KR101083031B1 - Ｎａｄｈ 선택적 형광 화학센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 NADH를 선택적으로 검출할 수 있는 형광 화학센서에 관한 것이다. 화학식 1의 화합물은 NADH 검출에 있어 다른 음이온에 대비하여 높은 선택성을 가진다. 화학식 1의 화합물과 NADH와의 결합으로 인한 형광 변화는 육안으로도 관찰 가능하고, 반응 직후 신속한 탐지가 가능하며, 다양한 pH 범위 내에서 검출이 가능하기 때문에, 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물을 이용하여 생체 시료 및 일반 시료에서 NADH를 효율적으로 검출할 수 있다. 또한 상기 조성물을 이용하여 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 다양한 효소의 활성을 측정할 수 있고, 상기 효소의 활성화제 또는 억제제를 고속 스크리닝할 수 있다.
NADH, 형광 화학센서

Description

ＮＡＤＨ 선택적 형광 화학센서 {NADH-Selective Fluorescence Chemosensor}
본 발명은 NADH를 선택적으로 검출할 수 있는 형광 화학센서에 관한 것이다.
NADH는 Nicotinamide adenine dinucleotide reduced form의 약어로, NAD의 환원형태이며 비타민 B3의 환원된 조효소의 형태로서 전자, 즉 에너지가 풍부하다. 이러한 NADH는 생체내의 중요한 전자 공여체로서 수많은 신진대사 활동에서 서로 상호 변환될 뿐만 아니라 신체 내 다양한 효소들의 조효소로 작용한다. 즉 이 조효소는 세포 내에서 NAD+의 산화형태와 NADH의 환원형태로 존재하며, NAD는 산화제로서 다른 분자로부터 전자를 받아서 환원형태인 NADH로 되고, 다시 NADH는 환원제로서 전자를 주는 역할을 한다.
NADH의 양의 측정 방법은 일반적으로 탈수소화효소(dehydrogenase)를 이용한 전극을 이용하여 전기화학적으로 측정하는 것을 기초로 한다. 즉, 탈수소화효소에 의해 NADH가 산화될 때 생성되는 전자의 양을 정량함으로써 NADH의 양을 측정한다. 하지만 이러한 방법은 효소를 사용하기 때문에 온도, pH, 염 농도 등 주위 환경에 매우 민감하며, 따라서 NADH 양의 측정에 어려움이 따른다.
효소 등을 이용하여 NADH를 검출하는 다양한 전기 화학센서들이 개발되었지만, 초분자 화학을 이용하여 NADH를 인지하고 센싱하는 형광 화학센서들은 그 사용의 편리성에도 불구하고 개발된 예가 거의 없다.
따라서 본 발명은 NADH에 대한 높은 선택성과 감도를 갖는 형광 화학센서, 이러한 NADH 형광 화학센서를 이용한 NADH의 검출 방법, NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성 측정용 조성물 및 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성화제 또는 억제제 스크리닝용 조성물을 제공함을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 NADH를 효과적으로 인지하는 형광 주인 화합물인 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 제공한다. 또한 상기 화학식 1의 화합물의 형광 변화를 탐지함으로써 생체 내외에서 NADH를 검출하는 방법, NADH 혹은 NAD+를 조효소로 사용하는 효소의 활성을 측정하는 방법, 이러한 효소의 활성화제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112009011782574-pat00001
화학식 1의 화합물은 NADH 검출에 있어 다른 음이온에 대비하여 높은 선택성을 가진다. 화학식 1의 화합물과 NADH와의 결합으로 인한 형광 변화는 육안으로도 관찰 가능하고, 반응 직후 신속한 탐지가 가능하며, 다양한 pH 범위 내에서 검출이 가능하기 때문에, 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물을 이용하여 생체 시료 및 일반 시료에서 NADH를 효율적으로 검출할 수 있다. 또한 상기 조성물을 이용하여 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 다양한 효소의 활성을 측정할 수 있고, 상기 효소의 활성화제 또는 억제제를 고속 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112009011782574-pat00002
화학식 1의 화합물은 플루오레세인(fluorescein)에 수은(Ⅱ) 아세테이트가 결합된 분자로, 밝은 적색을 띄는 물질이다. 플루오레세인은 적갈색을 띄며, 물에 녹기는 어렵지만 알칼리 수용액에 잘 녹아 녹색 형광을 발하며 미량으로도 색을 나타낸다. 이 화합물 그대로 또는 나트륨염 상태로 흡착 지시약, 형광지시약 등의 분석 지시약으로 사용되며, 높은 형광 양자 수율과 우수한 pH 선택성 등으로 인하여 많은 생물체계 안에서 형광 반응을 나타내어 광범위한 사용이 가능한 것으로 알려져 있다. 화학식 1의 화합물은 플루오레세인 발색단의 영향으로 형광을 띄긴 하지만, 플루오레세인만큼 큰 형광을 나타내지는 않는다.
