JPH095240A - 被検体の比色測定と電気化学的測定を同時に行う方法および試験薬 - Google Patents
被検体の比色測定と電気化学的測定を同時に行う方法および試験薬Info
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- JPH095240A JPH095240A JP8152299A JP15229996A JPH095240A JP H095240 A JPH095240 A JP H095240A JP 8152299 A JP8152299 A JP 8152299A JP 15229996 A JP15229996 A JP 15229996A JP H095240 A JPH095240 A JP H095240A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 酸化酵素と、この酵素から電子を受容する色
原体Ａを用いて、比色測定と電気化学的測定を同時に行
うことにより被検体を測定する方法を提供する。 【解決手段】 酸化酵素と、該酵素から電子を受容する
色原体Ａを用いる被検体の測定法であって、色原体Ａ
が、化合物Ａ′に還元された後、物質ＢＸとカップリン
グ反応を行って発色物質Ａ′Ｂを形成し、このＡ′Ｂの
濃度を被検体の存在または量の尺度として比色測定する
と同時に、上記カップリング反応によって、電気化学的
に測定可能な原子団Ｘ- がＢＸから開裂して生成し、こ
のＸ- の濃度を被検体の量の尺度として電気化学的に測
定することを特徴とする、被検体の比色測定と電気化学
的測定を同時に行う方法。
原体Ａを用いて、比色測定と電気化学的測定を同時に行
うことにより被検体を測定する方法を提供する。 【解決手段】 酸化酵素と、該酵素から電子を受容する
色原体Ａを用いる被検体の測定法であって、色原体Ａ
が、化合物Ａ′に還元された後、物質ＢＸとカップリン
グ反応を行って発色物質Ａ′Ｂを形成し、このＡ′Ｂの
濃度を被検体の存在または量の尺度として比色測定する
と同時に、上記カップリング反応によって、電気化学的
に測定可能な原子団Ｘ- がＢＸから開裂して生成し、こ
のＸ- の濃度を被検体の量の尺度として電気化学的に測
定することを特徴とする、被検体の比色測定と電気化学
的測定を同時に行う方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化酵素を用いて
被検体の比色測定および電気化学的測定を同時に行うた
めの方法および試験薬に関するものである。
被検体の比色測定および電気化学的測定を同時に行うた
めの方法および試験薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】分析学において、酵素的酸化の利用によ
り、様々な試料中の物質の検出および定量が可能にな
る。この分析過程において、酸化酵素は酸化反応による
電子を受け取る電子受容体の存在下、固有の酵素基質に
作用する。比色検出反応の場合には、電子受容体は色原
体であって、還元されると、単独で、または他の物質の
存在下で発色したり、色が変化したりすることにより、
酵素基質の存在を示す。比色検出反応は、測光的にまた
は好ましくは可視手段により評価することができ、特
に、被検体の濃度が低い場合に有利である。一般的に、
１０-4Ｍ以上の高い被検体濃度では、吸光度の変化が溶
液中で１以上となり、測定困難なほどに大きくなってし
まう。乾燥した試験担体上での反射率測定の場合には、
特に困難となる。
り、様々な試料中の物質の検出および定量が可能にな
る。この分析過程において、酸化酵素は酸化反応による
電子を受け取る電子受容体の存在下、固有の酵素基質に
作用する。比色検出反応の場合には、電子受容体は色原
体であって、還元されると、単独で、または他の物質の
存在下で発色したり、色が変化したりすることにより、
酵素基質の存在を示す。比色検出反応は、測光的にまた
は好ましくは可視手段により評価することができ、特
に、被検体の濃度が低い場合に有利である。一般的に、
１０-4Ｍ以上の高い被検体濃度では、吸光度の変化が溶
液中で１以上となり、測定困難なほどに大きくなってし
まう。乾燥した試験担体上での反射率測定の場合には、
特に困難となる。
【０００３】酸化酵素、すなわち、オキシダーゼとデヒ
ドロゲナーゼのための合成電子受容体は数多く知られて
いる。例として、たとえばＥＰ−Ａ−０ ３３０ ５１
７に記載されているものがあげられる。酸化酵素を利用
して被検体を定量するもう一つの方法として、電気化学
的測定がある。電気化学的測定においては、電極そのも
のが、酵素による電子の電子受容体として働き、それに
対応した電流が測定される。このような方法は、たとえ
ば、ＥＰ−Ａ−０ １２７ ９５８に記載されている。
濃度と電流の関係は基本的に直線的なので、電気化学的
測定は特に被検体の濃度が高い場合に適している。
ドロゲナーゼのための合成電子受容体は数多く知られて
いる。例として、たとえばＥＰ−Ａ−０ ３３０ ５１
７に記載されているものがあげられる。酸化酵素を利用
して被検体を定量するもう一つの方法として、電気化学
的測定がある。電気化学的測定においては、電極そのも
のが、酵素による電子の電子受容体として働き、それに
対応した電流が測定される。このような方法は、たとえ
ば、ＥＰ−Ａ−０ １２７ ９５８に記載されている。
濃度と電流の関係は基本的に直線的なので、電気化学的
測定は特に被検体の濃度が高い場合に適している。
【０００４】ＥＰ−Ａ−０ ０９４ １６１には、ＰＱ
Ｑ−依存性デヒドロゲナーゼと電子受容体としての色原
体を用いた被検体の検出が記載されており、この場合に
は色原体の還元が電気化学的にも観察されると考えられ
ている。しかし、これを実際に実施する方法としては、
単に、還元可能な電子受容体の還元型と酸化型の間の濃
度の変化を電位差測定すると述べられているにすぎな
い。電子は、原則として、色原体か電極かのどちらかを
還元するのに使われて、両方を同時に還元することはで
きないため、上記のような発色反応において、同時に電
流を測定することは不可能である。
Ｑ−依存性デヒドロゲナーゼと電子受容体としての色原
体を用いた被検体の検出が記載されており、この場合に
は色原体の還元が電気化学的にも観察されると考えられ
ている。しかし、これを実際に実施する方法としては、
単に、還元可能な電子受容体の還元型と酸化型の間の濃
度の変化を電位差測定すると述べられているにすぎな
い。電子は、原則として、色原体か電極かのどちらかを
還元するのに使われて、両方を同時に還元することはで
きないため、上記のような発色反応において、同時に電
流を測定することは不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、色原体の還元
により発色すると同時に、その一方で、形成された発色
物質とは異なる化合物を電流測定か電位差測定により、
被検体の量の尺度として測定できるような、電気化学的
測定と比色測定を組み合わせた測定方法が必要となっ
た。このような方法によれば、比色測定の利点と、電気
化学的測定の利点を組み合わせることが可能になり、そ
れらが相互に補完しあえる。本発明は、とりわけ、高い
被検体濃度範囲においても均一な精度をもたらすことを
目的としたものである。この目的は、特許請求の範囲に
記載された方法と試験薬により達成された。
により発色すると同時に、その一方で、形成された発色
物質とは異なる化合物を電流測定か電位差測定により、
被検体の量の尺度として測定できるような、電気化学的
測定と比色測定を組み合わせた測定方法が必要となっ
た。このような方法によれば、比色測定の利点と、電気
化学的測定の利点を組み合わせることが可能になり、そ
れらが相互に補完しあえる。本発明は、とりわけ、高い
被検体濃度範囲においても均一な精度をもたらすことを
目的としたものである。この目的は、特許請求の範囲に
記載された方法と試験薬により達成された。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、酸化酵素およ
び還元に際してこの酵素から電子を受容する色原体Ａを
用いて、比色測定と電気化学的測定を同時に行う方法に
関するものであって、以下のような特徴がある。すなわ
ち、この色原体Ａは還元されてＡ′となった後、物質Ｂ
Ｘとカップリング反応を行い、発色物質Ａ′Ｂを形成す
るが、この発色物質Ａ′Ｂの濃度を被検体の存在または
量の尺度として比色測定する。また、このカップリング
反応中に、電気化学的に測定可能な原子団Ｘ- が開裂に
より生成し、このＸ-の濃度を被検体の量の尺度として
電気化学的に測定するというものである。
び還元に際してこの酵素から電子を受容する色原体Ａを
用いて、比色測定と電気化学的測定を同時に行う方法に
関するものであって、以下のような特徴がある。すなわ
ち、この色原体Ａは還元されてＡ′となった後、物質Ｂ
Ｘとカップリング反応を行い、発色物質Ａ′Ｂを形成す
るが、この発色物質Ａ′Ｂの濃度を被検体の存在または
量の尺度として比色測定する。また、このカップリング
反応中に、電気化学的に測定可能な原子団Ｘ- が開裂に
より生成し、このＸ-の濃度を被検体の量の尺度として
電気化学的に測定するというものである。
