JPH0975084A - 改変シクロデキストリン合成酵素及びその 製造法並びに該酵素を用いたシクロデキス トリンの製造法 - Google Patents
改変シクロデキストリン合成酵素及びその 製造法並びに該酵素を用いたシクロデキス トリンの製造法Info
- Publication number
- JPH0975084A JPH0975084A JP25450595A JP25450595A JPH0975084A JP H0975084 A JPH0975084 A JP H0975084A JP 25450595 A JP25450595 A JP 25450595A JP 25450595 A JP25450595 A JP 25450595A JP H0975084 A JPH0975084 A JP H0975084A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cgtase
- cyclodextrin
- modified
- amino acid
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Cyclomaltodextrin glucanotransferase
（CGTase）のＡ領域の活性中心であるチロシン（Ｔｙ
ｒ）（Bacillus macerans由来のCGTaseの場合、１００
位のＴｙｒ）を他のアミノ酸（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅ
ｕ、Ａｓｎ）に置換した新規改変CGTase。 【効果】 改変CGTaseを基質（澱粉）に作用させると、
α−シクロデキストリン含有量が非常に高い反応生成物
が得られる。
（CGTase）のＡ領域の活性中心であるチロシン（Ｔｙ
ｒ）（Bacillus macerans由来のCGTaseの場合、１００
位のＴｙｒ）を他のアミノ酸（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅ
ｕ、Ａｓｎ）に置換した新規改変CGTase。 【効果】 改変CGTaseを基質（澱粉）に作用させると、
α−シクロデキストリン含有量が非常に高い反応生成物
が得られる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、改変シクロデキス
トリン合成酵素（CGTase : Cyclomaltodextrin glucano
transferase）及びその製造法並びに該改変CGTaseを用
いたシクロデキストリン（ＣＤ：cyclodextrin）の製造
法に関する。さらに詳しくは、バチルス・マセランス
（Bacillus macerans）由来のCGTaseのアミノ酸配列
中、Ｎ末端から１００位のチロシン（Ｔｙｒ）を他のア
ミノ酸に置換した改変CGTaseに関する。また、他のCGTa
seにおいても、バチルス・マセランス由来の該酵素の１
００位の位置のＴｙｒに相当するＴｙｒを他のアミノ酸
に置換した改変CGTaseに関する。
トリン合成酵素（CGTase : Cyclomaltodextrin glucano
transferase）及びその製造法並びに該改変CGTaseを用
いたシクロデキストリン（ＣＤ：cyclodextrin）の製造
法に関する。さらに詳しくは、バチルス・マセランス
（Bacillus macerans）由来のCGTaseのアミノ酸配列
中、Ｎ末端から１００位のチロシン（Ｔｙｒ）を他のア
ミノ酸に置換した改変CGTaseに関する。また、他のCGTa
seにおいても、バチルス・マセランス由来の該酵素の１
００位の位置のＴｙｒに相当するＴｙｒを他のアミノ酸
に置換した改変CGTaseに関する。
【０００２】更にまた、本発明は、該改変CGTaseのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子をバチルス（Bacillus）属
細菌に形質転換し、該形質転換体を培養することによ
り、該改変CGTaseを培養物中に生成、蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該改変CGTaseの製造法に関
する。さらに該改変CGTaseを澱粉などの基質に作用せし
め、α−ＣＤ含有量の非常に高い反応液よりＣＤを採取
することを特徴とするＣＤの製造法に関する。
ノ酸配列をコードする遺伝子をバチルス（Bacillus）属
細菌に形質転換し、該形質転換体を培養することによ
り、該改変CGTaseを培養物中に生成、蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該改変CGTaseの製造法に関
する。さらに該改変CGTaseを澱粉などの基質に作用せし
め、α−ＣＤ含有量の非常に高い反応液よりＣＤを採取
することを特徴とするＣＤの製造法に関する。
【０００３】
【従来の技術】CGTaseは、α−１，４グリコシド結合の
みを加水分解するα−アミラーゼの一種であり、澱粉を
分解し分子内糖転移により、環状多糖類であるシクロデ
キストリン（ＣＤ）を生成する酵素である。現在まで
に、バチルス（Bacillus）属、クレブシーラ（Klebsiel
la）属及びミクロコッカス（Micrococcus）属に属する
細菌がCGTaseを生産することが報告されている。
みを加水分解するα−アミラーゼの一種であり、澱粉を
分解し分子内糖転移により、環状多糖類であるシクロデ
キストリン（ＣＤ）を生成する酵素である。現在まで
に、バチルス（Bacillus）属、クレブシーラ（Klebsiel
la）属及びミクロコッカス（Micrococcus）属に属する
細菌がCGTaseを生産することが報告されている。
【０００４】CGTaseの作用によって澱粉から生成される
α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤは、それぞれ６、７及
び８個のグルコース残基がα−１，４結合により環状構
造をとったホモ・オリゴ糖であり、いずれのＣＤも環状
構造の空隙にゲストとなる疎水性の様々な物質を保持し
て安定な包接化合物を形成し、親水性を与える。ＣＤは
この包接機能を有するため、揮発性物質の安定化、酸化
防止、特異臭の除去、苦味の抑制、乳化作用、潮解性物
質の安定化、物質の溶解性の変化などの目的で、食品、
薬品、化粧品その他の産業において広く利用されてい
る。
α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤは、それぞれ６、７及
び８個のグルコース残基がα−１，４結合により環状構
造をとったホモ・オリゴ糖であり、いずれのＣＤも環状
構造の空隙にゲストとなる疎水性の様々な物質を保持し
て安定な包接化合物を形成し、親水性を与える。ＣＤは
この包接機能を有するため、揮発性物質の安定化、酸化
防止、特異臭の除去、苦味の抑制、乳化作用、潮解性物
質の安定化、物質の溶解性の変化などの目的で、食品、
薬品、化粧品その他の産業において広く利用されてい
る。
【０００５】従来のα−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤの
製造は、バチルス属などの微生物由来のCGTaseを澱粉な
どの基質に作用させ、α−、β−、γ−ＣＤの混合溶液
を得た後、その後の結晶化やクロマトなどによる分離に
よって各々のＣＤに分画、分取していた。しかしこの方
法では、純度の高い各々のＣＤを得るために複数回のク
ロマトを適用する必要があるなど分取に時間と労力が必
要で、製造コストが高くなるという問題があった。
製造は、バチルス属などの微生物由来のCGTaseを澱粉な
どの基質に作用させ、α−、β−、γ−ＣＤの混合溶液
を得た後、その後の結晶化やクロマトなどによる分離に
