JPH0980049A - 免疫検査用標準液または参照液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 凍結融解のような煩雑な操作を必要とせず、
血清または血漿とシリカ粒子を接触させるだけで、短時
間のうちにＣ４などを損失することなく清澄な血清また
は血漿からなる免疫検査用標準液または参照液を製造す
る。 【解決手段】 塩化ナトリウムなどの塩存在下に、血清
または血漿と乾式または湿式シリカ粒子を混和すること
により接触させて不溶化成分をシリカ粒子に吸着させ、
次いで、遠心分離などにより不溶化成分吸着シリカ粒子
を分離除去する免疫検査用標準液または参照液の製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、製造後の濁りの発
生がない免疫検査用標準液または参照液の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】免疫検査用標準液または参照液とは、血
中蛋白、具体的には免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと
略記する。）、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡと略記
する。）、免疫グロブリンＭ（以下、ＩｇＭと略記す
る。）、補体蛋白Ｃ３（以下、Ｃ３と略記する。）、補
体蛋白Ｃ４（以下、Ｃ４と略記する。）などの成分を免
疫学的手法により測定するための標準または参照として
用いられるものであり、具体的には例えば、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＭ、Ｃ３、Ｃ４などを所定濃度含有させた水
溶液である。

【０００３】免疫検査用標準液または参照液の製造方法
としては、それぞれ単独に分離濃縮などの処理を施した
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｃ３、Ｃ４などを適当な緩衝
液に添加して製造することも可能である。しかし、この
ようにして製造した免疫検査用標準液または参照液は、
被検体である血清や血漿とは、粘度や比重などの性状が
異なる。そのため、検体と該標準液または参照液とで分
注精度や反応性が異なるという問題がある。

【０００４】そこで、一般には血清または血漿を原料と
して、これに防腐剤などの添加する以外は基本組成を変
更せずに標準液または参照液としていた。具体的には、
動物から採血した血液を遠心分離または血清分離剤を使
用して、血漿または血清に分離した後、濃度調整と防腐
剤の添加を行っている。しかし、この方法では、液状で
長期間保存した場合や凍結保存の際に不溶化成分の析出
により、濁りを発生し、測定値に悪影響を及ぼすという
問題点があった。

【０００５】また、血清または血漿を数カ月間低温で保
存し、析出した不溶化成分を遠心分離して除去する方法
や、不溶化成分が析出しなくなるまで凍結融解を繰り返
す方法により、保存中の濁りの発生を抑制することが行
われているが、製造に数カ月を要することや、凍結融解
を繰り返すといった煩雑な作業を要するという欠点があ
った。

【０００６】一方、血清または血漿の保存中に発生する
不溶化成分の主成分はリポ蛋白であることが知られてお
り、リポ蛋白を除去する目的で、非イオン性界面活性剤
存在下、Ａｅｒｏｓｉｌ ３８０ を血清に２％（Ｗ／
Ｖ）添加し、室温で４時間緩やかに撹拌してリポ蛋白を
吸着させる方法が知られている（ティッセンら，バイラ
ル イムノダイアグノーシス，ｐ１２５，アカデミック
プレス，１９７４）。しかし、この方法において、界面
活性剤を低濃度で存在させた場合に、不溶化成分を除去
するために充分な濃度のシリカ粒子を添加すると、本来
目的とする血中蛋白のうちのＣ４などの大半が除去され
てしまうという問題点があり、また、界面活性剤を高濃
度で存在させた場合には、不溶化成分を除去することが
できず、濁りが発生するという問題点があった。上記問
題点から、この方法を免疫検査用標準液または参照液の
製造方法として使用することは困難であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血中蛋白で
あるＣ４などを損失することなく、濁りのない清澄な免
疫検査用標準液または参照液を、短時間で簡便に製造し
ようとするものである。

【０００８】

【課題を解決しようするための手段】上記の課題が、血
清または血漿中の不溶化成分を除去することを目的とし
て、血清または血漿とシリカ粒子を接触させる際に、塩
を共存させることにより、Ｃ４などの損失を抑制するこ
とで解決できることを見出して本発明を完成し、ここに
提案するに至った。

