KR940004672B1 - 류마토이드 인자 검출을 위한 폴리스틸렌 라텍스 비드를 이용한 진단용 시약의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
류마토이드 인자(Rheumatoid Factor; R.F)는 사람 면역글로불린 G(Human IgG) 분자의 C구역(dorminant)에 위치하고 있는 특이한 항원 결정기와 반응하는 사람 면역글로불린으로 류마티즘 환자에게서 발견되어 류마토이드 인자라고 불리운다.
류마토이드 인자의 종류는 사람 면역글로불린 M-R.F, 사람 면역글로불린 G-R.F, 사람 면역글로불린 D-R.F, 사람 면역글로불린 A-R.F, 사람 면역글로불린 E-R.F 등이 있다. 일반적으로 류마토이드 인자 중 가장 보편적으로 쉽게 발견할 수 있는 것은 분자량이 900,000달톤(Dalton)이고, 침강계수가 19S인 사람 면역글로불린 M-R.F이다. 이 사람 면역글로불린 M-R.F는 전체 류마토이드 인자중 75-90%를 차지하고 있다.
류마토이드 인자는 류마티즘 환자 뿐 아니라 결합 조직 질병(Connective tissue disease)을 가진 환자, 아급성 감염(Subacute infectious), Miscellaneous disorders등을 가진 환자와, 정상인이면서도 나이든 사람에게 많이 나타나는데 이는 오랫동인 계속적으로 반복해서 외래 항원에 노출되었기 때문이다. 류마토이드 인자는 홍반성 낭창(Lupus crythmatosus) 환자의 30%와 Polyarthritis nodosum 환자와 피부 경화증(scleroderma) 환자에서도 적은 %로 발견되고, 쇠그렌증후군(Sjogren's syndrome)환자와 펠티 증후군(Felty's syndrome)에서는 거의 100% 발견되었다. [참고문헌 : 가( Edward D.Harris, Jr : Rhematology and Immunology, p170; 나)John S. Davis IV : Rematology and Immunology, p177]
심장내막염(subacute bacterial endocarditis)같은 감염성 질병에서 R.F의 발견은 환자의 50%를 차지하며 후천성 무감마글로불린혈증(Acguired agammaglobulinemia)을 가진 환자는 R.F의 빈도가 증가한다.
류마티즘은 관절의 만성적인 병으로 류마티즘이 일어나는 원인은 정확하지 않다. 증세로는 초기에 활액막(synovium)에서 염증으로 시작되고 완화되는 것 같다가 간헐적인 과정을 거치던가 또는 뼈의 부식을 일으키는 증식 관절활막염으로 진전하고 결국은 연골과 건(tendon)이 파괴된다. 류마토이드 인자가 다른 류마토이드 인자와 서로 결합한 자기 결합(Self Associated) R.F 복합체는 염증을 일으키기도 한다. 또한 류마토이드 인자는 이차항체를 이용하여 항원에 대한 사람 면역글로불린 M(Ig M)을 검사하는 간접성 효소-표지 면역 흡착 분석(Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent assay)방법을 사용할 때 비특이적 양성반응을 나타내기도 한다. 이러한 방해 요인은 위양성(false positive) 결과를 나타내기도 한다.
류마토이드 인자는 1940년 Waaler와 Rose가 혈구 응집성에 민감한 양의 적혈구 세포를 이용한 응직반응 실험으로 검출되기 시작하였다. [참고문헌 : 가) Waaler.E : Acta Pathol Microbiol Scand 1940; 17; 172-188, 나) Rose. HM, Ragan. C, et al : Proc Soc Exp Biol Med 1949; 68; 1-6] 이 방법은 그 후 Singer-Plotz의 라텍스 고정실험(fixation test)으로 발전되었는데 쥐의 면역글로불린 G를 폴리비닐톨루엔 라텍스(Polyvinyltoluene latex)에 흡착시켜 류마티스환자 혈청과 특이적으로 응집반응 하는 것을 발견하였으며, 적혈구입자의 단점인 동물개체 차에 의한 개체 및 집단간의 친화 또는 반발성을 지닌 항체들간에 비특이적인 반응의 문제가 해결되었다. 라텍스는 화학합성 기술의 진보에 의해 폴리스티렌 물질로 항체가 흡착되어도 활성이 변하지 않고, 따라서 항체감작 라텍스 시약은 항체의 본질적인 항체 항원 반응성이 흡착에 의해 손상되지 않고 그대로 존재한다. [참고문헌; 가) Maiolini.R, Ferrua.B, et al : J.Immunol Methods 1978; 20; 25-34, 나) Carson.DA, Lawrance.S, et al : J.Immunol 1977; 119; 295-300, 다) Kallerup, HE, Egeskjold.EM, et al : Scand.J.Rheumatol 1979; 8; 1-9, 라) March.RE, Reeback.JS, et al : J.Immunol Methods 1981; 42; 137-146, 마) Cannon.GW, Egger.MJ, et al : Am JClin Pathol 1987; 87; 223-229]
