KR101954957B1 - 전기화학 시험 스트립용 시약 - Google Patents

전기화학 시험 스트립용 시약 Download PDF

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Abstract

특이적 기질로서 분석물을 산화하여 효소의 비활성 환원형을 생성하는 활성 레독스 효소; 및 페리시아나이드 염을 포함하는 건조 시약 조성물은 글루코스의 검출을 위해 사용되는 것과 같은 전기화학 시험 스트립에서 향상된 성능을 제공한다. 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 양으로 하전된 상대 이온은 페리시아나이드 염이 물에서 용해가능하고, 페리시아나이드 염 또는 페리시아나이드 염의 결정상이 물에서 용해성 및/또는 포타슘 페리시아나이드보다 100 mM의 농도에서 더 낮은 lower E0 eff를 갖도록 선택된다. 예를 들어, 페리시아나이드 염은 테트라메틸암모늄 페리시아나이드이다.

Description

전기화학 시험 스트립용 시약{Reagents for electrochemical test strips}
본원은 혈당(blood glucose)의 검출에 일반적으로 사용되는 유형과 같은 전기화학 시험 스트립(electrochemical test strip)용 시약 및 그러한 시약을 사용하는 조성물, 시험 스트립 및 관련 방법에 관한 것이다.
상업적 가치(commercial value) 및 학문적 관심(academic interest) 모두에 의해 평가되는, 바이오센서(biosensor)의 큰 부분은 관심있는 특정 분자(또는 "분석물(analyte)")에 대한, 산화환원 효소(oxidoreductase enzyme)의 특이성(specificity)을 활용(harnessing)하는 것을 포함한다. 이러한 바이오센서의 산화환원 효소는 관심있는 특정 분자로부터, 변환 메카니즘(transduction mechanism)에 의해 보다 용이하게 검출가능한 화학물질(chemical)로의 전자의 전달, 또는 그 역을 촉매하는데 사용된다. 변환 메카니즘은 전기화학적, 전기적 또는 광학적 수단에 의해 농도를 측정하는 것을 포함한다. 이러한 변환 메카니즘에 의해 보다 용이하게 검출가능한 화학 물질은 생물학적 효소와 바이오센서 내의 감지 메카니즘(sensing mechanism) 간의 이들의 중개 역할(intermediary role) 때문에 "매개체(mediator)"로 불린다.
산화환원 효소의 서브세트(subset)는 산화효소(oxidase)이고, 이는 매개체로서 시료 내에 이미 존재하는 산소를 사용하고, 종종 효소로부터 전자를 수용하는 모이어티로서 과산화 수소(hydrogen peroxide)를 형성한다. 과산화 수소의 검출에 기반한 바이오센서는 장치의 초기 세대(early generation)를 형성하였으나, 이는 백금(platinum)과 같은 촉매적 전극(catalytic electrode)에서만 전기화학적으로 검출가능한, 과산화물(peroxide)을 검출하는 어려움 때문에 상업적으로 제한되었다.
이러한 어려움을 극복하는 다수의 방법이 개발되었다. Lau 등(US 7,135,100 및 US 7,608,180)의 개시는 이러한 발명과 일부 관련되고, 페리시아나이드(ferricyanide)의 상이한 염이 과산화 수소(산소가 효소를 재생시키는 매개체로 작용할 때 형성됨)로부터 전자의 전극으로의 전달을 촉진하는데 사용되었다. 따라서, 이러한 시스템에서 페리시아나이드는 효소에 대해 매개체로서 활동하지 않고, 오히려 효소로부터 제거된 하나의 단계에서 작용한다. Lau의 염은 유기 용매 및 폴리머에서 이들의 용해성(solubility) 및 물에서의 낮은 용해도로 인해 선택되고, 이는 과산화물-매개 바이오센서에 대한 다른 어려움과 씨름하는 것을 목표로 한 기준(criterion)이다. 이는 전자의 방출 없이 과산화물을 분해하는, 카탈라제(catalase)의 존재 하에서 관심있는 분석물이 생물학적 시료에 종종 존재한다는 것이다. 막의 사용과 같은 방법은 생성된 과산화물 및 개발된 막-용해성 페리시아나이드로부터 카탈라제를 멀리하게 하여, 신호가 전극에 도달하고 검출될 수 있게 할 수 있도록 바이오센서에서 개발되어야만 했다.
이러한 과산화물-기반 바이오센서의 문제점에 대한 다른 대응은 신호 매개(mediation)의 필요없이 작동할 수 있는 산화효소에 기반한 바이오센서용시약 시스템의 개발이었다. 이러한 시스템은 일반적으로 효소를 활성 상태(active state)로 회복시키는 직접적인 매개체로서 포타슘 페리시아나이드를 사용하였다. 포타슘 염(potassium salt)이 아닌 페리시아나이드 염은 이전에 산화환원 효소와 조합하여 기술되었고: '소듐 페리시아나이드' (US 7,816,145, US 7,749,766, US 7,582,123, US 7,169,273, US 6,258,254에서와 같이) 또는 '알칼리 금속 페리시아나이드(예를 들어, 포타슘 또는 소듐 페리시아나이드)' US 6,187,751를 포함한다. 세 개의 다른 예에서, 페리시아나이드 염은 무차별적으로 열거되거나: '금속 이온은 예를 들어, 리튬, 소듐, 및 포타슘 이온과 같은 알칼리 금속 이온; 마그네슘 및 칼슘 이온과 같은 알칼리 토금속(alkaline earth metal) 이온; 및 또한 알루미늄 및 아연(zinc) 이온을 포함함'(Kadota 등 US 5,858,695) 또는 유기 용매(organic solvent)에서 용해성을 목표로 한다(상기에서 언급된 Lau 등 US 7,135,100 및 US 7,608,180).
포타슘 페리시아나이드는 다양한 산화환원 효소에 대해 우수한 매개체이다. 글루코스 산화효소와 같은 산화효소에 대해서조차, 높은 농도(~100 mM 또는 초과)의 포타슘 페리시아나이드는 단지 간섭제(interferent)로 되는, 시료 중 더 적게 농축된 산소보다 대부분 경쟁에서 앞설 수 있는, 충분히 빠른 매개체이다. 물에서 포타슘 페리시아나이드의 용해성은 그것을 함유한 바이오센서 제제(formulation)의 다른 장점을 주고; 페리시아나이드가 대량으로 존재할 때(예를 들어, US 5,508,171에서 Walling 등이 이들의 센서에서 '약 0.115 molar(M) 내지 약 0.7 M'의 포타슘 페리시아나이드에 대한 유용한 범위를 정의함), 작동 전극(working electrode)에서 반응을 균형잡기 위하여, 상대 전극(counter electrode)에서 적절한 상대 반응(counter reaction)을 지원(support)할 수 있다. 상대 반응은 충분한 전류(current)를 제공하고, 화학적 포텐셜(chemical potential)을 고정시켜 기준 전극(reference electrode)이 필요하지도 않고, 상대 전극이 작동 전극보다 더 클 필요도 없다. 이는 센서가 동일 크기 및 물질의 전극으로 두 개-전극 센서로 단순화될 수 있다는 것을 의미한다. 시약의 이러한 유형을 사용하는 다른 작업물은 WO 97/00441, US 5,708,247 및 US 6,258,229에서 발견된다.
그러나, 그것의 광범위한 사용의 결과로서 아마도, 포타슘 페리시아나이드의 문제점은 널리 인식된다. 이는 페리시아나이드가 매개체로서 산소보다 경쟁에서 앞설 수 있더라도, 생성된 페로시아나이드는 여전히 산소에 의한 산화에 민감하기 때문에, 산소에 대한 민감성(sensitivity)을 포함한다. 페리시아나이드의 다른 문제는 포타슘 페리시아나이드가 효소와 긴밀한 접촉을 하고 있는 상태에 있는 경우, 연장된 기간에 걸쳐 건조된(dried) 시약에서조차, 페리시아나이드의 일부가 페로시아나이드(ferrocyanide)로 변환(transform)하는 경향이다. 이 문제점을 개선하는 제제를 형성하는 다양한 방법이 개시되었다: Nankai 등(US 5,120,420)은 '친수성 고분자 물질 층(hydrophilic high molecular substance layer)'에 의해 분리된 층들에 이들의 효소 및 포타슘 페리시아나이드를 두어 이들을 서로 따로 두고, '탁월한 보존 특성'을 보장하는 반면, Walling 등(US 5,508,171)은 포타슘 페리시아나이드를 분산하는 미세결정(microcrystalline) 셀룰로오스를 이용한다.
더 신속한 시험 시간(test time) 및 향상된 정확도(accuracy)에 대한 주안점(emphasis) 증가와 함께, 포타슘 페리시아나이드의 느린 매개 속도(mediation rate)(더 높은 농도를 필요로 함) 및 건조된 시약에서 페로시아나이드를 생성하는 경향은 페리시아나이드 이온이 바이오센서 시약에서의 구성 성분(component)으로서의 선호(favor)를 잃고 있다는 것을 의미한다. 이 때문에, 산소보다 경쟁에서 앞서는 고농도를 필요로 하지 않는 매개체, 예를 들어 US 5,378,628, US 5,393,903, US 5,437,999, US 5,410, 059, US 5,589,326, US 5,846,702의 금속 비피리딜(bipyridyl)("bpy") 복합체, US 6,605,201, US 6,676,816, US 7,074,308의 금속 피리딜-이미다졸 복합체 및 US 7,090,756의 두자리(bidentate) 이미다졸 복합체가 개발되었다. 그러나, 이러한 유형의 복합체는 필요한 상대 반응을 지원하는 높은 용해도를 항상 갖는 것이 아니고, 따라서 스트립 구성(construction)은 기준(reference) 또는 Ag/AgCl 상대/기준 전극의 도입과 함께, 더욱 복잡해져야 한다. 높은-용해도 Os 복합체 유형은 US 5,589,326에 개시되어있지만, 오스뮴(osmium) 복합체의 비용은 이러한 접근을 일회용(disposable) 스트립에 대한 포타슘 페리시아나이드보다 눈에 띄게 더 비싸게 만든다.
상술된 것들을 포함한, 제2 매개체를 첨가하는 것에 의하여, 포타슘 페리시아나이드의 활성을 보충하는 것이 가능하고; 이는 일반적으로 매개체 양쪽의 최악의 특징(feature)을 부각시키는 문제점을 야기하고, 특히: (a) 요구되는 산화 포텐셜은 가장 높은 매개체 산화 포텐셜에 맞아야하고, (b) 산소에 기인한 신호의 손실(loss)은 이점에 있어서 두 개의 매개체의 최악(worst)에 의해 주도될 것이며, (c) 신호의 크기는 오직 가장 훌륭히 수행하는(best performing) 매개체의 것일 될 것이다. 게다가, 포타슘 페리시아나이드를 함유한 제제에 제2 매개체의 첨가는 건조된 시약에서의 페로시아나이드의 생성을 부각시킨다. 이러한 문제에 관한 방법이 개발되어야만 하고, 이들은 샌드위치에서 두 개의 전극 상의 시약 구성 성분의 물리적 분리에 관한 Guo 등의 방법(US 6,033,866)을 포함한다.
문제에 대한 부분적 해결책은 Harding 등, US 2007/0295616-A1에 의해 제시되고, 이는 원용에 의해서 본 명세서에 포함되고, 여기서 전극 전위(electrode potential)의 주의깊은 선택은 두 개의 전자-전달 종(species)이 병렬(in parallel)보다는 협력하여(in concert) 작용하게 한다. 이러한 시스템에서, 매개체는 효소를 재생시키고, 셔틀 화합물(shuttle compound)은 전극으로부터 전극에 전자의 전달을 위하여, 주요한 또는 유일한 전기활성(electroactive) 종으로 기능한다. 본원에 기재된 매개체의 특정 조합 및 셔틀 화합물은 매개체로서 [Os(MeBpy)2(Im)2]2+/3+ 또는 [Os(Mebpy)2Pic]+/2+ 및 셔틀로서 페리/페로시아나이드를 포함한다. 원용에 의해서 본 명세서에 포함되는, 미국 특허 제5,508,171호는 또한 두 개의 매개체가 채용된 일부 시스템을 개시한다.
본원은 특히 주의 깊게 선택된 페리시아나이드 염의 사용을 통하여 시약을 함유한 시험 스트립의 저장 안정성(shelf stability)을 특히 포함한 포타슘 페리시아나이드 매개체와 관련된 많은 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 따라서, 제1양태에서, 본원은 다음을 포함하는 건조 시약 조성물에 관한 것이다:
(a) 효소의 비활성형(inactive form)을 생성하는 특이적 기질(substrate)로서 분석물을 산화/환원시키는 활성 레독스(redox) 효소; 및
(b) 페리시아나이드 염으로서, 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온(counter ion)으로 구성되되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 페리시아나이드 염이 시료에서 분석물의 최대 분석 농도의 적어도 두 배까지, 그러나 포타슘 페리시아나이드의 용해도보다는 적은 농도로 물에서 용해가능하도록, 및/또는 페리시아나이드 염은 100 mM 포타슘 페리시아나이드의 것보다는 더 적은 100 mM의 농도에서 더 낮은 E0 eff를 갖도록 선택되는 것인, 페리시아나이드 염.
E0 eff는 페리시아나이드 염 전체에 대하여, 또는 단지 그것의 결정상(crystalline phase)에 대하여 측정될 수 있다. 페리시아나이드의 예시적 염은 루비듐 페리시아나이드 및 테트라메틸암모늄 페리시아나이드이다.