실험실에서 대부분의 알켄(alkene)들은 옥시수은 첨가반응 (Oxymercuration)에 의해 수화가 가장 잘 일어난다. 알켄은 수은 아세테이트 (Hg(OAc)2)로 처리하면 이중결합의 친전자성 첨가반응이 빨리 일어나게 된다. 중간체인 유기수은(Organomercury)화합물을 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride) 또는 NaBH4로 처리하면 수은 이탈반응(Demercuration)이 일어나 환원되어 알코올이 생성된다. 본 발명자들은 이 옥시수은 첨가반응의 마지막 단계인 수은이탈 반응에 착안하여, 환원제로 쓰이는 NaBH4 대신 생체 내 환원제인 NADH 또는 L-아스코르브산을 화학식 1의 화합물을 환원시키면 하기 반응식 1과 같은 반응이 일어나 형광이 증가할 것으로 예상하였다.
<반응식 1>
Figure 112009011782574-pat00003
그러나 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 놀랍게도 화학식 1의 화합물에 NADH를 가하였을 때 반응물의 형광이 크게 감소함을 발견하였다. 즉, NADH의 존재시 NADH와 화학식 1의 화합물이 반응하여 예상되는 달리 형광의 감소를 나타내게 된다.
따라서, 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 이용하면 시료와 상기 조성물 간의 반응으로 인한 형광의 변화 여부를 탐지함으로써 NADH를 검출할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 완충용액을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로 형광 화학센서는 pH에 민감하기 때문에 완충용액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 완충용액은 상기 화학식 1의 화합물의 NADH에 대한 민감도나 시료의 반응성을 고려하여 그 종류와 농도를 선택할 수 있으며, 완충용액의 종류나 농도가 특별히 제한되는 것은 아니다.
한 측면에서, 상기 완충용액은 소듐 포스페이트 완충용액(Sodium Phosphate Buffer, SPB)일 수 있다. 소듐 포스페이트 완충용액은 pH 6 내지 pH 9에 이르는 완충범위를 가지므로 시료가 생체물질일 경우에도 본 발명의 NADH 검출용 조성물이 시료의 반응성에 미치는 영향을 최소화할 수 있다.
완충용액의 농도는 NADH에 대한 상기 화학식 1의 화합물의 민감도가 최적이 될 수 있도록 적절히 조정할 수 있다. 그러나, 완충용액의 농도는 완충용액의 완충 능력을 유지하기 위해 조절하는 것일 뿐, 완충용액의 농도가 본 발명의 NADH 검출용 조성물의 검출능을 좌우하는 것은 아니다. 완충용액의 적정 농도는 완충용액의 종류와 염의 종류 및 농도에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 소듐 포스페이트 완충용액의 농도는, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.5 mM 내지 5M 일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 완충용액은 추가로 염을 포함할 수 있다. 상기 염은 완충용액의 완충 능력을 증가시키기 위해 포함될 수 있다. 상기 염은 완충용액의 종류나 농도를 고려하여 그 종류와 농도를 선택할 수 있으며, 염의 종류나 농도가 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 염은 NaCl 또는 NaNO3일 수 있다. 염의 농도는 완충용액의 농도와의 상관 관계를 고려하여, NADH에 대한 상기 화학식 1의 화합물의 민감도가 최적이 될 수 있도록 적절히 조정할 수 있다. 예를 들어, 상기 염의 농도는 0.5 mM 내지 5M일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, pH 6 내지 pH 9를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 조성물이 pH 6 내지 pH 9의 pH 범위를 갖는 경우 시료가 생체물질일 경우에도 본 발명의 NADH 검출용 조성물이 시료의 반응성에 미치는 영향을 최소화할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 생체 pH 범위인 pH 7.0 내지 pH 7.8일 수 있다. 다만 본 발명의 한 예일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 센서를 제공한다. 효과적인 화학센서의 중요한 변수는 우수한 감도(sensitivity)와 선택성(selectivity)이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 화학식 1의 화합물을 이용하면 수 μM 의 미량의 NADH도 감지할 수 있음이 정량실험을 통해 확인되었다. 또한 화학식 1의 화합물은 신체 내에 존재하는 다양한 음이온에 비해 NADH-선택적인 형광 감응성을 보임이 NAD, AMP, ADP, ATP, CTP, GTP, CI-, CO3-, HSO4 -, SO4 2-, OAc-, NO3 -, ClO4 -와의 형광 변화 비교 실험을 통해 확인되었다. 