그 이후로도 류마토이드 인자를 검사할 수 있는 방법이 많이 소개되었으나 현재 라텍스 고정실험이 검사 방법으로 많이 쓰이고 있다. [참고문헌 : Clinica chimica Acta 167(1987) 1-21]
1)사람 면역글로불린 G의 정재 방법
사람 면역글로불린 G를 얻기 위해 사람 혈청을 제품화되어있는 진단시약으로 간염표면 항원(HBsAg), 항-사이토메갈로 바이러스(Anti-CMV), 항-풍진(Anti-Rubella), 항-헤르페스(Anti-Herpes), 항-후천성 면역결핍증 바이러스(Anti-HIV), 및 R.F 검사등을 실시하여 모두 음성결과를 보인 정상인 혈청 사용한다. 보편적으로 사람 면역글로불린 G를 정제하는 방법은 겔여과 방법 또는 이온교환방법을 병용하여 정제하게 된다. 본 발명에서는 확보된 혈청을 시아노제 브로마이드으로 활성화시킨 CNBr-activated Sepharose CL4B(Pharamacia 사 제품)을 기질(matrix)로 하여 산양(Goat)에 사람 면역그로불린 G를 수차례 면역시켜 적당한 폴리클른항체를 보유했을 때 채혈하여 정제한 항-사람 면역그로불린 G(Anti-Human IgG)를 붙여 만든 친화성컬럼을 이용하여 한 단계의 정제를 하였다. 정제한 항-사람 면역글로불린 G의 정제도는 나트륨 도데실설페이트가 있는 폴라아크릴아미드 겔 전기영동방법을 사용하였고, 단백량은 로우리 분석법으로 조사하였다. 정제된 사람 면역글로불린 G는 95% 이상의 정제도를 보였으며 혈청 1ml당 15mg의 단백량을 얻었다.
2) 사람 면역글로불린 G와 라텍스 비드 간의 부착 방법.
사람 면역글로불린 G(농도 : 1mg/ml) 400㎕, 52mM 탄산염-중탄산염 완충액(pH9.6) 400㎕와 라텍스 비드를 환합하고 37℃에서 80분 동안 반응시켰다. 그후 12,000rpm에서 5분동안 원심분리하여 상청액은 버리고 침전물(사람 면역글로불린 G가 부착된 라텍스 비드)을 취하고 52mM 탄산염-중탄산염 완충액(pH9.6)을 1ml 가하고 다시 원심분리(12,000rpm, 5분간)했다. 상청액은 버리고 침전물을 취한 다음 1% 소혈청 알부민(BSA) 1ml를 첨가하고 다시 원심 분리했다. 다시 상청액을 제거하고 침전물을 취한다음, 1% 소혈청 알부민(BSA) 1ml를 가하여 사용하였다.
3) 사람 면역글로불린 G가 부착된 라텍스 비드를 이용한 혈청 검사 방법.
판정용 슬라이드 글라스에 표시된 원구획안에 양성대조액, 음성대조액 및 검사할 혈청을 50㎕씩 가하고 혈청을 구획내에 넓혀준다. 그 위에 라텍스시료를 50㎕ 떨어뜨린 후 슬라이드 교반기에 폴레이트를 올려놓고 70-100회전/분 속도로 2분간 혼합시킨다. 결과를 육안으로 판정하며, 라텍스 입자가 음성 대조액과 같이 고르게 퍼져 있으며 음성(-)판정으로 하고, 양성 대조액 같이 입자가 뭉쳐서 응집되어 있으면 양성(+)판정을 내린다. 양성 대조액 보다 더 크게 입자가 뭉쳐 있으며 강양성(++)으로 판정하고 양성 대조액의 응집보다 작으면 약양성(±)으로 판정을 내린다.
다음 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
사람 면역그로불린 G를 라텍스 비드에 흡착시킬 때의 적정농도를 조사하기 위해 사람 면역글로불린 G의 농도를 0.1mg/ml에서 5mg/ml로 변화시키면서 R.F 응집반응을 검사하였다. 이때 사용한 라텍스 비드의 직경은 0.4㎛였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
* H. Ig G : 사람 면역글로불린 G
외국제품 A : 상품명 RA-80, EIKEN Chemical Co. 사 제품, 일본
외국제품 B : 상품명 Rheuma-Wellcotest, Wellcome 사 제품, 영국
사람 면역글로불린 G의 농도가 0.5mg/ml 이하일 때는 민감도에 영향을 주었으며 1mg/ml 내지 5mg/ml의 농도에서는 동일한 결과를 얻었다. 따라서 가장 바람직한 농도는 1mg/ml의 사람 면역글로불린 G를 사용했을 때 임을 알 수 있다.
[실시예 2]
라텍스 바드의 크기를 결정하기 위해, 상품화 되어 있는 라텍스 비드(시그마, 미국)를 크기별로 준비하여 각각 1mg/ml의 사람 면역글로불린 G를 흡착시켜 12종류의 혈청에 대한 R.F 실험을 실시하였다. 비교시약으로는 외국에서 시판되는 것을 사용하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
외국제품 A : 상품명 RA-80, EIKEN Chemical Co. 사 제품, 일본
외국제품 B : 상품명 Rheuma-Wellcotest, Wellcome 사 제품, 영국
라텍스 비드 직경이 0.3㎛에서 0.8㎛ 사이인 것은 모두 사용 가능하였으며, 0.3㎛ 미만과 1.100㎛이상의 라텍스 비드 사용은 적절하지 못했다.