"최대 분석 농도(maximum analytical concentration)"는 주어진 센서에 대하여 설계된 동적 범위(dynamic range)의 상단(upper end)이다. 혈당의 경우, 이러한 값은 일반적으로 600 mg/dL이다.
건조 시약은 또한 추가적인 전자 전달 매개체(들), 완충제(buffering agent) 및 습윤제(wetting agent)를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그러한 추가적인 작용제(agent)와 관련된 양이온은 적어도 주로 동일하고, 바람직하게는 페리시아나이드 염의 양으로 하전된 상대 이온과 모두 동일하다.
또한, 본 발명은 금속 전극 및 본 발명의 건조 시약 조성물을 포함한 전기화학 시험 스트립에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 건조 시약은 실질적으로 및 놀랍게도 얻어진 시험 결과의 품질을 손상하지 않고 시료의 적용에 앞서 전기화학 시험 스트립의 저장 수명을 증가시킨다. 본 발명의 이러한 양태에 따라, 시료 중 글루코스(glucose)와 같은 산화가능한 분석물의 검출을 위하여 전기화학 시험 스트립은 다음을 포함한다:
(a) 제1 및 제2 비-반응성(non-reactive) 전극;
(b) 액체 시료를 수용하기 위한 시료 셀로서, 여기에서 시료 셀 안에 배치된 액체 시료는 제1 및 제2 전극과 접촉하는 것인 액체 시료; 및
(c) 본 발명에 따른 건조 시약.
건조 시약은 액체 시료의 시험 스트립에의 적용시, 건조 시약은 시료 셀 내에서 시료에서 용해한다.
본 발명은 또한 수성 액체(aqueous liquid) 캐리어(carrier) 중 본 발명의 시약을 포함하는 액체 조성물(liquid composition)을 제공한다. 그러한 액체 조성물은 혈액과 같은 액체 시료가 시험 스트립의 시료 챔버(sample chamber)에 도입될 때, 또는 액체 캐리어가 시험 스트립에의 적용 전에 시약과 혼합될 때 얻어진다. 그러한 조성물은 또한 저장 및 분배(distribution)를 위하여 이후의 건조에 앞서, 제조하는 동안 시약 조성물을 시험 장치(test device)로 전달하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 시료를 본 발명의 시험 스트립에 적용하는 것에 의하여 액체 시료에서 분석물을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 건조된 시약 내의 효소는 분석물에 대해 특이적인 것으로 선택되며; 외부 신호(external signal)를 시험 스트립에 적용하여 시료 내의 분석물 양을 나타내는 신호를 생성한다. 특정 구현예에서, 외부 신호는 제1 및 제2 전극 간에 적용된 포텐셜(potential)이고, 분석물 양을 나타내는 신호는 전류이다.
본 발명은 또한 분석물의 전기화학적 검출에 사용하기 위한 저장 안정성 시약(shelf stable reagent)을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 그 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 특이적 기질로서 분석물을 산화/환원시키는 산화환원 효소를 선택하는 단계;
(b) 페리시아나이드 염을 선택하는 단계로서, 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 선택된 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 페리시아나이드 염이 물에서 용해가능하고, 페리시아나이드 염 또는 페리시아나이드 염의 결정상(crystalline phase)이 시료 중 분석물의 최대 분석 농도의 적어도 두 배지만 포타슘 페리시아나이드의 용해도 보다는 적은 농도로 물에서의 용해도를 갖고 및/또는 페리시아나이드 염은 100 mM 포타슘 페리시아나이드의 것보다 더 적은 100 mM의 농도에서 더 낮은 E0 eff을 갖도록 선택되는 것인 단계; 및
(c) 선택된 효소 및 선택된 페리시아나이드 염을 조합하여, 분석물의 검출에 사용하기 위한 저장 안정성 전기화학적 시험 시약을 형성하는 단계.
본원은 분석물의 검출에 사용하기 위한 시약 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 전기화학 시험 스트립에 관한 것이다.
정의
본원의 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 용어의 하기 정의는 적용가능하다:
일반적으로, 용어 "분석물(analyte)"은 시료에서 관심있는 물질을 지칭하고, 이것의 존재 또는 양은 결정될 것이다. 본원의 경우, 용어 분석물은 특히 (a) 1V보다 적은 전위차에서, 수용액(aqueous solution)에서 금속 또는 다른 비-반응성 전극에서 직접적으로 산화성 또는 환원성이 아니고; (b) 수성 용액에서 레독스 효소에 의해 직접적으로 산화성 또는 환원성인 화합물을 지칭한다. 표 1에 열거된 글루코스, 콜레스테롤 및 기타 이러한 분석물을 제한없이 포함하는, 이러한 특성을 충족시키는 다양한 분석물이 "바이오센서(biosensor)"에 의한 검출을 위해 개시되었다. 본원의 실시예는 글루코스를 지칭하는데, 이는 바람직한 분석물이고, 다른 분석물 및 대응하는 효소는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 대체될 수 있고, 글루코스가 채용된 어떠한 실시예 또는 구조(structure)도 효소 및 전기활성 종의 적절한 변화와 함께 다른 분석물에 완전히 적용가능하다.
용어 "활성 레독스 효소(active redox enzyme)"는 그것이 특이적 기질로서 선택된 분석물을 산화 또는 환원하게 하는 레독스 상태에 있는 효소를 지칭한다. 이러한 산화 또는 환원은 이러한 기능을 더 이상 수행할 수 없는 효소의 비활성형을 생성한다. 본 발명에 따라 주어진 시약에서, 효소는 특이적 기질로서 원하는 분석물을 갖도록 선택될 것이다. 분석물/효소 짝(pair)의 실시예는 본 명세서에 원용에 의해 포함된, 미국 특허출원 제4,225,410호의 표 I에 부분적으로 기반한, 표 1에 열거된다.
용어 "전자 전달 매개체(electron transfer mediator)"는 분석물과의 반응에 의하여 형성되는 비활성 효소(inactive enzyme)로부터 활성 레독스 효소를 재생시키는 능력을 갖는 화학적 화합물(chemical compound)을 지칭한다. 전자 전달 매개체는 시험 스트립에 적용되는 시료(일반적으로 혈액, 소변(urine) 또는 침(saliva)과 같은 수성 매질(aqueous medium))에서 활성형(active form)을 재생시키는 효소의 비활성형을 산화 또는 환원하기에 충분한 전기화학적 포텐셜을 가져야만 한다. 따라서, 관심있는 분석물은 효소의 선택을 제어하고, 효소는 시약 내 전자 전달 매개체의 선택을 제어한다.
용어 "시험 스트립(test strip)"은 적어도 하나의 분석물의 전기화학적 검출에 적합한 전극 및 시약을 포함하는 부분과 스트립의 미터(meter)에의 부착을 위한 커넥터(connector)의 조립체(assemblage)를 지칭한다. 시험 스트립은 다중 분석물을 위하거나 또는 동일 분석물의 다중 결정(determination)을 위한, 다중 전극 세트(multiple electrode set) 및 시약을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 시험 스트립은 일회 사용, 일회용 요소(element)이다.
용어 "미터(meter)"는 시료가 미터와 관련된 시험 스트립에 적용될 때, 시료중 하나 이상의 분석물의 결정을 위한 통합된(integrated) 시험 유닛을 제공하는 시험 스트립과 관련된 전자 장치를 지칭한다. 일반적으로, 미터는 전기화학적 반응을 자극하는 시험 스트립에 포텐셜을 적용하고, 결과 신호(resulting signal)를 검출하고 분석한다. 그러나, 미터는 이러한 기능, 예를 들어 포텐셜의 적용 및 신호 검출의 일부만을 수행할 수 있고, 분석은 별개의 구성 요소(component)에서 수행될 수 있다.
용어 "TMA 페리( TMA ferri )", "TMA 페로 ( TMA ferro )" 및 "TMA 커플( TMA couple)"은 각각 테트라메틸암모늄 페리시아나이드, 테트라메틸암모늄 페로시아나이드 및 레독스 커플로서 공통 용액(common solution)에서의 TMA 페리 및 TMA 페로의 조합을 지칭한다.
용어 "충분한 포텐셜(sufficient potential)"은 전극에서 페리시아나이드 커플(예를 들어 TMA 커플)의 산화 및 환원을 야기하기에 충분히 큰 전극 간의 전위차를 지칭한다. 전압(voltage)이 전극 간의 전위차를 형성하도록 한쪽 또는 양쪽 전극에 적용될 수 있다.
용어 "용해도(solubility)"는 물에서 용해될 수 있는 화합물의 양을 지칭한다. 이는 다양한 방법으로 표현될 수 있지만(예를 들어, 물의 질량(mass) 당 화합물의 질량, 물의 부피당 화합물의 질량, 실제 단위(actual unit)로 정의되거나 또는 % 값으로 표현됨), 페리시아나이드 염에 대해서 적어도, 이 개시에서 비교를 위한 가장 유용한 단위는 페리시아나이드 함량의 직접적인 비교가 가능하기 때문에, 리터당 화합물의 몰(Molar, M)이다. 페리시아나이드 염의 용해도는 스트립의 저장 및 사용과 관련된 통상적인 온도, 예를 들어, 25℃에서 적절하게 비교된다.
본 발명에 사용된 페리시아나이드 염에 적용될 때, 용어 "물에서 용해가능한(soluble in water)"은 전기화학적 분석을 수행하기에 적합한, 혈액과 같은, 수성 시료(aqueous sample)에서 농도를 얻기에 충분한 용해도의 정도를 의미한다. 대부분의 목적에 대해, 이는 시험 스트립 장치를 작동하는데 있어 실제 농도는 이만큼 높을 필요가 없지만, 적어도 80 mM의 농도를 얻기에 충분한 용해도를 의미한다. 용해도의 하한(lower limit)은 전류가 양극에서 환원되는 종의 농도에 의해 제한되는 것을 확실하게 하는 음극에서 필요한 산화된 매개체의 농도에 의해 정해지고; 이러한 한계는 분석물의 최대 농도에 의해 생성되는 환원되는 종의 양에 의존한다. 글루코스에 대하여, 글루코스 산화환원효소(oxidoreductase)는 일반적으로 총 글루코스의 64%인, 베타-D-글루코스만의 산화를 촉매하고, 글루코스 몰당 페로시아나이드 2 몰을 생성하며, 따라서, 600 mg/dL (즉, 33.3 millimolar (mM))의 최대 분석 혈당 농도에 대하여, 42.7 mM 페로시아나이드가 생성될 것이다. 양극에서 페로시아나이드의 산화는 전류 제한(current limiting)이 계속되기 위하여, 페로시아나이드를 형성한 후에 남은 초과분을 갖는 시약에서 페리시아나이드의 이러한 농도의 적어도 두배(즉, 85.4 mM)가 바람직하다. 포타슘 페리시아나이드에 대하여, 이는 적어도 28.1 g/L의 용해도에 대응될 것이고, 포타슘보다 더 큰 중량의 양이온을 갖는 화합물에 대하여서는 더 크다. 반대로, US 7,135,100는 낮은 물-용해도를 갖는 화합물이 20 g/L의 최대 용해도를 갖는 것을 나타낸다.
용어 "E0 eff"는 관심있는 농도에서, 관심있는 이온의 존재 하에서, 주어진 전기활성 종에 대한 전극 전위를 지칭한다. 페리시아나이드의 전극 전위는 하기의 화학적 반쪽 반응(half-reaction)에 의해 나타내는 평형(equilibrium)의 표현이다.
(Fe(CN)6)3- + e- →(Fe(CN)6)4-
페리시아나이드 + 전자 → 페로시아나이드
전기화학자는 표준 전극 전위 E0가 임의의 특정 화학적 포텐셜, E에서 두 개의 화학 종의 비율을 결정하는 Nernst 식과 같은 식에서 사용될 수 있다.
E = E0 + (RT/nF)ln{[페리]/[페로]}
R은 기체 상수(gas constant), T는 절대 온도(Kelvin), n은 반쪽 반응에서 전달되는 전자의 갯수(페리시아나이드에 대해서 1임)이며, F는 Faraday의 상수, [페리]는 페리시아나이드 이온, (Fe(CN)6)3-의 농도이고, [페로]는 페로시아나이드 이온, (Fe(CN)6)4-의 농도이다. 이러한 식은 화학적 포텐셜, E가 시스템에서 양이온의 성질(nature)과 독립적이고, 표준 전극 전위, E0 는 [페리] = [페로]인 용액의 화학적 포텐셜로부터 결정될 수 있다는 기대를 준다. E0은 전극 전위의 측정으로부터 다른 농도 비율을 예측하는데 사용될 수 있거나 또는 역으로 [페리]/[페로]의 비율로부터 전극 전위를 예측하는데 사용될 수 있는, 그 역도 또한 기대된다. 그러나, 또한 전기화학자는 증가하는 농도에서, 농도 값의 직접적 사용이 에러(error)로 이어진다는 것과 이들이 열역학적 활성(thermodynamic activity)에 의하여 대체되어야만 한다는 것을 인식한다.
