KR101223854B1 - 분석물 특이성이 개선된 바이오센서 - Google Patents

분석물 특이성이 개선된 바이오센서 Download PDF

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Abstract

생물학적 유체 중 분석물의 농도를 측정하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 알킬페나진 4차염 및 니트로소아닐린을 포함한다. 화학 매트릭스를 전기화학 바이오센서와 사용하여, 반응이 바이오센서 내에서 일어난 후 분석물의 농도를 측정하고, 이때 농도를 측정하기 위한 분석이 완료된다. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 알킬페나진 4차염 및 니트로소아닐린의 화학 매트릭스를 사용하는 분석물의 농도 측정 방법은 기재되어 있는 또다른 양태이다. 상기 방법은 또한 추가로 5 초 이하의 시험 시간을 특징으로 한다. 신규 화학 매트릭스를 사용하는 방법은 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 약 20 내지 600 ㎎/㎗ 의 농도에서 혈액 글루코스와 같은 분석물을 용이하게 측정할 수 있다.

Description

분석물 특이성이 개선된 바이오센서 {BIOSENSOR WITH IMPROVED ANALYTE SPECIFICITY}
본 발명은 일반적으로 생물학적 유체 중 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하기 위한 화학 매트릭스 (chemistry matrix) 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적이지만 배타적이지 않게는, 본 발명은 방해 물질의 존재 하에 전기화학적 바이오센서로 분석물을 측정하는 경우에 분석물 특이성을 증가시키는 화학 매트릭스 및 방법에 관한 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "화학 매트릭스" 는 분석물과 반응할 수 있는 하나 이상의 화학 물질을 포함하는 물질 영역을 지칭한다.
물질의 농도를 특히 다른 혼란 물질의 존재 및 가변 조건 하에서 측정하는 것은 다수의 분야에서 중요하다. 예를 들어, 가변 조건 및 방해 물질의 존재 하에 혈액과 같은 체액 중 글루코스의 측정은 당뇨병의 유효한 치료에 결정적이다. 적절한 혈당치의 조절 실패는 실명 및 손발의 혈액 순환 감소를 비롯한 심한 합병증을 일으킬 수 있고, 이는 궁극적으로는 당뇨병 환자의 손가락, 손, 발 등을 사용하지 못하게 할 수 있다.
테스트 스트립은 종종 시험 샘플 중 선택된 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하는데 사용된다. 예를 들어, 다양한 테스트 스트립은 혈액 중 글루코스 농도를 측정하여 당뇨병을 지닌 인간의 혈당치를 모니터링하는데 사용된다. 이러한 테스트 스트립은 시약 조성물이 침전된 반응 챔버를 포함한다. 테스트 스트립의 최근 경향은 더욱 적은 시험 샘플 및 더욱 신속한 시험 분석 시간을 필요로 한다. 더욱 적은 시험 샘플을 사용하는 경우 환자에게 중요한 이점을 제공하고, 이러한 시험 샘플은 팔뚝과 같은 신체의 덜 민감한 부분으로부터 얻을 수 있다. 추가로, 더욱 신속하고 더욱 정확한 시험 시간으로 편리성이 더해지고, 환자의 혈당치를 더욱 양호하게 조절한다.
예를 들어, 혈액 샘플 중 글루코스와 같은 분석물의 농도를 측정하는 몇몇 방법이 알려져 있다. 이러한 방법은 전형적으로 두 카테고리: 광학 방법 및 전기화학 방법 중 하나로 나뉜다. 광학 방법은 일반적으로 시약에서 스펙트럼 시프트를 관찰하기 위한 반사율 또는 흡광도 분광분석을 포함한다. 이러한 시프트는 분석물의 농도를 지시하는 색변화를 일으키는 화학 반응에 의해 유발된다. 전기화학 방법은 일반적으로 분석물의 농도를 지시하는 전류, 전기량, 전위차 및/또는 전도성 반응을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 Columbus 의 제 4,233,029 호; Pace 의 제 4,225,410 호; Columbus 의 제 4,323,536 호; Muggli 의 제 4,008,448 호; Lilja 등의 제 4,654,197 호; Szuminsky 등의 제 5,108,564 호; Nankai 등의 제 5,120,420 호; Szuminsky 등의 제 5,128,015 호; White 의 제 5,243,516 호; Diebold 등의 제 5,437,999 호; Pollmann 등의 제 5,288,636 호; Carter 등의 제 5,628,890 호; Hill 등의 제 5,682,884 호; Hill 등의 제 5,727,548 호; Crismore 등의 제 5,997,817 호; Fujiwara 등의 제 6,004,441 호; Priedel 등의 제 4,919,770 호; 및 Shieh 의 제 6,054,039 호를 참조하고, 이들은 그의 전문이 참고로서 본원에 포함된다. 전기화학 방법은 통상적으로 혈당 측정기 (그러나 항상은 아님) 를 사용하여 시약의 존재 하에 혈액 샘플의 전기화학 반응을 측정한다. 시약은 글루코스와 반응하여, 그외 혈액에 존재하지 않는 전하 담체를 생성한다. 따라서, 소정의 신호의 존재 하에 혈액의 전기화학 반응은 혈중 글루코스 농도에 주로 의존한다고 의도된다. 전기화학적 혈당 측정기에 사용되는 전형적인 시약은 미국 특허 제 5,997,817 호, 제 5,122,244 호 및 제 5,286,362 호에 개시되어 있고, 이들 특허는 그 전문이 참고로서 본원에 포함된다.
다수의 오차 근원은 체액에서 분석물 농도를 측정할 때 부정확한 결과를 생성할 수 있다. 때때로, 센서가 노출되는 곤란한 상황은 센서의 정확도를 악화시킨다. 가끔, 센서는 종종 센서가 저장 동안 오용되고, 과도한 열, 광 및/또는 수분과 같은 해로운 조건에 노출되는 경우를 나타내는 "스트립 부패" 또는 "바이알 오용" 으로 칭하는 유해한 상태를 경험할 수 있다. 과도한 열 및/또는 수분에 노출됨으로써, 효소 활성의 손실로 인해 반응 시간이 느려질 수 있다.
과거에는, 분석물이 측정되는 반응 시간이 매우 신속하고 특이적 활성이 높은 효소를 사용함으로써 이러한 문제를 방지하여 왔다. 이러한 특정 특징을 갖는 효소를 사용함으로써, 다양한 온도 및 헤마토크리트 수준과 같은 모든 시험 조건 하에서 높고 유사한 수준으로 완료되는 반응을 달성할 수 있다. 그러나, 실제적인 문제로서, 효소는 통상적으로는 센서의 성능을 상당히 손실시키지 않으면서 센서에 매우 충분한 양으로 혼입될 수 없다. 또한, 특이적 활성이 높은 효소는 항상 모든 분석물에 대해 바람직한 것은 아니다. 예를 들어, 글루코스 농도를 측정하는 이러한 시스템은 여전히 부정확한 측정값을 생성할 수 있는 말토오스, 갈락토오스, 자일로스 등과 같은 방해물의 영향을 받지 않아야 한다는 것을 다루는데 실패하였다.
예를 들어, 복막 투석 또는 IGG 요법을 받는 환자는 혈중 말토오스의 농도가 높을 수 있고, 이는 정확한 혈중 글루코스 측정값을 방해할 수 있다. 그러므로, 말토오스로부터의 방해는 중요한 문제일 수 있다. 실례로서, Abbott Laboratories' Freeystyle? 혈중 글루코스 모니터링 시스템은 시험 시간이 변하는 전기량 분석 기술과 함께 글루코스-염색-산화환원효소 (GlucDOR) 를 사용한다. 그러나, 이러한 시스템은 여전히 말토오스로부터의 방해로 인해 임상적으로 허용되지 않고, 실제적인 문제로서, 현재 실시되고 있는 전기량 분석의 사용은 다수의 중요한 단점을 가진다. 또한, 글루코스에 대한 특이성이 더욱 높은 신규 GlucDOR 효소를 클로닝하여 말토오스 방해 영향을 최소화시키는 것을 시도하여 왔다. 그러나, 이는 실현가능하게 해결되지 않았다.