[실시예 3]
라텍스 비드의 사용농도를 결정하기 위해서, 1mg/ml의 사람 면역글로불린 G를 흡착시킨 라텍스 비드를 농도별로 준비하여 실험을 실시하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
* 라텍스 비드의 농드(%)는 검체와 혼합한 후의 최종 농도(%)를 나타낸다.
외국제품 A : 상품명 RA-80, EIKEN Chemical Co. 사 제품, 일본
외국제품 B : 상품명 Rheuma-Wellcotest, Wellcome 사 제품, 영국
라텍스 비드의 농도가 0.7% 이하인 때는 농도가 너무 낮아 양성검체에서의 응집반응이 조금 떨어지고 라텍스 비드의 농도가 1.5% 이상에서는 음성검체를 검사했을 때 농도가 너무 높아 약간의 위양성 반응을 보였다. 따라서 라텍스 비드의 적정한 사용농도는 0.8%에서 1.0% 사이가 가장 적당하다.
[실시예 4]
라텍스 비드에 사람 면역글로불린 G를 흡착시켜 결정된 농도로 검체와 응집반을 검사할 때 나타나는 비특이 반을 제거하기 위해서 염화나트륨 및 나트륨 티오시아네이트(NaSCN)의 Chaotropic Agent)를 사용한다. 비특이 반응 제거 실험을 실시하고 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
외국제품 A : 상품명 RA-80, EIKEN Chemical Co. 사 제품, 일본
외국제품 B : 상품명 Rheuma-Wellcotest, Wellcome 사 제품, 영국
염화나트륨(NaCl) 또는 나트륨 티아시아네이트(NaSCN)가 없을때 나타나는 비특이반응은 각각 염화나트륨 또는 나트륨 티오시아네이트 0.5M의 농도를 첨가했을때는 비특이반응을 완전히 제거하지 못하였으며, 1M 이상씩 넣었을때는 비특이 반응으로 완전히 제거하였다. 그러나 5M 농도의 염화나트륨은 괜찮은 반면 나트륨 티오시아네이트는 사람 면역글로불린 G의 반응성(Activity)에 영향을 미쳐 RF 양성검체의 일부를 음성으로 판정하는 것으로 나타났다. 그러므로 염화나트륨 및 나트륨티오시아네이트의 사용범위는 염화나트륨의 경우 1-5M, 나트륨 티오시아네이트는 1-3M의 농도가 비특이반을 제거할 수 있는 농도로 적당하였다.
[실시예 5]
사람 면역를로불린 G가 라텍스 비드에 부착된 시료와 검체를 판정용 슬라이드글라스에서 응집반응을 관찰하는 동안 시료와 검체의 혼합물이 마르는 현상을 방지하기위해 글리세룰을 시료에 혼합하여 용이한 판독을 내릴 수 있도록 조사하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
외국제품 A : 상품명 RA-80, EIKEN Chemical Co. 사 제품, 일본
외국제품 B : 상품명 Rheuma-Wellcotest, Wellcome 사 제품, 영국
글리세롤의 농도가 10% 미만일 경우 혈청과 시료를 섞어 반응시켰을때 쉽게 건조되면서 RF 음성혈청에서 일부는 판정을 내리기가 어려운 경우가 나타났으며 RF 양성혈청에서는 약양성혈청의 경우 판정이 애매하였다. 글리세롤의 농도 15% 이상에서는 점도가 높아 응집이 일어나는 시간이 길어지므로 RF 약양성혈청의 판정이 애매하였다. 따라서 혈청과 시료의 건조와 위음성 결과를 막기위해 글리세롤 10%를 사용하였다.
Claims (5)
- 사람 면역글로불린 G를 라텍스 비드에 흡착시키고 이를 이용하여 혈청 중의 류마토이드 인자를 검출하는 방법에 있어서 라텍스 비드의 크기는 0.3㎛~0.8㎕인 방법.
- 제1항에 있어서, 사람 면역글로불린 G가 흡착된 라텍스 비드의 사용농도는 0.8~1.0%인 방법.
- 제1항에 있어서, 검체 판정의 특이성을 높이기 위해 염화나트륨 또는 나트륨 티오시아네이트를 첨가하는 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 염화나트륨의 농도는 1-5M이며, 나트륨 티오시아네이트의 농도는 1-3M인 방법.
- 제1항에 있어서, 10% 농도의 글리세롤을 첨가하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1019900009218A KR940004672B1 (ko) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | 류마토이드 인자 검출을 위한 폴리스틸렌 라텍스 비드를 이용한 진단용 시약의 제조방법 |
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| KR1019900009218A KR940004672B1 (ko) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | 류마토이드 인자 검출을 위한 폴리스틸렌 라텍스 비드를 이용한 진단용 시약의 제조방법 |
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