이상적인 Nernst 식 외에, Hanania 등에 의한 연구(J. Phys Chem 1967, 71, pp2022-2030)는 페리시아나이드 및 페로시아나이드 이온이 용액의 양이온과 복합체 또는 이온 쌍(ion pair)을 형성한다는 아이디어를 탐구했다. 이러한 작업은 무한 희석(infinite dilution)에서 한계인, 일반적으로 사용되는 E0 = 356 mV의 참고 자료서(data-book) 값 대 표준 수소 전극을 설정하지만, 또한 포타슘 이온, 페리시아나이드 및 페로시아나이드의 더 높은 농도 간 존재하는 평형을 상세하게 탐구한다. 또한, 전극 전위에 대한 다른 염(알칼리 금속 및 테트라알칼암모늄 염)의 영향이 간단히 탐구되었다. Hanania 등은 비록 테트라알킬암모늄 페리시아나이드 염이 더 낮은 전극 전위를 주더라도, "KBr 및 NaCl... 과 같은 중성염(neutral salt)의 첨가는 환원 포텐셜에서 즉각적인 드라마틱한 상승을 가져온다". 따라서, E0 의 결정은 농도만이 아니고 존재할 수 있는 특정 복합체에도 의존할 것이다. 용어 E0 eff는 환원되고 산화된 종의 특정 총 농도에서 특정 염에 대해 적용가능한 E0의 형태이다.
본 발명의 건조 시약에서, 양이온성 상대 이온(cationic counter ion)을 포함하는 추가적인 염이 시약에 존재할 때, 이러한 양이온성 상대 이온이, 채용된 페리시아나이드 염에서 양으로 하전된 상대 이온과 적어도 주로 동일한 것이 바람직하다. 용어 "주로 동일(mainly the same)"은 전체적으로 건조 시약에서, 양으로 하전된 상대 이온의 25% 미만이 페리시아나이드의 상대 이온과 상이한 것을 의미한다. 이는 만일 몰 기준(molar basis)에서 페리시아나이드 염의 양에 대해 채용되는 추가적인 물질의 양이 적다면, 추가적인 물질이 실질적으로 그것의 상대 이온 모두를 상이하게 할 수 있고, 상대 이온을 동일하게 유지하는 것의 중요성은 추가적인 물질의 상대적 양이 증가함에 따라 증가할 것으로 생각될 것이다. 특정 구현예에서, 양으로 하전된 상대 이온의 10% 미만 및 더욱 바람직하게는 5% 미만은 상기 페리시아나이드의 상대 이온과 상이하다.
일부 구현예에서, 추가적인 물질과 관련된 양이온성 상대 이온의 "본질적으로 모두(essentially all)"는 채용된 페리시아나이드 염의 양으로 하전된 상대 이온과 동일하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 모두"는 다른 검출가능한 상대 이온이 없을 것을 요구하지 않지만, 어떠한 그러한 상대 이온도 첨가된 추가적인 물질에서 불순물로 간주될 것이다. 특정 구현예에서, 추가적인 물질의 순도는 페리시아나이드염 중 양으로 하전된 상대 이온과 동일한 상대 이온을 포함하는 화합물에 대하여 적어도 98% 순도를 갖는 염이다.
용어 "저장-안정성 시약(shelf-stable reagent)"은 금과 접촉했을 때, 전극이 동일한 조건 하에서 포타슘 페리시아나이드가 페리시아나이드 구성 성분으로 사용되는 다른 (otherwise) 동일한 조성물의 것보다 더 긴 저장 수명(shelf life)을 갖는 것인 건조 시약을 지칭한다. 저장 수명은 가속화된 에이징 테크닉을 사용하여 평가될 수 있고, 측정 시스템에서 글루코스를 함유한 액체(예를 들어 참조 표준(reference standard))로 얻은 결과의 비교에 기초하여, 또는 전극 간 산화되고 환원되는 매개체를 오가는(shuttle) 시스템에서 백그라운드 전류(시료 챔버로 글루코스 인풋(input)없이 측정됨)의 변화에 기초하여 측정될 수 있다.
용어 "상대 이온(counter ion)"은 그것이 채용되기 위한 기능을 수행하는 화합물의 일부의 전하(charge)와 균형을 이루는 이온성 화합물의 일부를 지칭한다. 따라서, TMA 페리에서, 페리시아나이드 이온은 전자 전달 기능을 제공하고, TMA는 양이온성 상대 이온이다.
용어 "기준선 신호(baseline signal)"는 분석물을 함유하지 않는 시료가 시약으로 시험될 때 발생하는 신호를 지칭한다. 소듐 또는 포타슘 페리시아나이드를 함유한 시약으로 제조된 바이오센서에서, 기준선 신호가 건조된 시약의 저장에서 증가할 때, 이는 페로시아나이드가 생성되었거나 생성되고 있다는 것을 보여준다(이것이 검출되고 있는 분자이기 때문임). 기준선이 증가하게 하는 전자의 궁극적 소스(ultimate source)는 설정될 필요가 없으나, 시약의 산화환원 효소의 존재와 종종 관련된다.
용어 "비-반응성 전극(non-reactive electrode)"은 분석 조건(analytical condition) 하에서 분석물의 검출을 위한 전기화학적 반응에 의도적으로 참여하지 않는 전극을 지칭한다. 비-반응성 전극의 예는 전극의 화학적 본질을 변화시키지 않고 전자를 수용하거나 방출하는 금속 전극(금, 백금, 팔라듐 등) 및 탄소 전극을 포함한다. 이는 은/은 이온의 반응이 측정가능한 신호의 생성을 지원하기 위하여 발생하는 Ag/AgCl과 같은, 반응성 전극과 대조를 이룬다.
건조 시약 조성물
제1 측면에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 건조 시약 조성물을 제공한다:
(a) 효소의 비활성형을 생성하는 특이적 기질로서 분석물을 산화/환원시키는 활성 레독스 효소; 및
(b) 페리시아나이드 염으로서, 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 물에서 용해가능한 페리시아나이드 염이 시료에서 분석물의 최대 분석 농도의 최소 두배인 물에서의 용해도이나, 포타슘 페리시아나이드의 용해도보다는 낮은 용해도를 갖도록 및/또는 페리시아나이드 염이 100 mM 포타슘 페리시아나이드의 것보다 낮은 100 mM 농도에서 더 낮은 E0 eff를 갖도록 상기 양으로 하전된 상대 이온이 선택되는 것인, 페리시아나이드 염.
하기에서 상술되는 바와 같이, 포타슘으로부터 상대이온(counterion)을 변화시키는 것이 시약 안정성 및 저장 수명을 강화시킬 수 있다는 메카니즘은 명백하지 않다. 처음에 본 발명자들에 의해 고려된 한 가지 가능성은 더 낮은 E0 eff를 갖는 것이 페리시아나이드의 페로시아나이드로의 더 적은 전환을 야기한다는 것이고, 따라서 감소된 기준선이 저장 시간(storage time)과 함께 증가한다는 것이다. 그러나, 루비듐 염의 E0eff가 고려되었을 때, 이러한 설명이 실험 결과와 일치하지 않는다는 것이 명백하게 되었다. 결국, 본 발명자들은 물에서의 염의 용해도와 관찰된 효과와의 사이에 상관관계가 있다는 것을 발견하였다. 지나고 보면, 이는 하기에서 논의되는 바와 같이, 결정화(crystallization)의 열역학에 기반하여 설명될 수 있다. 그러나, 충분히 더 낮은 E0 eff 단독 또는 용해도 고려와의 조합은 동일한 효과를 이루지 않는다는 것을 배제할 수 없고, 따라서 본 발명은 오직 유일한 메카니즘적(mechanistic) 이해에 한정될 필요가 없다.
도 1은 예시적 분석물로서 글루코스, 예시적 효소로서 글루코스 산화효소 및 예시적 페리시아나이드 염으로서 TMA 페리를 갖는, 시약 조성물을 함유한 시험 스트립에서 발생하는 일련의 반응을 도시한다. 글루코스는 산화된 효소인 글루코스 산화효소 (GOX( ox ))와 반응하여 글루콘산(gluconic acid)과 환원된 효소(GOX( red ))를 생성한다. GOX( red )는 TMA 페리와 반응하여 GOX( ox ) 및 TMA 페로를 재생시킨다. 이러한 많은 반응은 전극(10, 11)에서 적용된 포텐셜 없이 발생할 수 있다. 충분한 포텐셜 V가 전극(10, 11)에 적용될 때, 전자는 전극(11)으로부터 전극(11)에 인접한 TMA 페리로 전달(12)되어 TMA 페로를 형성할 수 있는 반면, 전자는 전극(10)에 인접한 TMA 페로의 분자로부터 전달(13)하여 TMA 페리를 생성한다. 이러한 전자 전달 반응은 측정가능한 전류를 야기한다. 전류는 또한 전극(11)으로부터 전극(12)으로의 TMA 페로의 확산(14) 후에 동일한 전달(13)에 의해 형성되고, 이 중 어느 것도 글루코스 농도의 표시(indication)를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 전류를 분석하기 위한 많은 방법이 당업계에 알려져 있고(예를 들어, 미국 특허 제7,501,052호, 제6,284,125호; 제5,942,102호; 제5,352,351호; 및 제5,243,516호 및 미국 특허공보 US-2005-0265094-A1, 이는 본 명세서에 원용에 의해 포함됨), 어떤 유형의 분석도 이러한 건조 시약 조성물의 사용으로부터 야기되는 전류를 분석하는데 사용될 수 있다.
채용되는 페리시아나이드 염은 용해도에 기반하여 선택될 수 있고; 염은 물에서 용해가능하여야만 하고 포타슘 페리시아나이드보다 더 낮은 용해도를 갖거나 또는 100mM 용액에서 포타슘 페리시아나이드의 E0 eff에 대해 E0 eff 값에 기반하여 선택될 수 있다. 표 2는 페리사아나이드의 다양한 염에 대하여 E0 eff 및 용해도에 대한 실험적 값을 열거한다. 나타내진 바와 같이, 소듐 페리시아나이드 및 세슘 페리시아나이드의 E0 eff 값 및 용해도는 포타슘 페리시아나이드에 대한 것보다 모두 더 크고, 따라서 본 발명의 범위에 속하지 않는다. 반면, 루비듐 페리시아나이드 및 테트라메틸암모늄 페리시아나이드는 더 낮은 용해도를 갖고, 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 테트라메틸암모늄 염은 E0 eff에 대하여 실질적으로 더 낮은 값을 갖는다.
페리시아나이드의 다른 적절한 염은 트리암모늄 페리시아나이드 및 다른 암모늄 또는 알킬암모늄이다. 알킬기는 염이 수용성이도록 크기 및 갯수가 선택된다. 일반적으로, 알킬암모늄 이온의 알킬기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 알칼암모늄 이온의 알킬기는 모두 동일할 수도 있고 또는 상이할 수도 있다. 따라서, 알칼암모늄 이온의 특정 추가적인 예는 테트라에틸암모늄, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 디메틸에틸암모늄, n-프로필암모늄을 포함한다. 페리시아나이드 염의 이온은 모두 동일할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모두 동일(all the same)"은 절대 제한(absolute limitation)라기 보다는 실제적 제한을 지칭하고, 비용-허용가능한 정제 기술에 의하여 제거하는 것은 비현실적인(impratical) 다른 상대이온의 불순물 양을 배제하지 않는다. 페리시아나이드 이온이 모두 동일하지 않은 혼합된 이온 종은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
용해도의 결정은 페리시아나이드 염의 양이온의 변화에 대한 시약 설계를 가이드하도록 작용하여, 열역학이 통상의 포타슘 페리시아나이드와 비교하여 시약 건조 동안 페리시아나이드의 더 이른 결정화를 돕는다. 광범위한 제제 실험을 수행하기 보다, 그러한 염은 물에서의 페리시아나이드 염의 용해도를 측정하고, 그것을 포타슘 페리시아나이드에 대한 것과 비교하는 것에 의해, 또는 Messinger 등의 A Dictionary of Chemical Solubility(Bound 1941, GoogleBooks로부터 온라인 이용가능)로부터 이용가능한 것과 같은 자료 값(book value)을 이용하는 것에 의하여 용이하게 확인될 수 있다. 다양한 방법에 의해 이를 하는 것이 가능하지만, 효과적인 방법은 두 개의 포화 용액, 포타슘 페리시아나이드를 갖는 하나 및 포타슘 이온에 대한 관심있는 이온의 치환에서만 상이한 다른 유사 용액의 흡수 스펙트럼(absorbance spectrum)을 비교하는 것이다. 420 nm에서의 흡수 피크는 페리시아나이드 이온의 특성이고, 페로시아나이드에 대한 보정(correction)이 320 nm에서 흡수 강도를 이용하여 적용될 수 있더라도 페로시아나이드로부터의 간섭(interference)으로부터 실질적으로 자유롭다. 대안적으로, 출발 시료(starting sample)에서 페리시아나이드 대 페로시아나이드의 비율은, Eo eff가 알려지고 용액의 전극 전위가 측정된다면, Nernst 식으로부터 결정될 수 있다. 전극 전위를 결정하는 방법은 출발 물질(starting material)에서의 대부분의 불확실성을 제거하고, Eo eff의 추정치(100 mM), [페리] + [페로] = 100 mM 즉, 농축액(concentrated solution)에서 실험 데이터로부터 결정된 Nernst 식에 따른 효과적인 전극 전위를 생성하는, 실시예 4 및 5에 나타난다.
시약에서, 포타슘 페리시아나이드보다 더 낮은 용해도 및/또는 더 낮은 Eo eff (100 mM)를 갖는 페리시아나이드 염을 이용하는 것은 기준선에서 향상된 안정성을 얻는 방법이다. 그러나, 이는 여전히 더 향상될 수 있다. 기술의 핵심은 시약이 건조하고 더 높은 용해도를 갖는 다른 페리시아나이드 염의 잔류물을 남기지 않을 때, 페리시아나이드가 결정화하는 것을 보장하는 것이다. 원하지 않은 염은 두 가지 방법 중 하나로 배제될 수 있다.