이처럼 화학식 1의 화합물은 NADH 검출에 있어 감도와 선택성이 우수할 뿐만 아니라, 형광 감소가 육안으로도 관찰 가능하고, 반응 직후 형광 변화의 신속한 탐지가 가능하다는 점에서 NADH 검출용 센서에서의 사용을 위해 매우 유용하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 센서는 0.1μM 내지 1M의 NADH를 검출할 수 있다. 하기 실시예에 따르면 상기 범위 내에서 화학식 1의 화합물에 대한 NADH 농도가 증가할수록 형광 감소 폭이 커져 감도와 선택성이 우수해지는 경향이 있음을 알 수 있다. 그러나, 이는 본 발명의 한 예일 뿐이며, 본 발명의 센서의 NADH 검출 범위는 화학식 1의 화합물의 농도, 또는 완충용액이나 염의 종류나 농도에 따라서도 변동될 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물과 시료를 접촉시키고, 상기 화학식 1의 화합물과 시료와의 반응으로 인한 형광의 변화 여부를 탐지하는 것을 포함하는 NADH의 검출 방법을 제공한다. 화학식 1의 화합물에 NADH를 가해지는 경우 이들 간의 반응으로 인하여 형광이 크게 감소하는바, 시료와 접촉시킨 화학식 1의 화합물의 형광 감소 여부를 탐지함으로써 시료에 NADH가 존재하는지 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 포함하는, NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성 측정용 조성물 및 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소 및 그의 기질과 접촉시키고, 이들 간의 반응으로 인한 형광 변화 여부를 탐지하는 것을 포함하는 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성 측정 방법을 제공한다.
NADH는 생체내의 중요한 전자 공여체로서 신체 내 다양한 효소들의 조효소로 작용한다. 즉 이 조효소는 세포내에서 NAD+의 산화형태와 NADH의 환원형태로 존재하며, NAD는 산화제로서 다른 분자로부터 전자를 받아서 환원형태인 NADH로 되고, 다시 NADH는 환원제로서 전자를 주는 역할을 한다. 따라서 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소와 그 기질을 접촉시키고 여기에 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물을 가한 후 형광 변화를 탐지하여 NADH의 양을 측정함으로써 효소의 활성 측정이 가능하다. 예를 들어, NADH를 환원제로 이용하는 효소가 활성화된 경우 NADH가 많이 산화되어서 화학식 1의 화합물과 반응하는 NADH의 양이 줄어드는바, 형광 감소 폭도 줄어든다. 반대로 상기 효소 활성이 억제된 경우 NADH 가 산화되지 않고 많이 남아있어서 화학식 1의 화합물과 반응하는 NADH의 양이 많아지는바, 형광 감소 폭이 커진다. 이와 같은 원리로 본 발명의 NADH 검출용 조성물의 형광 변화에 따라 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 탈수소효소 또는 산화환원효소일 수 있다. 예를 들어, 상기 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소, 피루브산 탈수소효소, NADH 탈수소효소 등을 포함한다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 포함하는, NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성화제 또는 억제제 스크리닝용 조성물 및 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소 및 시험대상물질과 접촉시키고, 이들 간의 반응으로 인한 형광 변화 여부를 탐지하는 것을 포함하는, NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성화제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
예를 들어, NADH를 환원제로 사용하는 효소의 활성화제에 의해 상기 효소가 활성화되면, NADH가 많이 산화되어서 화학식 1의 화합물과 반응하는 NADH의 양이 줄어드는바, 형광 감소 폭도 줄어든다. 반대로 NADH를 환원제로 사용하는 효소의 억제제에 의해 상기 효소 활성이 억제되면, NADH 가 산화되지 않고 많이 남아있어서 화학식 1의 화합물과 반응하는 NADH의 양이 많아지는바, 형광 감소 폭이 커진다. 이와 같은 원리를 이용하면 화학식 1의 화합물의 형광 변화에 따라 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성화제 또는 억제제를 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 탈수소효소 또는 산화환원효소일 수 있다. 예를 들어, 상기 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소는, 이에 제한되는 것은 아니나, 알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소, 피루브산 탈수소효소, NADH 탈수소효소 등을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
하기 실시예에 사용된 시약 및 기기를 먼저 설명하면 다음과 같다.