よって各々のＣＤに分画、分取していた。しかしこの方
法では、純度の高い各々のＣＤを得るために複数回のク
ロマトを適用する必要があるなど分取に時間と労力が必
要で、製造コストが高くなるという問題があった。
【０００６】また特異性の高いCGTaseを使用して、特定
のＣＤを効率よく生産する方法も行われている。例え
ば、生成するＣＤの約50％がα−ＣＤであるバチルス・
マセランス（Bacillus macerans）の生産する比較的α
−ＣＤを高率に生産するCGTaseを使用することにより、
ある程度選択的にα−ＣＤを調製することができる。し
かし、この方法もいまひとつＣＤ生成の選択性が低く、
混在するＣＤからα−ＣＤを分離・精製する必要がある
という問題があった。
のＣＤを効率よく生産する方法も行われている。例え
ば、生成するＣＤの約50％がα−ＣＤであるバチルス・
マセランス（Bacillus macerans）の生産する比較的α
−ＣＤを高率に生産するCGTaseを使用することにより、
ある程度選択的にα−ＣＤを調製することができる。し
かし、この方法もいまひとつＣＤ生成の選択性が低く、
混在するＣＤからα−ＣＤを分離・精製する必要がある
という問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、この
ような問題点を解決して、ＣＤを効率よく製造すること
であって、先ず、特定のＣＤを特異的に生産するCGTase
を新たに開発することを目的として設定した。
ような問題点を解決して、ＣＤを効率よく製造すること
であって、先ず、特定のＣＤを特異的に生産するCGTase
を新たに開発することを目的として設定した。
【０００８】しかして、CGTase分子はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ
領域から構成され（化学と生物 31, 112-120 (199
3)）、現在までに報告されている由来の異なるCGTase間
のアミノ酸配列は、互いに６０％以上の相同性を有して
いることが知られている。Ａ領域は、澱粉に結合して分
解する活性を有する領域である。バチルス・マセランス
由来のCGTase(Takano, T. et. al., J.Bacteriol., 16
6, 1118-1122(1986)）のＮ末端から１００番目のＡ領域
に属するアミノ酸はチロシン（Ｔｒｙ１００）である
が、この１００番目のアミノ酸はＡ領域の活性中心を構
成しており、CGTaseの活性の発現に重要な役割を果たし
ていると考えられる。
領域から構成され（化学と生物 31, 112-120 (199
3)）、現在までに報告されている由来の異なるCGTase間
のアミノ酸配列は、互いに６０％以上の相同性を有して
いることが知られている。Ａ領域は、澱粉に結合して分
解する活性を有する領域である。バチルス・マセランス
由来のCGTase(Takano, T. et. al., J.Bacteriol., 16
6, 1118-1122(1986)）のＮ末端から１００番目のＡ領域
に属するアミノ酸はチロシン（Ｔｒｙ１００）である
が、この１００番目のアミノ酸はＡ領域の活性中心を構
成しており、CGTaseの活性の発現に重要な役割を果たし
ていると考えられる。
【０００９】そこで、上記バチルス・マセランス由来の
CGTase遺伝子のＴｙｒ１００領域を遺伝子工学的に他の
アミノ酸に改変すれば、CGTaseの酵素としての性質が変
化し、特定ＣＤを特異的に生成する性質を有するCGTase
を得ることができるとの考えにはじめてたち、改変CGTa
seの開発という技術課題をはじめて創設した。
CGTase遺伝子のＴｙｒ１００領域を遺伝子工学的に他の
アミノ酸に改変すれば、CGTaseの酵素としての性質が変
化し、特定ＣＤを特異的に生成する性質を有するCGTase
を得ることができるとの考えにはじめてたち、改変CGTa
seの開発という技術課題をはじめて創設した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するためになされたものであって、本発明者らは、特
定ＣＤの生成率の高いCGTaseを得るために、バチルス・
マセランスのCGTaseのＡ領域のＴｙｒ１００に注目し、
鋭意検討を行った。その結果、Ｔｙｒ１００をＴｒｐ、
Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＡｓｎに置換した改変CGTaseがα
−ＣＤを特異的に生成することを見出し、本発明を完成
するに至った。
決するためになされたものであって、本発明者らは、特
定ＣＤの生成率の高いCGTaseを得るために、バチルス・
マセランスのCGTaseのＡ領域のＴｙｒ１００に注目し、
鋭意検討を行った。その結果、Ｔｙｒ１００をＴｒｐ、
Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＡｓｎに置換した改変CGTaseがα
−ＣＤを特異的に生成することを見出し、本発明を完成
するに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、バチルス・マセラン
ス由来のCGTaseのＴｙｒ１００をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅ
ｕ、またはＡｓｎに置換した、α−ＣＤを特異的に生成
する改変CGTaseに関するものである。また更に、バチル
ス・マセランス由来のCGTaseのみでなく、他のすべての
CGTaseにおいても、同菌由来の酵素のＮ末端から１００
位の位置のＴｙｒに相当するＴｒｙについて、これを他
のアミノ酸に置換しても、α−ＣＤを特異的に生成する
改変CGTaseを創製することができ、本発明は、これらす
べての新規な改変CGTaseを包含するものである。
ス由来のCGTaseのＴｙｒ１００をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅ
ｕ、またはＡｓｎに置換した、α−ＣＤを特異的に生成
する改変CGTaseに関するものである。また更に、バチル
ス・マセランス由来のCGTaseのみでなく、他のすべての
CGTaseにおいても、同菌由来の酵素のＮ末端から１００
位の位置のＴｙｒに相当するＴｒｙについて、これを他
のアミノ酸に置換しても、α−ＣＤを特異的に生成する
改変CGTaseを創製することができ、本発明は、これらす
べての新規な改変CGTaseを包含するものである。
【００１２】また本発明は、該改変CGTaseのアミノ酸配
列をコードする遺伝子をバチルス属細菌に形質転換し、
該形質転換体を培養することによる改変CGTaseの製造法
に関する。さらに該改変CGTaseを澱粉などの基質に作用
せしめ、反応液よりＣＤを採取することを特徴とするＣ
Ｄの製造法に関する。
列をコードする遺伝子をバチルス属細菌に形質転換し、
該形質転換体を培養することによる改変CGTaseの製造法
に関する。さらに該改変CGTaseを澱粉などの基質に作用
せしめ、反応液よりＣＤを採取することを特徴とするＣ
Ｄの製造法に関する。
【００１３】本発明においては、CGTaseであればすべて
のものが改変に供することが可能であって、バチルス・
マセランス由来のCGTaseも有利に使用することができ、
例えば、下記表１、表２、表３、表４で示される配列表
の配列番号１に示されるところの、バチルス・マセラン
ス ＩＡＭ １２４３（Bacillus macerans IAM 1243:
Takano, T. et. al., J.Bacteriol., 166, 1118-1122(1
986)）のCGTaseが好適に使用できる。
のものが改変に供することが可能であって、バチルス・
マセランス由来のCGTaseも有利に使用することができ、
例えば、下記表１、表２、表３、表４で示される配列表