첫째, 시약의 다른 구성 성분이 원하지 않는 페리시아나이드 염을 형성할 수 있는 양이온을 함유한다면, 대안(alternative)은 원하는 페리시아나이드 염에서 오직 선택한 양이온만을 함유하는 것으로 찾아져야만 한다. 다른 이온은 자주 예를 들어, 시약 pH의 제어를 하기 위하여 포함되는 완충제 염에서 발견된다. 루비듐 페리시아나이드 제제에서 아세테이트 완충제의 경우에, 예를 들어, 완충제 스톡(stock) 용액은 단지 아세트산(acetic acid)을 이용하고 소듐 또는 포타슘 아세테이트를 갖는 아세트산을 이용하지 않고 제조되어야만 한다. 그 후 pH는 루비듐 히드록사이드를 갖는 아세트산을 적정하는 것에 의해 원하는 수준까지 이끌어지고, 따라서 제제에서 사용될 수 있는 소듐 또는 포타슘 이온이 없는 아세테이트 완충제의 스톡 용액을 형성한다. 원하지 않는 양이온을 배제하는 다른 제조 방법은 통상의 기술자에게 친숙할 것이고 본 발명의 범위에 속한다. 원하지 않는 양이온을 배제하는 것에 의하여, 결정화할 수 있는 페리시아나이드 염만이 원하는 염일 것이고 따라서 바람직하고, 안정한 상태(phase)가 얻어질 것이다.
둘째, 일부 경우에, 상당한 양의 원하지 않는 페리시아나이드 염의 결정을 형성하지 않는 한, 원하지 않는 양이온이 존재하게 하는 것이 가능하다. 이는 상이한 상태(phase)의 용해도 및 양이온의 일부 선택이 이에 도움이 될 수 있기 때문에 이러한 것이 달성될 수 있다. 예를 들어, 테트라메틸암모늄 페리시아나이드는 약 0.158 M의 농도까지 실온에서 용해될 수 있으나, 포타슘 페리시아나이드는 실온에서 1.11 M까지 용해될 수 있다. 따라서, 페리시아나이드 결정 핵(crystal nuclei)을 시딩(seed)하는 첫 번째 상태(phase)는 테트라메틸암모늄 페리시아나이드가 될 것이고, 이는 그 후 신속한 증발 조건 하에서 선호되는 결정상이 될 것이다. 그러나, 이는 원하지 않는 이온의 배제보다 덜 효과적인 방법이고, 원하지 않는 이온이 낮은 농도로 존재할 경우, 일반적으로 신뢰할 수 있을 것이다.
본 발명의 건조 시약은 선택적으로 페리시아나이드 염이 아닌 전자 전달 매개체를 더 포함할 수 있다. 이러한 전자 전달 매개체는 효소의 비활성 환원형(inactive reduced form)을 산화시켜 활성 레독스 효소를 재생시키기에 충분한 수성 매질에서 전기화학적 포텐셜을 갖는다. 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된, US 5,378,628, US 5,393,903, US 5,437,999, US 5,410, 059, US 5,589,326, US 5,846,702, US 6,605,201, US 6,676,816, US 7,074,308 및 US 7,090,756에 기재된, 이러한 목적에 적합한 많은 화합물이 당업계에 알려져 있다. 특정 구현예에서, 전자 전달 매개체는 Os(dmbpy)2PicCl 또는 Os(dmbpy)2Im2Cl과 같은 오스뮴 배위결합 복합체(coordination complex)이다. 이러한 매개체는 양이온성 상대 이온을 갖지 않는다. 그러나, 만일 매개체가 양이온성 상대 이온을 갖는다면, 이러한 상대 이온이 페리시아나이드 염의 양으로 하전된 상대 이온과 적어도 대부분이 동일한 것이 바람직하다.
도 2A-2C는 TMA 페리 및 전자 전달 매개체를 모두 함유한 건조 시약이 글루코스를 측정하는데 사용될 때, 발생할 수 있는 일련의 반응을 도시한다. 도 2A에서, 매개체 커플 및 페리시아나이드 염 모두(TMA 페리로 예시됨)는 전극(10) 및 전극(11) 사이에서 적용된 포텐셜에서 산화되고 환원될 수 있다. 따라서, 양 구성 성분은 확산 공정(diffusion process)(14 및 23)를 통하여 주요 전류 소스(primary current source)로서 기능한다. 도 2B에서, 매개체의 환원 반응(21)은 전극(10)에서 발생하지만, 매개체의 역 산화(reverse oxidation)는 전극(11)에서 발생하지 않는다. 따라서, 전극 간 확산에 기인한 대부분의 전류(14)는 페리시아나이드 염의 산화 및 환원을 통하여 생성된다. 도 2C에서, 매개체는 페리시아나이드 염과의 레독스 반응(24)에 의하여 재생된다. 전류는 전체적으로 전극에서 페리시아나이드 염의 산화 및 환원의 결과이다.
매개체 및 TMA 페리 간의 전자 전달 중간체(intermediate)로서 작용하는 촉매와 같은, 다른 전자 전달 반응물(reactant)이 또한 본 발명의 시약에 포함될 수 있다(미국 특허공개공보 제20070295616호의 도 8 참조). 그러나, 일반적으로 건조 시약에서 그러한 물질의 수를 증가시키는 것은 건조 시약의 안정성에 부정적 영향을 갖는다는 것이 본 발명자들에 의하여 관찰되었다.
본 발명의 건조 시약(전자 전달 매개체가 있거나 또는 없음)은 또한 효소 반응의 활성을 최적화하는 선택적 완충제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 완충제는 양으로 하전된 완충제 상대 이온 및 완충제 짝염기를 포함하는 양쪽성 이온(zwitterions) 완충제이다. 적절한 짝염기의 구체적인 예는 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산(TAPSO)의 짝염기, 피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판설폰산)(POPSO)의 짝염기, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄 설폰산(HEPES)의 짝염기 및 N-트리스(히드록시-메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산 (TES)의 짝염기이다. 특정 구현예에서, 양으로 하전된 완충제 상대 이온은 페리시아나이드 염과 동일한 상대 이온을 포함하거나, 주로 페리시아나이드 염의 상대 이온과 동일하거나, 또는 필수적으로 모든 양으로 하전된 완충제 상대 이온이 페리시아나이드 염과 동일한 상대 이온을 갖는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 건조 시약 조성물은 다음을 포함한다:
(DR1) (a) 특이적 기질로서의 분석물을 산화시켜 효소의 비활성 환원형을 생성하는 활성 레독스 효소; 및
(b) 페리시아나이드 염으로서, 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 페리시아나이드 염이 물에서 용해가능하고, 페리시아나이드 염 또는 페리시아나이드 염의 결정상이 물에서 용해성을 갖고 및/또는 포타슘 페리시아나이드보다 100 mM의 농도에서 더 낮은 E0 eff를 갖도록 선택되는 것인 페리시아나이드 염.
(DR2) 단락 (DR1)의 건조 시약, 여기서 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 알킬암모늄 이온을 포함한다.
(DR3) 단락 (DR2)의 건조 시약, 여기서 알킬암모늄 이온의 알킬기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다.
(DR4) 단락 (DR3)의 건조 시약, 여기서 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 테트라메틸암모늄을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 페리시아나이드 염으로 도입된 양으로 하전된 상대 이온 모두는 테트라메틸암모늄 이온이다.
(DR5) 단락 (DR1)의 건조 시약, 여기서 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 루비듐 이온을 포함한다.
(DR6) 단락 (DR1) 내지 (DR5) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 페리시아나이드 염의 양으로 하전된 상대 이온은 모두 동일하다.
(DR7) 단락 (DR1) 내지 (DR6) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 시약은 페리시아나이드 염이 아닌 전자 전달 매개체를 더 포함하고, 상기 전자 전달 매개체는 활성 레독스 효소를 재생하는 효소의 비활성 환원형을 산화시키는데 충분한 수성 매질에서 전기화학적 포텐셜을 갖는다.
(DR8) 단락 (DR7)의 건조 시약, 여기서 전자 전달 매개체는 오스뮴 배위결합 복합체이다.
(DR9) 단락 (DR8)의 건조 시약, 여기서 오스뮴 배위결합 복합체는 Os(dmbpy)2 PicCl이다.
(DR10) 단락 (DR8)의 건조 시약, 여기서 오스뮴 배위결합 복합체는 Os(dmbpy)2 Im2Cl이다.
(DR11) 전자 전달 매개체의 환원형을 더 포함하는, 단락 (DR7) 내지 (DR10) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 전자 전달 매개체의 산화형에 대한 상기 전자 전달 매개체의 환원형의 양은 시약 용액이 전자 전달 매개체의 환원형의 부존재 하에서 에이징된 건조 시약의 용액에 의하여 생성되는 정상 상태(steady-state) 기준선 신호와 비교될 수 있는 기준선을 갖도록 하는 것이다.
(DR12) 페로시아나이드 염을 더 포함하는, 단락 (DR1) 내지 (DR11) 중 어느 하나의 건조 시약, 상기 페로시아나이드 염은 페로시아나이드 및 페리시아나이드 염과 동일한 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 여기서 페리시아나이드에 관한 페로시아나이드의 양은 건조된 시약의 용액이 페리시아나이드 및 건조된 시약의 효소 구성 성분만을 함유하는 에이징된 건조 시약의 용액에 의하여 생성되는 정상 상태 기준선 신호와 비교될 수 있는 기준선을 갖도록 하는 것이다.
(DR13) 염 형태의 하나 이상의 추가적인 화합물을 더 포함하는, 단락 (DR1) 내지 (DR12) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 추가적인 화합물에 존재하는 양이온은 필수적으로 페리시아나이드 염의 양이온과 동일하다.
(DR14) 양으로 하전된 완충제 상대 이온 및 완충제 짝염기를 포함하는 양쪽성 이온 완충제를 더 포함하는, 단락 (DR1) 내지 (DR13) 중 어느 하나의 건조 시약.
(DR15) 단락 (DR14)의 건조 시약, 여기서 완충제 짝염기는 3-[N-트리스 (히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산이다.
(DR16) 단락 (DR14)의 건조 시약, 여기서 완충제 짝염기는 N-트리스(히드록시-메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산의 짝염기이다.
(DR17) 단락 (DR14) 내지 (DR16) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 양으로 하전된 완충제 상대 이온은 페리시아나이드 염과 동일한 상대 이온을 포함한다.
(DR18) 단락 (DR14) 내지 (DR16) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 필수적으로 양으로 하전된 완충제 상대 이온 모두는 페리시아나이드 염의 상대 이온과 동일하다.
(DR19) 아민 및 설포네이트를 포함하는 친수성 헤드 기(head group) 및 10 내지 16개의 탄소 원자의 소수성 지방성 꼬리를 포함하는 양쪽성 이온성 습윤제를 더 포함하는, 단락 (DR1) 내지 (DR18) 중 어느 하나의 건조 시약.
(DR20) 단락(DR19)의 건조 시약, 여기서 양쪽성 이온성 습윤제의 소수성 꼬리는 12개의 탄소 원자 꼬리이다.
(DR21) 단락 (DR1) 내지 (DR20) 중 어느 하나의 건조 시약, 여기서 효소는 글루코스 산화효소이다.
액체 조성물
상기 기재된 건조 시약은 본 발명에 따른 액체 조성물을 형성하는 수성 액체와 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 수성 액체는 분석물, 예를 들어, 혈액, 간질액(interstitial fluid), 소변 또는 침과 같은 체액(body fluid)에 대하여 시험되는 시료이다. 건조 시약은 수성 액체에 실질적으로 용매화되고(solvate) 분산되어(disperse), 도 1 및 2A-2c에 기술된 바와 같은 전자 전달 반응이 발생할 수 있다.
액체 조성물이 형성되거나 분석물의 측정을 위한 시험 스트립의 시료 셀을 도입할 때, 수성 액체의 효소의 농도는 바람직하게는 18 mg/ml 이상 및 더 바람직하게는 27 mg/ml 이상이다.
시약이 Os(dmbpy)2 PicCl을 함유하고, 액체 조성물이 형성되거나 분석물의 측정을 위한 시험 스트립의 시료 셀로 도입될 때, Os(dmbpy)2 PicCl는 0.5 내지 2.0 mg/ml 및 더 바람직하게는 0.8 내지 1.0 mg/ml의 농도에서 적절하게 존재한다.
완충제가 시약에 존재할 때, 완충제는 적절하게 22 mM를 초과하여 pH 6.8까지 완충제 능력(buffer capacity)을 제공하기에 충분한 액체 조성물에서의 농도를 갖는다. 완충제는 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산 (TAPSO)의 짝염기를 포함할 때, 완충제의 농도는 적절하게 50 내지 200 mM이다. 적절하게, 완충제는 대부분의 효소와 양립가능한 pH 7 내지 8의 범위의 액체 조성물의 pH를 유지한다.
본 발명에 따른 액체 조성물은 또한 시험 스트립의 제조 동안 사용될 수 있다. 시약을 함유한 액체 조성물은 전극으로 또는 시료 챔버로 배치되고 건조되게 한다. 액체 조성물 내의 시약의 농도는 시료 부피(sample volume)가 시험 스트립에 첨가될 때, 효소, 페리시아나이드 염 및 전자 전달 매개체(존재한다면)의 작동 수준을 달성할 시약의 양을 전달(deliver)하기에 충분하다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물의 액체는 다음을 포함한다:
(LC1) 단락 (DR1) 내지 (DR21) 중 어느 하나의 시약 및 수성 액체 캐리어, 예를 들어, 혈액, 간질액, 소변 또는 침.