합성에 필요한 모든 시약은 Aldrich, Sigma, T.C.I 사로부터 구입하였다. 화학식 1의 화합물은 중앙대학교 화학과 분자인지 실험실의 류대훈씨에게서 합성받았 다. L-아스코르빈산은 Aldrich의 것을, NaNO3, NaH2PO42H2O는 Junsei Chemical Co.,Ltd의 것을, NADH, AMP, ADP, ATP, GTP, CTP, TTP는 sigma사의 것을, 그리고 NAD는 T.C.I 사의 것을 사용하였다. 형광기기는 SCINCO사의 FluoroMaster Plus를 사용하여 웨이브 스캔의 방출 모드로 측정하였다. 실험조건은 PMT voltage는 700V, PMT 인태그레이션 타임은 5초, 단색기(Monochromator) 속도는 10000(nm/min)으로 하였다. 익사이팅 슬릿과 방출 슬릿은 각각 10nm과 5nm으로 설정했다. 익사이팅 파장은 470nm으로 설정하여 방출 시작 파장은 480nm, 방출 종료 파장은 700nm으로 하였다. pH 측정기는 METTLER TOLEDO사의 SevenEasy pH Meter 모델을 사용하여, pH 4.00와 7.00으로 보정하고 측정하였다.
<실시예 1> 화학식 1의 화합물의 합성
플루오레세인 1.0 g을 메탄올에 넣고 수은 아세테이트 4.79 g을 가하고 50℃에서 4시간 동안 환류하였다. 반응 종료 후 침전을 여과한 후 아세톤으로 씻고 건조하여 화학식 1의 화합물을 얻었다.
<실시예 2> 완충용액의 선택
형광 화학센서의 선택성 및 감도가 최적이 되는 용매를 찾기 위하여 다양한 농도의 완충용액과 다른 종류의 염을 넣은 용매를 만들어 형광을 측정하였다. 우선 pH 6.00~ pH 9.00에 이르는 완충범위를 갖는 소듐 포스페이트(이하 SPB)를 선택하 였고, 염으로는 NaCl과 NaNO3를 선택하여 다양한 농도로 만들었다. pH에 따른 영향을 배제하기 위하여 용매의 pH는 모두 7.20으로 만들었다.
1) pH 7.20인 0.01M SPB(with 0.6M NaCl)을 1mM 농도까지 3차 증류수로 희석하여 5mM, 2.5mM, 1mM농도의 SPB를 만들었다. 화학식 1의 화합물을 3차 증류수로 녹여 100μM의 저장 용액을 만들었다. 그리고 L-아스코르빈산과 NADH 역시 3차 증류수로 2mM 농도의 저장 용액을 만들었다. 앞에서 만든 버퍼로 1μM 화학식 1의 화합물을 포함하는 용액(이하 Flu-Hg)을 만들고 20초 동안 볼텍싱하였다. 2시간 동안 평형에 도달하게 한 후 형광을 측정했다. 같은 종류의 버퍼로 같은 농도의 Flu-Hg 샘플을 만든 후 아스코르빈산과 NADH를 각각 20μM의 농도가 되도록 넣고 2시간 후 각각의 형광을 측정하여 관찰했다. 이 완충용액을 1/2배, 1/4배, 1/10배로 희석하여 같은 방법으로 형광을 측정했다. 형광 측정시 exciting 파장은 470nm으로 설정하여 480nm에서 700nm까지의 파장의 형광을 측정하였다. 2) 1M SPB(with 1M NaNO3)에서부터 25mM SPB까지 3차 증류수로 희석하여 다양한 농도의 완충용액을 만들었다. 1)과 같은 방법으로 형광변화를 측정했다.