【０００９】即ち、本発明は、血清または血漿からなる
免疫検査用標準液または参照液の製造方法において、塩
存在下に、血清または血漿とシリカ粒子を接触させるこ
とを特徴とする前記製造方法である。

【００１０】血漿とは、ヒトなどの動物より採血した血
液に、血液凝固阻止剤を加え、血球成分を分離除去した
ものである。血清とは、血液または血漿を凝固させた
後、遠心及び濾過などの方法で血球や血液凝固因子を分
離除去したものである。血漿、血清のいずれも本発明に
用いられる。

【００１１】血清または血漿中の不溶化成分はリポ蛋白
が主成分と考えられている。リポ蛋白とは脂質と蛋白の
複合体である。トリグリセリドとコレステロールエステ
ルのような中性脂肪を中心部にもち、表層をリン脂質と
遊離コレステロールのような極性部をもつ脂質が一層の
単分子層で覆い、さらに蛋白が表層脂質と結合した粒子
状構造をしている。また、大きさはリポ蛋白の種類によ
り異なり、７ｎｍ〜１０００ｎｍまで広範にわたってい
る。

【００１２】リポ蛋白は、構成する脂質と蛋白の組成の
違いにより比重が異なり、大きくは以下の４つの比重範
囲に分類されている。それらは、比重０.９５以下のカ
イロミクロン（乳糜粒子）、比重０.９５〜１.００６の
超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、比重１.００６〜１.０
６３の低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、比重１.０６３〜１.
２１の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）である。

【００１３】本発明に用いられるシリカ粒子とは、精製
された四塩化ケイ素を酸素と水素で燃焼して作られる気
相法の乾式シリカ粒子及びケイ酸ナトリウムと硫酸のよ
うな鉱酸から作られる湿式シリカ粒子を意味し、いずれ
のシリカ粒子も好適に使用することができる。

【００１４】乾式シリカ粒子の例示としては、粒径５〜
５０ｎｍのレオロシールＱＳ−１０、レオロシールＱＳ
−２０、レオロシールＱＳ−４０（いずれも（株）トク
ヤマ製）などがあり、湿式シリカ粒子の例示としては、
粒径１０〜２０μｍのトクシールＧＵ−Ｎ、トクシール
ＵＲ（いずれも（株）トクヤマ製）などが挙げられる。

【００１５】本発明で使用される塩としては、無機塩類
も有機塩類も共に使用可能である。一般に使用される塩
を例示すると次の通りである。無機塩類としては、塩化
ナトリウム、塩化カリウムのような塩化物、臭化ナトリ
ウム、臭化カリウムのような臭化物、ヨウ化ナトリウ
ム、ヨウ化カリウムのようなヨウ化物、チオシアン酸の
ようなチオシアン酸塩類、硫酸ナトリウム、硫酸アンモ
ニウムのうような硫酸塩、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ムなどの炭酸塩、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムな
どの重炭酸塩などが挙げられ、特にナトリウム塩、リチ
ウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩や、アンモニ
ウム塩が好適に使用される。有機塩類としては、酢酸ナ
トリウム、酢酸アンモニウムなどの酢酸塩、トリクロロ
酢酸ナトリウムなどのトリクロロ酢酸塩などが挙げら
れ、ナトリウム塩やアンモニウム塩が好適に使用され
る。一般に、高純度品が安価に、容易に入手できるとい
う点で塩化ナトリウムが特に好適に使用される。

【００１６】塩存在下に、血清または血漿とシリカ粒子
を接触させて不溶化成分をシリカ粒子に吸着させる方法
は特に限定されない。例えば、一定量の塩とシリカ粒子
を秤量して、血清や血漿に直接添加混合してもよいし、
シリカ粒子の一定量を懸濁した塩の水溶液を、血清や血
漿に添加混合してもよい。尚、その際に公知の方法にあ
るように非イオン性界面活性剤を共存させることは特に
必要ではない。