또한 또다른 예에서, Abbott Laboratories' PCx/TrueMeasure™ 시스템은 말토오스 방해가 실질적으로 없는 시스템을 제공하기 위해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD)-의존 글루코스 탈수소효소 (GDH/NAD) 와 연결된 전류법을 사용한다. 그러나, 전류측정 시스템은 혈중 산소 농도 (pO2) 방해, 샘플이 취해진 곳을 비롯한 다양한 인자로 인해 글루코스 농도 측정값이 변하게 되는 영향 때문에 부정확한 측정값을 제공할 수 있다. 예를 들어, 혈중 산소 농도는 샘플이 모세혈관, 정맥 또는 동맥 혈액인지에 따라 실질적으로 변할 수 있다. 따라서, 산소 방해를 최소화시키기 위해, 이러한 시스템의 사용자는 샘플링 전에 혈액 샘플의 공급원 또는 특성을 명시해야 한다. 인식될 수 있는 바와 같이, 사용자에게 혈액 샘플에 대한 정보를 입력하는 것을 요구함으로써, 정보가 사용자에 의해 잘못 입력되는 경우 오류의 추가 근원을 제공한다.
효소 활성을 느리게하는 것 이외에, 바이알 오용은 또한 측정값을 취할 때, 종종 "블랭크 전류" 로 칭하는 백그라운드 전류를 증가시킬 수 있다. 백그라운드 또는 블랭크 전류에 대한 다양한 공급원이 존재한다. 예를 들어, 센서가 사용되기 전에, 효소에서 전극으로 전자를 수송하는데 사용되는 매개체가 산화 상태로 존재하는 것이 바람직하다. 시간이 흘러, 바이알 오용으로부터 열 및/또는 습기가 매개체를 환원시키는 경향이 있다. 매개체 일부가 센서 사용 전에 환원 상태인 경우, 매개체의 환원 형태를 산화시키는 작동 전극으로부터 전류 일부가 기인한다. 생성되는 백그라운드 또는 블랭크 전류는 매개체를 바이어스 (bias) 하는 경향이 있고, 이는 또한 부정확한 결과를 얻을 수 있다. 시약 중 다른 불순물은 또한 백그라운드 또는 블랭크 전류 문제를 증가시킬 수 있다.
블랭크 전류 문제를 설명하기 위해 "번-오프 (burn-off)" 접근을 사용하는 전류측정 센서가 제안되어 왔다. 이러한 접근에 있어서, 두 DC 신호가 센서에 적용된다. 첫번째 DC 신호 또는 번-오프 신호를 사용하여, 이후에 분석물을 분석하는데 사용되는 동일한 확산층에서 블랭크 전류의 원인이 되는 임의의 종을 소비 또는 산화시킨다. 이후, 두번째 신호 또는 분석 신호를 사용하여 분석물 농도를 분석한다. 번-오프 및 분석 신호 모두는 동일한 극성을 가진다. 상기 번-오프 기술이 블랭크 또는 백그라운드 전류의 영향을 감소시키지만, 측정될 분석물을 부분 산화 (또는 환원) 시키는 비용이 들고, 따라서 센서의 노이즈-대-신호 비율을 감소시킨다. 또한, 이러한 기술은 두서너 가지 예만 들면 느린/변하는 반응 속도를 갖는 효소 및 온도와 같은 인자에 의해 유발되는 반응 시간의 변화를 보상하는데 실패하였다. 또한, 이러한 센서에 사용되는 효소는 말토오스 방해를 허용하는 경향이 있다.
상기를 고려하여, 분석물 (예컨대, 글루코스) 을 측정하는데 사용되는 바이오센서가 분석물에 대한 특이성이 증가한 화학 매트릭스를 갖고, 말토오스와 같은 방해 물질 및 산소 농도의 변동으로부터 야기되는 방해를 최소화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 추가로, 광화학적으로 안정한 화학 매트릭스를 제공하는 것이 바람직하다.
본원에 개시되는 조성물, 방법 및 장치의 구현예는 산소 농도의 변동 및 관련된 물질 (예컨대, 말토오스) 로부터 기인하는 방해를 최소화시킬 수 있는 분석물 (예컨대, 글루코스) 에 대한 특이성이 증가된 화학 매트릭스를 포함한다. 대략적으로, 상기 화학 매트릭스는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 페나진 유도체 및 니트로소아닐린을 포함한다. 화학 매트릭스의 바람직한 구현예는 전형적으로는 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 안정하고, 광화학적으로 안정하다. 화학 매트릭스 또는 이의 성분은, 매트릭스 또는 이의 성분이 1 시간 이상 동안 일상적인 형광등에의 노출시 여전히 무색인 경우, 광화학적으로 안정하다고 고려된다.
본 발명의 제 1 양태는 분석물의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스 조성물을 제공한다. 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 안정한 상기 화학 매트릭스는 광화학적으로 안정하고, 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 알킬페나진 4차염 및 니트로소아닐린을 포함한다.
본 발명에 유용한 적합한 알킬페나진 4차염에는 하기 화학식 Ⅰa 로 표시되는 5-알킬 페나진이 포함되나 이에 제한되지 않는다:
Figure 112010068023903-pct00001
(식 중,
Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m 은 0 내지 약 6 의 범위의 정수이고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00002
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고, Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 및 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3, 또는
Figure 112010068023903-pct00003
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며; X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
본 발명의 제 2 양태는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린, 및 분석물의 농도를 측정하는데 유용한 광화학적으로 안정한 5-알킬-1-카르복시알콕시페나진을 포함하는, 분석물의 농도를 측정하는데 사용될 수 있는 화학 매트릭스 조성물을 제공한다. 카르복시알콕시페나진기의 "카르복시기" 에는 카르복실산, 이들의 염, 에스테르, 아미드, 니트릴 및 카르복실산의 알려져 있는 다른 유도체가 포함된다. 특히 적합한 5-알킬-1-카르복시알콕시페나진은 하기 화학식 Ⅱa 로 표시된다.
Figure 112010068023903-pct00004
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며, n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
본 발명의 제 3 양태는 분석물의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 추가의 화학 매트릭스 조성물을 제공한다. 이 화학 매트릭스는 하기를 포함한다:
(a) 글루코스 탈수소효소;
(b) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드;
(c) 하기 화학식을 갖는 페나진 에토설페이트:
Figure 112010068023903-pct00005
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NR2R3, -NH(CH2)mNH2, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이고, n 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며, m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임); 및
(d) 하기 화학식을 갖는 니트로소아닐린 유도체:
Figure 112010068023903-pct00006
(식 중, R10 은 3-OCH3 이고, R11 및 R12 = CH2CH2OH 임).
상기 화학 매트릭스에서, 화학식 Ⅰa 의 페나진은 또한 상기 화학식 Ⅱ 의 페나진 대신에 대체될 수 있다.
본 발명의 제 4 양태는 분석물의 농도를 측정하는데 유용한 화학 매트릭스 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함한다.
본 발명의 제 5 양태는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함하는 매트릭스와 분석물을 반응시켜 전기화학 반응을 일으킬 수 있는 전기활성제를 생성하고, 신호를 제공하여 전기화학 반응을 일으키고, 생성된 전기화학 반응을 측정하며, 측정된 전기화학 반응에 기초하여 액체 샘플 중 분석물 농도를 측정하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 분석물의 전기화학 분석 방법을 제공한다. 이 방법은 통상적으로는 상기 화학 매트릭스의 구현예를 포함하는 테스트 스트립을 갖는 바이오센서의 적용 영역에 샘플을 적용하고, 화학 매트릭스와 반응시켜 분석물을 수량화하는 것을 포함한다. 상기 방법은 약 20 ㎎/㎗ 내지 약 600 ㎎/㎗ 범위의 혈당치를 측정하는데 특히 효과적이고, 약 5 초 이하의 시험 시간을 제공할 수 있다. 시험 시간은 시험 샘플을 테스트 스트립에 적용할 때 (또는 시험 샘플의 적용을 실제적으로 검출할 때) 와 시험 결과가 수득되고 바이오센서와 사용하도록 설정된 모니터링 장치의 디스플레이에 표시될 때 사이의 시간을 나타낸다.