(LC2) 단락 (LC1)의 액체 조성물, 여기서 수성 액체 캐리어 내의 효소의 농도는 27 mg/ml 이상이다.
(LC3) 단락 (LC1) 또는 (LC2)의 액체 조성물, 여기서 시약은 0.8 내지 1.0 mg/ml의 농도에서 Os(dmbpy)2 PicCl을 함유한다.
(LC4) 단락 (LC1) 내지 (LC3) 중 어느 하나의 액체 조성물, 여기서 완충제는 시약에 존재하고, 22 mM를 초과하여 pH 6.8에서 완충 능력을 제공하기에 충분한 액체 조성물의 농도를 갖는다.
(LC5) 단락(LC4)의 액체 조성물, 여기서 완충제는 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산의 짝염기를 포함하고, 완충제의 농도는 50 내지 200 mM이다.
(LC6) 단락 (LC1) 내지 (LC5) 중 어느 하나의 액체 조성물, 여기서 완충제는 pH 7 내지 8, 바람직하게는 7.6 내지 7.8의 범위의 조성물의 pH를 유지한다.
시험 스트립
본 발명은 또한 상기에서 논의된 바와 같이 건조 시약을 포함하는 시험 스트립을 제공한다. 도 3에 묘사된 바와 같이, 시험 스트립은 다음을 포함한다:
(a) 스트립 구조(strip construction)(32)의 한 부분에 제1 전극(31) 및 스트립 구조의 두 번째 부분에 제2 전극(33);
(b) 스트립(38)을 조립하는 것에 의해 형성되는 액체 시료를 수용하기 위한 시료 셀(35)로서, 여기서 시료 셀(35) 내에 배치된 액체 시료는 제1 및 제2 전극(31, 33)과 접촉하는 것인 시료 셀; 및
(c) 조립 전에 노출된 전극(31) 상에 배치된 건조 시약 및
(d) 전기적 접촉이 전극(31 및 33)에 형성되도록 하는 노출된 표면(exposed surface)(36).
건조 시약은 시험 스트립에 액체 시료의 적용 시, 건조 시약이 시료 셀 내에서 시료에서 용해하도록 배치된다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 시험 스트립에서 보여지고 통상적인 바와 같이, 건조 시약은 액체 시료의 적용에 앞서 시료 셀 내에 배치될 수 있다.
제1 및 제2 전극은 적절한 전도(conduction)를 갖는 불활성 물질(inert material), 즉 탄소 또는 금, 팔라듐 또는 백금과 같은 금속으로부터 적절하게 제조된다. 탄소 전극을 갖는 일부 구현예에서, 탄소는 스크린 인쇄 가능한(screen-printable) 잉크의 형태로 제조된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 전극 중 적어도 하나는 팔라듐을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 전극 및 제2 전극 모두는 팔라듐을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 전극 및 제2 전극의 적어도 하나 또는 제1 전극 및 제2 전극 모두는 금을 포함한다. 전극은 동일하거나 상이한 크기일 수 있고, 동일하거나 상이한 물질로부터 제조될 수 있다.
전극은 도 3에 도시된 바와 같이 페이싱 배열(facing configuration)에 있을 수 있으나, 또한 동일평면(coplanar) 배열에 있을 수도 있다. 페이싱 배열에 있을 때, 건조 시약은 본 명세서에 원용에 의해 포함된, US-2005-0258036 A1에 기재된 바와 같이, 하나의 전극 상에 적절하게 배치되고 U-형태(U-shaped) 배열에서 셀의 벽을 따라 위로 연장할 수 있다.
시험을 수행하기 위해 요구되는 시료의 양을 최소화하기 위하여, 시료 셀은 바람직하게는 매우 소량, 예를 들어 1㎕, 바람직하게는 500 nl 미만, 더 바람직하게는 300 nl 미만의 부피를 가질 수 있다. 그러한 시료 부피는 알려져 있고, 시험 참가자에 대한 고통을 최소하하는 것이 가능한 정도까지 시료 부피를 감소시킨다는 잘 이해된 목표와 일치하는, 통상적인 상업적으로 이용가능한 시험 스트립에 사용된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 시험 스트립은 하기를 포함한다:
(TS1) (a) 제1 및 제2 비-반응성 전극;
(b) 액체 시료를 수용하기 위한 시료 셀로서, 시료 셀 내에 배치된 액체 시료는 제1 및 제2 전극과 접촉하는 것인 시료 셀; 및
(c) 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 따른 건조 시약으로서, 상기 건조 시약은 액체 시료의 시험 스트립에 적용 시, 건조 시약이 시료 셀 내에서 시료에 용해되도록 배치되는 것인 건조 시약.
(TS2) 단락 (TS1)의 시험 스트립, 여기서 건조 시약은 액체 시료의 적용 전에 시료 셀 내에 배치된다.
(TS3) 단락 (TS1) 또는 (TS2)의 시험 스트립, 여기서 제1 및 제2 전극은 금속 전극이다.
(TS4) 단락 (TS1) 내지 (TS3) 중 어느 하나의 시험 스트립, 여기서 제1 및 제2 전극의 적어도 하나는 팔라듐을 포함한다.
(TS5) 단락 (TS4)의 시험 스트립, 여기서 제1 및 제2 전극 모두는 팔라듐을 포함한다.
(TS6) 단락 (TS1) 내지 (TS3) 중 어느 하나의 시험 스트립, 여기서 제1 및 제2 전극의 적어도 하나는 금을 포함한다.
(TS7) 단락 (TS6)의 시험 스트립, 여기서 제1 및 제2 전극 모두는 금을 포함한다.
분석물에 대한 시험을 위한 방법
본 발명의 추가적 양태는 액체 시료의 분석물에 대한 시험을 하기 위한 방법이다. 그 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상기에서 기술된 바와 같은 건조 시약을 포함하는 시험 스트립에 액체 시료를 적용하는 단계; 여기서 건조된 시약의 효소는 분석물에 특이적인 것으로 선택되는 것인 단계;
(b) 외부 신호를 시험 스트립에 적용하여 시료의 분석물 양을 나타내는 신호를 생성하는 단계.
본 발명의 특정 구현예에서, 액체 시료는 혈액이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 분석물은 글루코스이고 효소는 글루코스 산화효소이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 외부 신호는 시험 스트립의 제1 및 제2 전극 사이에 적용된 포텐셜이고, 전류는 시료의 분석물 양을 나타내는 신호로서 측정된다. 이러한 유형의 측정을 하는 방법은 당업계, 예를 들어 상기 표시된 특허 및 논문으로부터 알려져 있고, 전류 측정법(amperometric measurement)으로 지칭될 수 있다. 클로메트리(Coulometry)는 기간(period of time)에 통과되는 총 전하(전류 신호의 적분(integral))가 측정되는 전류법(amperometry)에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 적용되는 신호는 전류이고, 측정되는 것은 포텐셜이다. (본 명세서에 원용에 의해 포함된 미국 특허 제5,413,690호 및 미국 특허공개공보 제2010/0025265호 참조)
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은:
(MT1) 하기 단계를 포함하는 액체 시료의 분석물에 대해 시험하기 위한 방법:
(a) 단락 (TS1) 내지 (TS7) 중 어느 하나에 따른 시험 스트립에 액체 시료를 적용하는 단계; 건조된 시약의 효소는 분석물에 특이적인 것으로 선택되는 것인 단계; 및
(b) 시험 스트립에 외부 신호를 적용하여 시료의 분석물의 양을 나타내는 신호를 재생하는 단계.
(MT2) 단락 (MT1)의 방법, 여기서 외부 신호는 시험 스트립의 제1 및 제2 전극 간 적용되는 포텐셜이고, 전류는 시료의 분석물 양을 나타내는 신호로서 측정된다.
(MT3) 단락 (MT1) 또는 (MT2)의 방법, 여기서 액체 시료는 혈액이다.
(MT4) 단락 (M1) 내지 (M3) 중 어느 하나의 방법, 여기서 분석물은 글루코스이고 효소는 글루코스 산화효소이다.
저장 안정성 시약을 형성하기 위한 방법
추가 양태에서, 본 발명은 글루코스와 같은 분석물에 대한 시험에 사용하기 위한 저장-안정성 시약을 형성하기 위한 방법을 제공한다. 이는 시약과 반응하는 금 전극에 대한 포텐셜 때문에 시약이 금 전극을 갖는 시험 스트립에 저장된 경우 특히 관련된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이러한 양태는 다음을 포함한다:
(SS1) 하기 단계를 포함하는 분석물의 검출에 사용하기 위한 저장 안정성 전기화학적 시험 시약을 형성하기 위한 방법:
(a) 특이적 기질로서 분석물을 산화/환원시키는 산화환원 효소를 선택하는 단계;
(b) 페리시아나이드 염을 선택하는 단계로서, 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 선택된 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 페리시아나이드 염이 물에서 용해가능하고, 페리시아나이드 염 또는 페리시아나이드 염의 결정상이 물에서 용해성을 갖고 및/또는 포타슘 페리시아나이드보다 100 mM의 농도에서 더 낮은 E0 eff를 갖도록 선택되는 것인 단계; 및
(c) 선택된 효소 및 선택된 페리시아나이드 염을 조합하여 분석물의 검출에 사용하기 위한 저장 안정성 전기화학적 시험 시약을 형성하는 단계.
(SS2) 단락 (SS1)의 방법, 여기서 선택된 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 알킬암모늄 이온을 포함한다.
(SS3) 단락 (SS2)의 방법, 여기서 알킬암모늄 이온의 알킬기는 1 내지 3 개의 탄소 원자를 함유한다.
(SS4) 단락 (SS3)의 방법, 여기서 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 테트라메틸암모늄 이온을 포함한다.
(SS5) 단락 (SS3)의 방법, 여기서 페리시아나이드 염은 양으로 하전된 상대 이온으로서 루비듐을 포함한다.
(SS6) 단락 (SS1) 내지 (SS5) 중 어느 하나의 방법, 여기서 선택된 페리시아나이드 염의 양으로 하전된 상대 이온은 모두 동일하다.
(SS7) 단락 (SS1) 내지 (SS6) 중 어느 하나의 방법, 여기서 시약은 페리시아나이드 염이 아닌 전자 전달 매개체를 선택하는 단계를 더 포함하고, 상기 전자 전달 매개체는 효소의 비활성 환원형(reduced form)을 환원/산화시켜 활성 레독스 효소를 재생하기에 충분한 수성 매질 내의 전기화학적 포텐셜을 갖고, 시약 내 선택된 전자 전달 매개체를 포함한다.
(SS8) 시약 내에 전자 전달 매개체의 환원형을 포함하는 단계를 더 포함하는, 단락 (SS7)의 방법, 여기서 전자 전달 매개체의 산화형(oxdized form)에 대한 전자 전달 매개체의 상기 환원형의 양은 시약의 용액이 전자 전달 매개체의 환원형의 부존재 하에서 에이징된 건조 시약의 용액에 의하여 생성된 정상 상태 기준선 신호와 비교할 수 있는 기준선을 갖도록 하는 것이다.
(SS9) 단락 (SS7) 또는 (SS8)의 방법, 여기서 전자 전달 매개체는 오스뮴 배위결합 복합체이다.
(SS10) 단락 (SS9)의 방법, 여기서 오스뮴 배위결합 복합체는 Os(dmbpy)2 PicCl이다.
(SS11) 단락 (SS9)의 방법, 여기서 오스뮴 배위결합 복합체는 Os(dmbpy)2 Im2Cl이다.
(SS12) 건조 시약에 페로시아나이드 염을 포함하는 단계를 더 포함하는, 단락 (SS1) 내지 (SS11) 중 어느 하나의 방법, 상기 페로시아나이드 염은 페로시아나이드 및 페리시아나이드 염과 동일한 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 여기서 페리시아나이드에 대한 페로시아나이드의 양은 건조된 시약의 용액이 단지 페리시아나이드 및 건조된 시약의 효소 구성 성분을 함유한 에이징된 건조 시약의 용액에 의하여 생성되는 정상 상태 기준선 신호와 비교할 수 있는 기준선을 갖도록 하는 것이다.
(SS13) 양으로 하전된 완충제 상대 이온 및 시약에 대한 완충제 짝염기를 포함한, 양쪽성 이온 완충제를 첨가하는 단계를 더 포함하는, 단락 (SS1) 내지 (SS12) 중 어느 하나의 방법.
(SS14) 단락 (SS13)의 방법, 여기서 완충제 짝염기는 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산의 짝염기이다.
(SS15) 단락 (SS13)의 방법, 여기서 짝염기는 N-트리스(히드록시-메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산의 짝염기이다.
(SS16) 단락 (SS13) 내지 (SS15) 중 어느 하나의 방법, 여기서 양으로 하전된 완충제 상대 이온은 선택된 페리시아나이드 염과 동일한 상대이온을 포함한다.
(SS17) 단락 (SS13) 내지 (SS15) 중 어느 하나의 방법, 여기서 양으로 하전된 완충제 상대 이온은 선택된 페리시아나이드 염과 동일한 상대 이온으로 필수적으로 구성된다.
(SS18) 아민 및 설포네이트(sulphonate)를 포함하는 친수성 헤드기 및 10 내지 16개의 탄소 원자의 소수성 지방성 꼬리(hydrophobic aliphatic tail)를 시약에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 단락 (SS1) 내지 (SS17) 중 어느 하나의 방법.
(SS19) 단락 (SS18)의 방법, 여기서 양쪽성 이온성 습윤제의 소수성 꼬리는 12개의 탄소 원자 꼬리이다.
