JPH09505999A - 酵素によるモルフィン−６−グルクロニドまたは置換モルフィン−６−グルクロニドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少くとも１種類のβ−グルクロニダーゼを使用して、モルフィン−３，６−ジグルクロニドまたは置換モルフィン−３，６−ジグルクロニドにおける３−グルクロニド部分を選択的酵素分割する、モルフィン−６−グルクロニドの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素によるモルフィン−６−グルクロニドまたは 置換モルフィン−６−グルクロニドの製造方法 本発明は、酵素によるモルフィン−６−グルクロニドまたは置換モルフィン− ６−グルクロニドの製造方法に関する。 モルフィン−６−グルクロニド（モルフィン−６−β−Ｄ−グルクロニド、Ｍ −６−Ｇとも称される）は、人体内におけるモルフィンの代謝産物であって、モ ルフィン自体よりも強力な鎮痛作用を示す（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １９８８、 ８２８におけるＲ．オズボーンらの論稿およびこれに引用されている文献参照） 。これはすでにＨ．ヨシムラら（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ１９６８、１ ６ 、２１１４）およびその他、例えばＰ．Ａ．キャルプトら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈ ｅｍ．１９９１、３４、１２７２）により、ケーニヒス、クノル法により合成さ れている。この方法では、メチル（トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシル ブロミド）ウロナートを合成し（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５５、７７ 、３３１０におけるＧ．Ｎ．ボレンバッハらの論稿参照）、炭酸銀の存在下 に、還流ベンゼン中において、３−アセチルモルフィンと反応させる。モルフィ ン−６−グルクロニドの最終的単離のためには、再結晶による精製前に、不溶性 バリウム塩からこれを遊離させる必要がある（前記Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ ｌｌ．におけるＨ．ヨシムラらおよび前記Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．におけるＰ． Ａ．キャルプトらの論稿参照）。モルフィン−６−グルクロニドは、生物学およ び臨床上の高い評価から、今や大量の供給が必要とされている。しかしながら、 このケーニッヒス、クノール法による最終生成物から痕跡量の重金属を除去する ことが極めて困難である。ケーニッヒス、クノール法に伴なうさらに他の問題は 、グリコシド形成に際して不安定な蔗糖誘導体と不均一反応系がもたらされ、こ れにより共役体収率の変動をもたらし、またモルフィン−６−グルクロニド大量 合成の際の精製に困難をもたらすことである。 同様の問題は、モルフィン−３，６−ジグルクロニドの製造に当たっても生起 した。この化合物も、モルフィンおよびそのモノグルクロニドの代謝産物である 。 ＷＯ９３／０３０５１号公報には、酸性触媒を使用し、任意置換モルフィンと 任意置換グルコナートエステルの共役によりモルフィン−６−グルコニドを製造 する方法が開示されている。 本発明は、モルフィン−６−グルコニドまたは置換モルフィン−６−グルコニ ドを製造するための、これとは異なる方法を提供することを目的とする。 本発明により、少くとも１種類のβ−グルクロニダーゼを使用して、モルフィ ン−３，６−ジグルクロニド、または置換モルフィン−３，６−ジグルクロニド の３−グルクロニド部分を選択的酵素分割することにより、モルフィン−６−グ ルクロニドを製造する方法が提供される。 適当なβ−グルクロニダーゼとしては、以下のものが挙げられる。 アワビ内蔵（アワビ） Ｌ−１１（カサガイの類、Ｐａｔｅｌｌａ ｖｕｌｇａｔａ） ＨＡ−４（マイマイの類、Ｈｅｌｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ） Ｈ５− （同上、Ｈｅｌｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ） Ｂ−１ （ウシ肝臓） Ｂ−３ （同上） Ｂ−１０（同上） ＢＩ （ビーズ状アガロース上のウシ肝臓からの不溶性酵素） Ｓ−１ （ホタテガイの類、Ｃｈｌａｍｙｓ ｏｐｅｒｃｕｌａｒｉｓ） 最初のスクリーニング実験を、０．