본 발명의 제 6 양태는 화학 매트릭스를 포함하는 테스트 스트립을 갖는 바이오센서의 적용 영역에 샘플을 적용하고, 화학 매트릭스와 반응시켜 분석물을 수량화하고, 상기 바이오센서와 사용하도록 설정된 모니터링 장치의 디스플레이에 상기 수량화된 결과를 표시하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 분석물의 전기화학 분석 방법을 제공하고, 상기 화학 매트릭스는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 하기 화학식을 갖는 5-알킬페나진 4차염을 포함한다:
Figure 112010068023903-pct00007
(식 중,
Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고, m 은 0 내지 약 6 의 범위의 임의의 정수일 수 있고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00008
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고, Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 및 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3 또는
Figure 112010068023903-pct00009
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이고; X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임). 다양한 니트로소아닐린이 상기 방법의 화학 매트릭스에 사용될 수 있으나, 구조 Ⅲ 으로 표시되는 니트로소아닐린이 특히 적합하다.
본 발명의 다수의 이점 및 추가적인 양태는 하기의 바람직한 구현예 및 도면의 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1 은 본 발명의 구현예에 사용되는 테스트 스트립의 첫번째 상면도이고, 테스트 스트립의 커버층이 제거되어 있다.
도 2 는 제자리에 커버층을 갖는 도 1 의 테스트 스트립의 두번째 상면도이다.
도 3 은 실시예 1 에 기재되어 있는 신규 화학 매트릭스로 측정된 혈액/글루코스 반응의 선형 특성을 나타내는 그래프이다.
도 4 는 약 0 내지 약 120 ㎎/㎗ 범위의 글루코스 농도 및 두 산소 농도에서 산소 방해의 결여를 나타내는 그래프이다.
도 5 는 약 0 내지 약 700 ㎎/㎗ 범위의 글루코스 농도 및 두 산소 농도에서 산소 방해의 결여를 나타내는 그래프이다.
도 6 은 종래의 테스트 스트립을 사용한 말토오스의 방해 및 신규 화학 매트릭스 기재의 테스트 스트립을 사용한 방해의 부재를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 원리의 이해를 증진시키기 위해, 이제 도면에 도시된 구현예를 참고할 것이고, 특정 언어를 사용하여 이를 기재할 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 할 것이다. 도시된 장치의 이러한 변형 및 추가의 변형 및 거기에 나타낸 본 발명의 원리의 추가 적용은 본 발명과 관련되어 있는 당업자에게 통상적으로 일어나는 바와 같이 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 특히, 본 발명이 혈당 측정기에 대해 논의되고 있으나, 본 발명이 다른 분석물 및 다른 샘플 유형을 측정하는 장치에 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 대안적인 구현예는 당업자에게 분명한, 본원에서 논의되어 있는 구현예에 대한 특정한 변화를 필요로 한다.
본 발명은 일반적으로 관련된 성분 (예를 들어, 말토오스) 및 변하는 농도의 관련되지 않은 성분 (예를 들어, 산소) 의 존재 하에서 분석물 (예를 들어, 글루코스) 의 농도를 측정하는데 사용되는 화학 매트릭스에 관한 것이다. 이미 명시된 바와 같이, 말토오스와 산소 농도의 변화 모두의 존재는 다양한 전기화학적 바이오센서로 수행되는 글루코스의 측정을 방해할 수 있다. 화학 매트릭스 및 수행 방법이 혈당치 분석에 대해 이하에 기재될 것이나, 본 발명의 화학 매트릭스 및 방법은 또한 다른 유형의 분석물을 분석하는데 사용될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
본 발명의 구현예는 생물학적 유체 중 분석물의 농도를 측정하는데 사용하기 위한 신규 화학 매트릭스를 고려한다. 통상적으로는, 신규 화학 매트릭스 조성물의 구현예는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 페나진 유도체, 및/또는 니트로소아닐린, 또는 이의 유도체를 포함한다. 화학 매트릭스의 상이한 구현예는 반응이 바이오센서 내에서 일어난 후 분석물의 농도를 측정하는데 전기화학 바이오센서와 사용된다. 페나진 유도체의 구현예에는 광화학적으로 안정한 페나진 유도체, 예컨대 1-치환된-5-알킬 페나진 4차염이 포함된다. 추가 구현예가 또한 고려된다. 본 발명의 화학 매트릭스의 구현예를 사용하여 분석물의 농도를 측정하는 방법은 본 발명의 또다른 양태이다. 상기 방법은, 예를 들어, 약 5 초 이하의 시험 시간 내에 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 600 ㎎/ℓ 범위의 혈당치를 측정할 수 있다. 화학 매트릭스는 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 잘 작용할 수 있다.
신규 화학 매트릭스는 이제 상세히 완전히 기재될 것이다. 신규 화학 매트릭스의 성분은 효소, 보조인자, 시약 및 매개체를 포함할 수 있다. 사용되는 경우, 효소는 글루코스 탈수소효소일 수 있고, 보조인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드일 수 있고, 시약은 페나진 유도체일 수 있으며, 매개체는 니트로소아닐린일 수 있다. 페나진 유도체의 구현예에는 5-알킬페나진 4차염이 포함된다. 니트로소아닐린은 니트로소아닐린 분자 그자체가 전기화학적 분석물 검출 및 측정 방법에 통상 사용되는 전자 매개 시퀀스에 직접 수반되지 않는다는 점에서 간접적인 전자 매개체의 예이고; 오히려, 니트로소아닐린은 글루코스 및 화학 매트릭스의 다른 성분과 반응시켜 1 또는 2 회 제거된 전기활성 반응 생성물을 생성함으로써 시퀀스에 참여하고, 미국 특허 제 5,122,244 호 및 제 5,286,362 호 (상기 참고됨) 에서 더욱 전체적으로 기재되고 설명될 수 있는 것과 같이, 통상적인 매개 시퀀스에 직접 수반되는 전기활성 반응 생성물이라는 것이 이해될 것이다. 상기에도 불구하고, 니트로소아닐린 및/또는 이의 유도체는, 니트로소아닐린이 전기화학적 매개 시퀀스에 직접 수반되는 매개체에 대한 전구체라는 것을 이해하는 출원인에 의해 창출되고/되거나 제조되는 다른 참고문헌 및 본원에서 매개체로서 나타낼 수 있다.
페나진 유도체
필요하지는 않지만, 적합한 페나진 유도체는 통상적으로는 유도체가 광의 존재 하에 그리고 특히 약 7 내지 약 8.5 의 pH 범위에서 안정하도록 선택된다. 적합한 페나진 유도체에는 5-알킬페나진 4차염, 예컨대 상기 화학식 Ⅰa 및 하기 화학식 Ⅱa 및 Ⅱb 로 표시되는 유형의 5-알킬-1-치환된 페나진 4차염이 포함된다:
Figure 112010068023903-pct00010
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며, n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
니트로소아닐린
니트로소아닐린은 하기 화학식 Ⅲ 을 가진다:
Figure 112010068023903-pct00011
(식 중, R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고, R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며, R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나, R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 알킬 부분에 OH 로 임의 치환된 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기, 또는 알킬 부분에 히드록시 잔기로 임의 치환된 폴리알콕시알킬 잔기를 나타내거나, R11 및 R12 는 질소가 알킬, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 알콕시히드록시알킬, 디옥사닐릴-알킬 또는 폴리알콕시알킬 잔기로 치환된, 황 또는 질소로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나 (이들 각각은 그 자체가 히드록시 잔기로 알킬 부분에서 임의 치환됨), R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나, 알킬렌 잔기가 3 개의 탄소 원자를 함유하는 경우, 이는 또한 임의로 알킬 잔기를 나타냄). 이에 대해, 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 나타낸다. 불소 및 염소는 R10 에 대한 전형적인 할로겐이다. 알킬, 알콕시 또는 알킬티오는 탄소수 1 내지 6 의 잔기이고, 탄소수 1 내지 3 의 것이 특히 적합하다. 알킬에 대한 상기 정의는 또한 히드록시알킬, 디알킬아미노알킬, 히드록시알콕시-알킬, 알콕시알킬, 폴리알콕시알킬, 알콕시-히드록시알킬 및 디옥사닐릴-알킬 잔기의 알킬 부분에 적용된다.
디옥사닐릴-알킬 잔기는 디옥산 고리계가 알킬 잔기에 결합되는 잔기이다. 이는 통상적으로 1,4-디옥산 고리계, 즉
Figure 112010068023903-pct00012
이다.
폴리알콕시알킬 잔기는 p 가 1 내지 10 인 -알킬-(알콕시)p-알콕시 잔기이다. 통상적으로는 p 는 1 내지 4 이고; 더욱 통상적으로는 p 는 1 내지 3 이다.