の配列番号１に示されるところの、バチルス・マセラン
ス ＩＡＭ １２４３（Bacillus macerans IAM 1243:
Takano, T. et. al., J.Bacteriol., 166, 1118-1122(1
986)）のCGTaseが好適に使用できる。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】
【表３】
【００１７】
【表４】
【００１８】また、B. maceransのほか、B. lichenifor
mis (Nucleic Acids Res., 18, 199 (1990))、B. ohben
sis (Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 600-605(199
1))、B. circulans (J. Mol. Biol., 236, 590-600 (19
94))、B. sp. #1011 (J. Bacteriol., 169, 4399-4402
(1987))、B. sp. #1018 (Biochem. Biophys. Res. Comm
un., 166, 630-638 (1990))、B. stearothermophilus
(Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 4018-4025(199
1))、その他バチルス属菌由来のCGTaseも、本発明にお
いて広く改変に供することができる。
mis (Nucleic Acids Res., 18, 199 (1990))、B. ohben
sis (Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 600-605(199
1))、B. circulans (J. Mol. Biol., 236, 590-600 (19
94))、B. sp. #1011 (J. Bacteriol., 169, 4399-4402
(1987))、B. sp. #1018 (Biochem. Biophys. Res. Comm
un., 166, 630-638 (1990))、B. stearothermophilus
(Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 4018-4025(199
1))、その他バチルス属菌由来のCGTaseも、本発明にお
いて広く改変に供することができる。
【００１９】本発明を実施するには、バチルス・マセラ
ンス由来のCGTaseのＡ領域の活性中心、Ｔｙｒ１００を
他のアミノ酸に置換する必要があり、例えば配列番号１
に示されるCGTaseの１００位のＴｙｒを他のアミノ酸に
置換すればよい。
ンス由来のCGTaseのＡ領域の活性中心、Ｔｙｒ１００を
他のアミノ酸に置換する必要があり、例えば配列番号１
に示されるCGTaseの１００位のＴｙｒを他のアミノ酸に
置換すればよい。
【００２０】また、バチルス・マセランス以外のすべて
の菌由来のCGTaseについても、例えば図１に示すよう
に、バチルス・マセランスの１００位の位置のＴｙｒに
相当するＴｙｒが存在しており、このＴｙｒを他のアミ
ノ酸に置換すればよい。このように、CGTaseであれば、
由来を問わず、すべての酵素を本発明の改変に供するこ
とができる。
の菌由来のCGTaseについても、例えば図１に示すよう
に、バチルス・マセランスの１００位の位置のＴｙｒに
相当するＴｙｒが存在しており、このＴｙｒを他のアミ
ノ酸に置換すればよい。このように、CGTaseであれば、
由来を問わず、すべての酵素を本発明の改変に供するこ
とができる。
【００２１】CGTaseにおいて、Ｔｙｒ１００（又はそれ
に相当するＴｙｒ）を他のアミノ酸に置換するには、化
学的手法、生物学的手法、遺伝子工学的手法その他各種
の方法が適宜利用可能である。
に相当するＴｙｒ）を他のアミノ酸に置換するには、化
学的手法、生物学的手法、遺伝子工学的手法その他各種
の方法が適宜利用可能である。
【００２２】これらのうち、遺伝子工学的手法による置
換は、例えば次のようにして行う。先ず、CGTaseをコー
ドする遺伝子を調製しなければならないが、CGTaseをコ
ードする遺伝子は公知の方法で得ることが出来る。例え
ばCGTaseを生産するバチルス・マセランスからCGTaseを
コードする遺伝子をクローニングすることによって得る
ことが出来る。例えばバチルス・マセランス ＩＡＭ１
２４３からSaito、Miuraの方法（Saito, H., and Miur
a, K., Biochem. Biophys. Acta., 72, 639(1964)）に
よって染色体ＤＮＡを取り出したのち、既知の上記CGTa
seのシークエンスを基に作製したプライマーを用いて、
ＰＣＲにてCGTase遺伝子を増幅すればよい。
換は、例えば次のようにして行う。先ず、CGTaseをコー
ドする遺伝子を調製しなければならないが、CGTaseをコ
ードする遺伝子は公知の方法で得ることが出来る。例え
ばCGTaseを生産するバチルス・マセランスからCGTaseを
コードする遺伝子をクローニングすることによって得る
ことが出来る。例えばバチルス・マセランス ＩＡＭ１
２４３からSaito、Miuraの方法（Saito, H., and Miur
a, K., Biochem. Biophys. Acta., 72, 639(1964)）に
よって染色体ＤＮＡを取り出したのち、既知の上記CGTa
seのシークエンスを基に作製したプライマーを用いて、
ＰＣＲにてCGTase遺伝子を増幅すればよい。
【００２３】CGTaseの改変は、CGTaseをコードする遺伝
子を部位特異的変異（Site-Directed Mutagenesis）な
どの方法で改変することによって行うことができる。例
えば、CGTase分子中のＮ末端から１００番目のＴｙｒを
コードする塩基配列を、他のアミノ酸をコードする塩基
配列に改変した合成ＤＮＡをプライマーとし、CGTase遺
伝子を鋳型としてＰＣＲを行えば、目的とする１００番
目のＴｙｒ部分のみが改変した改変CGTase遺伝子を得る
ことが出来る。
子を部位特異的変異（Site-Directed Mutagenesis）な
どの方法で改変することによって行うことができる。例
えば、CGTase分子中のＮ末端から１００番目のＴｙｒを
コードする塩基配列を、他のアミノ酸をコードする塩基
配列に改変した合成ＤＮＡをプライマーとし、CGTase遺
伝子を鋳型としてＰＣＲを行えば、目的とする１００番
目のＴｙｒ部分のみが改変した改変CGTase遺伝子を得る
ことが出来る。
【００２４】このようにして得た改変CGTase遺伝子をベ
クターに挿入し、該ベクターで宿主菌を形質転換すれ
ば、改変CGTaseを生産する形質転換体を得ることが出来
る。
クターに挿入し、該ベクターで宿主菌を形質転換すれ
ば、改変CGTaseを生産する形質転換体を得ることが出来
る。
【００２５】改変遺伝子を挿入するベクターとしては、
宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラス
ミドが適している。例えばプラスミドはｐＮＨ４００
（J.Bacteriol., 177, 745-749(1995)）、ｐＮＵ２００
（鵜高重三、日本農芸化学会誌、61、669(1987)）、ｐ
ＨＹ７００（Biosci, Biotech, Biochem., 56, 812-813
(1992)）、ｐＨＴ１１０（特開平6-133782）やこれらの
派生体などが使用できる。プラスミドを構築する方法と
しては、公知の方法が適宜用いられ、例えばMolecular
cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harber L