【００１７】共存させる塩の濃度はＣ４などの損失が小
さい濃度であれば特に限定されないが、終濃度０．１Ｍ
〜２．０Ｍの範囲で好適に使用され、０．５〜１．０Ｍ
の範囲が特に好適である。

【００１８】シリカ粒子の添加量は特に限定されない
が、不溶化成分の吸着効率や操作性を考慮すると、血清
や血漿に対して１％〜３％（Ｗ／Ｖ）添加することが好
ましい。

【００１９】添加したシリカ粒子に不溶化成分を効率よ
く吸着させる方法としては、しばらく静置するだけでも
よいし、激しく攪拌してもよいが、３０分〜１時間程度
ゆるやかに振盪することが好ましい。その際の温度は、
蛋白が変性しない範囲であれば特に限定されないが、２
０〜４０℃が好適である。

【００２０】以上のようにして不溶化成分を吸着させた
シリカ粒子を分離除去し、目的とする清澄な血清または
血漿を得る方法には、遠心分離、デカンテーションある
いは濾過などの一般的分離操作が用いられるが、操作性
や処理時間を考慮すると、遠心分離が好適である。その
際の遠心分離の条件は不溶化成分吸着シリカ粒子が沈降
する条件であれば何ら限定されなく、例えば、遠心加速
度８，０００×ｇ〜１２，０００×ｇ、５〜１５分間の
条件が好適である。

【００２１】得られた清澄な血清または血漿は、そのま
ま免疫検査用標準液または参照液としてもよいが、必要
に応じて生理食塩水などに対する透析やゲル濾過などの
一般的な脱塩処理を行って免疫検査用標準液または参照
液とすることができる。更には先に示した種々の血中蛋
白の濃度調製を行う場合もある。

【００２２】

【発明の効果】本発明の方法により、凍結融解のような
煩雑な操作を必要とせず、塩存在下に、血清または血漿
とシリカ粒子を接触させるだけで、短時間のうちにＣ４
などを損失することなく清澄な血清または血漿を得、こ
れを免疫検査用標準液または参照液とすることができ
る。この方法は、免疫検査用標準液または参照液の工業
的生産に有用である。

【００２３】

【実施例】以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。

【００２４】（塩の添加によるＣ４残存率の向上） 実施例１ １０ｍｌ容のプラスチックチューブ内において、ヒト血
清２ｍｌと１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．２）２ｍｌとを混合し、塩化ナトリ
ウムの終濃度が０．５Ｍとなるようにした。次いで、乾
式微粉体シリカ粒子（レオロシールＱＳー２０；（株）
トクヤマ）を１．５％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し
た。室温（２７℃）下で１時間振盪した後、１０，００
０×ｇ、１０分間の遠心分離により不溶化成分吸着シリ
カ粒子を沈降させた。上清を採取し、凍結融解処理後の
濁度変化およびＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｃ３、Ｃ４濃
度を測定した。

【００２５】凍結融解後の濁度の測定は、分離した上清
を１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．２）にて透析し、−８０℃下での凍結と
室温下での融解を４回繰り返し、分光光度計Ｕ−３２０
０（日立製作所製）を用いて７００ｎｍの吸光度を測定
することにより行った。

【００２６】ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｃ３、Ｃ４濃度
は、ラテックス凝集比濁法試薬（イムノティクルスオー
ト；（株）エイアンドティー製）を用い、全自動分析装
置ＴＢＡ３０Ｒ（東芝製）により測定した。

【００２７】尚、コントロールには、ヒト血清を５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）で２倍に希釈したも
のを用いた。測定結果は、コントロールの測定結果を１
００％とした相対値で表１にまとめて示す。