알킬렌 잔기는 직쇄 또는 분지형 잔기, 바람직하게는 직쇄이고, 포화 또는 불포화, 예컨대 2 개의 유리 결합 부위를 갖는 탄소수 2 내지 5, 바람직하게는 2 내지 4 의 포화 탄화수소 사슬일 수 있다.
황 또는 질소에 의해 방해된 R11 및 R12 의 알킬렌 잔기의 의미 내에서, 질소 원자의 내포로 형성된 티오모르폴린 또는 피페라진 잔기가 적합하다. 피페라진 잔기가 특히 적합하다.
R11 및 R12 로부터 형성된 알킬렌 잔기의 의미 내에서, 하기 화학식 Ⅴ 의 방향족 고리의 내포로 형성된 인돌린 또는 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린 잔기가 적합하다.
Figure 112010068023903-pct00013
본 발명에 따른 화학식 Ⅲ 의 니트로소아닐린 유도체의 염으로서, 강산, 특히 염산, 황산, 질산 및 인산과 같은 무기산의 염이 적합하다. 히드로클로라이드가 특히 적합하다.
하기 신규 니트로소아닐린 유도체가 본 발명의 화학 매트릭스의 특히 적합한 성분이다:
a) 2,2'-[(3-플루오로-4-니트로소페닐)이미노]비스-에탄올,
b) 2,2'-[(3-클로로-4-니트로소페닐)이미노]비스-에탄올,
c) 2,2'-[(3-메톡시-4-니트로소페닐)이미노]비스-에탄올,
d) 2,2'-[(3-메틸메르캅토-4-니트로소페닐)이미노]비스-에탄올,
e) 2-[(2-히드록시에톡시)에틸-(4-니트로소페닐)아미노]에탄올,
f) 2-[(2-메톡시에톡시)에틸-(4-니트로소페닐)아미노]에탄올,
g) 1-[N-(2-히드록시에틸)-(4-니트로소아닐리노)]-3-메톡시-2-프로판올,
h) 1-[N-(2-히드록시에틸)-(4-니트로소아닐리노)]-3-(2-히드록시에톡시)-2-프로판올,
i) 1-메틸-4-(4-니트로소페닐)-피페라진,
j) 4-(4-니트로소페닐)-1-피페라지노-에탄올,
k) 5-니트로소-1-인돌린 에탄올,
l) 1-메틸-6-니트로소-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린,
m) 6-니트로소-3,4-디히드로-1(2H)퀴놀린 에탄올 및 이들의 염
n) 2-[(2-히드록시에틸-4-니트로소페닐)아미노]에탄올.
이 중에서, 화합물 a), d), e), f), g) 및 h) 및 이들의 염이 특히 적합하다. 화합물 e) 또는 이의 염, 특히 히드로클로라이드가 특히 적합하다.
페나진 성분의 제조
화학 매트릭스의 성분 중 하나는 페나진 유도체를 포함한다. 페나진 유도체는 다양한 상이한 치환된 페나진으로부터 선택될 수 있으나, 5-알킬, 1-치환된 페나진이 본 발명에서 유용하고, 5-에틸-1-치환된 페나진이 가장 바람직하다. 5-알킬화된 페나진의 위치 1 에서의 다양한 상이한 연결기가 적합하다. 적합한 치환된 페나진은 하기 구조 Ⅰa 를 포함한다:
Figure 112010068023903-pct00014
(식 중,
Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m 은 0 내지 약 6 의 범위의 정수이고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00015
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고, Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 및 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3 또는
Figure 112010068023903-pct00016
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며; X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
특히 적합한 페나진 유도체는 하기 화학식 Ⅱa 로 표시될 수 있다:
Figure 112010068023903-pct00017
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 은 C1 내지 C6 알킬이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며, n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
하기 반응식 1 내지 9 는 적합한 페나진 유도체를 제조하는데 사용될 수 있는 일부의 통상적인 반응 경로를 나타낸다.
반응식 1
Figure 112010068023903-pct00018
반응식 1 은 5-에틸-1-알콕시 카르복실산 페나진 유도체 (5) 의 합성을 나타낸다. 상기 화합물의 제조는 문헌 ([Eur. J. Biochem, 179, 293-298 (1989)] 참조) 에 기재되어 있다. 그러나, 합성 절차를 광범위하게 변경하여, 필요한 양의 치환된 페나진 (5) 을 산출하였다.
1-히드록시페나진 (1) 을 TCI America 로부터 구입하였다. 이를 탄산칼륨 및 18-크라운 6 의 존재 하에 아세톤에서 환류 조건 하에 에틸 4-브로모부티레이트와 반응시켜 페나진 에틸 에스테르 (3) 를 산출하였다. 상기 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 페나진 에틸 에스테르 (3) 와 디에틸설페이트의 반응은 어떠한 N-알킬화된 생성물을 산출하지 않았다. 페나진 에틸 에스테르 (3) 의 N-에틸화를 위한 반응 공정을 탄산칼륨과 같은 염기의 첨가로 수행하였다. 따라서, 100 ℃ 에서 18 시간 동안 탄산칼륨의 존재 하에 페나진 에틸 에스테르 (3) 와 디에틸설페이트를 반응시켜 5-N-에틸 1-치환된 카르복실산 에틸 에스테르 페나진 유도체 (4) 를 산출하였다. 생성된 5-N-에틸 페나진 에틸 에스테르를 희석된 염산으로 가수분해시켜 5-에틸-1-카르복시부틸 페나진 유도체 (5) 를 산출하였다.
반응식 2
Figure 112010068023903-pct00019
반응식 2 는 페나진 용해도에 영향을 줄 수 있는 친수성 링커 (linker) 를 갖는 1-알콕시-치환된 페나진 유도체 (9) 의 합성을 나타낸다. 친수성 치환된 페나진의 이용가능성은 매트릭스 제형의 범위를 더욱 넓게 한다. 5-N-에틸 페나진 1-히드록시부티르산 유도체 (5) 는 1-에틸 N-3,3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드와 반응하여 상응하는 N-히드록시숙신이미드를 산출한다. 이러한 활성화된 에스테르는 트리에틸아민과 같은 3차 염기의 존재 하에서 시판되는 아미노 d-PEG4 메틸 에스테르 (Quanta Biodesign, USA) 와 반응한다. 메틸 에스테르의 탈보호는 문헌 ([Greene, T. 및 Wuts, P., "Protective Groups in Organic synthesis", 2nd edition, Wiley Intersciences, 1991] 참조) 에 기재되어 있다. 메틸 에스테르기를 산 또는 염기의 존재 하에 탈보호시켜 PEG 링커를 갖는 페나진 유도체 (9) 를 산출할 수 있다. 메틸 에스테르를 희석된 염산으로 가수분해시키는 것은 이러한 페나진 화학 시스템에 특히 적합하다고 증명되어 있다.
반응식 3
Figure 112010068023903-pct00020
반응식 3 은 이량체화된 페나진 유도체 (11) 의 합성을 기술한다. 페나진 유도체 (11) 를 포함하는 화학 매트릭스는 통상적으로는 향상된 감도를 제공한다. 페나진 유도체 (11) 는 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 3차 염기의 존재 하에 디메틸포름아미드 또는 테트라히드로푸란과 같은 용매에서 0 ℃ 내지 실온 범위의 온도에서 활성화된 에스테르 (6) 와 2,2-(에틸렌디옥시)비스에틸아민 (Aldrich Chemical Company, USA) 을 반응시켜 제조될 수 있다. 특히 적합한 염기/용매 조합은 트리에틸아민/디메틸포름아미드를 포함한다.
반응식 4
Figure 112010068023903-pct00021
반응식 4 는 아미노 말단 1-치환된 N-에틸 페나진의 합성을 나타낸다. 1-히드록시페나진의 O-알킬화는 예를 들어 프탈이미도 또는 t-BOC 유도체와 같은 말단 아미노 보호된 알킬화제를 사용하여 수행될 수 있다. 생성된 t-Boc 보호된 아민은 트리플루오로아세트산과 같은 산성 조건 하에서 탈보호될 수 있는 반면, 생성된 프탈이미도 보호된 아민은 히드라진 또는 메틸아민의 존재 하에서 탈보호될 수 있다. 특히 적합한 방법은, 탄산칼륨과 같은 염기의 존재 하에 아세톤, DMF 또는 THF 와 같은 용매에서 환류 조건 하에 1-히드록시페나진과 N-(4-브로모부틸)프탈이미드 (Acros Chemicals, USA) 를 반응시키는 것을 포함한다. 아세톤이 이 반응에 특히 적합한 용매라는 것이 발견되었다. 생성된 알킬화된 생성물 (13) 은 탄산칼륨의 존재 하에 디에틸설페이트와 반응하여 N-에틸 프탈이미도 보호된 페나진 (14) 을 산출한다. 프탈이미도기는 메탄올 중에 실온에서 메틸아민으로 탈보호되어 아미노 말단 1-치환된 N-에틸 페나진 (15) 을 산출한다.