(SS20) 단락 (SS1) 내지 (SS19) 중 어느 하나의 방법, 여기서 효소는 글루코스 산화효소이다.
본 발명의 완충제 조성물
본 발명의 추가 양태에서, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산 및 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산의 짝염기의 테트라메틸암모늄 염으로부터 형성된 완충제를 포함한 완충 용액(buffer solution)이 제공된다.
본 발명의 효과
페리시아나이드 (일반적으로 포타슘 페리시아나이드)는 잘 알려져 있고, 특히 글루코스의 측정을 위한, 다양한 상업적 시험 스트립에서 계속 이용되는 상대적으로 저렴한 전자 전달 매개체이다. 그러나, 상기에서 언급한 바와 같이, 포타슘 페리시아나이드는 문제점을 갖는다. 본 발명은 이러한 문제점을 극복하고, 따라서 이러한 능력을 갖는 페리시아나이드의 계속된 사용을 가능하게 한다.
도 4는 다시 다양한 기간의 가속화됨 후에 글루코스 산화효소, 포타슘 페리시아나이드 및 Os(dmbpy)2 PicCl(실시예11 참조)을 함유하는 건조 시약을 이용하여 제조된 시험 스트립에 대한 글루코스 농도의 함수로서 측정된 전류를 도시한다. 도시된 바와 같이, 주어진 농도에서 측정된 전류는 실질적으로 에이징 시간과 함께 증가한다. 도 5는 포타슘 페리시아나이드 대신 TMA 페리를 함유한 시험 스트립에서의 동일한 실험 결과를 도시한다. 에이징 시간에 관계없이 측정된 전류의 양에 변화가 없다.
임의의 특정 메카니즘에 의하여 얽매이려는 의도 없이, 전류의 이러한 변화는 에이징 과정 중에 페리시아나이드 부분의 페로시아나이드로의 전환에 기인하는 것으로 생각된다. 이는 시료에서 글루코스의 부존재 하에서조차 발생하는 전극 간 기준선 전류를 야기한다. 도 6은 다양한 염에 대한 이러한 기준선 전류의 관계를 도시한다. TMA 페리는 시험된 염 중 명백히 가장 우수한 것이다. 그러나, 또한 기준선 전류의 증가가 포타슘 염보다 더 낮은 수준까지 고르게 되는 경향이 있기 때문에, 루비듐 페리시아나이드가 탁월하고, 이는 에이징에 기인한 변화에 대하여 보상하는 것이 더 용이하게 만든다. 50℃에서 에이징 14일 후 기준선 및 염의 포화 용해도 간의 상관관계가 도 7에 도시된다. 또한, 임의의 특정 메카니즘에 얽매이려는 의도없이, 이러한 결과는 젖은 시약(wet reagent)의 최종 부분(final part)이 건조될 때 시약에서 유리상(glassy phase)이 형성되는 것을 도시하는 것으로 믿어지고; 이러한 유리상에 갇힌 페리시아나이드의 양이 페리시아나이드 염의 용해도에 의존하고, 페리:페로의 제한 비율(limiting ratio)이 도달될 때까지, 이러한 페리시아나이드의 세트 부분이 페로시아나이드로 전환하여 기준선 신호를 준다.
스트립 저장 수명의 과정에 걸쳐 변화하는 기준선 신호는 스트립 수행에서의 에러의 큰 소스이다. 이러한 에러는 스트립에 대한 더 열악한 수행 내성(performance tolerance) 또는 제품의 더 짧은 저장 수명을 특정하는 것에 의해 관리될 수 있다. 따라서 가장 높은 기준선에 대한 하한을 갖는 것 뿐만 아니라 스트립 저장 수명의 과정에 걸쳐 기준선의 작은 변화를 갖는 것만으로부터 이익이 있다. 도 4, 5 및 6의 것과 같은 에이징 실험으로부터, 기준선 상승의 한계를 설립하는 것이 가능하고, 이는 50℃에서 14일에 의해 일반적으로 안정화된다. 따라서 스트립을 제조하기 전에 젖은 시약으로 페로시아나이드를 도입하는 것은 장점이어서, 갓 제조된 스트립의 기준선은 이미 스트립 수명(strip life)의 출발시에 이러한 수준에 있을 것이다. 대안적으로, 상이한 환원제(reducing agent)가 인시튜(in situ) 페로시아나이드를 생성하는 용액에 첨가될 수 있다. 만일 이러한 환원제가 이미 확인된 시약의 구성 성분의 다른 것이라면, 이는 불순물의 도입을 방지하기 때문에, 이는 장점이다. 만일, 그 구성 성분이 효소에 대한 전자 전달 매개체, 예를 들어, Os(dmbpy)2 PicCl이라면, 이러한 유형의 화합물의 환원형이 다루기에 제조적으로(preparatively) 훨씬 용이하기 때문에(그러한 복합체의 환원형은 종종 더 낮은 용해도를 가져서, 더 용이하게 분리되고, 이들의 전자 배열 때문에, 이들의 순도는 n.m.r.의 표준 분석 기술에 의해 수립될 수 있는 반면, 산화형은 그럴 수 없다), 특히 유용하다. 동일한 시약이 PbO2와 먼저 산화되어 기준선 전류를 더 낮게 하는 스트립과 비교하여, 환원된 매개체가 시약에서 사용되는 스트립을 비교하는 것에 의하여 기준선의 안정성이 조사될 수 있다. 이는 실시예 15에 기재되고, 그 효과는 도 8에 도시되고, 이는 시약의 환원된 구성 성분의 존재가 센서로부터 더 안정한 기준선 전류를 제공한다는 것을 보여준다.
또한, 본 발명의 시약은 시험 스트립 에이지(age)로서 효소 활성의 더 낮은 손실을 경험한다. 이는 수행의 높은 수준을 유지할 수 있으면서, 각 시험 스트립의 더 적은 효소의 사용을 가능하게 한다.
도 1은 충분한 포텐셜이 전극에 적용될 때, 본 발명의 제1 구현예에 따른 건조 시약을 함유한 시험 스트립에서 발생하는 일련의 반응을 도시한다.
도 2A, 2B 및 2C는 본 발명의 제2 구현예에 따른 건조 시약을 함유한 시험 스트립에서 충분한 포텐셜이 전극에 적용될 때 발생할 수 있는 대안적인 일련의 반응을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 시험 스트립을 도시한다.
도 4는 글루코스 산화효소, 포타슘 페리시아나이드 및 Os(dmbpy)2 PicCl을 함유한 건조 시약을 이용하여 제조된 시험 스트립에 대한 글루코스 농도의 함수(function)로서 측정된 전류를 도시한다. 에이징 조건(aging condition)은 스트립이 50℃에서 건조기 바이알(desiccator vial)에 있는 것이었고; 에이징 시간(aging time)은 도면에 표시된 바와 같다.
도 5는 글루코스 산화효소, TMA 페리(ferri) 및 Os(dmbpy)2 PicCl을 함유한 건조 시약을 이용하여 제조된 시험 스트립에 대한 글루코스 농도의 함수로서 측정된 전류를 도시한다. 에이징은 도 4와 같다.
도 6은 에이징 시간의 함수로서 페리시아나이드의 상이한 염에 대한 기준선(baseline) 전류(시험 액체에 글루코스가 없음)의 변화를 도시한다.
도 7은 스트립 내의 시약의 페리시아나이드 염의 포화 용해도를 갖는 건조기 바이알에서 50℃에 놓인 스트립으로부터 기준선 전류 간의 상관관계(correlation)를 도시한다.
도 8은 건조기 바이알에서 50℃에 놓인 스트립에 대하여 에이징 시간을 갖는 기준선 전류의 발전(evolution)을 도시한다. 시약은 실시예 15에 기재된 바와 같다.
도 9는 페리 대 페로의 농도 비율의 로그에 대한 ORP 전극에 의해 측정된 바와 같은 화학적 포텐셜의 플롯(plot)을 도시한다.
도 10은 페리시아나이드 농도의 함수로서 포타슘 페리시아나이드의 420 nm에서의 흡광 강도(absorbance intensity)를 도시한다.
도 11은 모두 희석된 800:1의 다양한 포화 페리시아나이드 용액에 대한 UV/Vis 스펙트라의 예를 도시한다.
도 12는 건조 시약을 함유하는 TMA 페리에서 효소 안정성에 대한 다양한 완충제 유형의 효과를 도시한다.
도 13은 기준선 전류에 대한 다양한 완충제 유형의 효과를 도시한다.
도 14는 안정한 분석을 위하여 요구되는 활성 효소의 최소량을 나타낸다.
도 15는 가속화된 에이징 동안 본 발명에 따른 시약을 함유한 시험 스트립에서 효소 활성의 안정성을 나타낸다.
도 16 및 17은 바람직한 역치(threshold) 초과의 효소의 양으로 제조된 시험 스트립에서 슬로프(slope) 및 기준선의 안정성 및 일관성(consistency)을 도시한다.
실시예 1 테트라메틸암모늄 페리시아나이드의 합성
Dowex 50WX2-200(H) 이온 교환 수지(ion exchange resin)가 DI 물에 첨가되고 진탕(shaken)하여 슬러리(slurry)를 형성한다. 이러한 슬러리를 유리 다공성 프릿(glass porous frit) 및 PTFE 스톱콕(stopcock)을 갖는 유리 칼럼(glass column)에 부었다. 또한 칼럼을 UV 필터링 플라스틱(UV filtering plastic)으로 둘러쌌다. 더 많은 슬러리를 첨가하고, 수지의 깊이가 58 ml의 칼럼 부피가 되도록 안정될 때까지 액체가 사용되었다(run out). 칼럼을 DI 물로 세정(rinse)하고; 초기에 용리액(eluent)은 오렌지 색이었으나, 용리액이 맑아질 때까지 세정을 계속하였다. 20 ml의 1M HCl을 첨가하고 칼럼을 통과시키고: 이는 칼럼 부피가 45 ml까지 줄어들게 하였다. 용리액의 pH가 ~ pH6(pH 종이로 측정)가 될 때까지 산을 칼럼에서 세정하고, 이때까지 칼럼 부피를 또한 수지의 팽윤(swelling)에 의해 58 ml까지 복원시켰다. 25개의 수집 포트(collection pot)를 조립하고, >10 ml 부피를 갖는 각각은 물 중 테트라메틸암모늄 히드록사이드의 25 wt% 용액의 400 ul으로 충전하였다. 8 ml의 1M 포타슘 페리시아나이드를 칼럼에 첨가하고; 8 ml 모두 칼럼으로 들어가는 때까지, 바닥 밖으로 나온 용리액은 황색기(yellow tinge)를 보였고, pH ~4였다. 용리액의 수집을 첫 번째 수집 포트에서 시작하고, 즉각적인 침전물(immediate precipitate)이 형성되었으나, 이는 포트의 내용물(content)이 산성이 될 때 용해하였다. 용리액 수집은 내용물이 산성이 되는 매순간 다음 포트로 바뀌고, 처음 8개의 포트 모두에 대해 내용물이 산성이 될 때 침전물이 용해되는 것으로 관찰되었다. 9번째부터 15번째 포트는 침전물의 완전한 용해(dissolution)없이 산성이 되고, 상청액(supernatant)은 녹색이고, 매우 농축되었다. 이러한 색은 16번째 포트에 대해 옅은 노랑(paler yellow)이었고, 17번째 포트까지 침전물이 형성되지 않았고, 용리액은 점점더 옅어졌다. 수집은 이러한 시점에 중지하였고, 모든 포트의 산성화된 내용물을 혼합하고; 그 뒤 물 중 더 많은 25 wt% 용액의 테트라메틸암모늄 히드록사이드로 중성화하고, 중성화에 요구되는 히드록사이드의 총 부피는 8.6 ml로 계산되었다(17개의 수집 포트의 내용물을 포함). 이는 2.15 g의 테트라메틸암모늄 히드록사이드, 즉 23.58 mmole과 같고, 이는 본래의(original) 포타슘 페리시아나이드 용액으로부터 이온 교환된 포타슘 24 mmole과 잘 비교된다. 중성화된, 황색 용액의 테트라메틸암모늄 페리시아나이드는 얼음 수조(ice bath)에서 냉각하고, 흡입 여과(suction filtration)에 의해 분리되고 진공 건조기(vacuum desiccator)에서 건조되어 2.517 g, 이수소화물(dihydride)에 기반하여 67%를 생성하는, 결정이 플레이크(flake)로서 성장하였다. 더 높은 수율은 염-얼음 수조에서 냉각하는 것에 의해 얻어질 수 있다(2시간 후 > 80%).