【０００７】本発明はまた、被検体の比色測定と電気化
学的測定を同時に行うための、酸化酵素および還元に際
してこの酵素から電子を受容する色原体Ａを含有する試
験薬に関するもので、以下のような特徴がある。すなわ
ち、この試験薬は、色原体Ａに加えて、物質ＢＸを含有
し、色原体Ａは、還元された後この物質ＢＸとカップリ
ング反応を行い、発色物質Ａ′Ｂを形成し得る。このカ
ップリング反応は電気化学的に測定可能な原子団Ｘ- の
開裂反応をともなう。それに加えて、本発明には、開裂
した原子団Ｘ- の量または濃度を電気化学的に測定する
ためのセンサー電極が含まれる。
学的測定を同時に行うための、酸化酵素および還元に際
してこの酵素から電子を受容する色原体Ａを含有する試
験薬に関するもので、以下のような特徴がある。すなわ
ち、この試験薬は、色原体Ａに加えて、物質ＢＸを含有
し、色原体Ａは、還元された後この物質ＢＸとカップリ
ング反応を行い、発色物質Ａ′Ｂを形成し得る。このカ
ップリング反応は電気化学的に測定可能な原子団Ｘ- の
開裂反応をともなう。それに加えて、本発明には、開裂
した原子団Ｘ- の量または濃度を電気化学的に測定する
ためのセンサー電極が含まれる。
【０００８】合成基質Ａへの電子の伝達を伴って被検体
を酸化する酸化酵素として、すべての酵素が考慮され
る。この過程において、電子が酵素から合成基質Ａに直
接伝達される必要はなく、フェナジンメトスルフェート
またはジアホラーゼのような媒介物質を介しても伝達さ
れ得る。酸化酵素はオキシドレダクターゼとして知られ
ているもので、具体的には、オキシダーゼ、ＮＡＤ依存
性またはＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼがあげられる
が、デヒドロゲナーゼが特に好ましい。
を酸化する酸化酵素として、すべての酵素が考慮され
る。この過程において、電子が酵素から合成基質Ａに直
接伝達される必要はなく、フェナジンメトスルフェート
またはジアホラーゼのような媒介物質を介しても伝達さ
れ得る。酸化酵素はオキシドレダクターゼとして知られ
ているもので、具体的には、オキシダーゼ、ＮＡＤ依存
性またはＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼがあげられる
が、デヒドロゲナーゼが特に好ましい。
【０００９】本発明によれば、色原体Ａとしては、還元
後カップリング能のある化合物Ａ′を生成するあらゆる
物質が含まれると理解すべきであり、このＡ′が別の物
質とカップリングして今度は発色物質を生成し、その最
大の吸光度変化が可視または近赤外の領域、すなわち４
５０から９５０ｎmの間においておこるものである。芳
香族化合物から誘導されるイミノ化合物が、カップリン
グ可能な還元体Ａ′として特に好ましい。特に、ＥＰ−
Ａ−０ ６２０ ２８３に記載されるようなキノンジイ
ミンが好ましく、この特許の全内容を参照されたい。こ
れらは芳香族ニトロソ化合物の還元によって作られる。
後カップリング能のある化合物Ａ′を生成するあらゆる
物質が含まれると理解すべきであり、このＡ′が別の物
質とカップリングして今度は発色物質を生成し、その最
大の吸光度変化が可視または近赤外の領域、すなわち４
５０から９５０ｎmの間においておこるものである。芳
香族化合物から誘導されるイミノ化合物が、カップリン
グ可能な還元体Ａ′として特に好ましい。特に、ＥＰ−
Ａ−０ ６２０ ２８３に記載されるようなキノンジイ
ミンが好ましく、この特許の全内容を参照されたい。こ
れらは芳香族ニトロソ化合物の還元によって作られる。
【００１０】一般式Ｉのニトロソベンゼン誘導体が特に
好ましい。
好ましい。
【００１１】
【化３】
【００１２】式Ｉにおいて、Ｒ1 は、水素原子、水酸
基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリ
ールオキシ基、アリールチオ基、ハロゲンまたはアミノ
基を表し、上記のアルキル基は、水酸基、ＣＯＯＨ，Ｐ
Ｏ3 Ｈ2 またはＳＯ3 Ｈで置換されていてもよく、ま
た、上記のアミノ基はアルキル基（水酸基、ＰＯ
3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィニル基、ＳＯ3 ＨまたはＣ
Ｏ2 Ｈで置換されていてもよい）で一または多置換され
ていてもよい；Ｒ2 は、水酸基、アルコキシ基、アリー
ルオキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基を示
し、これらの置換基中のアルキル残基は水酸基、アルコ
キシ基またはアミノ基（アルキル基で一または多置換さ
れていてもよい）によって置換されていてもよく、ある
いは、Ｒ2 は、ＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ3 ＨまたはＣＯ2 Ｈ
の、酸そのままの形または塩の形、すなわち、アンモニ
ウム塩、アルカリ塩またはアルカリ土類金属塩を示し、
あるいは、Ｒ2 はアミノ基ＮＲ3 Ｒ4 を示し、ここで、
Ｒ3 とＲ4 は同一でも異なっていてもよく、水素、アリ
ール基またはアルキル基を表し、このアリール基または
アルキル基は、水酸基、アルコキシ基、ヒドロキシアル
コキシ基、任意に水酸基で置換されたポリアルコキシ
基、酸そのままの形または塩の形のＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ3
Ｈ、ＣＯＯＨ、またはアミノ基（アルキル基で一または
多置換されていてもよい）で置換されていてもよく、あ
るいは、Ｒ3 とＲ4 は、鎖中に酸素、硫黄または窒素が
介在してもよいアルキレン残基を表し、この場合、窒素
はアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアル
コキシアルキル基、アルコキシヒドロキシアルキル基、
アルコキシカルボニルアルキル基、ジオキサニルアルキ
ル基またはポリアルコキシアルキル基で置換されてお
り、これらの置換基はそれぞれアルキル基の部分が水酸
基で置換されていてもよい；あるいはＲ1 がＮＲ3 Ｒ4
に対してオルト位にある場合には、Ｒ3 またはＲ4 はＲ
1 と共同してアルキレン残基を表す。
基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリ
ールオキシ基、アリールチオ基、ハロゲンまたはアミノ
基を表し、上記のアルキル基は、水酸基、ＣＯＯＨ，Ｐ
Ｏ3 Ｈ2 またはＳＯ3 Ｈで置換されていてもよく、ま
た、上記のアミノ基はアルキル基（水酸基、ＰＯ
3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィニル基、ＳＯ3 ＨまたはＣ
Ｏ2 Ｈで置換されていてもよい）で一または多置換され
ていてもよい；Ｒ2 は、水酸基、アルコキシ基、アリー
ルオキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基を示
し、これらの置換基中のアルキル残基は水酸基、アルコ
キシ基またはアミノ基（アルキル基で一または多置換さ
れていてもよい）によって置換されていてもよく、ある
いは、Ｒ2 は、ＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ3 ＨまたはＣＯ2 Ｈ
の、酸そのままの形または塩の形、すなわち、アンモニ
ウム塩、アルカリ塩またはアルカリ土類金属塩を示し、
あるいは、Ｒ2 はアミノ基ＮＲ3 Ｒ4 を示し、ここで、
Ｒ3 とＲ4 は同一でも異なっていてもよく、水素、アリ
ール基またはアルキル基を表し、このアリール基または
アルキル基は、水酸基、アルコキシ基、ヒドロキシアル
コキシ基、任意に水酸基で置換されたポリアルコキシ
基、酸そのままの形または塩の形のＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ3
Ｈ、ＣＯＯＨ、またはアミノ基（アルキル基で一または
多置換されていてもよい）で置換されていてもよく、あ
るいは、Ｒ3 とＲ4 は、鎖中に酸素、硫黄または窒素が
介在してもよいアルキレン残基を表し、この場合、窒素
はアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアル
コキシアルキル基、アルコキシヒドロキシアルキル基、
アルコキシカルボニルアルキル基、ジオキサニルアルキ
ル基またはポリアルコキシアルキル基で置換されてお
り、これらの置換基はそれぞれアルキル基の部分が水酸
基で置換されていてもよい；あるいはＲ1 がＮＲ3 Ｒ4
に対してオルト位にある場合には、Ｒ3 またはＲ4 はＲ
1 と共同してアルキレン残基を表す。
【００１３】上記において、ハロゲンはフッ素、塩素、
臭素およびヨウ素を示す。フッ素と塩素が特に好まし
い。アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基中のア
ルキルは、炭素原子数１−６の炭化水素残基を示し、特
に、炭素原子数１−３の残基が好ましい。このアルキル
の定義は、ヒドロキシアルキル基、ジアルキルアミノア
ルキル基、ヒドロキシアルコキシアルキル基、アルコキ
シアルキル基、ポリアルコキシアルキル基、アルコキシ
ヒドロキシアルキル基およびジオキサニルアルキル基に