상기 실험의 결과, 화학식 1의 화합물에 L-아스코르빈산와 NADH를 각각 가했을 때 L-아스코르빈산을 가한 샘플은 형광변화가 거의 없었으며 NADH를 가한 샘플은 형광감소를 나타내었다.
1) 염으로 NaCl 을 사용한 경우
0.01M SPB(with 0.6M NaCl)를 만들고 각각 5mM, 2.5mM, 1mM 로 희석하여 각 각의 완충용액으로 형광을 측정한 결과가 도 1 내지 도 4에 나타나 있다. 각각의 도면에 나타나듯이 Flu-Hg, L-아스코르빈산을 첨가한 경우에 비해 NADH를 첨가한 경우 형광 세기가 감소되었다. 또한 도 1 내지 도 4를 비교해 보면, 이 버퍼 농도가 낮을수록 Flu-Hg의 형광 세기가 증가하는 경향성을 보였고, NADH의 형광 세기 역시 증가하였다. 따라서 1mM 내지 0.01M의 버퍼에서 NADH의 검출이 가능하였으나, 5mM SPB(with 0.3M NaCl) 이하의 버퍼는 Flu-Hg와 NADH의 형광 세기 차이가 작아 감도가 떨어진다고 여겨진다. 따라서 SPB의 농도를 증가시키고 염도 NaNO3로 바꾸어 버퍼를 다시 만들어 형광을 측정해 보았다.
2) 염으로 NaNO3 를 사용한 경우
1M SPB (with 1M NaNO3)와 이것을 희석하여 0.5M 내지0.1M의 SPB를 만들어 형광을 측정한 결과가 도 5 내지 도 7에 나타나 있다. 각각의 도면에 나타나듯이, Flu-Hg, L-아스코르빈산 를 첨가한 경우에 비해 NADH를 첨가한 경우 형광 세기가 현저히 감소되었다. 또한 도 5 내지 도 7을 비교해보면, 이 버퍼는 SPB의 농도가 증가할 수록 Flu-Hg, L-아스코르빈산을 첨가한 경우의 형광세기는 큰 변화를 보이지 않은 반면 NADH의 형광세기는 현저하게 감소하였다. 따라서 0.1M 내지 1M 의 버퍼에서 NADH의 검출이 가능하였으나, 0.1M 이상에서 특히 형광 세기 차이가 현저하여 감도가 좋다고 여겨진다. 특히 1M의 SPB시스템에서 가장 감도가 좋다고 판단, 이후 실험에서는 1M SPB(with 1M NaNO3)로 모든 실험을 진행하였다.
<실시예 3> pH 에 따른 형광 변화
Flu-Hg가 pH변화에 따른 선택성을 나타내는지 알아보기 위해 완충용액의 pH를 6.00, 6.50, 7.20, 8.00, 9.00으로 변화시킴에 따라 어떠한 형광 세기 변화를 나타내는지 측정하였다.
NaNO3,, NaH2PO42H2O로 pH 6.00, 6.50, 7.20, 8.00, 9.00인 1M SPB(with 1M NaNO3,)를 만들었다. 이 때 용매는 3차 증류수를 사용하였다. 첫 번째 샘플은 pH 6.00인 1M SPB에 100μM의 Flu-Hg stock solution을 30μℓ만큼 취해 최종농도가 1μM Flu-Hg인 샘플을 만들었으며, 두 번째 샘플은 동일 완충용액으로 최종 농도가 1μM Flu-Hg에 20μM L-아스코르빈산이 되도록 2mM L-아스코르빈산 stock solution 30μℓ을 첨가하였다. 세 번째 샘플 역시 같은 완충용액으로 최종 농도가 1μM Flu-Hg에 20μM NADH가 되도록 NADH stock solution을 첨가하였다. 세 가지 샘플을 vortex로 20초 동안 흔들고 2시간 동안 평형에 도달하게 한 후 각각 형광을 측정하였다. pH 6.50, 7.20, 8.00, 9.00의 1M SPB를 사용하여 동일한 방법으로 형광을 측정하였으며 실험에 쓰이는 Flu-Hg의 최종농도는 항상 1μM이 되도록 실험하였다.