실시예 2 루비듐 페리시아나이드의 합성
이온-교환 칼럼은 3 내지 10 ml의 부피를 갖는 실시예 1 및 20의 수집 포트가 제조되는 바와 같이 제조되고, 각각은 물 중 50 wt% 용액의 루비듐 히드록사이드 200 ul로 채워진다. 10 ml의 포타슘 페리시아나이드를 첨가하고 칼럼에 흘렸다. 용리액의 수집을 UV-흡수제(UV-absorbent) 커버와 맞는 형광 빛(fluorescent light) 하에서 수행하였다. 용리액 수집은 첫번째 포트로 시작하고 pH 종이로 모니터링하여, 내용물이 산성이 되는 매순간 다음 포트로 바꾸었다. 포트 용액은 내용물이 급격히 산성이 되고, 그 경우 녹색이 될 때를 제외하고는, 맑고 황색이었다. 이러한 황색 컬러는 18번째 포트에 대하여 옅은 황색이고, 19번째 포트까지 용리액은 점점더 옅어졌다. 수집은 이러한 시점에 중단되고 모든 포트의 산성화된 내용물을 조합하고; 물 중 더 많은 50 wt% 용액의 루비듐 히드록사이드로 중성화되고, 중성화에 요구되는 히드록사이드의 총 부피는 3.4 ml로 계산되었다(17 수집 포트의 내용물을 포함). 이는 28.87 mmole의 루비듐 히드록사이드와 같고, 이는 본래의 포타슘 페리시아나이드 용액으로부터 이온 교환된 30 mmole의 포타슘과 잘 비교된다. 중성화된, 황색 용액의 루비듐 페리시아나이드는 거의 끓는 용액이 결정 형성의 첫번째 증거(약 12 ml에서)를 보여줄 때까지 핫 플레이트(hot plate) 상에서 온건하게 가열하는 것에 의해 농축되고, 농축된 용액을 냉각시키는 것은 오렌지 페리시아나이드 결정이 천천히 형성되게 한다. 결정은 흡입 여과에 의하여 분리되고 진공 건조기에서 건조된다. 루비듐 페리시아나이드의 수율은 468.39g/mol에서 루비듐 페리시아나이드의 MWt에 기반하여, 대략 3.66g, 78%이다.
실시예 3 루비듐 페로시아나이드의 합성
실시예 2로부터의 여과액(filtrate)을 에탄올과 혼합하여 50:50 수성 에탄올 용액을 생성하고, 이는 옅은 황색의 즉각적인 침전물(immediate precipitate)을 생성하였다. 이러한 용액을 가열하여 끓이고, 천천히 알코올이 증류하게(distil off) 하는 것은 천천히 밤새 냉각하여 옅은 황색 결정을 생성하게 하는 맑은 용액을 생성한다. 결정을 흡입 여과로 분리하고 진공 건조기에서 건조하여, 1.05 g의 루비듐 페로시아나이드 삼수화물(trihydrate), 607.87 g/mol의 rmm에 기반하여 1.72 mmoles 및 추가 17.2%의 회수된(recovered) 초기 페리시아나이드를 생성한다.
실시예 4 포타슘 페리시아나이드의 효과적인 전극 전위를 측정
포타슘 페리시아나이드 (10ml 중 0.3293g, 100 mM, 'A'로 표시) 및 포타슘 페로시아나이드 (10 ml 중 0.4224g의 삼수화물, 100 mM, 'B'로 표시)의 원액(stock solution)을 제조하였다. 4ml의 원액 A를 덜어내고(measure out), 용액의 화학적 포텐셜을 ORP 전극을 이용하여 측정하였다. 원액 B의 하기 분취액(aliquot)을 첨가한 후에 추가 ORP 측정을 하였다: 40 ul, 46 ul (즉 총 86 ul), 100 ul (총 186 ul), 214 ul (총 400 ul), 460 ul (총 860 ul), 1000 ul, (총 1860 ul), 2140 ul (총 4000 ul). 유사하게, 4ml의 원액 B를 덜어내고, 용액의 화학적 포텐셜을 ORP 전극을 이용하여 측정하였다. 원액 A의 하기 분취액을 첨가한 후에 추가 ORP 측정을 하였다: 40 ul, 46 ul (즉 총 86 ul), 100 ul (총 186 ul), 214 ul (총 400 ul), 460 ul (총 860 ul), 1000 ul, (총 1860 ul), 2140 ul (총 4000 ul). 각 용액의 A 및 B의 총 부피의 데이터 및 각각의 ORP 판독(reading)을 Nernst 식에 맞추기 위해 스프레드 시트(spread sheet)에 기재하였다. 원액의 농도는 순수할 것으로 추정되지 않고: 원액 A는 페리시아나이드의 알려지지 않은 농도 'a' mM을 갖는 것으로 추정되고 따라서 100-a mM의 페로시아나이드 및 a = 99.9 mM의 초기 값이 스프레드 시트에 설정되었다. 유사하게, 원액 B는 페로시아나이드의 알려지지 않는 농도 'b' mM을 갖는 것으로 추정되고 따라서 b= 99.9 mM의 초기 값을 갖는 100-b mM의 페로시아나이드가 스프레드 시트에 설정된다. 그 후, 페리시아나이드 및 페로시아나이드의 농도를 각 혼합물에 대해 계산하고, ORP 판독 vs log([페리]/[페로])의 그래프를 나타내었다(plot). 'a' 및 'b'의 값은 그래프가 선형이 될 때까지 변화했고, 혼합물의 슬로프(slope)는 농도 비율에서 변화 10 당(decade of change) 59.4 mV에 가까웠다. log([페리]/[페로]) = 0을 가진 ORP 축의 인터셉트(intercept)를 결정하고, 이는 Nernst 식에 따른 Eo(100 mM), 표준 전극 전위의 척도이지만, [페리] + [페로] = 100 mM에서 측정하였다. 결과를 도 9에 도시한다.
실시예 5 테트라메틸암모늄 페리시아나이드의 효과적인 전극 전위 측정
테트라메틸암모늄 페리시아나이드 (10ml 중 0.470g의 이수화물, 100 mM, 'A'로 표시됨) 및 테트라메틸암모늄 페로시아나이드 (5 ml 중 0.4964g, 100 mM, 'B'로 표시됨)의 원액을 제조하였다. 원액의 화학적 포텐셜을 측정하였다. 원액의 하기 혼합물의 ORP 판독을 또한 측정하였다: {0.3 ml A + 2.7 ml B}, {0.15 ml A + 2.85 ml B}, {0.3 ml A + 2.7 ml B}, {0.75 ml A + 2.25 ml B}, {1.5 ml A + 1.5 ml B}, {2.25 ml A + 0.75 ml B}, {0.3 ml A + 2.7 ml B}. 각 용액의 A 및 B의 총 부피의 데이터 및 각각의 ORP 판독을 실시예 4에 기재된 바와 같은 Nernst 식에 맞도록 스프레드 시트에 기입하고, 그 결과를 도 9에 도시한다.
실시예 6 포타슘 페리시아나이드의 흡수를 보정( calibrating )
용량 플라스크(volumetric flask)의 5 mL 부피까지 되도록, 물에 1.6463 g의 포타슘 페리시아나이드를 용해하는 것에 의하여 1 M 포타슘 페리시아나이드의 원액을 제조하였다. 이러한 용액의 1 mL을 100 mL 용량 플라스크에 넣고, 물로 100 mL 부피까지 만드는 것에 의해 10 mM로 희석하였다. 이러한 10 mM 용액의 희석을 큐벳(cuvette)에서 제조하여 0.025 내지 4.5 mM 농도 범위를 커버하고, 용액이 제조되자 마자 희석의 UV/Vis 스펙트럼을 기록하였다. 물 시료의 흡광도(absorbance)를 감산(subtract)하여, 기준선 흡광도에 대해 정정(correct)하였다. 420 nm에서 피크의 흡광 강도를 기준선-감산된 스펙트럼으로부터 측정하고, 큐벳 용액의 농도에 대해 플롯으로 나타내었다. 도 10에 도시된 바와 같이 흡광도의 선형 범위 및 이러한 선형 범위 내의 데이터로부터 페리시아나이드 몰 당 흡광도를 결정하기 위해 그래프를 조사하였다.
실시예 7 테트라메틸암모늄 페리시아나이드의 포화 농도 측정
테트라메틸암모늄 페리시아나이드 결정의 시료를 알루미늄 호일(foil)의 시트 상에 배치하고 호일을 시료를 커버하도록 접었다. 이를 절구(mortar)에 조심스럽게 놓고, 결정을 절구공이(pestle)로 태핑(tapping)하는 것에 의하여 분쇄(crush)하였다. 호일 및 분쇄된 결정을 절구공이에서 꺼내서 분쇄된 결정을 에펜도르프(eppendorf) 튜브에 부었다. 소량의 물을 첨가하고 용액을 진탕하여 가능한 많은 고체를 용해하고, 그 후 적어도 한 시간 동안 평형하도록 두었다. 일부 고체가 여전히 남아있는지 확인하도록 검사하고, 10 uL의 용액을 피펫(pipette)으로 추출하고, 큐벳에서 990 uL의 물로 혼합하였다. 큐벳을 UV/Vis 분광기(spectrometer)에 배치하고 흡광 스펙트럼을 200 내지 600 nm에서 기록하였다. 420 nm에서 흡광도를 실시예 6의 보정(calibration)과 조합하여 이용하여 포화 농도를 결정하고: TMA 페리 흡광도는 420 nm에서 1.5317이고 보정 슬로프는 [페리시아나이드] = 1.03 x 흡광도이고, 100:1 희석에 대하여 [페리시아나이드] = 1.58 mM 및 TMA 페리의 포화 농도에 대하여 0.158 M를 보였다. 이러한 방법에 의하여 측정된 다양한 포화 용액에 대한 예시적 스펙트럼을 도 11에 도시한다.
실시예 8 TAPSO 완충제 , pH 7.5의 TMA 염의 합성
5.18g의 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산 (TAPSO)을 100 ml 비커(beaker)에서 계량하고 30 ml의 물을 첨가하여 고체를 용해하였다. 충분한 25 wt% 테트라메틸암모늄 히드록사이드를 첨가하여 pH를 7.5까지 만들고, 비커의 내용물을 50 ml 용량 플라스크에 부었다. 비커를 세정하여 모든 TAPSO가 용량 플라스크에 전달되었는지 확실하게 하고 용액의 부피를 더 많은 물로 50 ml까지 만들었다.
TMA-TAPSO 완충제는 본 발명의 추가 양태를 나타낸다.
실시예 9 시험 스트립에 대한 시약을 위한 제제 방법
3.66 ml의 DI 물을 20 ml 비커로 덜어 내고, 1.25 mL의 TAPSO 완충제 pH 7.5(실시예 8의 방법에 따라 선택한 양이온을 이용하여 이러한 pH로 적정함)를 첨가하고, 이어서 비스-4,4-디메틸 비피리딜오스뮴(II)피콜리네이트 클로라이드의 Zwittergent 312. 5 mg의 5% 용액 90 uL를 첨가하고, 5 밀리몰의 원하는 페리시아나이드 염을 계량하고 용액에 첨가하고 5분간 교반하였다. 135 mg의 글루코스 산화효소(glucose oxidase) (Aspergillus niger, BBI Enzymes 공급, Catalogue No. GO3A)를 계량하고, 천천히 교반된 용액에 조심스럽게 첨가하고, 추가 5분간 온화하게 교반하게 두었다. 용액을 나사형 상부 뚜껑(screw-top lid)을 갖는 불투명(opaque) 블랙 플라스틱 시료 튜브로 5 um 필터를 통해 여과하였다. pH를 체크하고 지나치게 알칼리성인 것으로 발견되면 소량의 1 M HCl을 이용하여 pH 7.5까지 산성화하였다.
실시예 10 시험 스트립 구성( construction )
시료 챔버가 접착형 간극제(adhesive spacer) 0.085 mm 두께에 의해 서로 마주보도록 놓여 전도 셀 (conduction cell)을 형성하는 두 개의 팔라듐 전극, 1.5 x 2.0 mm으로부터 형성된 일회용 시험 스트립으로 글루코스 센서를 제조하였다. 시료 챔버는 255 nl의 공칭 부피(nominal volume)를 갖는다. 구성하는 동안 실시예 9로부터 300 nl의 시약 용액을 시료 챔버에 도입하고 건조하였다.
실시예 11 시험 스트립을 이용한 분석물 측정
포스페이트-완충된 염수(phosphate-buffered saline solution) 중 상이한 농도의 글루코스 용액을 실시예 10의 시험 스트립에 도입하였다. 300 mV의 포텐셜을 전극에 적용하였다. 포텐셜의 적용은 전극 간 시료의 도입에 의해 촉발되었다. 포텐셜을 적용한 후 5초에 발생하는 안정한 정상 상태 전류를 측정하였다.
시험 스트립을 건조기에서 50℃에서 14일까지의 시간 동안 시험 스트립을 가속화된 에이징 조건에 두었다. 도 4는 다시 가속화된 다양한 기간 후에 글루코스 산화효소, 포타슘 페리시아나이드 및 Os(dmbpy)2 PicCl을 함유한 건조 시약을 이용하여 제조된 시험 스트립에 대한 글루코스 농도의 함수로서 측정된 전류를 도시한다. 도 5는 포타슘 페리시아나이드 대신 TMA 페리를 함유하는 시험 스트립에서의 동일한 실험 결과를 도시한다.
실시예 12 시험 스트립을 이용하여 기준선 측정
두 개 이온의 상호 전환(inter-conversion)이 시료의 초기 분석물의 부존재 하에서조차 발생할 수 있기 때문에, 페리시아나이드의 페로시아나이드로의 전환은 기준선 상승을 야기할 수 있다. 제제의 기준선 상승에 대한 감수성(susceptibility)은 종종 경미하다. 그러나, 2년 이상의 저장 수명과 함께, 상승하는 기준선에 대한 경미한 경사도(inclination) 조차 센서 수명(sensor lifetime) 과정에 걸쳐 센서 성능(performance)의 극적인 이동을 야기할 수 있다. 기준선 상승에 대한 제제의 감수성을 평가할 수 있기 위하여, 따라서, 기준선 상승 속도를 가속화하는 방법을 갖는 것이 중요하다. 그러한 가속화된 에이징(aging)은 종종 상승된-온도 환경에 저장된 센서를 배치하는 것에 의하여 얻어진다.