aboratory(1982)に記載の方法などが例示される。
宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラス
ミドが適している。例えばプラスミドはｐＮＨ４００
（J.Bacteriol., 177, 745-749(1995)）、ｐＮＵ２００
（鵜高重三、日本農芸化学会誌、61、669(1987)）、ｐ
ＨＹ７００（Biosci, Biotech, Biochem., 56, 812-813
(1992)）、ｐＨＴ１１０（特開平6-133782）やこれらの
派生体などが使用できる。プラスミドを構築する方法と
しては、公知の方法が適宜用いられ、例えばMolecular
cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harber L
aboratory(1982)に記載の方法などが例示される。
【００２６】改変CGTase遺伝子を組み込んだ発現ベクタ
ーで形質転換する微生物としては、ベクター、プロモー
ターが発現可能なバチルス属細菌であれば何れでもよ
く、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）などが使
用できるが、特に好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３
１（本菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−１０８７）と同一菌株である。）が使用される。
ーで形質転換する微生物としては、ベクター、プロモー
ターが発現可能なバチルス属細菌であれば何れでもよ
く、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）などが使
用できるが、特に好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３
１（本菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−１０８７）と同一菌株である。）が使用される。
【００２７】宿主にプラスミドを導入する方法として
は、公知の方法、例えば、トリス−ＰＥＧ法（J. Bacte
riol., 156, 1130-1134(1983)）やエレクトロポレーシ
ョン法（Agric, Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989)）
などが適用できる。CGTaseを生産する形質転換体の選択
は、澱粉を含むプレート上で、コロニーの周りが透明に
なるかどうか（澱粉が分解された際生じるハロ）を確認
して行うことができる。
は、公知の方法、例えば、トリス−ＰＥＧ法（J. Bacte
riol., 156, 1130-1134(1983)）やエレクトロポレーシ
ョン法（Agric, Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989)）
などが適用できる。CGTaseを生産する形質転換体の選択
は、澱粉を含むプレート上で、コロニーの周りが透明に
なるかどうか（澱粉が分解された際生じるハロ）を確認
して行うことができる。
【００２８】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする改変CGTaseを生産
しうるものであれば如何なる培地でもよい。例えば培地
の炭素源としては、グルコース、シュークロース、グリ
セロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、有機酸
などが用いられる。また窒素源としては、カゼイン、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を
示す菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すれば
よい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、
核酸などが挙げられる。
は、形質転換体が生育して目的とする改変CGTaseを生産
しうるものであれば如何なる培地でもよい。例えば培地
の炭素源としては、グルコース、シュークロース、グリ
セロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、有機酸
などが用いられる。また窒素源としては、カゼイン、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を
示す菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すれば
よい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、
核酸などが挙げられる。
【００２９】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えば、ペニシリン、エリスロマイシン、クロ
ラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリ
ン、アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必
要により、消泡剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活
性剤などを加えてもよい。
抗生物質例えば、ペニシリン、エリスロマイシン、クロ
ラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリ
ン、アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必
要により、消泡剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活
性剤などを加えてもよい。
【００３０】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０、さらに
好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通常１５
℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、
培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好ましくは２
４〜９６時間である。
好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通常１５
℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、
培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好ましくは２
４〜９６時間である。
【００３１】本発明では、形質転換体を前記の条件で培
養することによって、培養物中に改変CGTaseが生成、蓄
積される。このようにして得られた改変CGTaseは、公知
の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、クロマトグ
ラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂、
（１９８５））で精製することができる。
養することによって、培養物中に改変CGTaseが生成、蓄
積される。このようにして得られた改変CGTaseは、公知
の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、クロマトグ
ラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂、
（１９８５））で精製することができる。
【００３２】精製された各種の改変CGTaseの澱粉分解能
の分析は、可溶性澱粉を基質として、酵素液を加えて反
応後、ヨード液で反応を停止させ吸光度（ＯＤ５５０）
を測定することによって行えばよい。また、精製された
改変CGTaseの反応生成物の分析は、可溶性澱粉を基質に
し、酵素液を加えて３７℃で反応させ、煮沸にて反応を
停止させた後、生成したＣＤをＨＰＬＣで分析すること
によって行うことができる。
の分析は、可溶性澱粉を基質として、酵素液を加えて反
応後、ヨード液で反応を停止させ吸光度（ＯＤ５５０）
を測定することによって行えばよい。また、精製された
改変CGTaseの反応生成物の分析は、可溶性澱粉を基質に
し、酵素液を加えて３７℃で反応させ、煮沸にて反応を
停止させた後、生成したＣＤをＨＰＬＣで分析すること
によって行うことができる。
【００３３】また本発明の改変CGTaseを澱粉などの基質
溶液に作用させてＣＤ含有溶液を得、このＣＤ溶液から
ＨＰＬＣなどの方法によって各種ＣＤに分画することに
よって各種のＣＤを得ることができる。
溶液に作用させてＣＤ含有溶液を得、このＣＤ溶液から
ＨＰＬＣなどの方法によって各種ＣＤに分画することに
よって各種のＣＤを得ることができる。
【００３４】以下本発明を実施例により更に詳しく説明
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
【００３５】
【実施例１】 発現ベクター(pNH400CG)の構築 Takanoらによって明らかにされているバチルス・マセラ
ンスのCGTaseのＤＮＡシークエンス（J.Bacteriol., 16
6, 1118-1122(1986)）を基にPrimerを作製し、バチルス
・マセランスＩＡＭ１２４３の染色体よりCGTase遺伝子
を増幅した。次に増幅した遺伝子を制限酵素NcoI及びBa
mHIで処理し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行
い、２kbのCGTase断片をゲルからGene clean（Bio101社
製、 USA）を用いて回収した。
ンスのCGTaseのＤＮＡシークエンス（J.Bacteriol., 16
6, 1118-1122(1986)）を基にPrimerを作製し、バチルス
・マセランスＩＡＭ１２４３の染色体よりCGTase遺伝子
を増幅した。次に増幅した遺伝子を制限酵素NcoI及びBa
mHIで処理し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行
い、２kbのCGTase断片をゲルからGene clean（Bio101社
製、 USA）を用いて回収した。
【００３６】プラスミドpNH400(J.Bacteriol., 177, 74
5-749(1995)）を、BamHIで処理後NcoIで部分分解し、pN
H400のＭＷＰ由来のシグナルペプチド上のNcoIが切断さ
れている４．１ｋｂ断片をアガロースゲルより回収し、
先に得たCGTase遺伝子断片とＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、CGTase遺伝子を保有するプラスミドpNH400CG
を構築した。次に、pNH400CGを用いてバチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）をエレクト
ロポレーション法（Agric, Biol. Chem., 53,3099-3100
(1989)）により形質転換した。形質転換体からのCGTase
生産株の選択は３％澱粉を含むＴ２プレート培地（澱粉
３％、ペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス
０．２％、グルコース１％、ネオマイシン６０μｇ／ｍ
ｌ、寒天１．５％、ｐＨ７．０）で、コロニーの周りが
透明になるかどうか（澱粉が分解された際生じるハロ）
を確認することによって行い、CGTaseを生産する形質転
換体を得た。
5-749(1995)）を、BamHIで処理後NcoIで部分分解し、pN
H400のＭＷＰ由来のシグナルペプチド上のNcoIが切断さ
れている４．１ｋｂ断片をアガロースゲルより回収し、
先に得たCGTase遺伝子断片とＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、CGTase遺伝子を保有するプラスミドpNH400CG
を構築した。次に、pNH400CGを用いてバチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）をエレクト
ロポレーション法（Agric, Biol. Chem., 53,3099-3100
(1989)）により形質転換した。形質転換体からのCGTase
生産株の選択は３％澱粉を含むＴ２プレート培地（澱粉
３％、ペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス
０．２％、グルコース１％、ネオマイシン６０μｇ／ｍ
ｌ、寒天１．５％、ｐＨ７．０）で、コロニーの周りが
透明になるかどうか（澱粉が分解された際生じるハロ）
を確認することによって行い、CGTaseを生産する形質転
換体を得た。
【００３７】部位特異的変異及び改変CGTase遺伝子を
保有する発現ベクターの構築 Ｔｙｒ１００をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎに置換
させるためpNH400CG上のCGTase遺伝子を２断片に分け増
幅した（Ｎ末端側の断片をFragment N、Ｃ末端側の断片
をFragment Cと呼ぶ）。
保有する発現ベクターの構築 Ｔｙｒ１００をＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎに置換
させるためpNH400CG上のCGTase遺伝子を２断片に分け増
幅した（Ｎ末端側の断片をFragment N、Ｃ末端側の断片
をFragment Cと呼ぶ）。
【００３８】Fragment N（０．３ｋｂ）の増幅には、表
５で示される配列表の配列番号２に示されるPrimer N
と、表７で示される配列番号４に示されるPrimer YCを
用いた。また、Fragment C（１．８ｋｂ）の増幅には、
表６で示される配列番号３に示されるPrimer Cと、表８
で示される配列番号５に示されるPrimer YNW、表９で示
される配列番号６に示されるPrimer YNF、表１０で示さ
れる配列番号７に示されるPrimer YNL及び表１１で示さ
れる配列番号８に示されるPrimer YNNを用いた。（図
２）
５で示される配列表の配列番号２に示されるPrimer N
と、表７で示される配列番号４に示されるPrimer YCを
用いた。また、Fragment C（１．８ｋｂ）の増幅には、
表６で示される配列番号３に示されるPrimer Cと、表８
で示される配列番号５に示されるPrimer YNW、表９で示
される配列番号６に示されるPrimer YNF、表１０で示さ
れる配列番号７に示されるPrimer YNL及び表１１で示さ
れる配列番号８に示されるPrimer YNNを用いた。（図
２）
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
【表７】
【００４２】
【表８】
【００４３】
【表９】
【００４４】
【表１０】
【００４５】
【表１１】
【００４６】Ｔｙｒ１００は、４種のPrimer YNW、YN
F、YNL及びYNNにより、各々Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ及