반응식 5
Figure 112010068023903-pct00022
반응식 5 는 히드록실 말단 1-치환된 페나진 유도체의 합성을 기술한다. 1-히드록시 페나진 (1) 은 탄산칼륨의 존재 하에 아세톤에서 환류 조건 하에 예를 들어 (3-브로모프로폭시)-tert-부틸디메틸실란 (16) (Aldrich chemical company, USA) 과 같은 히드록시 보호된 알킬화제와 반응하여 tert-부틸디메틸실란 (TBDMS) 보호된 페나진 유도체 (17) 를 산출한다. (17) 의 N-알킬화는 탄산칼륨의 존재 하에 디에틸설페이트와 수행되어 N-에틸 1-치환 보호된 히드록실 말단 페나진 유도체 (18) 를 산출한다. TBDMS 기의 탈보호는 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF) 의 존재 하에 THF 중에 실온에서 수행되어 1-히드록시부틸 N-에틸 페나진 (19) 을 산출한다.
반응식 6
Figure 112010068023903-pct00023
반응식 6 은 N-에틸 페나진 1-히드록시부틸 메틸 에테르의 합성을 나타낸다. 페나진 에테르 (21) 를 1-히드록시페나진 (1) 과 4-메톡시부틸브로마이드 (Aldrich Chemical Company, USA) 의 알킬화에 의해 제조하여 페나진 유도체 (21) 를 산출한다. N-에틸 페나진 (22) 은 탄산칼륨의 존재 하에 화합물 (21) 과 디에틸 설페이트를 반응시켜 제조된다.
반응식 7
Figure 112010068023903-pct00024
반응식 7 은 1-카르복시 N-에틸 페나진 (29a) 과 8-메틸 1-카르복시 N-에틸 페나진 (29b) 유도체의 합성을 나타낸다. 아닐린 (또는 오르토 톨루이딘) 과 2-브로모-3-니트로벤조산의 혼합물을 CuCl, Cu 분말 및 N-에틸모르폴린의 존재 하에 부탄-2,3-디올에서 70 내지 80 ℃ 에서 8 내지 24 시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 0.1 M NH4OH 용액으로 희석시키고, 셀라이트 층으로 여과시킨다. 생성된 용액을 서서히 2N HCl 에 부어 N-페닐-3-니트로 안트라닐산 (25a) 또는 메틸 치환된 유도체 (25b) 를 산출한다. 중간체 (25a) 또는 (25b) 는 2N NaOH 용액에서 환류 조건 하에 수소화붕소나트륨과 반응하여 개환시키고, 페나진의 나트륨염을 산출하고, 이는 산성화 시 (26a) 또는 (26b) 를 산출한다. 페나진 1-카르복시 유도체 (또는 8-메틸 1-카르복시페나진) 의 산 클로라이드는 티오닐 클로라이드와 반응하여 제조되고, 생성된 산 클로라이드는 HCl 에서 메탄올과 반응하여 메틸 에스테르로 전환된다. 생성된 페나진 메틸 에스테르 (27a) 또는 (27b) 는 디에틸 설페이트 및 탄산칼륨으로 알킬화되어 상응하는 N-에틸 페나진 유도체 (28a) 또는 (28b) 를 산출한다. 최종적으로, 페나진 (28a) 또는 (28b) 의 메틸 에스테르기는 희석된 염산으로 가수분해되어 (29a) 또는 (29b) 를 산출한다.
반응식 8
Figure 112010068023903-pct00025
반응식 8 은 1-아세트아미도-N-에틸 페나진 유도체 (35) 에 대한 합성 경로를 제공한다. 3-아미노-카테콜 히드로클로라이드 (30) 를 에틸 아세테이트에서 산화은 및 무수 나트륨 설페이트와 반응시켜 3-아미노-1,2-퀴논 (31) 을 산출하고, 이를 추가로 오르토 페닐렌디아민 (32) 과 제자리 반응시켜 1-아미노 페나진 (33) 을 산출한다. 아미노 페나진 (33) 은 아세트산에서 아세트산 무수물로 아세틸화되어 1-아세트아미도 페나진 (34) 을 산출한다. 생성된 1-아세트아미도 페나진은 탄산칼륨의 존재 하에 디에틸 설페이트와 반응하여 N-에틸-1-아세트아미도-페나진 (35) 을 산출한다.
반응식 9
Figure 112010068023903-pct00026
반응식 9 는 1-카르복시메틸-5-N-에틸 페나진 유도체 (42) 에 대한 합성 경로를 제공한다. 1-메틸 페나진 (36) (Apin Chemicals, UK 에서 입수가능함) 과 N-브로모숙신이미드를 벤조일 퍼옥시드 및 용매의 존재 하에 반응시켜 브로모 유도체 (37) 를 형성한다. 사염화탄소는 브롬화 반응에 특히 적합한 용매이다. 예를 들어, DMF 와 같은 적합한 용매에서 브로마이드 (37) 와 KCN 을 반응시켜 1-시아노메틸 페나진 유도체 (38) 를 산출한다. 시아노페나진 (38) 의 산 가수분해는 1-카르복시메틸 페나진 (39) 을 산출한다. 메탄올과 HCl 의 반응에 의해 화합물 (39) 의 산기를 메틸 에스테르로 전환시켜 페나진 에스테르 (40) 를 산출한다. 에스테르 (40) 는 탄산칼륨의 존재 하에 디메틸 설페이트로 N-알킬화되어 5-에틸 페나진 에스테르 (41) 를 산출할 수 있다. 에스테르 (41) 를 희석된 염산으로 가수분해시켜 5-에틸-1-카르복시메틸 페나진 (42) 을 산출한다.
니트로소아닐린 성분의 제조
화학식 Ⅲ 의 화합물은, R4, R5 및 R6 이 화학식 Ⅲ 의 화합물에서와 동일한 의미를 갖는 화학식 Ⅵ 의 화합물과 니트라이트를 반응시켜 제조될 수 있다. 상기에 화학식 Ⅲ 에 대해 상세히 제공되어 있다.
Figure 112010068023903-pct00027
유사한 방법은 [J. J. D'Amico 등, J. Amer. Chem. Soc. 81, 5957 (1959)] 로부터 알려져 있다.
알칼리 니트라이트는 통상적으로 니트라이트로서 사용되고, 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐 또는 세슘은 알칼리 금속으로서 가능하고; 나트륨 니트라이트 및 칼륨 니트라이트가 특히 적합하다. 나트륨 니트라이트가 특히 적합하다. 반응은 통상적으로 산 매질 중에 저온에서 일어난다. 온도가 10 ℃ 미만, 바람직하게는 -10 내지 +5 ℃ 인 경우가 유리하다.
화학식 Ⅵ 의 화합물과 니트라이트의 반응이 수성 매질에서 일어나는 경우가 유리하다. 매질에 적합한 pH 는 3 미만이고, 2 미만이 특히 적합하다.
반응에 대한 한 구현예에서, 화학식 Ⅵ 의 화합물 또는 이의 염, 예컨대 염산, 황산, 질산 또는 인산과 같은 무기산의 염을 우선 수성 산성 매질에 첨가하고 냉각한다.
이어서, 반응 혼합물을 저온에서 유지시키면서 니트라이트, 통상적으로는 용해된 형태의 니트라이트를 첨가한다. 수성 매질이 또한 니트라이트에 대한 용매로서 사용되는 경우가 유리하다. 니트라이트의 첨가 후, 반응이 완료될 때까지 반응 혼합물을 저온에서 유지한다. 반응 혼합물을 진행시키기 위해, 통상적으로는 유기 용매로 추출하고, 생성물을 추출물로부터 단리시킨다.