【００２８】終濃度０．５Ｍの塩化ナトリウム存在下で
血清にシリカ粒子を作用させた場合、凍結融解処理後の
濁度はコントロールに比較して１０．９％と非常に低
く、不溶化成分の除去が効率よく行われることが判っ
た。血中成分の回収率はコントロールに対してＩｇＧ；
９３．４％，ＩｇＡ；９６．２％，ＩｇＭ；８９．７
％，Ｃ３；６０．０％，Ｃ４；７１．０％であり、いず
れの成分も損失なく回収されることが判った。

【００２９】実施例２〜６ 実施例１で使用した１Ｍ塩化ナトリウム溶液の代わり
に、１Ｍ塩化カリウムまたは１Ｍ硫酸ナトリウムまたは
１Ｍ硫酸アンモニウムまたは１Ｍ酢酸アンモニウムある
いは１Ｍトリクロロ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を血清に添加した以外は実
施例１と同様の操作を行った。それぞれの結果を実施例
１の結果と共に表１に示す。実施例１の塩化ナトリウム
の場合と同様に、塩化カリウム，硫酸ナトリウム，硫酸
アンモニウム，酢酸アンモニウム，トリクロロ酢酸ナト
リウムのいずれの塩でも不溶化成分の除去が効率よく行
われた。Ｃ４の回収率も高く、ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，Ｃ３も高い回収率が得られた。

【００３０】比較例１ 実施例１で使用した１Ｍ塩化ナトリウム溶液の代わり
に、塩を含まない５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
２）を血清に添加した以外は実施例１と同様の操作を行
った。結果を実施例１の結果と共に表１に示す。

【００３１】凍結融解処理後の濁度はコントロールと比
較して１３．１％と低く、不溶化成分の除去が効率よく
行われていた。しかし、Ｃ４の回収率はコントロールに
対して３３．７％と非常に低いものであった。その他の
血中成分の回収率は、ＩｇＧ；８９．０％，ＩｇＡ；８
６．５％，ＩｇＭ；８３．９％，Ｃ３；５１．４％であ
った。

【００３２】比較例２ 実施例１で使用した１Ｍ塩化ナトリウム溶液の代わり
に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を血清に添加した以外は
実施例１と同様の操作を行った。結果を実施例１の結果
と共に表１に示す。

【００３３】比較例３ 実施例１で使用した１Ｍ塩化ナトリウム溶液の代わり
に、１％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を血清に添加した以外は実施
例１と同様の操作を行った。結果を実施例１の結果と共
に表１に示す。

【００３４】比較例４ 実施例１で使用した１Ｍ塩化ナトリウム溶液の代わり
に、２％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を血清に添加した以外は実施
例１と同様の操作を行った。結果を実施例１の結果と共
に表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】比較例２〜比較例４では、０．０５％のツ
イーン２０を添加した場合、凍結融解後の濁度は改善さ
れたが、Ｃ４の回収率は４５．８％と低かった。反面、
ツイーン２０を０．５％あるいは１％存在させた条件下
では、Ｃ４の回収率は向上したが、凍結融解後の濁度が
コントロールの１００％に比べ、１４５％〜２０９．３
％と著しく高くなった。したがって、非イオン性界面活
性剤であるツイーン２０の添加では、Ｃ４の回収率を高
くすることと、凍結融解後の濁度を減少させることの２
つを両立させることができないことが判った。 （塩の添加量に関する検討） 実施例７ 添加する塩を塩化ナトリウムとし、終濃度を０．５また
は１．０または１．５あるいは２．０Ｍとなるように添
加した以外は、実施例１と同様の操作を行った。シリカ
粒子と接触させない血清を１００％としたときの凍結融
解後の濁度とＣ４の回収率を図１に示す。

【００３７】凍結融解後の濁度については、塩化ナトリ
ウム終濃度０．５〜２．０Ｍの範囲でコントロールに比
較して５．６〜８．７％であり、充分に不溶化成分の除
去が行われたことが判る。

【００３８】Ｃ４の回収率は、塩化ナトリウム終濃度
０．５〜２．０Ｍの範囲で、塩化ナトリウム無添加の場
合に比べて著しく高くなった。

【００３９】（シリカ粒子種の検討） 実施例８ 塩化ナトリウムを終濃度０．７Ｍとなるように添加し、
乾式シリカ粒子としてレオロシールＱＳ−１０〔（株）
トクヤマ製：ＱＳ−１０という〕を用いた以外は実施例
１と同様の操作を行った。結果を表２に示す。