１Ｎのくえん酸塩緩衝液中において、１− ２ｍｇ／ｍｌのＭ−３−３，６−ｄｉＧと１−１３，０００フィシュマン単位の 酵素を使用して行なった。１フィシュマン単位は、所定のｐＨ値、３７℃におい て、１時間にフェノールフタレイングルクロニドから１μｇのフェノールフタレ インを遊離させるに必要な酵素量である。 成功実験は、３種類の他のモルフィングリコシドを含有する純度８０から９６ ％のＭ−３，６−ジＧを使用して行なわれた。 最初のスクリーニング実験により、３−グルクロニドをことに良好な選択性を 以て分割し得た４種類の酵素が判明した。Ｂ−１０、ＨＡ−４、Ｌ−１１および アワビ内蔵である。 しかしながら、Ｂ−１０酵素の活性は比較的低く、Ｌ−１１とＨＡ−４は、共 に低酵素濃度で１７ｍｇ／ｍｌまでのＭ−３，６−ジＧを許容したが、アワビ内 蔵はこのレベルで阻害された。酵素濃度は、酵素濃度阻害を防止するために低く 抑制された。Ｌ−１１およびＨＡ−４をさらに検討したところ、共に、１００ｍ ｇ／ｍｌのＭ−３，６−ジＧおよび７１，０００フィシュマン単位／ｍｌの酵素 を阻害なく許容した。 Ｍ−３，６−ジＧが高濃度の場合、Ｌ−１１はＨＡ−４よりも有効に不純物に 対処するように考えられる。Ｌ−１１はグラム当たり１００−３００万フィシュ マン単位の活性で得られたが、入手し得たＨＡ−４はグラム当たり僅かに２５− ５０万フィシュマン単位の活性を示したに止まる。 開始の次段階において、Ｍ−６−Ｇへの転化率の目標を最少限度８０％に設定 した。このレベルであれば、生成物を再結晶により精製し得るからである。この 目的から、Ｍ−３，６−ジＧの濃度を１０ｍｇ／ｍｌに設定し、Ｌ−１１の濃度 を変化させた。この実験は、Ｌ−１１を５１，２００フィシュマン単位／ｍｌの 濃度で使用して、２４時間に９４％の転化率を達成することができ、しかもそれ 以上の濃度では活性が阻害されることを示した。 反応の間に採取した飼料を分析したところ、酵素は最初の８時間でその活性の 大部分を失なうことが判明した。 開発のさらに次の段階は、酵素が最初の８時間で活性を失なわないように安定 させる方法を開発し、酵素をリサイクルさせる可能性を探究することであった。 この目的から、０．１Ｎアセタート緩衝液中において、Ｍ−３，６−ジＧを添加 する前に、酵素をオキシランアクリル樹脂ビーズに附着させた。この実験におい て、Ｍ−３，６−ジＧの濃度を２５−２７ｍｇ／ｍｌに、Ｌ−１１の濃度を１３ ，５００から１４，６００単位に設定し、酵素の安定化に必要な量を確定するた めにアクリル樹脂ビーズ量を種々に変更した。この実験の結果、酵素１４，６０ ０フィシュマン単位に対し、アクリルビーズ５０ｍｇが最適レベルであるこ とが判明した。Ｍ−３，６−ジＧ２６ｍｇに対し、１４，６００フィシュマン単 位のビーズ担持酵素を使用して７１時間で９３％の転化率を達成し得た。この転 化率は、非担持酵素の場合の約１０倍である。この酵素安定化により、７１時間 の経過後も酵素は活性を維持し、濾過、洗浄しても本来の活性のほぼ半分が依然 維持されるという劇的な結果がもたらされた。 この方法をグラム規模で実施して、高純度の生成物を２０−２５％の収率で得 た。 実験データ ｐＨ３．８アセタート緩衝液中における担持Ｌ−１１酵素の場合の実験データ ｐＨ３．８アセタート緩衝液中における非担持Ｌ−１１酵素の場合の実験データ ｐＨ３．８くえん酸塩緩衝液中における非担持Ｌ−１１酵素の場合の実験データ ｐＨ５．０くえん酸塩緩衝液中におけるＨＡ−４酵素の場合の実験データ くえん酸塩緩衝液中における各種酵素の実験データ 酵素Ｌ−１１を使用するＭ−６−Ｇのミリグラム規模の製造 酵素（２８．２ｍｇ、５３，３００単位）をアセタート緩衝液（１．０ｍｌ、 ０．１Ｍ ｐＨ３．８）中に溶解させ、ジグルクロニド（９．８ｍｇ、１４．６ μモル）を添加した。反応混合物を３０℃において培養器中に入れ、ＨＰＬＣに より反応を監視した。１８時間後の分析はＭ−６−Ｇへの転化率９０％を示した 。 酵素Ｌ−１１を使用するＭ−６−Ｇのグラム規模の製造 酵素（２５０．１ｍｇ、６００，０００単位）をアセタート緩衝液（４０ｍｌ 、０．１Ｎ ｐＨ３．８）に溶解させ、オキシランアクリル樹脂ビーズ（２．０ ２ｇ）を添加した。この懸濁液を、ジクルクロニド（１．００ｇ、１．４９ミリ モル）の添加前、３０℃において培養器中に３０分置いた。反応をＨＰＬＣで監 視し、分析によりＭ−６−Ｇへの転化率９１％を示した６８時間後に中止させた 。樹脂ビーズをヒルシュ漏斗で濾過し、不透明溶液を得、これをＨＰＬＣ溶媒フ ィルターで透明となし、減圧下に蒸散させて固体を得た。