (ii) CD4+CD25고CD127- 및/또는 CD4+CD25+CD127저 세포를 선택함에 의해 분리되는, 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Treg가 FOXP3+ 세포를 선택함에 의해 분리되고; 바람직하게는 Treg는 CD4+CD25+FOXP3+헬리오스+뉴로필린1+ 세포를 선택함에 의해 분리되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는 조작된 Treg.
  15. FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 Treg로서, 상응하는 비-조작된 Treg보다 더 높은 FOXP3 발현을 갖는, 조작된 Treg.
  16. 제15항에 있어서, FOXP3 폴리펩티드가 (i) SEQ ID NO: 3 또는 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나, (ii) SEQ ID NO: 1 또는 2와 적어도 80% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편에 의해 인코딩되는, 조작된 Treg.
  17. 제16항에 있어서, FOXP3을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터의 인접부인, 조작된 Treg.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 조작된 Treg.
  19. 제18항에 있어서, FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 외인성 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단일 발현에 의해 제공되는, 조작된 Treg.
  20. 제19항에 있어서, 벡터가 5' FOXP3 - X - TCR/CAR 방향의 핵산을 포함하며, 여기에서 X는 내부 자가-절단 서열인, 조작된 Treg.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조작된 Treg를 포함하는 약학적 조성물.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 조작된 Treg 또는 약학적 조성물.
  23. 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조작된 Treg의 용도.
  24. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조작된 Treg 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 자가면역 질환이며, 바람직하게는 질병은 다발성 경화증인, 조작된 Treg 또는 약학적 조성물, 조작된 Treg의 용도, 또는 방법.
  26. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이며, 질병은 이식 거부 또는 이식편대숙주병인, 조작된 Treg.
  27. 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 능력을 향상시키기 위한 FOXP3 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도.
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