おけるアルキル部分についても当てはまる。ジオキサニ
ルアルキル基は、ジオキサン環系がアルキル残基に結合
したものである。中でも、下に示すような１，４−ジオ
キサン環系をもつものが好ましい。
臭素およびヨウ素を示す。フッ素と塩素が特に好まし
い。アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基中のア
ルキルは、炭素原子数１−６の炭化水素残基を示し、特
に、炭素原子数１−３の残基が好ましい。このアルキル
の定義は、ヒドロキシアルキル基、ジアルキルアミノア
ルキル基、ヒドロキシアルコキシアルキル基、アルコキ
シアルキル基、ポリアルコキシアルキル基、アルコキシ
ヒドロキシアルキル基およびジオキサニルアルキル基に
おけるアルキル部分についても当てはまる。ジオキサニ
ルアルキル基は、ジオキサン環系がアルキル残基に結合
したものである。中でも、下に示すような１，４−ジオ
キサン環系をもつものが好ましい。
【００１４】
【化４】
【００１５】ポリアルコキシアルキル基は下に示すよう
なものである。 −アルキル−（アルコキシ）ｎ−アルコキシ ここで、ｎ＝１−１０。好ましくは、ｎ＝１−４。特に
ｎ＝１−３が好ましい。アルキレン残基は直鎖または分
枝鎖（直鎖が好ましい）、飽和または不飽和（飽和が好
ましい）の炭素原子数２−５（炭素原子数２−４が好ま
しい）の二つの遊離結合部位をもつ炭素水素鎖である。
なものである。 −アルキル−（アルコキシ）ｎ−アルコキシ ここで、ｎ＝１−１０。好ましくは、ｎ＝１−４。特に
ｎ＝１−３が好ましい。アルキレン残基は直鎖または分
枝鎖（直鎖が好ましい）、飽和または不飽和（飽和が好
ましい）の炭素原子数２−５（炭素原子数２−４が好ま
しい）の二つの遊離結合部位をもつ炭素水素鎖である。
【００１６】アリール基またはアラルキル基中のアリー
ルは、炭素原子６−１０を有する芳香環系で、中でも、
フェニルが好ましい。アンモニウム塩としては、アンモ
ニウムイオンＮＨ4 + と、アルキル、アリールまたはア
ラルキル残基により一または多置換されたアンモニウム
カチオンとがあげられる。
ルは、炭素原子６−１０を有する芳香環系で、中でも、
フェニルが好ましい。アンモニウム塩としては、アンモ
ニウムイオンＮＨ4 + と、アルキル、アリールまたはア
ラルキル残基により一または多置換されたアンモニウム
カチオンとがあげられる。
【００１７】アルカリ塩としては、リチウム、ナトリウ
ムまたはカリウム塩が好ましい。アルカリ土類金属塩と
しては、マグネシウムおよびカルシウム塩が好ましい。
Ｒ1 残基としては、水素およびアルキル基が好ましく、
特に、水素が好ましい。Ｒ2 残基としては、アルコキシ
基とアミノ基ＮＲ3 Ｒ4 が好ましい。
ムまたはカリウム塩が好ましい。アルカリ土類金属塩と
しては、マグネシウムおよびカルシウム塩が好ましい。
Ｒ1 残基としては、水素およびアルキル基が好ましく、
特に、水素が好ましい。Ｒ2 残基としては、アルコキシ
基とアミノ基ＮＲ3 Ｒ4 が好ましい。
【００１８】Ｒ1 とＲ3 によって形成され、鎖中に酸
素、硫黄または窒素を有するアルキレン残基の中では、
一般式Ｉ中の窒素とともにモルフォリン、チオモルフォ
リンまたはピペラジン残基を形成するものが好ましい。
特に、ピペラジン残基が好ましい。Ｒ1 とＲ3 によって
形成されるアルキレン残基としては、一般式Ｉ中の芳香
環とともにインドリンまたは１，２，３，４−テトラヒ
ドロキノリン残基を形成するものが好ましい。
素、硫黄または窒素を有するアルキレン残基の中では、
一般式Ｉ中の窒素とともにモルフォリン、チオモルフォ
リンまたはピペラジン残基を形成するものが好ましい。
特に、ピペラジン残基が好ましい。Ｒ1 とＲ3 によって
形成されるアルキレン残基としては、一般式Ｉ中の芳香
環とともにインドリンまたは１，２，３，４−テトラヒ
ドロキノリン残基を形成するものが好ましい。
【００１９】本発明によれば、一般式Ｉのニトロソアニ
リン誘導体の塩としては、強酸塩が好ましく、特に、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸のような、無機酸の塩が好まし
い。中でも、塩酸塩が特に好ましい。一般式Ｉで表され
るニトロソ化合物の中で、次のものが好ましい。 Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−ニト
ロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−ニトロソフェニル）−ピペラ
ジン Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−５−ニトロソインドリ
ン ２，４−ジメトキシニトロソベンゼン Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−メトキシエチル）−４−ニトロ
ソアニリン Ｎ−（４−ニトロソフェニル）−モルフォリン Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−Ｎ′−（４−ニト
ロソフェニル）−ピペラジン ｐ−ニトロソフェノール ３−メトキシ−４−ニトロソフェノール 芳香環系の電子密度が非常に高いために、ニトロソ／オ
キシム互変異性およびイミンの形成に外部からの＋Ｍ置
換基を必要としないような、電子密度の高いヘテロ芳香
族ニトロソ化合物の中では、ニトロソ基で置換されたピ
ラゾロンおよびピラゾールが、なかでも、特に、たとえ
ばUllmannの工業化学辞典、第５版、Ａ２０巻、７２−
７４ページに記載されているようなニトロソ置換ピラゾ
ロ化合物が、本発明の方法への使用に適している。この
場合には、一般式IIで表される３−ニトロソピラゾロ化
合物が好ましい。
リン誘導体の塩としては、強酸塩が好ましく、特に、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸のような、無機酸の塩が好まし
い。中でも、塩酸塩が特に好ましい。一般式Ｉで表され
るニトロソ化合物の中で、次のものが好ましい。 Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−ニト
ロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−ニトロソフェニル）−ピペラ
ジン Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−５−ニトロソインドリ
ン ２，４−ジメトキシニトロソベンゼン Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−メトキシエチル）−４−ニトロ
ソアニリン Ｎ−（４−ニトロソフェニル）−モルフォリン Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−Ｎ′−（４−ニト
ロソフェニル）−ピペラジン ｐ−ニトロソフェノール ３−メトキシ−４−ニトロソフェノール 芳香環系の電子密度が非常に高いために、ニトロソ／オ
キシム互変異性およびイミンの形成に外部からの＋Ｍ置
換基を必要としないような、電子密度の高いヘテロ芳香
族ニトロソ化合物の中では、ニトロソ基で置換されたピ
ラゾロンおよびピラゾールが、なかでも、特に、たとえ
ばUllmannの工業化学辞典、第５版、Ａ２０巻、７２−
７４ページに記載されているようなニトロソ置換ピラゾ
ロ化合物が、本発明の方法への使用に適している。この
場合には、一般式IIで表される３−ニトロソピラゾロ化
合物が好ましい。
【００２０】
【化５】
【００２１】これらの化合物のほとんどは、ヨーロッパ
特許出願、ＥＰ−Ａ−０ ４３３８５４に記載されるよ
うに、対応する３−アミノピラゾロ化合物合成用の前駆
体としてよく知られている。化学式IIにおいて、Ｘ−Ｙ
はＮＲ5 −ＣＯまたはＮ＝ＣＲ6 を表す；Ｒ5 は水素、
アルキル基を表し、このアルキル基は、水酸基、カルボ
キシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィ
ニル基で置換されていてもよい；Ｒ6 は水素、アルキル
基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ア
リール基、アリールチオ基、アラルキル基を表し、これ
らの置換基は、それぞれ水酸基、カルボキシル基、ＳＯ
3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、これらの酸の塩、または／およびア
ルコキシカルボニル基で置換されていてもよく、あるい
は、Ｒ6 はアミノ基を示し、このアミノ基は、アルキル
基（一または数個の水酸基、カルボキシル基または／お
よびアルコキシカルボニル基を有していてもよい）で一
または二置換されていてもよく、アミノ基がアルキル残
基で二置換されている場合には、２つのアルキル残基は
閉じて環を形成でき、この環は、窒素原子に加えて、環
中に酸素、硫黄、または別の窒素原子が介在してもよ
く、あるいは、Ｒ6 はアミノ基を表し、このアミノ基は
一または二個のアシル基、アルコキシ基または／および
アラルコキシカルボニル基、Ｈ2 Ｎ−ＣＯ、アルキル