실험 결과는 도 8 내지 도 12 에 나타나 있다. 각 도면에서 보듯, 각각의 pH에서 Flu-Hg, L-아스코르빈산을 첨가한 경우에 비해 NADH를 첨가한 경우 형광 세기가 감소되어 NADH의 검출이 가능함을 알 수 있다. 특히 pH 7.20일 때 NADH를 가한 Flu-Hg의 형광이 현저하게 감소하였는데, 이것으로 보아 Flu-Hg가 pH 7.20에서 특히 선택적인 형광변화를 일으킴을 알았다.
<실시예 4> 시간에 따른 형광 변화
반응 시간에 따른 NADH 센서의 감도 변화를 알아보기 위하여 pH 7.20에서, 1M SPB 을 사용하여 1μM의 Flu-Hg에 20μM의 NADH를 가한 샘플을 만든 직후 형광셀에 넣어 형광을 측정하였다. 그리고 그것을 기준으로 30분 간격으로 4시간 동안 형광을 측정하였다. 이때 470nm에서 exciting시켜 480nm에서 700nm사이의 형광 스펙트럼을 얻었다.
그 결과, 도 13에 보여지듯 시간에 따른 형광변화는 거의 보이지 않았다.
<실시예 5> NADH의 농도 증가에 따른 형광 변화 및 형광 적정
Flu-Hg의 NADH에 대한 농도 의존성을 밝혀내기 위해 NADH의 농도증가에 따른 형광 스펙트럼을 관찰하였다. pH 7.20인 1M SPB을 이용하여 1μM Flu-Hg의 시료를 만들고 이것의 형광을 측정하였다. 또한 NADH stock solution을 이용하여 다양한 농도의 NADH와 최종 농도가 1μM Flu-Hg인 혼합 용액을 만들었다. (NADH의 최종농도, 1μM, 2.5μM, 5μM, 7.5μM......80μM까지). 이 샘플들을 vortex로 약 20초정도 흔들고 2시간 동안 평형에 도달하게 한 후 470nm에서 exciting시켜 480nm에서 700nm사이의 형광 스펙트럼을 관찰하였다.
그 결과, 도 14 및 도 15 에서 보듯 NADH 농도가 증가할수록 형광이 감소되었다. 특히 NADH의 농도가 15μM 이상일 때부터 현저한 형광 감소를 나타내었으며, NADH농도가 30μM 이상일 때부터 형광 세기 변화가 급격히 감소하여 80μM에서 포 화 되었다. 이렇게 형광적정 실험을 통해 정량한 결과, Flu-Hg의 NADH에 대한 검출한계는 1.06 x 10-8 M이 얻어졌다.
<실시예 6> 여러 가지 음이온에 대한 형광 변화
NADH 이외의 다른 생체 내 음이온들에 대한 Flu-Hg의 감도를 알아보기 위하여, pH 7.20, 1M SPB에 1μM Flu-Hg을 녹여 형광을 측정하고, 같은 농도의 Flu-Hg에 20μM농도의 NAD, AMP, ADP, ATP, CTP, GTP 및 Cl-, CO3 -, HSO4 -, SO4 2-, OAc-, NO3 -, ClO4 - 음이온을 각각 가하여 형광을 측정하였다.
pH 7.20, 1M SPB에 1μM의 Flu-Hg가 되도록 100μM Flu-Hg stock solution 30㎕을 넣는다. 그리고 상기 음이온들을 3차 증류수에 녹여 각각 2mM의 stock solution을 만들었다. 여기에 만들어 놓은 음이온들의 stock solution 30㎕을 각각 가하여 20μM의 NAD, AMP, ADP, ATP, CTP, GTP 및 다양한 음이온을 가한 샘플이 되게 하였다. 2시간 후 형광을 측정하여, 아무것도 가하지 않은 1μM의 Flu-Hg의 형광과 비교하였다. 모든 샘플의 최종 부피는 3mL로 하였다.