화학 매트릭스
화학 매트릭스의 제 1 구현예는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 5-에틸 페나진 4차염, 및 니트로소아닐린을 포함한다. 필요하지는 않지만, 적합한 4차염은 통상적으로는 광화학적으로 안정하다. 광화학적으로 안정한 5-에틸 4차염의 예는 하기 화학식 Ⅰa 및 Ⅱb 로 표시된다:
Figure 112010068023903-pct00028
(식 중,
Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m 은 0 내지 약 6 의 범위의 정수이고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00029
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고, Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 및 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3 또는
Figure 112010068023903-pct00030
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며; X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임); 및
Figure 112010068023903-pct00031
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며, n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
화학 매트릭스의 추가 구현예는 상기 화학식 Ⅱa 또는 Ⅱb 로 표시되는 화학식을 갖는 페나진 알킬 4차염을 포함한다. 적합한 4차염은 통상적으로 광화학적으로 안정하고, 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 안정하다. 이 구현예의 추가 성분은 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및/또는 니트로소아닐린을 포함할 수 있다. 적합한 니트로소아닐린은 상기 화학식 Ⅲ 으로 표시된다.
화학 매트릭스의 또한 추가 구현예는 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 상기 화학식 Ⅱb 로 표시되는 5-에틸 페나진 4차염 및 하기 화학식 Ⅶ 로 표시되는 1,4-니트로소아닐린을 포함한다.
Figure 112010068023903-pct00032
적합한 페나진 4차염은 통상적으로 광화학적으로 안정하다.
화학 매트릭스 조성물의 또한 추가 구현예는 광화학적으로 안정한 5-알킬 페나진 4차염을 포함한다. 상기 조성물은 추가로 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 및 니트로소아닐린을 함유할 수 있다. 적합한 페나진 4차염은 상기 화학식 Ⅰ 로 표시된다. 적합한 니트로소아닐린은 상기 화학식 Ⅲ 으로 표시된다.
또다른 구현예는 화학 매트릭스의 구현예를 사용하여 분석물 샘플 (특히, 혈중 글루코스) 의 농도를 측정하는 방법 또는 시험을 포함한다. 상기 방법은 상기 바이오센서 및 테스트 스트립 배열을 사용하는 것을 포함한다. 화학 매트릭스를 화학 반응에 사용하여 분석물의 농도를 측정한다. 특정 방법은 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 5-알킬 페나진 4차염 및 니트로소아닐린을 포함하는 화학 매트릭스를 이용한다. 특정 다른 방법은 화학식 Ⅱb 로 표시되는 5-알킬페나진 4차염을 이용하고, 또한 다른 방법은 화학식 Ⅶ 로 표시되는 니트로소아닐린을 이용한다. 본원에 기재되어 있는 방법을 사용하여 약 5 초 이하의 시험 시간 내에 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 600 ㎎/ℓ 의 혈액 글루코스를 함유하는 샘플을 분석할 수 있다. 최적의 결과는 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 범위에서 화학 매트릭스를 이용할 때 수득될 수 있다.
도면을 참조하여 본 발명의 양태를 추가로 개시한다. 본원에 기재되어 있는 방법 및 화학에 사용하는데 적합한, 전류법 전기화학 분석물 센서 (20) 를 도 1 및 2 에 나타낸다. 도 1 및 2 의 센서 (20) 가 단지 본 발명에 따른 방법 및 화학과 함께 사용될 수 있는 센서 유형의 예이고, 상이한 배열을 갖는 다른 유형의 센서가 유사하게 사용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 도 1 및 2 에 나타내는 센서가 얽혀있는 어레이로 형성된 전극을 갖지만, 상이한 배열 또는 추가적인 전극을 갖는 센서가 본 발명의 화학 매트릭스 및 방법에 사용될 수 있다. 또다른 예로서, 도시된 구현예의 전극은 공면 배열을 가지나, 다른 구현예의 전극 (22) 은 외장 구조와 같은 다른 배열을 가질 수 있다는 것을 인지해야 한다. 간단하고 분명하게 하기 위하여, 센서 시스템의 모든 특징이 이하에 기술되지 않을 것이나, 미국 특허 제 5,989,917 호; 미국 특허 제 6,270,637 호; 및 미국 공개 출원 제 2003/0155237 A1 호에 기재되어 있는 것을 비롯한 본 발명의 화학 및 방법이 유용한 다른 유형의 센서의 예를 참고하고, 상기 특허 모두는 그 전문이 본원에 참고로서 포함된다.
이제 도 1 로 돌아가면, 센서 (20) 는 유연 기판 (24) 상에 배치된 얽혀있는 어레이의 전극 (22) 을 포함한다. 한쌍의 전극 (22) 중 하나는 작동 전극으로 작용하고, 다른 전극은 상대 전극으로 작용한다. 그러나, 이전에 지시된 바와 같이, 본 발명의 한 구현예에 따른 전극 (22) 은 역할을 바꿀 수 있다. 즉, 한번은 전극 (22) 은 작동 전극으로서 작용할 수 있고, 다른 때에는 상대 전극으로서 작용할 수 있다. 도시된 구현예에서, 두 전극 (22) 을 나타내지만, 다른 구현예에서는 센서 (20) 가 더 많은 전극을 포함할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 전극 (22) 은 유연 기판 (24) 의 표면에 위치한 접촉 패드 (28) 를 포함하는 전기전도성 커넥터 (26) 에 연결되어 있고, 상기 접촉 패드 (28) 는 측정기와 같은 외부 전기 회로에 접촉될 수 있다. 커넥터 (26) 는 또한 커넥터 일부 (30) 를 포함하고, 이는 어레이 (22) 에서의 전극 소자를 패드 (28) 에 연결시키고, 통상적으로는 절연층으로 커버될 수 있다.
도 2 에 대해, 비전도성 스페이서 층 (32) 은 기판 (24) 및 커넥터 (26) 의 커넥터 일부 (30) 상에 배치되어 있다. 스페이서 층 (32) 은 모세관 샘플 챔버 (34) 를 한정하고, 상기 샘플 챔버 (34) 는 유체 샘플이 샘플 챔버 (34) 로 이동하는 유입구를 가진다. 시약층 (35) 은 샘플 챔버 (34) 내 어레이 (22) 상에 배치되어 있다. 시약층 (35) 은 이하에 추가로 상세히 기재될 것이나, 유체 샘플을 분석하도록 설정된다. 호일 (36) 은 환기구 (38) 를 제외한 모세관 챔버 (34) 일부 및 스페이서 (32) 를 커버하고, 상기 환기구는 챔버 (34) 로부터 환기시키는데 사용된다.
매트릭스 용액의 제조
표준 매트릭스 용액
25.148 g 의 Pipes 세스퀴나트륨염, 0.125 g 의 Triton X-100 및 2.40 g 의 트레할로오스를 400 ㎖ 의 재증류수에 첨가하고 용액의 pH 를 7.00 으로 조절하여 저장 완충 용액을 제조하였다. 상기 용액을 500 ㎖ 메스플라스크에 첨가하고, 재증류수로 희석시켜 500 ㎖ 의 용액을 제조하였다. 396 g 의 초기 완충 용액과 2 g 의 폴리에틸렌 옥시드 (300K) 및 2 g 의 Natrosol 250M 을 조합하여 완충/중합체 용액의 제조를 완성하였다. 밤새 방치하여, 모든 고체를 용해시키고, 용액을 사용하기 위해 준비하였다.
(a) 하기 성분을 11.198 g 의 완충 저장 용액을 함유하는 25 ㎖ 의 고속 혼합 컵에 연속 방식으로 첨가하고, 각 첨가 후 33,000 rpm 에서 1 분 동안 고속 혼합시키고: 0.5592 g 의 KCl, 0.1824 g 의 NAD 등급 1 및 0.0913 g 의 치환된 니트로소아닐린 (구조 Ⅶ); (b) pH 를 7.00 으로 조절하며; (c) 0.0163 g 의 1-(3-카르복시프로필옥시)-5-에틸페나진 (반응식 1 의 5) 을 용기에 첨가하고 1 분 동안 33,000 rpm 으로 혼합하고 최종적으로 0.6574 g 의 글루코스 탈수소효소를 첨가하고 2 분 동안 33,000 rpm 으로 고속 혼합함으로써, 매트릭스 용액을 저장 완충 용액으로부터 제조하였다.