基、アラルキル基、または／およびアリールカルバモイ
ル基によって置換されていてもよく、あるいは、Ｒ
6は、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カル
ボキシアミド基またはハロゲンを示す；Ｒ7 は、アルキ
ル基、チオアルキル基またはアラルキル基を示し、これ
らは水酸基、カルボキシル基、ＳＯ3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ
2 で置換されていてもよく、あるいは、Ｒ7 はアミノ基
を示し、このアミノ基はアルキル基（水酸基、カルボキ
シル基、ＳＯ3 Ｈ、ジアルキルホスフィニル基またはＰ
Ｏ3 Ｈ2 で置換されていてもよい）で一または二置換さ
れていてもよい；ただし、Ｒ6 およびＲ7 の少なくとも
どちらか一方はアミノ基を表す；Ｒ8 はアルキル基また
はアラルキル基を表し、これらは水酸基、カルボキシル
基、ＳＯ3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ2 で置換されていてもよ
い。
特許出願、ＥＰ−Ａ−０ ４３３８５４に記載されるよ
うに、対応する３−アミノピラゾロ化合物合成用の前駆
体としてよく知られている。化学式IIにおいて、Ｘ−Ｙ
はＮＲ5 −ＣＯまたはＮ＝ＣＲ6 を表す；Ｒ5 は水素、
アルキル基を表し、このアルキル基は、水酸基、カルボ
キシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィ
ニル基で置換されていてもよい；Ｒ6 は水素、アルキル
基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ア
リール基、アリールチオ基、アラルキル基を表し、これ
らの置換基は、それぞれ水酸基、カルボキシル基、ＳＯ
3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、これらの酸の塩、または／およびア
ルコキシカルボニル基で置換されていてもよく、あるい
は、Ｒ6 はアミノ基を示し、このアミノ基は、アルキル
基（一または数個の水酸基、カルボキシル基または／お
よびアルコキシカルボニル基を有していてもよい）で一
または二置換されていてもよく、アミノ基がアルキル残
基で二置換されている場合には、２つのアルキル残基は
閉じて環を形成でき、この環は、窒素原子に加えて、環
中に酸素、硫黄、または別の窒素原子が介在してもよ
く、あるいは、Ｒ6 はアミノ基を表し、このアミノ基は
一または二個のアシル基、アルコキシ基または／および
アラルコキシカルボニル基、Ｈ2 Ｎ−ＣＯ、アルキル
基、アラルキル基、または／およびアリールカルバモイ
ル基によって置換されていてもよく、あるいは、Ｒ
6は、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カル
ボキシアミド基またはハロゲンを示す；Ｒ7 は、アルキ
ル基、チオアルキル基またはアラルキル基を示し、これ
らは水酸基、カルボキシル基、ＳＯ3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ
2 で置換されていてもよく、あるいは、Ｒ7 はアミノ基
を示し、このアミノ基はアルキル基（水酸基、カルボキ
シル基、ＳＯ3 Ｈ、ジアルキルホスフィニル基またはＰ
Ｏ3 Ｈ2 で置換されていてもよい）で一または二置換さ
れていてもよい；ただし、Ｒ6 およびＲ7 の少なくとも
どちらか一方はアミノ基を表す；Ｒ8 はアルキル基また
はアラルキル基を表し、これらは水酸基、カルボキシル
基、ＳＯ3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ2 で置換されていてもよ
い。
【００２２】あるいは、Ｒ7 およびＲ8 は、共同して、
３または４員の窒素原子または炭素原子を有する飽和ま
たは不飽和鎖を表す。この場合、鎖中に１または数個の
窒素または硫黄原子を有していてもよく、また、鎖中の
炭素原子は、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ
基、水酸基、アラルキル基、アリール基、カルボキシル
基、カルボキシアミド基、アルコキシカルボニル基、シ
アノ基、ハロゲン、アミノ基で置換されていてもよい。
前記アミノ基は、水酸基、カルボキシル基または／およ
びアルコキシカルボニル基を１または数個有してもよい
アルキル残基によって一または二置換されていてもよ
い。また、上記鎖中の二重結合を形成していない窒素原
子は、アルキル基またはアラルキル基で置換されてお
り、これらのアルキルまたはアラルキルは、水酸基、Ｓ
Ｏ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、カルボキシル基またはジアルキル
ホスフィニル基で置換されていてもよい。２つの隣り合
った鎖置換基は、アルキレン基を形成してもよく、この
アルキレン基はアリール基で置換されるか、縮合環を形
成していてもよい。
３または４員の窒素原子または炭素原子を有する飽和ま
たは不飽和鎖を表す。この場合、鎖中に１または数個の
窒素または硫黄原子を有していてもよく、また、鎖中の
炭素原子は、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ
基、水酸基、アラルキル基、アリール基、カルボキシル
基、カルボキシアミド基、アルコキシカルボニル基、シ
アノ基、ハロゲン、アミノ基で置換されていてもよい。
前記アミノ基は、水酸基、カルボキシル基または／およ
びアルコキシカルボニル基を１または数個有してもよい
アルキル残基によって一または二置換されていてもよ
い。また、上記鎖中の二重結合を形成していない窒素原
子は、アルキル基またはアラルキル基で置換されてお
り、これらのアルキルまたはアラルキルは、水酸基、Ｓ
Ｏ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、カルボキシル基またはジアルキル
ホスフィニル基で置換されていてもよい。２つの隣り合
った鎖置換基は、アルキレン基を形成してもよく、この
アルキレン基はアリール基で置換されるか、縮合環を形
成していてもよい。
【００２３】上記の化合物は、対応する互変異性体およ
び塩の形を取っていてもよい。上記において、アルキル
基は、アルキルチオ基、ジアルキルホスフィニル基、ア
ルキルカルバモイル基およびアラルキル基中のアルキル
も含めて、炭素原子数１−６、好ましくは、１−４の、
直鎖または分枝アルキル残基を表す。たとえば、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソブチル基または第三ブ
チル基があげられる。
び塩の形を取っていてもよい。上記において、アルキル
基は、アルキルチオ基、ジアルキルホスフィニル基、ア
ルキルカルバモイル基およびアラルキル基中のアルキル
も含めて、炭素原子数１−６、好ましくは、１−４の、
直鎖または分枝アルキル残基を表す。たとえば、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソブチル基または第三ブ
チル基があげられる。
【００２４】アミノ基が２つのアルキル残基で置換され
ている場合、これらの置換基は閉じて環を形成し、全体
として窒素原子を有する環となっていてもよい。この場
合、上記のアミノ基は全体で５または６員環を形成する
のが好ましく、環中に酸素、硫黄または窒素原子を有し
ていてもよい。モルフォリノ基が特に好ましい。アルコ
キシ基は、アルコキシカルボニル基およびアラルコキシ
カルボニル基中のアルコキシも含めて、炭素原子数１−
６、好ましくは１−４の直鎖または分枝アルコキシ基を
表す。例として、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオ
キシ基、イソブチルオキシ基または第三ブチルオキシ基
があげられる。
ている場合、これらの置換基は閉じて環を形成し、全体
として窒素原子を有する環となっていてもよい。この場
合、上記のアミノ基は全体で５または６員環を形成する
のが好ましく、環中に酸素、硫黄または窒素原子を有し
ていてもよい。モルフォリノ基が特に好ましい。アルコ
キシ基は、アルコキシカルボニル基およびアラルコキシ
カルボニル基中のアルコキシも含めて、炭素原子数１−
６、好ましくは１−４の直鎖または分枝アルコキシ基を
表す。例として、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオ
キシ基、イソブチルオキシ基または第三ブチルオキシ基
があげられる。
【００２５】アリール基は、アリールカルバモイル基中
のアリールも含めて、炭素芳香族またはヘテロ芳香族残
基を示す。環の原子数が６−１０のものが好ましく、特
に、フェニル基またはナフチル基が好ましい。このフェ
ニル基またはナフチル基はさらにアルキル、アルコキシ
または／およびハロゲンで置換されていてもよい。なか
でも、フェニル基が特に好ましい。
のアリールも含めて、炭素芳香族またはヘテロ芳香族残
基を示す。環の原子数が６−１０のものが好ましく、特
に、フェニル基またはナフチル基が好ましい。このフェ
ニル基またはナフチル基はさらにアルキル、アルコキシ