그 결과, 도 16 에 나타난 것처럼 상기 음이온들에 대해서는 Flu-Hg 가 형광 변화를 보이지 않았다. 이 음이온들을 가했을 때의 최대 intensity변화가 4000정도로 5~12%의 감소를 보였는데, 이는 같은 농도인 20μM NADH을 가했을 때 변화에 비하면(약 22000정도- 66.10% 감소) 의미 있는 형광 변화가 아니라 여겨진다. 따라서 이 실험을 통해 Flu-Hg가 NADH에만 선택적인 형광변화를 보임을 알 수 있었으며 이것으로 생체 관련 시료들의 분석에 대한 응용가능성을 확인할 수 있었다.
도 1은 pH 7.20, 0.01M SPB(with 0.6M NaCl)에서의 형광 변화를 나타낸 표이다.
도 2는 pH 7.20, 5mM SPB(with 0.3M NaCl)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 3은 pH 7.20, 2.5mM SPB(with 0.15M NaCl)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 4는 pH 7.20, 1mM SPB(with 60mM NaCl)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 5는 pH 7.20, 1M SPB(with 1M NaNO3)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 6은 pH 7.20, 0.5M SPB(with 0.5M NaNO3)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 7은 pH 7.20 0.1M SPB(with 0.1M NaNO3)에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 8은 1M SPB (with 1M NaNO3), pH 6.00에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 9는 1M SPB (with 1M NaNO3), pH 6.50에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 10은 1M SPB (with 1M NaNO3), pH 7.20에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 11은 1M SPB (with 1M NaNO3), pH 8.00에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 12는 1M SPB (with 1M NaNO3), pH 9.00 에서의 형광변화를 나타낸 표이다.
도 13은 pH 7.20, 1M SPB(with 1M NaNO3)에서 화학식 1의 화합물 1μM에 20μM NADH를 반응시켰을 때 시간에 따른 형광변화를 나타낸 표이다.
도 14는 pH 7.20, 1M SPB (with 1M NaNO3) 에서 NADH농도 증가에 따른 화학식 1의 화합물의 형광 적정 스펙트럼을 나타낸 표이다. [Flu-Hg]=1 x 10-6M
도 15는 pH 7.20, 1M SPB(with 1M NaNO3) 에서 NADH의 농도에 따른 형광 적정 변화 그래프를 나타낸 표이다. [Flu-Hg]=1 x 10-6M
도 16은 pH 7.20, 1M SPB(with 1M NaNO3) 에 화학식 1의 화합물 1μM 과 20μM의 NAD, AMP, ADP, ATP, CTP, GTP, Cl-, CO3 -, HSO4 -, SO4 2-, OAc-, NO3 - ,ClO4 - 음이온들을 첨가하였을 때의 형광변화를 나타낸 표이다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112009011782574-pat00004
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 완충용액을 추가로 포함하는 것인 NADH 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 완충용액은 소듐 포스페이트 완충용액인 NADH 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 소듐 포스페이트 완충용액의 농도는 0.5 mM 내지 5 M 인 NADH 검출용 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충용액은 추가로 염을 포함하는 것인 NADH 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 염은 NaCl 또는 NaNO3인 NADH 검출용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 염의 농도는 0.5 mM 내지 5M인 NADH 검출용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 6 내지 pH 9를 갖는 것인 NADH 검출용 조성물.
  9. 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 센서.
  10. 삭제
  11. 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물과 시료를 접촉시키고,
    상기 화학식 1의 화합물과 시료와의 반응으로 인한 형광의 변화 여부를 탐지하는 것을 포함하는
    NADH의 검출 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소 및 그의 기질과 접촉시키고,
    이들 간의 반응으로 인한 형광 변화 여부를 탐지하여 NADH의 양을 측정하는 것을 포함하는
    NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성 측정 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 화학식 1의 화합물을 포함하는 NADH 검출용 조성물을 NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소 및 시험대상물질과 접촉시키고,
    이들 간의 반응으로 인한 형광 변화 여부를 탐지하여 NADH의 양을 측정하는 것을 포함하는
    NADH 또는 NAD를 조효소로 사용하는 효소의 활성화제 또는 억제제 스크리닝 방법.
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