대안적인 페나진을 사용한 추가적인 매트릭스 용액
1-(3-카르복시프로필옥시)-5-에틸 페나진 대신에 대안적인 1-치환된 페나진 유도체로 대체하거나, 유사하게는 화학식 Ⅵ 으로 표시되는 니트로소아닐린 대신에 대안적인 니트로소아닐린으로 대체하여 상기 방법을 사용함으로써 매트릭스 용액을 유사하게 제조할 수 있다. 적합한 페나진 유도체는 통상적으로는 광화학적으로 안정하다. 화학식 Ⅱ 로 표시되는 1-에틸-5-치환된 페나진 4차염이 더욱 적합할 수 있고, 화학식 Ⅰ 로 표시되는 다른 1-알킬-5-치환된 페나진 4차염이 또한 사용될 수 있다.
대안적인 니트로소아닐린을 사용한 추가적인 매트릭스 용액
화학식 Ⅶ 로 표시되는 니트로소아닐린 대신에 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 니트로소아닐린으로 대체하여 상기 방법에 의해 매트릭스 용액을 또한 제조할 수 있다.
테스트 스트립의 제조
스페이서 및 모세관 디자인을 갖는 ACCU-CHEK? Aviva 브랜드 전극의 카드를 각 전극 채널에 약 1.8 ㎕ 의 상기 염기성 매트릭스 용액으로 충전하고, 약 45 ℃ 에서 약 1 분 동안 건조시켰다. 건조된 카드를 건조 대기에서 밤새 저장하고, 친수성 상부 호일의 스트립을 수동적으로 스페이서 층에 적층시켰다. 카드를 적절한 스트립으로 절단시키고, 사용할 때까지 건조된 바이알에 저장하였다. 이 방법은 상기 몇몇 매트릭스 용액 기재의 테스트 스트립을 제조하는데 유사하게 사용될 수 있다.
전혈 투여량 반응의 실험
약 2.5 초 지연 및 약 2.5 초 측정 (신호가 테스트 스트립과 샘플을 접촉시킨 후 약 2.5 초에 적용되고, 측정값이 신호의 적용 후 약 2.5 초에 취해지는 것을 의미함) 을 이용한, 염기성 매트릭스 용액으로부터 상기 제조된 테스트 스트립을 사용하여 7 개의 상이한 농도의 글루코스 (약 50 내지 약 600 ㎎/㎗) 를 함유하는 전혈 샘플을 측정하였다. 샘플과 테스트 스트립을 접촉시킨 후 약 5 초에 평균 전류를 측정하여 전류와 글루코스 농도 간의 선형 관계식을 산출하였다. 글루코스 농도와 전류 측정값 간의 선형 관계식의 확립은 글루코스와 같은 분석물을 분석하는데 화학 매트릭스의 이용을 용이하게 한다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 상기 몇몇 매트릭스 용액으로부터 제조된 테스트 스트립을 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
상이한 산소 농도에서의 매트릭스 성능
약 0 내지 약 110 ㎎/㎗ 범위의 글루코스 농도를 갖는 혈액 글루코스 샘플을 약 39 ㎜Hg 및 약 100 ㎜Hg 의 산소로 포화시키고, 염기성 매트릭스 용액으로부터 제조된 상기 테스트 스트립을 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 샘플을 약 3 초 지연 및 약 2 초 측정으로 작동시켰다. 약 5 초에서의 평균 전류를 측정하고 그래프로 나타냈다. 도 4 에 나타낸 그래프에 도시되는 바와 같이, 산소 농도는 글루코스 측정에 영향을 미치지 않았다. 상기 대안적인 매트릭스 용액으로부터 제조된 테스트 스트립으로 이 실시예를 반복할 시 유사한 결과를 얻었다.
후속 시험에서, 약 50 내지 약 600 ㎎/ℓ 범위의 글루코스 농도를 갖는 혈액 샘플을 약 42 ㎜Hg 및 약 135 ㎜Hg 의 산소로 포화시키고, 염기성 매트릭스 용액으로부터 상기 제조된 테스트 스트립을 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 도 5 에 도시된 바와 같이, 산소 농도는 이러한 광범위한 농도 범위에 대한 글루코스 측정에 영향을 미치지 않았다. 상기 대안적인 매트릭스 용액으로부터 제조된 테스트 스트립으로 이 실시예를 반복할 시 유사한 결과를 얻었다.
말토오스 방해 연구
21 mM 의 말토오스를 200 ㎖ 의 식염수 용액에 첨가하여 말오토스 저장 용액을 제조하였다. 약 10 내지 약 550 ㎎/ℓ 범위의 글루코스 농도를 함유하는 6 개의 혈액 샘플을 제조하였다. 각 샘플을 두 부분으로 나누고, 한 계열의 샘플에 있어서 시험 샘플의 각 1 ㎖ 부분에 대해 0.05 ㎖ 의 말토오스 저장 용액을 첨가하였다. 두 번째 계열의 샘플에 있어서, 동일 부피의 식염수 용액을 시험 샘플의 1 ㎖ 부분에 첨가하였다. 표준 ACCU-CHEK? Aviva 브랜드 테스트 스트립 및 일반적으로 유사한 구조 성분을 가지나 상기 신규 화학 매트릭스를 함유하는 테스트 스트립으로 샘플의 글루코스 함량을 측정하였다. 도 6 에 도시되는 바와 같이, 말토오스는 표준 ACCU-CHEK? Aviva 브랜드 스트립을 이용한 측정값을 상승시키는 반면, 신규 화학 매트릭스를 이용한 측정은 말토오스를 함유하지 않은 샘플에서와 실질적으로 동일하였다. 상기 대안적인 매트릭스 용액으로부터 제조된 테스트 스트립으로 이 연구를 반복할 시에 유사한 결과를 얻었다. ACCU-CHEK? 및 Aviva 는 Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Straße 116, D-68305 Mannheim, Germany 의 미국 등록 상표이다.
본 발명은 도면 및 상기 기술에서 상세히 설명되고 기재되지만, 이는 예시적이고, 특징에 있어서 제한되지 않는다는 것을 고려해야 하고, 선택된 구현예만을 나타내고 설명하였으며, 지금까지 기재되고/되거나 하기 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 정신의 범위 내에 있는 모든 변화, 변경 및 동등물은 보호되어야 한다고 이해된다. 또한, 본원에서 인용된 모든 공개물은 당업 기술의 수준을 지시하는 것이고, 각각이 개별적으로 참고로 포함되거나 완전히 설명되는 것과 같이 이들의 전문이 본원에 참고로서 포함된다.
하기는 본 발명의 바람직한 구현예의 목록이다:
1. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 5-알킬페나진 4차염 및 니트로소아닐린을 포함하고, 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 에서 안정하고 광화학적으로 안정한, 분석물의 농도를 측정하는데 유용한 화학 매트릭스 조성물.
2. 5-알킬페나진 4차염이 하기 화학식을 갖는 화합물인, 바람직한 구현예 1 의 조성물:
Figure 112010068023903-pct00033
(식 중,
Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m 은 0 내지 약 6 의 범위의 임의의 정수일 수 있고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00034
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고, Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 또는 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3 또는
Figure 112010068023903-pct00035
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며; X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
3. 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 이의 염인, 바람직한 구현예 1 의 조성물:
Figure 112010068023903-pct00036
(식 중,
R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며,
R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
R10 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
4. R1 이 C2H5 인, 바람직한 구현예 2 의 화학 매트릭스.
5. 상기 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는, 바람직한 구현예 4 의 화학 매트릭스:
Figure 112010068023903-pct00037
.
6. Z 가 -O-(CH2)3COH 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
7. Z 가 -O-(CH2)4CO-NHCH2CH2-(OH2CH2)4-COOH 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
8. Z 가 -O-(CH2)4-NH2 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
9. Z 가 -O-(CH2)3-OH 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
10. Z 가 -O-(CH2)4-OCH3 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
11. Z 가 -(CH2)COOH 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
12. Z 가 -NH-COCH3 인, 바람직한 구현예 5 의 화학 매트릭스 조성물.
13. 글루코스 탈수소효소; 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드; 니트로소아닐린 및 하기 화학식을 갖는 5-알킬페나진 4차염을 포함하는, 분석물의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스 조성물:
Figure 112010068023903-pct00038
(식 중, R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며, n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
14. R1 이 C2H5 인, 바람직한 구현예 13 의 화학 매트릭스.
15. 상기 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖거나 이의 염인, 바람직한 구현예 14 의 화학 매트릭스:
Figure 112010068023903-pct00039
(식 중,
R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며,
R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
R10 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
16. 상기 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는, 바람직한 구현예 15 의 화학 매트릭스:
Figure 112010068023903-pct00040
.
17. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린, 및 분석물의 농도를 측정하는데 유용한 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함하는, 분석물의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스 조성물.
18. 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는, 바람직한 구현예 17 의 화학 매트릭스:
Figure 112010068023903-pct00041
(식 중,
R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며, R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
19. 5-알킬-1-카르복시알킬옥시페나진이 하기 화학식을 갖는 화합물인, 바람직한 구현예 18 의 화학 매트릭스:
Figure 112010068023903-pct00042
(식 중,
R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며,
n 및 m 은 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수임).
20. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함하는 매트릭스와 분석물을 반응시켜 전기활성제를 생성하고, 전기활성제에 의해 생성된 전기화학 반응을 측정하며, 측정된 전기화학 반응을 기초로 하여 액체 샘플 중 분석물 농도를 측정하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 분석물의 전기화학 분석 방법.
21. 분석물이 글루코스이고, 샘플이 약 20 ㎎/㎗ 내지 약 600 ㎎/㎗ 의 혈액 글루코스를 함유하는, 바람직한 구현예 20 의 방법.
22. 화학 매트릭스가 약 6.5 내지 약 8.5 의 pH 를 갖는, 바람직한 구현예 20 의 방법.
23. 화학 매트릭스를 포함하는 테스트 스트립을 갖는 바이오센서의 적용 영역에 샘플을 적용하고, 화학 매트릭스와 반응시켜 분석물을 수량화시키며, 상기 바이오센서와 사용하도록 설정된 모니터링 장치의 디스플레이에 상기 수량화의 결과를 표시하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 분석물의 전기화학 분석 방법으로서, 상기 화학 매트릭스가 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 하기 화학식을 갖는 5-알킬페나진 4차염을 포함하는 방법:
Figure 112010068023903-pct00043
(식 중, Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m 은 0 내지 약 6 의 범위의 정수이고, Y 는
Figure 112010068023903-pct00044
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 약 1 내지 약 4 의 범위의 정수이고;
Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 및 -(OCH2CH2)oOH 이고; G 는 -COOH, NR2R3 또는
Figure 112010068023903-pct00045
이고;
R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고,
R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
o 는 약 1 내지 약 6 의 범위의 정수이며;
X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
24. 상기 수량화가 약 20 내지 약 600 ㎎/㎗ 범위의 혈당치를 갖는 상기 샘플에 대해 수행될 수 있는, 바람직한 구현예 23 의 방법.
25. 상기 수량화 및 상기 표시화가 상기 샘플을 적용한 후 약 5 초 이하 내에 일어나는, 바람직한 구현예 23 의 방법.

Claims (15)

  1. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 5-알킬페나진 4차염 및 니트로소아닐린을 포함하고, 6.5 내지 8.5 의 pH 에서 안정하고 광화학적으로 안정한, 글루코스의 농도를 측정하는데 유용한 화학 매트릭스 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 5-알킬페나진 4차염이 하기 화학식을 갖는 화합물인 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00046

    (식 중,
    Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    m 은 0 내지 6 의 범위의 임의의 정수일 수 있고, Y 는
    Figure 112012051039971-pct00047
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n 은 1 내지 4 의 범위의 정수이고,
    Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 또는 -(OCH2CH2)oOH 이고, G 는 -COOH, NR2R3 또는
    Figure 112012051039971-pct00048
    이고;
    R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고,
    R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
    o 는 1 내지 6 의 범위의 정수이며;
    X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
  3. 제 1 항에 있어서, 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 이의 염인 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00049

    (식 중,
    R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
    R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며,
    R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
    단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
    R10 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
  4. 제 2 항에 있어서, R1 이 C2H5 인 화학 매트릭스 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00050
    .
  6. 제 5 항에 있어서, Z 가 -O-(CH2)3-COOH, -O-(CH2)4CO-NHCH2CH2-(OCH2CH2)4-COOH, -O-(CH2)4-NH2, -O-(CH2)3-OH, -O-(CH2)4-OCH3, -(CH2)COOH 및 -NH-COCH3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학 매트릭스 조성물.
  7. 글루코스 탈수소효소; 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드; 니트로소아닐린 및 하기 화학식을 갖는 5-알킬페나진 4차염을 포함하는, 글루코스의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00051

    (식 중,
    R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고,
    R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
    X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며,
    n 및 m 은 1 내지 6 의 범위의 정수임).
  8. 제 7 항에 있어서, R1 이 C2H5 인 화학 매트릭스 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖거나 이의 염인 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00052

    (식 중,
    R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
    R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며,
    R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
    단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
    R10 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
  10. 제 9 항에 있어서, 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00053
    .
  11. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린, 및 글루코스의 농도를 측정하는데 유용한 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함하는, 글루코스의 농도를 분석하는데 사용하기 위한 화학 매트릭스 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 니트로소아닐린이 하기 화학식을 갖는 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00054

    (식 중,
    R10 은 수소, 할로겐, 알콕시 또는 알킬티오를 나타내고,
    R11 은 알킬 또는 히드록시알킬 잔기를 나타내며,
    R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 동일 또는 상이하고, 각각은 디알킬아미노알킬 잔기, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬 또는 알콕시알킬 잔기를 나타내거나,
    R11 및 R12 는 황, 질소 또는 치환된 질소 잔기로 방해된 알킬렌 잔기를 형성하거나,
    단, R10 이 NR11R12 에 대한 오르토 위치에 존재하는 경우, R11 은 또한 R10 과 함께 알킬렌 잔기를 나타내고, 이때 R12 는 히드록시알킬 잔기를 나타냄).
  13. 제 12 항에 있어서, 5-알킬-1-카르복시알킬옥시페나진이 하기 화학식을 갖는 화합물인 화학 매트릭스 조성물:
    Figure 112012051039971-pct00055

    (식 중,
    R6 은 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)mNR2R3, -NH(CH2)mOH, -O(CH2)mNH2 및 -O(CH2)mOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고,
    R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
    X- 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이며,
    n 및 m 은 1 내지 6 의 범위의 정수임).
  14. 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 광화학적으로 안정한 1-카르복시알킬옥시-5-알킬페나진을 포함하는 매트릭스와 글루코스를 반응시켜 전기활성제를 생성하고, 전기활성제로 생성된 전기화학 반응을 측정하며, 측정된 전기화학 반응을 기초로 하여 액체 샘플 중 글루코스 농도를 측정하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 글루코스의 전기화학 분석 방법.
  15. 화학 매트릭스를 포함하는 테스트 스트립을 갖는 바이오센서의 적용 영역에 샘플을 적용하고, 화학 매트릭스와 반응시켜 글루코스를 수량화시키며, 상기 바이오센서와 사용하도록 설정된 모니터링 장치의 디스플레이에 상기 수량화의 결과를 표시하는 것을 포함하는, 액체 샘플 중 글루코스의 전기화학 분석 방법으로서, 상기 화학 매트릭스가 글루코스 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 니트로소아닐린 및 하기 화학식을 갖는 5-알킬페나진 4차염을 포함하는 방법:
    Figure 112012051039971-pct00056

    (식 중,
    Z 는 -(CH2)mCOOH, -NH-COCH3 및 -OY 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    m 은 0 내지 6 의 범위의 정수이고, Y 는
    Figure 112012051039971-pct00057
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n 은 1 내지 4 의 범위의 정수이고;
    Q 는 -OH, -OR1, -NH2, -NHR2, -NR2R3, -NH(CH2)oNR2R3, -NH(CH2)oOH, -NHCH2CH2-(OCH2CH2)o-G, -(CH2)oNR2R3, -(OCH2CH2)oNR2R3 또는 -(OCH2CH2)oOH 이고; G 는 -COOH, NR2R3 또는
    Figure 112012051039971-pct00058
    이고;
    R1 은 C1 내지 C6 알킬기이고,
    R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고, 각각은 H 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고,
    o 는 1 내지 6 의 범위의 정수이며;
    X 는 할라이드, 설페이트, 알킬 설페이트, 포스페이트, 포스파이트, 카르복실레이트, CF3COO-, CH3OSO2 -, C2H5OSO2 - 및 CH3SO3 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온임).
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