びＡｓｎに置換した。Ｔｙｒ１００が正しく置換されて
いることは、ＤＮＡのシークエンスを行って確認した。
F、YNL及びYNNにより、各々Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ及
びＡｓｎに置換した。Ｔｙｒ１００が正しく置換されて
いることは、ＤＮＡのシークエンスを行って確認した。
【００４７】得られたFragment NをNcoI、BspEIでFragm
ent CをBspEI、BamHIでそれぞれ処理した後、のpNH40
0CG構築時と同様の方法でプラスミドpNH400に挿入し、
改変CGTaseをコードする遺伝子を保持するプラスミドpN
H400CGY100W、pNH400CGY100F、pNH400CGY100L、pNH400C
GY100Nを得た。ここで得た各々のプラスミドでバチルス
・ブレビス ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）を
と同じ方法で形質転換し、改変CGTaseを生産する形質
転換体を得た。
ent CをBspEI、BamHIでそれぞれ処理した後、のpNH40
0CG構築時と同様の方法でプラスミドpNH400に挿入し、
改変CGTaseをコードする遺伝子を保持するプラスミドpN
H400CGY100W、pNH400CGY100F、pNH400CGY100L、pNH400C
GY100Nを得た。ここで得た各々のプラスミドでバチルス
・ブレビス ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）を
と同じ方法で形質転換し、改変CGTaseを生産する形質
転換体を得た。
【００４８】Wild Type（バチルス・マセランス Ｉ
ＡＭ１２４３のCGTase）及び改変CGTaseの発現・精製 及びで得た各々の形質転換体を、オートクレーブ滅
菌した２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５
％、グルコース２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１
％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ネオマイシン６０μｇ／
ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角
フラスコに植菌し、３０℃、３日間振とう培養した。各
々のCGTase（バチルス・マセランス ＩＡＭ１２４３の
CGTase（Wild Type）、Ｔｒｐ改変CGTase、Ｐｈｅ改変C
GTase、Ｌｅｕ改変CGTase及びＡｓｎ改変CGTase）の培
養液中ヘの生産量はいずれも約１ｇ／Ｌであった。
ＡＭ１２４３のCGTase）及び改変CGTaseの発現・精製 及びで得た各々の形質転換体を、オートクレーブ滅
菌した２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５
％、グルコース２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１
％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ネオマイシン６０μｇ／
ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角
フラスコに植菌し、３０℃、３日間振とう培養した。各
々のCGTase（バチルス・マセランス ＩＡＭ１２４３の
CGTase（Wild Type）、Ｔｒｐ改変CGTase、Ｐｈｅ改変C
GTase、Ｌｅｕ改変CGTase及びＡｓｎ改変CGTase）の培
養液中ヘの生産量はいずれも約１ｇ／Ｌであった。
【００４９】培養終了後、各々の培養液から遠心分離で
菌体を除いた培養上清に５０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、生成したCGTaseを沈澱させた。沈澱
を遠心分離にて回収して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ６．０）に溶解後、
同緩衝液で透析した。溶解したCGTaseを上記と同じ酢酸
緩衝液にて平衡化させたDEAE-Toyopearl 650Mカラムに
吸着させた後、塩化ナトリウム０Ｍ〜０．２Ｍまでの直
線濃度勾配により溶出させ、CGTase画分を回収した。回
収したCGTase画分に最終塩濃度４Ｍ〜０Ｍになる様に塩
化ナトリウムを加え、４Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸緩
衝液にて平衡化させたphenyl-Toyopearl650Mカラムに吸
着させ、塩化ナトリウム濃度４Ｍからの直線逆濃度勾配
にてCGTaseを溶出させ、CGTase画分を回収した。回収し
たCGTase画分を酢酸緩衝液を用いて透析して、Wild typ
e CGTase、Ｔｒｐ改変CGTase、Ｐｈｅ改変CGTase、Ｌｅ
ｕ改変CGTase及びＡｓｎ改変CGTaseの精製物を得た。
菌体を除いた培養上清に５０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、生成したCGTaseを沈澱させた。沈澱
を遠心分離にて回収して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ６．０）に溶解後、
同緩衝液で透析した。溶解したCGTaseを上記と同じ酢酸
緩衝液にて平衡化させたDEAE-Toyopearl 650Mカラムに
吸着させた後、塩化ナトリウム０Ｍ〜０．２Ｍまでの直
線濃度勾配により溶出させ、CGTase画分を回収した。回
収したCGTase画分に最終塩濃度４Ｍ〜０Ｍになる様に塩
化ナトリウムを加え、４Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸緩
衝液にて平衡化させたphenyl-Toyopearl650Mカラムに吸
着させ、塩化ナトリウム濃度４Ｍからの直線逆濃度勾配
にてCGTaseを溶出させ、CGTase画分を回収した。回収し
たCGTase画分を酢酸緩衝液を用いて透析して、Wild typ
e CGTase、Ｔｒｐ改変CGTase、Ｐｈｅ改変CGTase、Ｌｅ
ｕ改変CGTase及びＡｓｎ改変CGTaseの精製物を得た。
【００５０】改変CGTaseの反応生成物の分析 で得たWild Type及び各々の改変CGTaseの酵素液３５
０μｌ（CGTaseを４ｍｇ／ｍｌで含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０）に、０．４％可溶性澱粉を含む酢酸緩
衝液１００μｌを加え、３７℃で反応を行った。反応開
始２０分経過後にサンプリングを行い、直ちに１００℃
で５分間煮沸し、反応を停止させた。反応停止後、反応
液をフィルター濾過し（０．０２μｍ）、生成したＣＤ
をＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔ
ｓ、粒径５μｍ、径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（東ソ
ー社製）、緩衝液：メタノール／水（１２／８８）、流
速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：示差屈折計）にて分
析した。
０μｌ（CGTaseを４ｍｇ／ｍｌで含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０）に、０．４％可溶性澱粉を含む酢酸緩
衝液１００μｌを加え、３７℃で反応を行った。反応開