または／およびハロゲンで置換されていてもよい。なか
でも、フェニル基が特に好ましい。
【００２６】アラルキル基は、アラルキルカルバモイル
基中のアラルキルも含めて、上に定義されたアルキル基
が、上に特徴づけられたアリール残基で置換されたもの
である。ベンジル基が好ましい。アラルコキシ基、たと
えば、アラルコキシカルボニル基中のアラルコキシは、
上に定義されたアルコキシ基が、上に定義されたアリー
ル残基で置換されたものである。ベンジルオキシ基が好
ましい。
基中のアラルキルも含めて、上に定義されたアルキル基
が、上に特徴づけられたアリール残基で置換されたもの
である。ベンジル基が好ましい。アラルコキシ基、たと
えば、アラルコキシカルボニル基中のアラルコキシは、
上に定義されたアルコキシ基が、上に定義されたアリー
ル残基で置換されたものである。ベンジルオキシ基が好
ましい。
【００２７】ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨ
ウ素を表す。フッ素と塩素が好ましい。アシル基は、ア
ルキル基、アラルキル基またはアリール基を含むことが
できるカルボン酸残基を表す。アセチル基、フェニルア
セチル基またはベンゾイル基が好ましい。
ウ素を表す。フッ素と塩素が好ましい。アシル基は、ア
ルキル基、アラルキル基またはアリール基を含むことが
できるカルボン酸残基を表す。アセチル基、フェニルア
セチル基またはベンゾイル基が好ましい。
【００２８】アルキレン基は、炭素原子３−５、好まし
くは、３または４からなる直鎖または分枝の、飽和また
は不飽和の、炭化水素鎖で、２つの遊離結合部位を有す
るものである。例として、下記のものがあげられる。
くは、３または４からなる直鎖または分枝の、飽和また
は不飽和の、炭化水素鎖で、２つの遊離結合部位を有す
るものである。例として、下記のものがあげられる。
【００２９】
【化６】
【００３０】ブタジエンジイル基（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ
＝ＣＨ−）およびテトラメチレン基（−（ＣＨ2 ）
4 −）が好ましい。アルケニル基は、炭素原子数２−５
の直鎖または分枝の炭素鎖で、少なくとも１つの二重結
合を有する置換基である。たとえば、ビニル基が好まし
い。ジアルキルホスフィニル基は下に示す置換基であ
る。
＝ＣＨ−）およびテトラメチレン基（−（ＣＨ2 ）
4 −）が好ましい。アルケニル基は、炭素原子数２−５
の直鎖または分枝の炭素鎖で、少なくとも１つの二重結
合を有する置換基である。たとえば、ビニル基が好まし
い。ジアルキルホスフィニル基は下に示す置換基であ
る。
【００３１】
【化７】
【００３２】この式において、アルキルは上で定義した
とおりである。ジメチルホスフィニル基が好ましい。Ｓ
Ｏ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 およびカルボキシル基の塩として、
アルカリ、アルカリ土類金属またはアンモニウム塩を用
い得る。アルカリ塩としては、リチウム、ナトリウム、
カリウム、ルビジウムおよびセシウム塩があげられる
が、この中で、リチウム、ナトリウムおよびカリウム塩
が、とりわけ、ナトリウムおよびカリウム塩が好まし
い。アルカリ土類金属塩としては、ベリリウム、マグネ
シウム、カルシウム、ストロンチウムまたはバリウム塩
があげられる。マグネシウムおよびカルシウム塩が好ま
しく、特に、カルシウム塩が好ましい。アンモニウム塩
として、無置換のアンモニウムイオンＮＨ4 + の塩が用
いられる。一方、アンモニウムイオンが、１−４個のア
ルキル、アリールまたはアラルキル残基で置換されてい
るアンモニウム塩も用いることができる。これらの置換
基の定義は上に記したとおりであるが、アルキル基とし
てはメチル基、エチル基およびｎ−プロピル基が、アリ
ール基としてはフェニル基が、アラルキル基としてはベ
ンジル基が、特に好ましい。
とおりである。ジメチルホスフィニル基が好ましい。Ｓ
Ｏ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 およびカルボキシル基の塩として、
アルカリ、アルカリ土類金属またはアンモニウム塩を用
い得る。アルカリ塩としては、リチウム、ナトリウム、
カリウム、ルビジウムおよびセシウム塩があげられる
が、この中で、リチウム、ナトリウムおよびカリウム塩
が、とりわけ、ナトリウムおよびカリウム塩が好まし
い。アルカリ土類金属塩としては、ベリリウム、マグネ
シウム、カルシウム、ストロンチウムまたはバリウム塩
があげられる。マグネシウムおよびカルシウム塩が好ま
しく、特に、カルシウム塩が好ましい。アンモニウム塩
として、無置換のアンモニウムイオンＮＨ4 + の塩が用
いられる。一方、アンモニウムイオンが、１−４個のア
ルキル、アリールまたはアラルキル残基で置換されてい
るアンモニウム塩も用いることができる。これらの置換
基の定義は上に記したとおりであるが、アルキル基とし
てはメチル基、エチル基およびｎ−プロピル基が、アリ
ール基としてはフェニル基が、アラルキル基としてはベ
ンジル基が、特に好ましい。
【００３３】カルボキシアミド基としては、ＣＯＮＨ2
で表される置換基、および式中のアミノ基が１または２
個のアルキル残基で置換されたものがある。上記のアル
キル残基は１または数個の水酸基、カルボキシル基また
は／およびアルコキシカルボニル基で置換されていても
よい。本発明によれば、一般式IIのニトロソ化合物の中
でも、Ｒ7 とＲ8 が、上記のように、飽和または不飽和
の鎖を形成するような化合物が好ましい。この中で、こ
の鎖が不飽和で、不飽和鎖上の窒素原子の自由電子対が
二重結合および一般式IIの架橋窒素原子と共役してお
り、この結果、縮合芳香環を形成しているものが特に好
ましい。
で表される置換基、および式中のアミノ基が１または２
個のアルキル残基で置換されたものがある。上記のアル
キル残基は１または数個の水酸基、カルボキシル基また
は／およびアルコキシカルボニル基で置換されていても
よい。本発明によれば、一般式IIのニトロソ化合物の中
でも、Ｒ7 とＲ8 が、上記のように、飽和または不飽和
の鎖を形成するような化合物が好ましい。この中で、こ
の鎖が不飽和で、不飽和鎖上の窒素原子の自由電子対が
二重結合および一般式IIの架橋窒素原子と共役してお
り、この結果、縮合芳香環を形成しているものが特に好
ましい。
【００３４】互変異性体も、一般式IIの物質として用い
ることができる。これらの互変異性体も、一般式IIに含
まれることを理解すべきである。本発明によれば、一般
式IIIからXIIで表されるニトロソ化合物が好ましい。ま
た、これらの互変異性体および塩も用いられる。
ることができる。これらの互変異性体も、一般式IIに含
まれることを理解すべきである。本発明によれば、一般
式IIIからXIIで表されるニトロソ化合物が好ましい。ま
た、これらの互変異性体および塩も用いられる。
【００３５】
【化８】
【００３６】上記の一般式において、Ｘ−Ｙの意味は上
に記載したとおりである。Ｒ9 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12
は同一でも異なっていてもよく、水素、水酸基、アルキ
ル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アラルキル基、
アリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル
基、カルボキシアミド基、シアノ基、アミノ基を表す。
このアミノ基は、１または２個のアルキル基で置換され
ていてもよく、このアルキル基は１または数個の水酸
基、カルボキシル基、または／およびアルコキシカルボ
ニル基で置換されていてもよい。あるいは、Ｒ9 、
Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は、ハロゲンを表す。この場合に
２つの隣り合う置換基がアルキレン基を形成していても
よく、このアルキレン基はアリール基で置換されている
か、縮合環を形成していてもよい。Ｒ13は、アルキル基
またはアラルキル基を表し、これらは、水酸基、カルボ
キシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 またはジアルキルホス
フィニル基で置換されていてもよい。置換基の定義は、
一般式IIについて記載したものと同じである。
に記載したとおりである。Ｒ9 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12
は同一でも異なっていてもよく、水素、水酸基、アルキ
ル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アラルキル基、
アリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル
基、カルボキシアミド基、シアノ基、アミノ基を表す。
このアミノ基は、１または２個のアルキル基で置換され
ていてもよく、このアルキル基は１または数個の水酸
基、カルボキシル基、または／およびアルコキシカルボ
ニル基で置換されていてもよい。あるいは、Ｒ9 、
Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は、ハロゲンを表す。この場合に
２つの隣り合う置換基がアルキレン基を形成していても
よく、このアルキレン基はアリール基で置換されている
か、縮合環を形成していてもよい。Ｒ13は、アルキル基
またはアラルキル基を表し、これらは、水酸基、カルボ
キシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 またはジアルキルホス
フィニル基で置換されていてもよい。置換基の定義は、
一般式IIについて記載したものと同じである。
【００３７】本発明によれば、一般式III、IV、V、VI
I、VIIIおよびIXの物質、もしくは、対応する互変異性
体およびこれらの塩を使用するのが特に好ましい。Ｘ−
ＹがＮ＝ＣＲ6 を表し、Ｒ6 が一般式ＩＩで述べたとお
りの置換基を表すような物質が特に好ましい。化合物、
３−ニトロソ−２−メチルピラゾロ−［１．５ａ］−ピ
リジン、３−ニトロソピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ンおよび３−ニトロソピラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−ト
リアゾール、およびその塩、特に塩酸塩が、本発明への
使用に際して、優れて適していることが立証された。
I、VIIIおよびIXの物質、もしくは、対応する互変異性
体およびこれらの塩を使用するのが特に好ましい。Ｘ−
ＹがＮ＝ＣＲ6 を表し、Ｒ6 が一般式ＩＩで述べたとお
りの置換基を表すような物質が特に好ましい。化合物、
３−ニトロソ−２−メチルピラゾロ−［１．５ａ］−ピ
リジン、３−ニトロソピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ンおよび３−ニトロソピラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−ト
リアゾール、およびその塩、特に塩酸塩が、本発明への
使用に際して、優れて適していることが立証された。
【００３８】置換基を有する芳香族化合物、特に容易に
置換可能な基を有するフェノールおよびナフトールが、
カップラー物質ＢＸとしての使用に適している。ハロゲ
ン、特に臭素および塩素、または、ＳＯ3 Ｈ基が、置換
可能で、開裂可能な基として好ましく使用される。本発
明における好ましい反応原理は、還元された化合物Ａ′
による、化合物ＢＸの開裂可能な原子団Ｘの求核的芳香
族置換である。
置換可能な基を有するフェノールおよびナフトールが、
カップラー物質ＢＸとしての使用に適している。ハロゲ
ン、特に臭素および塩素、または、ＳＯ3 Ｈ基が、置換
可能で、開裂可能な基として好ましく使用される。本発
明における好ましい反応原理は、還元された化合物Ａ′
による、化合物ＢＸの開裂可能な原子団Ｘの求核的芳香
族置換である。
【００３９】ＢＸとして好ましい化合物は、２，４，６
−トリハロゲン−３−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジ
ハロゲン−１−ナフトール、１−ナフトール−４−スル
ホン酸、４−モノハロゲンアニリン、４−モノハロゲン
フェノールおよび４−モノハロゲンナフトールである。
開裂した原子団Ｘ- の性質によってこの原子団の濃度は
電流測定または電位差測定により、測定される。開裂し
た原子団がハロゲン化物イオンである場合、Ag／Agハロ
ゲン化物電極またはカロメル電極に対する電位差測定に
より測定されるのが望ましい。その他の、たとえばＳＯ
3 - のような開裂可能な原子団は、電極上での酸化によ
る電流測定によっても測定することができる。
−トリハロゲン−３−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジ
ハロゲン−１−ナフトール、１−ナフトール−４−スル
ホン酸、４−モノハロゲンアニリン、４−モノハロゲン
フェノールおよび４−モノハロゲンナフトールである。
開裂した原子団Ｘ- の性質によってこの原子団の濃度は
電流測定または電位差測定により、測定される。開裂し
た原子団がハロゲン化物イオンである場合、Ag／Agハロ
ゲン化物電極またはカロメル電極に対する電位差測定に
より測定されるのが望ましい。その他の、たとえばＳＯ
3 - のような開裂可能な原子団は、電極上での酸化によ
る電流測定によっても測定することができる。
【００４０】開裂した原子団Ｘ- の電気化学的測定と同
時に、カップリング生成物Ａ′Ｂが呈する色も、比色法
により測定される。これは、目視でも可能であるが、光
度計を用いて測定するのが望ましい。比色測定は特に低
濃度において有利であるのに対して、電気化学的測定は
高濃度においてより精密な定量が可能なので、このプロ
セスにおいて、比色測定と電位差測定は、相互に理想的
な形で補完しあっている。さらに、発色を、電気化学的
検出システムの機能をモニターするのに利用することが
できる。
時に、カップリング生成物Ａ′Ｂが呈する色も、比色法
により測定される。これは、目視でも可能であるが、光
度計を用いて測定するのが望ましい。比色測定は特に低
濃度において有利であるのに対して、電気化学的測定は
高濃度においてより精密な定量が可能なので、このプロ
セスにおいて、比色測定と電位差測定は、相互に理想的
な形で補完しあっている。さらに、発色を、電気化学的
検出システムの機能をモニターするのに利用することが
できる。
【００４１】電流を直接測定するために、反応混合物
を、開裂可能な原子団から電子を受け取ることができ、
半電池の一つの電極を構成する、不活性固体電極（たと
えばプラチナ電極）と接触させておく。その半電池は、
還元反応が起こり得るような第二の電極（たとえば、銀
／塩化銀電極、カロメル電極またはプラチナ／フェロシ
アン化物）と導電的に接続される。塩橋により、２つの
電極間に液絡を形成することが望ましい。
を、開裂可能な原子団から電子を受け取ることができ、
半電池の一つの電極を構成する、不活性固体電極（たと
えばプラチナ電極）と接触させておく。その半電池は、
還元反応が起こり得るような第二の電極（たとえば、銀
／塩化銀電極、カロメル電極またはプラチナ／フェロシ
アン化物）と導電的に接続される。塩橋により、２つの
電極間に液絡を形成することが望ましい。
【００４２】開裂したイオンＸ- を電位差測定により測
定するためには、たとえば塩化物イオンまたは臭化物イ
オン感応性電極のような、イオン感応性電極を使うと有
利である。このような電極としてはいろいろなものが市
販されている。適正な電極の配備および測定の方法は、
当業者には公知である。この本発明の方法は、水溶液
中、即ち電気化学的に不活性な溶液(non-electrochemic
ally active solution) 中で実施されるのが望ましい。
この方法の実施に当たって、適正なｐＨ値を維持するた
め、特に、使用する酵素に適したｐＨ値を維持するた
め、本発明の試験薬は緩衝剤を含有することが好まし
い。試験溶液はｐＨ値が４−９、特に５−７となるよう
な緩衝液とするとよい。
定するためには、たとえば塩化物イオンまたは臭化物イ
オン感応性電極のような、イオン感応性電極を使うと有
利である。このような電極としてはいろいろなものが市
販されている。適正な電極の配備および測定の方法は、
当業者には公知である。この本発明の方法は、水溶液
中、即ち電気化学的に不活性な溶液(non-electrochemic
ally active solution) 中で実施されるのが望ましい。
この方法の実施に当たって、適正なｐＨ値を維持するた
め、特に、使用する酵素に適したｐＨ値を維持するた
め、本発明の試験薬は緩衝剤を含有することが好まし
い。試験溶液はｐＨ値が４−９、特に５−７となるよう
な緩衝液とするとよい。
【００４３】本発明の試験薬は、溶液の状態で提供され
ても、あるいは、その溶液を吸収性または膨潤性担体に
加えて乾燥した状態で提供されてもよい。溶液の状態で
提供される場合には、試験薬には本方法に必要な試薬が
すべて含有されていることが望ましい。溶剤としては、
水、および水と水溶性有機溶剤、たとえば、メタノー
ル、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムアミド
との混合物が挙げられる。安定性上の理由から、試験に
必要な試薬を２から数種類の溶液に分けておいて、実際
の分析に当たって初めて混合することが有利である。使
用する合成電子受容体の濃度は、測定する被検体の濃度
に依存する。
ても、あるいは、その溶液を吸収性または膨潤性担体に
加えて乾燥した状態で提供されてもよい。溶液の状態で
提供される場合には、試験薬には本方法に必要な試薬が
すべて含有されていることが望ましい。溶剤としては、
水、および水と水溶性有機溶剤、たとえば、メタノー
ル、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムアミド
との混合物が挙げられる。安定性上の理由から、試験に
必要な試薬を２から数種類の溶液に分けておいて、実際
の分析に当たって初めて混合することが有利である。使
用する合成電子受容体の濃度は、測定する被検体の濃度
に依存する。
【００４４】本発明の方法によって測定される被検体の
標準的な濃度は、１０-6から１０-2モル／ｌ、特に１０
-5から１０-2モル／ｌである。対応する合成電子受容体
Ａの標準的な濃度は、１０-4から１０-1モル／ｌであ
る。酸化酵素の濃度はその活性と被検体の濃度に依存す
る。酵素濃度の標準的な値はキュベット試験の場合、１
ｍＵ／ｍｌから１Ｕ／ｍｌである。
標準的な濃度は、１０-6から１０-2モル／ｌ、特に１０
-5から１０-2モル／ｌである。対応する合成電子受容体
Ａの標準的な濃度は、１０-4から１０-1モル／ｌであ
る。酸化酵素の濃度はその活性と被検体の濃度に依存す
る。酵素濃度の標準的な値はキュベット試験の場合、１
ｍＵ／ｍｌから１Ｕ／ｍｌである。
【００４５】カップリング可能な化合物ＢＸは、少なく
とも、化合物Ａと化学量論的な比率で用いられるが、
１．５−２倍多く用いることが望ましい。本発明の試験
薬は、試験ストリップの形で提供することもできる。こ
のような試験ストリップに関しては様々な態様が知られ
ている。試験ストリップにおいては本測定方法を実施す
るのに必要な試薬は固体の担体層状に存在する。分析さ
れる試験液で湿らせる担体層としては、吸収性および／
または膨潤性材料が挙げられる。試薬は担体材料の中ま
たは上に固体の状態で存在する。試験液を試験ストリッ
プ上にたらすか、試験ストリップを試験液に浸すかする
と、試験ストリップ中に液体の環境が形成され、この中
で検出反応が進行する。この場合、開裂可能な原子団Ｘ
- を測定するためには、電極が上記の反応混合物の液体
の環境と導電的に液絡している必要がある。
とも、化合物Ａと化学量論的な比率で用いられるが、
１．５−２倍多く用いることが望ましい。本発明の試験
薬は、試験ストリップの形で提供することもできる。こ
のような試験ストリップに関しては様々な態様が知られ
ている。試験ストリップにおいては本測定方法を実施す
るのに必要な試薬は固体の担体層状に存在する。分析さ
れる試験液で湿らせる担体層としては、吸収性および／
または膨潤性材料が挙げられる。試薬は担体材料の中ま
たは上に固体の状態で存在する。試験液を試験ストリッ
プ上にたらすか、試験ストリップを試験液に浸すかする
と、試験ストリップ中に液体の環境が形成され、この中
で検出反応が進行する。この場合、開裂可能な原子団Ｘ
- を測定するためには、電極が上記の反応混合物の液体
の環境と導電的に液絡している必要がある。
【００４６】試験ストリップ上の個々の試薬の好ましい
濃度は次の通りである。 被検体 標準的には１０-4から１０-1Ｍ 色原体Ａ １０-3から１Ｍ カップリング可能な物質ＢＸ １０-3から１Ｍ 酵素 試験ゾーンあたり０．１から１００Ｕ
濃度は次の通りである。 被検体 標準的には１０-4から１０-1Ｍ 色原体Ａ １０-3から１Ｍ カップリング可能な物質ＢＸ １０-3から１Ｍ 酵素 試験ゾーンあたり０．１から１００Ｕ
【００４７】
実施例１ 色素形成および電気化学的検出によるグルコースの検出 反応式
【００４８】
【化９】
【００４９】測定混合物（最終的な濃度）： １００ｍＭ クエン酸塩緩衝液 ｐＨ５．８ １０ｍＭ ２，４，６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安
息香酸 １ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−４
−ニトロソアニリン １０Ｕ／ｍｌ グルコース -色素- オキシドレダクター
ゼ（ＰＱＱ−依存グルコースデヒドロゲナーゼ） ０．１Ｍ硝酸ナトリウム グルコースは被検体として、１００から５００μＭの間
で、濃度を変化させて添加される。 測定 ａ）電気化学的測定 キノンジイミンＡ′の２，４，６−トリブロモ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸との還元的カップリングにより生成す
る臭化物イオンをＩｎｇｏｌｄ社製,Ｔｙｐｅ３７３−
９０−ＷＴＥ−ＩＳＥ−Ｓ７のイオン感応性電極と、こ
れと連結したＫｎｉｃｋ社製（Ｔｙｐｅ７６３）の小型
電圧計を用いて測定する。結果を図１に示す。 ｂ）比色測定 グルコース濃度の増加とともに臭化物イオン濃度が増加
（臭化物イオン感応性電極の測定チェーンボルテージ(m
easuring chain voltage) が減少）するのに平行して、
λｍａｘ．＝７０５ｎｍの緑色の色素 Ａ′Ｂの生成が
増加するのが観察される（図２）。
息香酸 １ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−４
−ニトロソアニリン １０Ｕ／ｍｌ グルコース -色素- オキシドレダクター
ゼ（ＰＱＱ−依存グルコースデヒドロゲナーゼ） ０．１Ｍ硝酸ナトリウム グルコースは被検体として、１００から５００μＭの間
で、濃度を変化させて添加される。 測定 ａ）電気化学的測定 キノンジイミンＡ′の２，４，６−トリブロモ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸との還元的カップリングにより生成す
る臭化物イオンをＩｎｇｏｌｄ社製,Ｔｙｐｅ３７３−
９０−ＷＴＥ−ＩＳＥ−Ｓ７のイオン感応性電極と、こ
れと連結したＫｎｉｃｋ社製（Ｔｙｐｅ７６３）の小型
電圧計を用いて測定する。結果を図１に示す。 ｂ）比色測定 グルコース濃度の増加とともに臭化物イオン濃度が増加
（臭化物イオン感応性電極の測定チェーンボルテージ(m
easuring chain voltage) が減少）するのに平行して、
λｍａｘ．＝７０５ｎｍの緑色の色素 Ａ′Ｂの生成が
増加するのが観察される（図２）。
【図１】実施例１による臭化物イオンの電気化学的測定
の結果を示す図である。
の結果を示す図である。
【図２】実施例１による緑色色素Ａ′Ｂの比色測定の結
果を示す図である。
果を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 ホルガー コーツァン ドイツ連邦共和国 ディー−68526 ラー デンブルグ，レアルシュルシュトラーセ 25番地 (72)発明者 ヴォルカー ウンクリーク ドイツ連邦共和国 ディー−68526 ラー デンブルグ，シュタールビュールリンク 27番地 (72)発明者 ミッシェル マルカント ドイツ連邦共和国 ディー−68305 マン ハイム， グリュックスブルガー ヴェー ク 58番地
Claims (17)
- 【請求項１】 酸化酵素と、該酵素から電子を受容する
色原体Ａを用いる被検体の測定法であって、色原体Ａ
が、化合物Ａ′に還元された後、物質ＢＸとカップリン
グ反応を行って発色物質Ａ′Ｂを形成し、このＡ′Ｂの
濃度を被検体の存在または量の尺度として比色測定する
と同時に、上記カップリング反応によって、電気化学的
に測定可能な原子団Ｘ- がＢＸから開裂して生成し、こ
のＸ- の濃度を被検体の量の尺度として電気化学的に測
定することを特徴とする、被検体の比色測定と電気化学
的測定を同時に行う方法。 - 【請求項２】 色原体Ａが、電子密度の高い芳香族ニト
ロソ化合物であって、還元されるとカップリング可能な
イミノ化合物を形成する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 色原体が式Ｉの化合物である、請求項２
記載の方法。 【化１】 式Ｉにおいて、Ｒ1 は、水素原子、水酸基、アルキル
基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ
基、アリールチオ基、ハロゲンまたはアミノ基を表し、
上記のアルキル基は、水酸基、ＣＯＯＨ，ＰＯ3 Ｈ2 ま
たはＳＯ3 Ｈで置換されていてもよくまた、上記のアミ
ノ基はアルキル基（水酸基、ＰＯ3 Ｈ2 、ジアルキルホ
スフィニル基、ＳＯ3 ＨまたはＣＯ2 Ｈで置換されてい
てもよい）で一または多置換されていてもよい；Ｒ
2 は、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリ
ールチオ基またはアルキルチオ基を示し、これらの置換
基中のアルキル残基は水酸基、アルコキシ基またはアミ
ノ基（アルキル基で一または多置換されていてもよい）
によって置換されていてもよく、あるいは、Ｒ2 は、Ｐ
Ｏ3 Ｈ2 、ＳＯ3 ＨまたはＣＯ2 Ｈの、酸そのままの形
または塩の形、すなわち、アンモニウム塩、アルカリ塩
またはアルカリ土類金属塩を示し、あるいは、Ｒ2 はア
ミノ基ＮＲ3 Ｒ4 を示し、ここで、Ｒ3 とＲ4 は同一で
も異なっていてもよく、水素、アリール基またはアルキ
ル基を表し、このアリール基またはアルキル基は、水酸
基、アルコキシ基、ヒドロキシアルコキシ基、任意に水
酸基で置換されたポリアルコキシ基、酸そのままの形ま
たは塩の形のＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ3 Ｈ、ＣＯＯＨ、または
アミノ基（アルキル基で一または多置換されていてもよ
い）で置換されていてもよく、あるいは、Ｒ3 とＲ
4 は、鎖中に酸素、硫黄または窒素が介在してもよいア
ルキレン残基を表し、この場合、窒素はアルキル基、ヒ
ドロキシアルキル基、ヒドロキシアルコキシアルキル
基、アルコキシヒドロキシアルキル基、アルコキシカル