水性メタノールから再 結晶させ、白色固体としてＭ−６−Ｇを得た（１７５ｍｇ、２５％）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１月１１日 【補正内容】 Ｂ−３ （同上） Ｂ−１０（同上） ＢＩ （ビーズ状アガロース上のウシ肝臓からの不溶性酵素） Ｓ−１ （ホタテガイの類、Ｃｈｌａｍｙｓ ｏｐｅｒｃｕｌａｒｉｓ） 上述の文字数字結合符号は、シグマ−オールドリッチ、コンパニイ、リミテッ ド社のカタログ分類である。 最初のスクリーニング実験を、０．１Ｎのくえん酸塩緩衝液中において、１− ２ｍｇ／ｍｌのＭ−３−３，６−ｄｉＧと１−１３，０００フィシュマン単位の 酵素を使用して行なった。１フィシュマン単位は、所定のｐＨ値、３７℃におい て、１時間にフェノールフタレイングルクロニドから１μｇのフェノールフタレ インを遊離させるに必要な酵素量である。 成功実験は、３種類の他のモルフィングリコシドを含有する純度８０から９６ ％のＭ−３，６−ジＧを使用して行なわれた。 最初のスクリーニング実験により、３−グルクロニドをことに良好な選択性を 以て分割し得た４種類の酵素が判明した。Ｂ−１０、ＨＡ−４、Ｌ−１１および アワビ内蔵である。 しかしながら、Ｂ−１０酵素の活性は比較的低く、Ｌ−１１とＨＡ−４は、共 に低酵素濃度で１７ｍｇ／ｍｌまでのＭ−３，６−ジＧを許容したが、アワビ内 蔵はこのレベルで阻害された。酵素濃度は、酵素濃度阻害を防止するために低く 抑制された。 請求の範囲 １．少くとも１種類のβ−グルクロニダーゼを使用して、モルフィン−３，６ −ジグルクロニドまたは置換モルフィン−３，６−ジグルクロニドにおける３− グルクロニド部分を選択的酵素分割する、モルフィン−６−グルクロニドの製造 方法。 ２．β−グルクロニダーゼが、アワビから得られるアワビ内蔵、カサガイの類 のＰａｔｅｌｌａ ｖｕｌｇａｔａ、Ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ、ホタテガイの類のｃｈｌａｍｙｓ ｏｐｅｒｃｕｌａｒｉｓ 、あるいはビーズ状アガロース上のウシの肝臓から得られる不溶性酵素のいずれ かである、請求項１の方法。 ３．β−グルクロニダーゼが、ウシの肝臓、ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ、ｌ ｉｍｐｅｔ ｐａｔｅｌｌａ、アワビから得られる内蔵のいずれかである、請求 項１の方法。 ４．β−グルクロニダーゼを単一もしくは複数のアクリル樹脂ビーズに担持さ せる上記各項のいずれかの方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ターナー，ニコラス ジョン イギリス国、イーエックス17 １イーキュ ー、デボン、クレジトン、ブラグドン テ ラス、３ (72)発明者 ブラウン，リチャード タルボット イギリス国、ピーアール１ ８ディーエッ クス、ランカシャー、プレストン、ブロー ドゲイト、24 (72)発明者 カーター，ニール エドワード イギリス国、エム14 ５ピーユー、マンチ ェスター、ビクトーリア パーク、カーズ ン アヴェニュー、24、フラット、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少くとも１種類のβ−グルクロニダーゼを使用して、モルフィン−３，６ −ジグルクロニドまたは置換モルフィン−３，６−ジグルクロニドにおける３− グルクロニド部分を選択的酵素分割する、モルフィン−６−グルクロニドの製造 方法。 ２．β−グルクロニダーゼが、アワビから得られるアワビ内蔵、カサガイの類 のＨｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａから得られるＨＡ−４、同じくＨｅｌｉｘ ｐｏ ｍａｔｉａから得られるＨ５、ウシの肝臓から得られるＢ−１、ウシの肝臓から 得られるＢ３、ウシの肝臓から得られるＢ−１０ビーズ状アガロース上のウシの 肝臓から得られる不溶性酵素としてのＢ１、ホタテガイの類のｃｈｌａｍｙｓ ｏｐｅｒｃｕｌａｒｉｓから得られるＳ−１のいずれかである、請求項１の方法 。 ３．β−グルクロニダーゼが、ウシの肝臓から得られるＢ−１０、ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａから得られるＨＡ−４、ｌｉｍｐｅｔ ｐａｔｅｌｌａから得ら れるＬ−１１およびアワビから得られる内蔵のいずれかである、請求項１の方法 。 ４．β−グルクロニダーゼを単一もしくは複数のアクリル樹脂ビーズに担持さ せる上記各項のいずれかの方法。