始２０分経過後にサンプリングを行い、直ちに１００℃
で５分間煮沸し、反応を停止させた。反応停止後、反応
液をフィルター濾過し（０．０２μｍ）、生成したＣＤ
をＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔ
ｓ、粒径５μｍ、径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（東ソ
ー社製）、緩衝液：メタノール／水（１２／８８）、流
速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：示差屈折計）にて分
析した。
【００５１】図３に（１）α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−
ＣＤの標準品を混合したスタンダード溶液、（２）澱粉
溶液にWild Type CGTaseを２０分間作用させた時の反応
液、（３）澱粉溶液にＬｅｕ改変CGTaseを２０分間作用
させた時の反応液のＨＰＬＣ分析のパターンを示した。
ＣＤの標準品を混合したスタンダード溶液、（２）澱粉
溶液にWild Type CGTaseを２０分間作用させた時の反応
液、（３）澱粉溶液にＬｅｕ改変CGTaseを２０分間作用
させた時の反応液のＨＰＬＣ分析のパターンを示した。
【００５２】またこのときの生成された総ＣＤ量に対す
るα−、β−、γ−ＣＤの生成比率を表１２に示した。
Wild Type CGTaseは、α−ＣＤ５３％、β−ＣＤ３４
％、γ−ＣＤ１３％である。これに対していずれの改変
CGTaseもα−ＣＤの生成比率が高くなっている。この様
にCGTaseのＴｙｒ１００の改変はα−ＣＤ生成率を増加
させ、特にＬｅｕ改変CGTaseにおいてその傾向は顕著に
現れた。
るα−、β−、γ−ＣＤの生成比率を表１２に示した。
Wild Type CGTaseは、α−ＣＤ５３％、β−ＣＤ３４
％、γ−ＣＤ１３％である。これに対していずれの改変
CGTaseもα−ＣＤの生成比率が高くなっている。この様
にCGTaseのＴｙｒ１００の改変はα−ＣＤ生成率を増加
させ、特にＬｅｕ改変CGTaseにおいてその傾向は顕著に
現れた。
【００５３】
【表１２】
【００５４】改変CGTaseを用いたＣＤの製造 で得たＬｅｕ改変CGTase１．５ｇ、を０．４％可溶性
澱粉溶液／５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍ
ｌに添加し、４０℃にて３０分間反応させた後、煮沸し
て酵素を失活させた。この反応液をフィルター濾過
（０．０２μｍ）したのち、ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ
−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔｓ、粒径５μｍ、径４．６ｍ
ｍ×長さ２５０ｍｍ（東ソー社製）、緩衝液：メタノー
ル／水（１２／８８）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検
出器：示差屈折計）にてα−ＣＤ画分を分取した。本画
分のα−ＣＤの純度は９５％であり、ＨＰＬＣによる１
回の分画のみで高純度のα−ＣＤを得ることが出来た。
澱粉溶液／５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍ
ｌに添加し、４０℃にて３０分間反応させた後、煮沸し
て酵素を失活させた。この反応液をフィルター濾過
（０．０２μｍ）したのち、ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ
−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔｓ、粒径５μｍ、径４．６ｍ
ｍ×長さ２５０ｍｍ（東ソー社製）、緩衝液：メタノー
ル／水（１２／８８）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検
出器：示差屈折計）にてα−ＣＤ画分を分取した。本画
分のα−ＣＤの純度は９５％であり、ＨＰＬＣによる１
回の分画のみで高純度のα−ＣＤを得ることが出来た。
【００５５】
【発明の効果】本発明によって改変CGTaseの製造がはじ
めて可能となった。本改変CGTaseは従来未知の新規酵素
であって、本酵素を澱粉等の基質に作用させると、特に
α−ＣＤ含有量が非常に高いＣＤが得られる。
めて可能となった。本改変CGTaseは従来未知の新規酵素
であって、本酵素を澱粉等の基質に作用させると、特に
α−ＣＤ含有量が非常に高いＣＤが得られる。
【図１】各種菌株由来CGTaseのＡ領域におけるチロシン
残基前後のアミノ酸配列を示す。
残基前後のアミノ酸配列を示す。
【図２】CGTase遺伝子の２断片（Fragment A、B）の増
幅を示す。
幅を示す。
【図３】３種類のサンプルについてのＨＰＬＣ分析パタ
ーンを示す。
ーンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 松井 郁夫 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 石川 一彦 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 平野 隆 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 細野 邦昭 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 高木 広明 茨城県鹿島郡波崎町7707番８号 (72)発明者 田中 昭光 千葉県銚子市飯沼町８番６号
Claims (6)
- 【請求項１】 シクロデキストリン合成酵素のＡ領域の
活性中心を構成するチロシンが他のアミノ酸に置換され
た改変シクロデキストリン合成酵素。 - 【請求項２】 バチルス・マセランス由来のシクロデキ
ストリン合成酵素のＮ末端から１００位の位置のチロシ
ンに相当するチロシンが他のアミノ酸に置換された請求
項１に記載の改変シクロデキストリン合成酵素。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
され、１００位のチロシンが他のアミノ酸に置換された
改変シクロデキストリン合成酵素。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
され、１００位のチロシンがトリプトファン、フェニル
アラニン、ロイシンまたはアスパラギンに置換され、α
−シクロデキストリンを特異的に生成することを特徴と
する改変シクロデキストリン合成酵素。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
改変シクロデキストリン合成酵素のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子をバチルス属細菌に形質転換し、該形質転
換体を培養することにより、該改変シクロデキストリン
合成酵素を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする改変シクロデキストリン合成酵素の
製造法。 - 【請求項６】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
改変シクロデキストリン合成酵素を基質に作用せしめ、
反応液よりシクロデキストリンを採取することを特徴と
するシクロデキストリンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25450595A JP3809472B2 (ja) | 1995-09-07 | 1995-09-07 | 改変シクロデキストリン合成酵素及びその製造法並びに該酵素を用いたシクロデキストリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25450595A JP3809472B2 (ja) | 1995-09-07 | 1995-09-07 | 改変シクロデキストリン合成酵素及びその製造法並びに該酵素を用いたシクロデキストリンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0975084A true JPH0975084A (ja) | 1997-03-25 |
| JP3809472B2 JP3809472B2 (ja) | 2006-08-16 |
Family
ID=17265994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25450595A Expired - Lifetime JP3809472B2 (ja) | 1995-09-07 | 1995-09-07 | 改変シクロデキストリン合成酵素及びその製造法並びに該酵素を用いたシクロデキストリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3809472B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109307682A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-02-05 | 常州大学 | 一种基于二元自组装识别苯丙氨酸对映体的方法 |
-
1995
- 1995-09-07 JP JP25450595A patent/JP3809472B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109307682A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-02-05 | 常州大学 | 一种基于二元自组装识别苯丙氨酸对映体的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3809472B2 (ja) | 2006-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2113551A1 (fr) | Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes | |
| JPH04228079A (ja) | セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 | |
| US5795738A (en) | Engineered peptide synthetases and their use for the non-ribosomal production of peptides | |
| US5474917A (en) | Modified cyclodextrin glycosyltransferases for producing γ-cyclodextrins | |
| JPH084515B2 (ja) | 有機化合物の製造方法 | |
| AU784466B2 (en) | Cyclic depsipeptide synthases, genes thereof and mass production system of cyclic depsipeptide | |
| JP3809472B2 (ja) | 改変シクロデキストリン合成酵素及びその製造法並びに該酵素を用いたシクロデキストリンの製造法 | |
| IE920659A1 (en) | Method of producing d-ribose | |
| JPH0358787A (ja) | Ｄｎａおよびその用途 | |
| JP5754682B2 (ja) | Ｄ−，ｌ−ペプチドの立体選択的合成法 | |
| JP4162383B2 (ja) | ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子およびその使用 | |
| CA1335183C (en) | Polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucanotransferase activity | |
| Skvortsova et al. | Novel extracellular ribonuclease from Bacillus intermedius—Binase II: purification and some properties of the enzyme | |
| JPH1033187A (ja) | ＣＧＴアーゼ、突然変異ＣＧＴアーゼ遺伝子の製法、ＣＧＴアーゼをコードするＤＮＡ−配列、γ−ＣＧＴアーゼの製法、γ−ＣＤの製法 | |
| CN112912504B (zh) | 麦芽三糖生成淀粉酶 | |
| AU716408B2 (en) | Novel HS gene, expression plasmid in which HS gene is ligated downstream of structural gene encoding foreign gene PR product, and process for producing foreign gene product using transformant containing the expression of plasmid | |
| CN113957025B (zh) | 一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| WO2020213374A1 (ja) | ペルオキシダーゼの組換え生産 | |
| JP5528013B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ高生産菌 | |
| JPH09505989A (ja) | 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現 | |
| JP3060019B2 (ja) | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 | |
| JP2007228926A (ja) | グリオキシル酸製造用酵素及びそれを用いたグリオキシル酸の製造方法 | |
| JP4997420B2 (ja) | 変異微生物 | |
| JP3795279B2 (ja) | ムレ臭減感ないし非感納豆 | |
| JP2024531706A (ja) | ポリオールまたは粘液性高分子の生産能が調節された組換え微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050830 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051027 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051213 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060208 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060328 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060329 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |