JP2005292021A - 乳酸脱水素酵素の電気化学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇを目的とする検査センサに有用な乳酸脱水素酵素の測定方法を提供する。
【解決手段】 乳酸脱水素酵素を含む試料と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化体、ジアホラーゼ、酸化型電子メディエーターおよび緩衝剤を含む混合液を調製し、ここへ乳酸を添加することにより反応を開始させ、発生する電子を電気化学的に測定することによって、乳酸脱水素酵素を測定する方法を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、電気化学的手法を用いて1つの測定系で乳酸脱水素酵素の酵素活性を測定する方法に関するものである。

乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、ニコチン酸アミドアデニンヌクレオチド還元体（ＮＡＤＨ）、ニコチン酸アミドアデニンヌクレオチド酸化体（ＮＡＤ）を補酵素として、

の反応を触媒する酵素であり、体内に広く分布する。
血清中のＬＤＨ活性の上昇は、心、肺、腎などの各種疾患、悪性腫瘍、白血病、悪性貧血などに見られるため、臨床現場ではこれらの疾患の診断、経過観察などに参考とされている。

従来、酵素活性の測定は、測定対象の酵素と、その酵素の基質と、さらに他の酵素、補酵素及び発色試薬等を添加して成り立つ反応系において、酵素作用により酵素基質に化学反応を行わせ、そのときの反応系の吸光度を測定する方法で行われてきた。

ＬＤＨ活性を測定する場合、上記式にあるように、ＬＤＨと、その基質であるピルビン酸と、補酵素としてＮＡＤＨを添加し、そのＬＤＨの酵素作用により乳酸とＮＡＤを生成させる。つまりピルビン酸より乳酸が生成するのに並行してＮＡＤＨがＮＡＤに変化し、ピルビン酸→乳酸の反応の経過とともにそのＮＡＤＨが減少する。ＮＡＤＨは波長３４０ｎｍにおいて吸光を示す事から、ＮＡＤＨの濃度減少の変化を波長３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸光度測定から知ることができる。従って間接的にＬＤＨの酵素活性を測定できることになる。

この反応は、基質として乳酸、補酵素としてＮＡＤを用い、ＬＤＨの酵素作用によりピルビン酸とＮＡＤＨを生成する逆の反応も可能であり、その場合乳酸→ピルビン酸の反応の経過とともにＮＡＤＨが増加し、その濃度上昇を３４０ｎｍの吸光度で測定することができる。

しかし血清のＬＤＨには個人差があり、また安定なものと不安定なものがあるため、採血当日に測定するか、あるいは後に測定するのであれば−６０℃以下に保存する必要があるなどの点が問題点としてあげられる。

また吸光度測定法は一定以上の量の試料を必要とするため、微量な試料からの酵素の測定には限界がある。また測定対象の酵素の濃度が高い場合、希釈等の操作が必要となり、煩雑な操作や測定時間が延長する等の欠点となっている。

吸光度測定法は、試料の濁りや着色物質の影響を受けやすく、懸濁物を含む反応系に含まれる物質の測定は不可能である。従ってそのような試料を測定する場合、あらかじめ懸濁物の除去など前処理が必要となる。かかる処理には、煩雑な操作が多い上に、操作によって測定値が変化するなどの不安定さが欠点としてあげられる。さらに吸光度測定装置は大型である事が多く、近年さまざまな医療機関や研究機関等で求められているＰＯＣＴ用途を目的とした検査センサの開発に対して大きな課題を残すものである。ＰＯＣＴとは、Point of care testingの略語で、診察現場でのその場診断あるいはその方法を意味する。

このような吸光度測定の欠点を解決するために電気化学的測定法を応用した装置が従来、提案されている（特許文献１）。

この装置は、資料中の酵素が関与して生成もしくは消滅する物質（検知物質）に作用する酵素を固定した膜を添着した酵素電極を２本相互に離間して配置したフローシステムである。この装置では、試料中に当初から含まれていた検知物質の与える電気信号をベース値とし、さらに試料中の酵素の作用によって、その酵素の活性に対応して生成もしくは消滅した物質（検知物質）の与える電気信号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の活性を測定するものである。
特開昭５６−９７８６４号

従来の方法である吸光度測定法では、上記に述べたようにＬＤＨ測定の充分実用的な方法とは言いがたい。しかしながら、ＰＯＣＴ用途を目的とした検査センサに利用しうる、ＬＤＨ測定法はまだ開発されていない。

従って本発明は、ＰＯＣＴ用途を目的とした電気化学的測定法により微量のＬＤＨを安定に測定できる測定方法を提供する事を目的とする。

本発明は、非常に微量のＬＤＨ、たとえば血液検査において参照されるヒトの血清中に含まれるＬＤＨの量である１１５〜２２５Ｕ／Ｌ（０．１１５〜０．２２５Ｕ／ｍｌ）を含む範囲の濃度のＬＤＨを測定することが可能な、ＬＤＨの電気化学的測定方法を提供する。なお、１Ｕは、２５℃において最適条件下で１分間に１マイクロモルの基質の変化を触媒する酵素量を示す。

本発明は、ＰＯＣＴ用途を目的とした検査センサに使用しうる、ＬＤＨを電気化学的に測定する方法に関するものである。
試料中の乳酸脱水素酵素を電気化学的に測定する方法であり、
（ａ）乳酸脱水素酵素を含む試料と、緩衝剤、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する混合液を得る工程と、
（ｂ）該混合液へ乳酸を添加する工程と、
（ｃ）生成した電子を測定する工程
とを有する乳酸脱水素酵素の電気化学的測定法を提供する。

本発明はさらに、緩衝剤、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する組成物、乳酸および電気化学的測定装置を含有してなる、乳酸脱水素酵素測定用キットを提供する。

本発明の方法によって、ヒトの血清中に含まれる程度の微量の乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨという）を電気化学的に測定することが可能である。したがって、本発明の方法は、ＰＯＣＴ診断センサに使用できるＬＤＨ測定方法として有用である。

以下に本発明の実施の形態について説明する。
（実施の形態）
本発明のＬＤＨの電気化学測定方法は、図１に示すように、ＬＤＨを含む試料と、緩衝剤、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤという）、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する混合液を調製する工程（工程１）、この混合液へ乳酸を添加する工程（工程２）、生成した電子を測定する工程（工程３）を有する。

本発明の反応は図２に示したとおりである。すなわち、試料中のＬＤＨにより、工程２で投入した乳酸をピルビン酸とＮＡＤＨへ変換する反応（反応１）、変換により生じたＮＡＤＨおよびジアホラーゼにより酸化型メディエーターを還元型メディエーターへ変換する反応（反応２）、変換により生じた還元型メディエーターを、電極により酸化型メディエーターに変換する反応（反応３）を有する。
反応１〜３により生成する電子を測定し、これによってＬＤＨを電気化学的に測定できるという特徴を有する。

次に、工程１〜３と、反応１〜３について詳細に説明する。
まずはじめにＬＤＨを含む試料と、緩衝剤、ＮＡＤ、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する混合液を調製する（工程１）。緩衝剤、ＮＡＤ、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターは、所定量の液体、例えば血清を投入することにより、所望の濃度の緩衝液中に所望の濃度の各成分を含有する混合液が得られるよう予め混合しておき、ここへＬＤＨを含む液体試料を添加しても、あるいは予め緩衝液中に所定濃度で各成分を含有する溶液を作成しておき、ここへＬＤＨを含む試料を添加してもよい。
ＬＤＨを含む試料を添加した溶液へ、乳酸を添加する（工程２）。乳酸の添加により反応１：
乳酸＋ＮＡＤ → ピルビン酸＋ＮＡＤＨ
が開始する。試料中のＬＤＨがこの反応を触媒する。

生成したＮＡＤＨは次いで、ジアホラーゼの存在下で酸化型メディエーターを還元する。即ち、反応２：
ＮＡＤＨ＋酸化型メディエーター → ＮＡＤ＋還元型メディエーター
が生じる。
還元型メディエーターは、電極において酸化され、反応３：
還元型メディエーター → 酸化型メディエーター＋電子
が生じる。
工程３はこの反応で生じる電子によって生じる電流を測定する。

本発明の方法において、乳酸を含む試料としては、血液、特に血清が想定されるが、乳酸脱水素酵素量を測定する目的で、他の体液由来の試料であっても同様に測定することができる。

本発明の方法において用いられる試薬について、詳細に説明する。
１.乳酸
乳酸は市販されており、特に限定無く用いることができる。乳酸のアルカリ金属塩、たとえば乳酸リチウムとして添加してもよい。乳酸は最終濃度が０.０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０.０５ｍＭ〜５ｍＭ、特に好ましくは０.１ｍＭ〜２ｍＭとなるよう添加する。

２.ジアホラーゼ
ジアホラーゼもまた市販されており、その由来を含め、特に限定無く用いることができる。ジアホラーゼの最終濃度は、測定対象とするＬＤＨの最大濃度の１.０倍以上とする。好ましくは１．２倍以上、特に好ましくは１.５倍以上である。ジアホラーゼ濃度の上限は特に限定的ではなく、ＬＤＨ濃度の１０００倍でも好適な測定が可能である。それ以上であっても差し支えないが、不経済である。
ヒト血清中のＬＤＨの測定において例えば０.５Ｕ／ｍｌまでのＬＤＨを測定対象とするならば、ジアホラーゼ濃度は０.５Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．６Ｕ以上、さらに好ましくは０.７５Ｕ／ｍｌ以上、もっと好ましくは１．０Ｕ／ｍｌ以上とすればよい。ジアホラーゼ濃度の上限は特に限定的ではなく、例えば１００Ｕ／ｍｌまで、より好ましくは５０Ｕ／ｍｌまで、もっと好ましくは１０Ｕ／ｍｌまでとすればよい。

３.酸化型メディエーター
本発明において酸化型メディエータは、ＬＤＨによる酵素反応の結果生成されるＮＡＤＨにより電気化学的に還元され、電極において酸化される物質であれば特に制限はない。かかる物質は数多く知られており、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が例示される。かかる酸化型メディエーターは市販されており、いずれを用いてもよい。特に電極反応の応答の安定性が高い、フェリシアン化物、特にフェリシアン化カリウムが好適に用いられる。

フェリシアン化カリウムを用いる場合、その最終濃度は０.０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０.０５ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０.１ｍＭ〜２ｍＭとするのが好適である。

４.ＮＡＤ
ＮＡＤは市販されており、特に限定なく使用することができる。ＮＡＤは最終濃度が０.０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０.０５ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０.１ｍＭ〜２ｍＭとなるよう調整するとよい。

５.緩衝剤
緩衝剤としては水溶性で、ｐＨを中性〜弱アルカリ性に制御可能なものであれば特に限定無く用いられ、例えばトリス−ＨＣｌ緩衝剤、トリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ヘペス−ＮａＯＨ緩衝剤、リン酸緩衝剤、リン酸緩衝生理的食塩水からなる群から選択されるいずれを用いてもよい。

緩衝剤は最終濃度が１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３５ｍＭ〜１００ｍＭとなるよう用いるのが好ましい。緩衝剤は、ｐＨ８.０〜９.０、好ましくは８.２〜８.８、さらに好ましくは８.３〜８.５の緩衝液を与えることができるものが、好適に用いられる。

本発明の方法の工程３において電子を測定する装置としては、電極を検出素子として、測定物質により電極界面で起こる電流変化を検知し得るものであれば、特に限定なく用いることができる。一般的には絶縁基板表面に作用極、対極、参照電極が形成され、作用極と参照電極の電位差を外部回路により一定とし、作用極と対極との間に流れる電流を検出する、３電極方式のセンサが好適に用いられる。かかる装置はよく知られたものであり、種々のものが市販されている。

本発明のより具体的な実施の形態について以下に述べる。
使用試薬
１. １０ｍＭ 乳酸リチウム
２. １０ｍＭ βＮＡＤ＋
３. １０００Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＤＩＡＰＨＯＲＡＳＥ （Ｄｉ−１）Bacillus stearothermophilus由来（ユニチカ株式会社））
４. １０ｍＭ フェリシアン化カリウム (酸化型メディエーター)
５. １０ｍＭ ＮＡＤ
６. ５００ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液 （ｐＨ８.５）
７. １０００Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ
また電気化学測定装置としてＢＡＳ１００ＢＷ（ビー・エー・エス株式会社）を、電極は３電極方式を用いた。

以下実施例１を図１を用いて説明する。
図1に示す工程１ではそれぞれの最終濃度が
１．１ｍＭ ＮＡＤ
２．１００Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ
３．１ｍＭ フェリシアン化カリウム
４．１ｍＭ ＮＡＤ
５．５０ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液 （ｐＨ８.５）
６．０〜１.０Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ
になるよう、混合液を調製した。
得られた混合液中へ３電極を設置し、２分後に乳酸を添加する工程２を行った。乳酸は最終濃度が１ｍＭとなるように添加した。電流値の測定は合計で５分間行った。結果を図３に示す。

図３はジアホラーゼの濃度を１００Ｕ／ｍｌとした際の、ＬＤＨ終濃度と電流値変化率の相関を表したグラフである。ＬＤＨの濃度が上昇するのに比例して電流値変化率が上昇し、ＬＤＨ濃度を正確に測定することが可能であった。即ち、正常人の血清中のＬＤＨ濃度の正常範囲である０.１１５〜０.２２５Ｕ／ｍｌに加えて異常範囲として参照される範囲も含む、０〜１.０Ｕ／ｍｌのＬＤＨ濃度を正確に測定し得た。

使用試薬
１．１０ｍＭ 乳酸
２．１０ｍＭ ＮＡＤ
３．１０００Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＤＩＡＰＨＯＲＡＳＥ （Ｄｉ−１） Bacillus stearothermophilus由来（ユニチカ株式会社））
４．１０ｍＭ フェリシアン化カリウム（酸化型メディエーター）
５．１０ｍＭ ＮＡＤ
６．５００ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液 （ｐＨ８.５）
７．１０００Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ
また電気化学測定装置としてＢＡＳ１００ＢＷ（ビー・エー・エス株式会社）を、電極は３電極方式を用いた

以下実施例を図１を用いて説明する。
まず工程１では、それぞれの最終濃度が
１．１ｍＭ ＮＡＤ
２．０〜２．５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ
３．１ｍＭ フェリシアン化カリウム
４．１ｍＭ ＮＡＤ
５．５０ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液 （ｐＨ８.５）
６．１.０Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ
になるように混合液を調製した。
この混合液へ３電極を設置し、２分後に乳酸を添加する工程２を行った。乳酸は最終濃度が１ｍＭとなるように添加した。電流値の測定は合計で５分間行った。結果を図４に示す。

図４はＬＤＨの濃度を１.０Ｕ／ｍｌとし、ジアホラーゼの濃度を０、０.５、１.０、１．５、２.０、２.５Ｕ／ｍｌと変動させた際の、反応開始時間の変化を表したグラフである。ジアホラーゼ濃度が１．５Ｕ／ｍｌで反応時間が１秒未満になり、以降大きな変化は無い。従って、ジアホラーゼの濃度がＬＤＨの濃度の１．５倍以上で効率の良い反応が起きていることがわかる。

実施例１ではジアホラーゼの濃度を１００Ｕ／ｍｌとし、ＬＤＨの濃度を０.１〜１.０Ｕ／ｍｌの間で変動させた。つまりＬＤＨ濃度の１０００〜２５０倍のジアホラーゼを用いた場合に、ＬＤＨ濃度を正確に測定可能であることが示された。実施例２からは、ジアホラーゼがＬＤＨの濃度の１.５倍以上である場合にＬＤＨの活性測定が可能である事が示される。

以上実施例１と２は、酸化型電子メディエーターとしてフェリシアン化カリウムを用いた場合について説明したが、従来から知られている他の電子メディエーター、たとえばキノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等を用いた場合も同様の効果が得られることは当然に予測される。

また、実施例では緩衝剤としてトリスＨＣｌ緩衝剤を用いたが、本発明の反応を障害することなく、ｐＨを同様の範囲に調節できるものであれば種々の緩衝剤が同様に用いられることが容易に理解されるべきである。たとえばトリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ヘペス緩衝剤、リン酸緩衝剤、およびＰＢＳ等を用いた場合でも、同様の測定が可能であることは当然に理解されるべきである。

以上の本発明の説明から明白なように、本発明の方法は以下の特徴を持つ。
（１）ＬＤＨを電気化学的に測定できる
（２）人の血清中に含まれるＬＤＨの正常値１１５〜２２５Ｕ／Ｌを含む範囲のＬＤＨの測定が可能である。
（３）電子メディエーターを酸化還元する酵素であるジアホラーゼと、ＬＤＨの濃度は相関性がある

従って、従来の方法に比較して次のようなメリットを有することは明らかである。
（１）操作が簡単で再現性が高い
（２）検査に必要な濃度の範囲のＬＤＨを測定する事が出来る
（３）ＰＯＣＴを用途とする検査センサに必要な、ジアホラーゼと検査対象のＬＤＨの濃度関係がはっきりしている。

すなわち、本発明の方法は、発明が解決しようとする課題で述べた課題をすべてクリアし、ＰＯＣＴを用途とする検査センサに使用できるＬＤＨの測定方法として必要な条件をすべて達成していることが分かった。

本発明のＬＤＨ測定方法は、操作が簡単で、結果が安定しており、微量なＬＤＨの検出が可能である。したがって、ＰＯＣＴ用途を目的とした検査センサ用に有用である。

本実施形態のＬＤＨ測定原理を説明する図。 本実施形態のＬＤＨ測定方法を説明する図。 実施例１における、ＬＤＨ測定結果を示す図。 実施例２における、ＬＤＨとジアホラーゼの濃度比と反応開始時間の関係を示す図。

Claims (7)

1. 試料中の乳酸脱水素酵素を電気化学的に測定する方法であり、
   （ａ）乳酸脱水素酵素を含む試料と、緩衝剤、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する混合液を得る工程と、
   （ｂ）該混合液へ乳酸を添加する工程と、
   （ｃ）生成した電子を測定する工程
   とを有する乳酸脱水素酵素の電気化学的測定法。
2. 緩衝剤は、トリス緩衝剤、トリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ヘペス緩衝剤、リン酸バッファーおよびリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素の電気化学的測定法。
3. 乳酸の添加により反応が開始することを特徴とする、請求項１記載の乳酸脱水素酵素の電気化学的測定法。
4. 乳酸脱水素酵素を含む試料が血清である、請求項１から３いずれかに記載の方法。
5. ジアホラーゼの濃度が測定対象とする乳酸脱水素酵素濃度の最大値の１倍以上であることを特徴とする、請求項１から４いずれかに記載の乳酸脱水素酵素の電気化学的測定法。
6. 緩衝剤、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび酸化型メディエーターを含有する組成物、乳酸および電気化学的測定装置を含有してなる、乳酸脱水素酵素測定用キット。
7. 電気化学的測定装置が、３電極測定装置である、請求項６記載のキット。
   

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