ボニルアルキル基、ジオキサニルアルキル基またはポリ
アルコキシアルキル基で置換されており、これらの置換
基はそれぞれアルキル基の部分が水酸基で置換されてい
てもよい；あるいはＲ1 がＮＲ3 Ｒ4 に対してオルト位
にある場合には、Ｒ3 またはＲ4 はＲ1 と共同してアル
キレン残基を表す。 - 【請求項４】 色原体が一般式IIで表される化合物であ
る、請求項２記載の方法。 【化２】 一般式IIにおいて、Ｘ−ＹはＮＲ5 −ＣＯまたはＮ＝Ｃ
Ｒ6 を表す；Ｒ5 は水素、アルキル基を表し、このアル
キル基は、水酸基、カルボキシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3
Ｈ2 、ジアルキルホスフィニル基で置換されていてもよ
い；Ｒ6 は水素、アルキル基、アルケニル基、アルコキ
シ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールチオ基、
アラルキル基を表し、これらの置換基は、それぞれ水酸
基、カルボキシル基、ＳＯ3 Ｈ、ＰＯ3 Ｈ2 、これらの
酸の塩、または／およびアルコキシカルボニル基で置換
されていてもよく、あるいは、Ｒ6 はアミノ基を示し、
このアミノ基は、アルキル基（一または数個の水酸基、
カルボキシル基または／およびアルコキシカルボニル基
を有していてもよい）で一または二置換されていてもよ
く、アミノ基がアルキル残基で二置換されている場合に
は、２つのアルキル残基は閉じて環を形成でき、この環
は、窒素原子に加えて、環中に酸素、硫黄、または別の
窒素原子が介在してもよく、あるいは、Ｒ6 はアミノ基
を表し、このアミノ基は一または二個のアシル基、アル
コキシ基または／およびアラルコキシカルボニル基、Ｈ
2 Ｎ−ＣＯ、アルキル基、アラルキル基、または／およ
びアリールカルバモイル基によって置換されていてもよ
く、あるいは、Ｒ6は、カルボキシル基、アルコキシカ
ルボニル基、カルボキシアミド基またはハロゲンを示
す；Ｒ7 は、アルキル基、チオアルキル基またはアラル
キル基を示し、これらは水酸基、カルボキシル基、ＳＯ
3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ2 で置換されていてもよく、あるい
は、Ｒ7 はアミノ基を示し、このアミノ基はアルキル基
（水酸基、カルボキシル基、ＳＯ3 Ｈ、ジアルキルホス
フィニル基またはＰＯ3 Ｈ2 で置換されていてもよい）
で一または二置換されていてもよい；ただし、Ｒ6 およ
びＲ7 の少なくともどちらか一方はアミノ基を表す；Ｒ
8 はアルキル基またはアラルキル基を表し、これらは水
酸基、カルボキシル基、ＳＯ3 ＨまたはＰＯ3 Ｈ2 で置
換されていてもよい。 - 【請求項５】 カップリング可能な物質ＢＸが、容易に
置換され得る置換基Ｘを有する芳香族化合物である、請
求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ＢＸが、ハロゲンまたはスルホン酸で置
換されたフェノール、ナフトール、アニリンまたはナフ
チルアミンである、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 カップリング可能な物質ＢＸが、１−ナ
フトール−４−スルホン酸であって、カップリング反応
により開裂してＳＯ3 ＨＯ基を生成する、請求項６記載
の方法。 - 【請求項８】 カップリング可能な物質ＢＸが、２，
４，６−トリハロゲン−３−ヒドロキシ安息香酸、２，
４−ジハロゲン−１−ナフトール、４−モノハロゲンフ
ェノールまたは４−モノハロゲン−１−ナフトールであ
って、開裂してハロゲン化物イオンを生成する、請求項
６記載の方法。 - 【請求項９】 原子団Ｘ- が電位差測定により測定され
る、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 原子団Ｘ- が電流測定により測定され
る、請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 被検体の比色測定および電気化学的測
定を同時に行うための、酸化酵素と該酵素から電子を受
容する色原体Ａを含有する試験薬であって、色原体Ａに
加えて物質ＢＸを含有し、色原体Ａが還元された後、物
質ＢＸとカップリング反応を行って発色物質Ａ′Ｂを形
成すると同時に、物質ＢＸの開裂により、電気化学的に
測定可能な原子団Ｘ- を生成するものであり、さらに、
開裂された原子団Ｘ- の存在または濃度を電気化学的に
測定するためのセンサー電極を有する試験薬。 - 【請求項１２】 色原体Ａが電子密度の高い芳香族ニト
ロソ化合物である、請求項１１記載の試験薬。 - 【請求項１３】 物質ＢＸが、容易に置換し得る、電気
化学的に測定可能な離脱基Ｘ- を有する、フェノールま
たはナフトール化合物、またはアニリンまたはナフチル
アミンである、請求項１１または１２に記載の試験薬。 - 【請求項１４】 物質ＢＸが、１−ナフトール−４−ス
ルホン酸である、請求項１３記載の試験薬。 - 【請求項１５】 ＢＸが、２，４−ジハロゲン−１−ナ
フトール、４−モノハロゲンフェノール、４−モノハロ
ゲン−１−ナフトールまたは２，４，６−トリハロゲン
−３−ヒドロキシ安息香酸である、請求項１３記載の試
験薬。 - 【請求項１６】 酵素から色原体Ａへの電子伝達のため
の媒介物質をさらに含む、請求項１１−１４のいずれか
一項に記載の試験薬。 - 【請求項１７】 発色物質Ａ′Ｂの存在または濃度を定
量するための光学測定装置をさらに含む、請求項１１−
１６のいずれか一項に記載の試験薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19521019:0 | 1995-06-13 | ||
| DE19521019A DE19521019A1 (de) | 1995-06-13 | 1995-06-13 | Verfahren und Mittel zur gleichzeitigen kolorimetrischen und elektrochemischen Messung eines Analyten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH095240A true JPH095240A (ja) | 1997-01-10 |
Family
ID=7763980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8152299A Pending JPH095240A (ja) | 1995-06-13 | 1996-06-13 | 被検体の比色測定と電気化学的測定を同時に行う方法および試験薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5858691A (ja) |
| EP (1) | EP0748866B1 (ja) |
| JP (1) | JPH095240A (ja) |
| DE (2) | DE19521019A1 (ja) |
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| JP2013500728A (ja) * | 2009-08-03 | 2013-01-10 | エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト | フルクトシルペプチジルオキシダーゼおよび糖化タンパク質アッセイ用センサー |
| WO2015159969A1 (ja) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | 株式会社同仁化学研究所 | 脱水素酵素及びその基質濃度の測定方法、電子メディエーター並びに該電子メディエーターを含む脱水素酵素及びその基質用測定試薬 |
| JP2016528175A (ja) * | 2013-06-04 | 2016-09-15 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｆｒｅｔに有用な新規化合物およびそれに関連する方法 |
| KR101691174B1 (ko) * | 2015-07-31 | 2016-12-30 | 동국대학교 산학협력단 | 자가발전형 비색 산소 센서-지시계 |
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| KR101503072B1 (ko) | 2005-07-20 | 2015-03-16 | 바이엘 헬스케어 엘엘씨 | 게이트형 전류 측정법 |
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| CN105247357B (zh) | 2013-03-15 | 2017-12-12 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 在电化学测量期间检测高抗氧化剂水平和从中对分析物浓度防故障的方法及结合其的设备、装置和系统 |
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