에이징에 대한 스트립 기준선의 변화는 실시예 9에서와 같은 양이온의 범위로 제조된 시약으로 만들어진 센서로부터 수집된 데이터를 나타내는 도 6에 도시된다. 이러한 제제에서 발견된 0일 내지 14일 사이의 기준선의 변화가 페리시아나이드 염의 용해도의 함수로서 도 7에 도시된다. 도 7에 나타난 바와 같이, 포타슘 염보다 더 낮은 용해도를 갖는 모든 염은 향상된 기준선을 갖는 반면, 더 높은 용해도를 갖는 염은 저조한(worse) 기준선 안정성을 갖는다. 이는 제제 내의 낮은 기준선 상승을 주기 위하여 적절한 페리시아나이드를 선택하는 수단 및 그러한 제제가 갖는 기준선에 대한 영향을 보여주는 수단으로서 용해도의 활용을 나타낸다.
실시예 13 시약 안정성에 대한 완충제의 효과
효소 불안정성을 제한하는 친수성 환경을 제공하는 단순한 유기 화합물을 확인하기 위한 연구가 행해졌고, 포타슘 페리시아나이드의 존재 하에 글루코스 산화효소를 안정화하기 위하여, 본 발명자들에 의하여 알라닌 무수물(alanine anhydride)이 특히 적절한 것으로 발견되었다. 그러나, 테트라메틸암모늄 페리시아나이드에 대한 변화에서, 이는 검토되어야만 했다. TMA+ 이온은 K+ 보다 덜 이온성 환경을 제공하고, 단순한 친수성 안정화제(stabilizer)는 전보다 덜한 안정성을 제공한다는 것이 본 발명자들에 의하여 발견되었다. 안정성은 시약의 이온성 성질(inonic nature)을 증가시키는 것에 의하여 향상될 수 있으나, 알칼리 금속(alkaline metal) 양이온 회피 필요성이 선택을 제한한다. 일련의 양쪽성 이온은 효과적인 것으로 입증되는데, 아마 이들이 추가 자유 양이온(free cation)을 도입하지 않고 시약의 이온성 성질을 증가시키기 때문이다.
본 발명자들은 pH 7 내지 8의 우수한 완충 능력을 갖고 자연에서 양쪽성 이온성인 시약에서 완충제의 존재가 전체적인 시약 안정성에 도움이 될 것으로 판단하였다. 이러한 두 가지 특성은 Good 등(N.E. Good, G.D. Winget, W. Winter, T.N. Connolly, S. Izawa, 및 R.M.M. Singh, Biochemistry, 1966, 5, 467-477)에 의한 생화학적 반응을 안정화시키기 위하여 먼저 확인된 완충제의 범위를 형성한다. 건조된 시약에서 효소 안정화제로서 이들의 가치를 입증하는 두 개의 "우수한 완충제(Goods buffers)"는 TAPSO 및 TES이다.
건조 시약에서 효소 안정성을 유지하는데 있어 TMA-TAPSO 및 TMA-TES의 유효성(effectiveness)을 시험하기 위하여, 일련의 시약 제제가 표 3에 기술된 바와 같이 27 mg/ml 글루코스 산화효소, 1 mg/ml Os(dmbpy)2 PicCl, 100 mM TMA페리, 2.6 mg/ml Surfactant 10G 및 완충제/안정화제로 제조되었다. 스트립은 실시예 10의 것과 유사하나, 금 전극을 채용한 각각의 제제로 제조되었고, 이들은 50℃에서 40일까지 에이징되었다.
효소 활성의 손실이 보정 커브(calibration curve)(신호 대 글루코스 농도)의 슬로프에서의 변화를 야기하기 때문에, 스트립은 에이징 과정을 통하여 주기적으로 제거되었고, 보정 커브를 생성하는데 사용되었다. 에이징의 결과로서 보정 곡선의 슬로프의 변화가 측정되었다. 표 3은 에이징 14일에 슬로프 변화의 양에 대한 수치 값을 포함한다. 도 12는 그래프 포맷에서의 슬로프를 도시하고, 도 13은 인터셉트(intercept)를 도시한다. TMA-TAPSO은 TMA-TES보다 월등하고, 모두 비교 안정화제보다 훨씬 월등하다.
실시예 14 최소 효소 양
두 개의 기본 제제 (base formulation)를 하기와 같이 제조하였다: (1) 100mM KFerri, 100mM 포타슘 포스페이트 pH 6.2, 1 mg/ml OzPic, 2.6 mg/ml Surfactant 10G, 50mM 알라닌 무수물, 1 wt% 실리카 분산액(silica dispersion); (2) 100mM TMAFerri, 100mM TAPSO pH 7.5, 1 mg/ml OzPic, 0.9 mg/ml Zwittergent 312. 다양한 양의 글루코스 산화효소를 각 기본 제제에 첨가하고, 최종 제제를 실시예 10의 것과 유사하지만, 금 전극을 사용한 시험 스트립으로 도입하였다. 글루코스를 함유한 시료를 시험 스트립에서 평가하였다. 도 14는 글루코스 산화효소 농도에 대한 전류 대 글루코스 농도의 전류 슬로프(본질적으로 보정 커브)의 의존성을 도시한다.
이러한 두 개의 제제는 매우 상이하지만, 약 18mg/ml GOx에 의해 슬로프에서 플래토(plateau)에 도달하는 동일한 일반적인 형태를 도시한다. 따라서, 이는 안정한 성능을 위하여 요구되는 활성 효소의 최소량이고, 초과는 스트립 수명의 과정에 걸쳐 상실된 활성에 대한 보상으로 첨가되어야만 한다.
단일 스트립의 활성 효소의 양은 측정하기에 어려운 것이지만, 효소 활성의 상대적 측정으로서 효소에 의하여 생성되는 산의 속도를 자동적정기(autotitrator)를 이용하여 모니터링하는 것이 가능하다. 50℃에서 건조기 바이알에 놓인 스트립에 대하여 효소 활성의 이러한 측정이 시간에 따라 어떻게 변화하는지의 그래프가 도 15에 도시된다. 스트립의 시약은 100mM TMAferri, 1mg/ml OzPic, 27mg/ml GOx 100mM TAPSO pH 7.5 및 2.6mg/ml Surfactant 10G을 함유하였다.
시험 조건에 대한 감수성은 판독에 대한 불확실성의 정도를 제공하지만, 효소 활성의 손실이 저장 기간에 걸쳐 극단적으로 제한될 가능성이 있다. 50℃에서 56일의 도 16에서 조사된 기간은 11개의 요소를 이용하여 30℃의 전형적인 높은 저장 온도에서 등가 시간(equivalent time)과 동일시될 수 있고, 이는 이러한 가속화된 에이징 기간이 효소 활성의 유의한 소실없이 1년 8개월에 걸친 실제 저장 수명과 동일하다는 것을 의미한다. 그러나, 실제 저장 수명을 추정하는 데 있어 적절한 고려는 불확성으로 이루어져야만 한다.
따라서, 저장에 대한(on the shelf) 에이징 및 시험 스트립에 실제 분배된(dispensed) 효소의 양의 제조 변이의 결과로서 25%까지의 효소 손실을 설명하기 위하여, 효소가 시료 챔버의 최대 부피에 용해될 경우, 최소 27 mg/ml의 초기 농도를 야기하는 충분한 효소를 갖는 시험 스트립을 구성하는 것이 바람직하다.
이러한 최소한도(minimum) 위의 제제에 대하여, 도 16 및 17에서 도시된 바와 같이, 에이징에 대한 슬로프 또는 인터셉트에서의 발전(evolution)이 없고, 이러한 최소한도 위의 효소 농도에 대한 모든 슬로프 및 기준선은 겹치고, 이는 초과 효소가 적어도 여기서 조사된 농도에서는, 스트립 성능을 변형시키지 않는다는 것을 의미한다.
실시예 15 건조 시약의 기준선에 대한 젖은 시약에서의 산화 정도의 효과
한 뱃치(batch)의 스트립을 실시예 9 중 하나와 같은 시약을 이용하여 실시예 10에서와 같이 제조하였고, 시약은 1 mg/mL의 매개체 비스-4,4-디메틸비피리딜- 오스뮴(II)피콜리네이트 클로라이드를 함유하고; ORP 전극에 의하여 측정된 용액 포텐셜은 308 mV vs Ag/AgCl이었다. 세 개의 다른 뱃치의 스트립을 제조하고, 먼저 동일한 시약의 부분을 이용하지만, 전극 전위가 384 mV까지 상승할 때까지 그것을 PbO2과 함께 교반하는 것에 의하여 산화시켰다. 단지 0.7 mg/mL의 매개체를 함유하고, 그 용액의 포텐셜이 314 mV vs Ag/AgCl이라는 점을 제외하고, 첫 번째와 유사한 두 번째 시약을 제조하였고, 전극 전위가 390 mV까지 상승할 때까지 이러한 부분을 PbO2 로 산화시켰고; 두 개의 남은 뱃치의 스트립은 이러한 두 개의 시약을 사용하였다. 스트립을 50℃에서 건조기 바이알에서 에이징시켰고, 기준선 신호의 과정에 이어서 주기적 시험(periodic testing)(0일, 28일 및 56일)이 있었고; 결과를 도 8에 도시한다.
분석물 효소
글루코스 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소(dehydrogenase)
우레아(urea) (BUN) 우레아제(urease)
크레아티닌(creatinine) 크레아티나제(creatinase)
요산 우리카제(uricase)
콜레스테롤 콜레스테롤 산화효소
젖산/피루브산 젖산 탈수소효소 (LDH)
존재하는 양이온 0.1 M [페리] + [페로]에서 E0 eff vs Ag/AgCl 실온에서의 용해도
소듐 238 1.31 M
포타슘 228 1.09 M
루비듐 248 1.05 M
세슘 255 1.40 M
TMA 191 0.170 M
제제 명칭 완충제/안정화제 시약 pH 50℃에서 14일에 걸친 슬로프의 드롭(drop) (uA/mM 글루코스)
알라닌 무수물 pH 7.0 50 mM 알라닌 무수물 7.0 0.83
Xylitol pH 7.0 50 mM Xylitol 7.0 0.86
TAPSO pH 6.5 100 mM TAPSO 6.5 0.26
TAPSO pH 7.0 100 mM TAPSO 7.0 0.00
TAPSO pH 7.5 100 mM TAPSO 7.5 0.30
TES pH 6.5 100 mM TES 6.5 0.25
TES pH 7.0 100 mM TES 7.0 0.21

Claims (59)

  1. (a) 활성 레독스 효소의 비활성 환원형을 생성하기 위해 특이적 기질로서 분석물을 산화시키는 활성 레독스 효소; 및
    (b) 테트라메틸암모늄 페리시아나이드를 포함하는,
    전기화학 센서를 이용하여 시료 중 분석물을 결정하기 위한 건조 시약 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시약은 페리시아나이드 염이 아닌 전자 전달 매개체를 더 포함하고, 상기 전자 전달 매개체는 상기 효소의 비활성 환원형을 산화시켜 활성 레독스 효소를 재생하기에 충분한 수성 매질에서의 전기화학적 포텐셜을 갖는 것인 건조 시약 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 전자 전달 매개체는 오스뮴 배위결합 복합체인 것인 건조 시약 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 양으로 하전된 완충제 상대 이온 및 완충제 짝염기를 포함하는 양쪽성 이온 완충제를 더 포함하고, 상기 완충제 짝염기는 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산 또는 N-트리스(히드록시-메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산의 짝염기인 것인 건조 시약 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 아민 및 설포네이트를 포함하는 친수성 헤드 기(head group) 및 10 내지 16개의 탄소 원자의 소수성 지방성 꼬리를 포함하는 양쪽성 이온성 습윤제(zwitterionic wetting agent)를 더 포함하는 것인 건조 시약 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 있어서, 상기 효소는 글루코스 산화효소인 것인 건조 시약 조성물.
  7. (a) 제1 및 제2 비-반응성 전극;
    (b) 액체 시료를 수용하기 위한 시료 셀로서, 상기 시료 셀 내에 배치된 액체 시료는 상기 제1 및 제2 전극과 접촉하는 것인 시료 셀; 및
    (c) 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 따른 건조 시약으로서, 상기 건조 시약은 액체 시료의 시험 스트립에의 적용시 상기 건조 시약이 상기 시료 셀 내에서 상기 시료에 용해되도록 배치되고, 상기 건조 시약은 액체 시료의 적용에 앞서 상기 시료 셀 내에 배치되는 것인 건조 시약을 포함하는 시험 스트립.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 효소는 글루코스 산화효소인 것인 시험 스트립.
  9. (a) 청구항 7에 따른 시험 스트립에 액체 시료를 적용하는 단계로서, 상기 건조된 시약의 효소는 상기 분석물에 대하여 특이적인 것으로 선택되는 것인 단계;
    (b) 외부 신호를 상기 시험 스트립에 적용하여 상기 시료 내의 분석물 양을 나타내는 신호를 생성하는 것인 단계를 포함하는 액체 시료 내의 분석물에 대하여 시험하기 위한 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 효소는 글루코스 산화효소인 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 외부 신호는 상기 시험 스트립의 제1 및 제2 전극 간에 적용되는 포텐셜이고, 전류는 상기 시료 내의 분석물 양을 나타내는 신호로서 측정되는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 테트라메틸암모늄 페리시아나이드가 트리스(tris)-테트라메틸암모늄 페리시아나이드인 것인 건조 시약 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 건조 시약 조성물 내 모든 양이온이 테트라메틸암모늄 양이온인 것인 건조 시약 조성물.
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