【００４０】凍結融解処理後の濁度はコントロールと比
較して１５．３％と低く、不溶化成分の除去が効率よく
行われていた。

【００４１】Ｃ４の回収率はコントロールに対して８
４．６％と高かった。その他の血中成分の回収率は、Ｉ
ｇＧ；９１．４％，ＩｇＡ；９６．５％，ＩｇＭ；８
９．４％，Ｃ３；８７．５％であった。

【００４２】実施例９〜１３ 実施例８のシリカ粒子を、乾式シリカ粒子についてはレ
オロシールＱＳ−２０（ＱＳ−２０という）を１．０％
（Ｗ／Ｖ）またはレオロシールＱＳ−３０（ＱＳ−３０
という）を１．０％（Ｗ／Ｖ）あるいはＱＳ−４０（Ｑ
Ｓ−４０という）を１．０％（Ｗ／Ｖ）、また、湿式シ
リカ粒子についてはトクシールＧＵＮ（ＧＵＮという）
を３．０％（Ｗ／Ｖ）あるいはトクシールＮ（Ｎとい
う）を２．２５％（Ｗ／Ｖ）とした以外は実施例８と同
様の操作を行った。結果を表２に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】乾式シリカ粒子については、ＱＳ−１０を
１．５％（Ｗ／Ｖ）添加した場合に、コントロールに対
してＣ４の回収率が８４．６％，凍結融解後の濁度が１
５．３％、ＱＳ−２０を１．０％（Ｗ／Ｖ）添加した場
合に、コントロールに対してＣ４の回収率が８６．２
％，凍結融解後の濁度が１４．３％、ＱＳ−３０を１．
０％（Ｗ／Ｖ）添加した場合に、コントロールに対して
Ｃ４の回収率が７９．７％，凍結融解後の濁度が１３．
８％、ＱＳ−４０を１．０％（Ｗ／Ｖ）添加した場合
に、コントロールに対してＣ４の回収率が７４．８％，
凍結融解後の濁度が１４．８％であった。

【００４５】湿式シリカ粒子については、ＧＵＮを３．
０％（Ｗ／Ｖ）添加した場合に、コントロールに対して
Ｃ４回収率７７．１％，凍結融解後の濁度が１０．８％
であった。Ｎを２．２５％（Ｗ／Ｖ）添加した場合に、
Ｃ４回収率６６．３％，凍結融解後の濁度が１１．０％
であった。

【００４６】乾式シリカ粒子，湿式シリカ粒子いずれの
場合にも、凍結融解後の濁度はコントロールに比較して
低下し、Ｃ４の回収率は比較例１と比較して顕著に高く
なった。

【００４７】（血漿での検討） 実施例１４ 血清の代わりに血漿を用いた以外は実施例１と同様の操
作を行った。結果を表３に示す。

【００４８】コントロールに比較して、凍結融解後の濁
度は１４．０％、Ｃ４の回収率は６５．４％であった。

【００４９】比較例５ 塩化ナトリウムを添加しない以外は、実施例１４と同様
の操作を行った。結果を実施例１４とともに表３に示
す。

【００５０】コントロールに比較して、凍結融解後の濁
度は１８．５％と低かったが、Ｃ４は３６．７％しか回
収されなかった。

【００５１】処理対象を血漿とした場合でも、血清の場
合と同様に、塩化ナトリウムを添加することにより、Ｃ
４の回収率が著しく高くなることがわかった。

【００５２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本図は、塩化ナトリウム終濃度と、血清の濁
度とＣ４の回収率との関係を示した図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血清または血漿からなる免疫検査用標準
   液または参照液の製造方法において、塩存在下に、血清
   または血漿とシリカ粒子を接触させることを特徴とする
   前記製造方法。