JPS6149317B2 - - Google Patents

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JPS6149317B2
JPS6149317B2 JP53113096A JP11309678A JPS6149317B2 JP S6149317 B2 JPS6149317 B2 JP S6149317B2 JP 53113096 A JP53113096 A JP 53113096A JP 11309678 A JP11309678 A JP 11309678A JP S6149317 B2 JPS6149317 B2 JP S6149317B2
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JP
Japan
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cpc
water
fractions
chromatography
cooled
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Application number
JP53113096A
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English (en)
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JPS5540615A (en
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Kyoshi Nara
Kazuyoshi Katamoto
Kazuhiko Oota
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
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Priority to EP79301861A priority patent/EP0009363B1/en
Priority to DE7979301861T priority patent/DE2964213D1/de
Priority to ES484144A priority patent/ES484144A1/es
Publication of JPS5540615A publication Critical patent/JPS5540615A/ja
Priority to US06/522,549 priority patent/US4535155A/en
Publication of JPS6149317B2 publication Critical patent/JPS6149317B2/ja
Granted legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、デアセチルセフアロスポリンＣ（以
下Ｄ―CPCと略す）、デアセトキシセフアロスポ
リンＣ（以下DA―CPCと略す）、セフアロスポ
リンＣ（以下CPCと略す）などのセフアロスポ
リン類の分離、精製法に関するものである。
Ｄ―CPC，DA―CPC，CPCは各々次式で示さ
れ、いずれも半合成セフアロスポリン系化合物の
合成原料として重要な化合物である。
一般に、CPC，Ｄ―CPC，DA―CPCの二種類
以上を同時に蓄積する菌株（たとえば特開昭50―
18692，特開昭50―100291，特開昭50―63193など
に記載の菌株）を培養して得た醗酵液から
CPC，Ｄ―CPC，DA―CPCをそれぞれ単離する
方法は複雑で、従来これらの分離には通常セルロ
ースカラムクロマトグラフイーが用いられている
が、良好な分離をするには、予め被処理液をでき
るだけ少量にまで濃縮する必要があり、また大量
のセルロースとの分離に長時間を要する等、工業
上有利なものとは云えない。セルロースの替りに
活性炭をクロマト的分離の目的で使用した例（た
とえばU.S.P.3926973など）もあるが、CPC，セ
フアロスポリンＮ，色素の相互分離を目的とした
ものでCPC，Ｄ―CPC，DA―CPC相互の分離の
目的で用いた例はみあたらない。また、活性炭を
CPC，Ｄ―CPC，DA―CPCの二種以上を含む粗
水溶液の単なる精製手段として用いた例（特開昭
50―18692，特開昭50―100291など）もあるが、
各セフアロスポリンの分別を行なつていない。
本発明者らは、CPC，Ｄ―CPC，DA―CPCな
どのセフアロスポリン系化合物の混合物を分別す
る方法を研究し、これらを活性炭に吸着させて有
機溶剤を少量含んでいてもよい水で分別溶出を行
なうと、Ｄ―CPC，DA―CPC，CPCの相互分離
が工業上理想的に行われることを見出し、これら
の知見をもとに本発明を完成した。すなわち、本
発明は、有機溶剤を０〜20％（Ｖ／Ｖ）含む水中
での活性炭に対するCPC，Ｄ―CPC，DA―CPC
の親和性の差を利用したものであつて、CPC，
Ｄ―CPC，DA―CPCのすくなくとも二種類以上
を含有する粗水溶液を活性炭に接触させて、含有
するセフアロスポリン類を吸着させ、有機溶剤を
０〜20％（Ｖ／Ｖ）含む水を用いて分別溶出する
ことを特徴とするＤ―CPC，DA―CPC，CPCの
分離、精製法である。
本発明方法に適用し得るCPC，Ｄ―CPC，DA
―CPC含有粗水溶液としては、CPC，Ｄ―
CPC，DA―CPCのすくなくとも二種類以上を任
意の割合で含有するものであり、たとえばセフア
ロスポリン醗酵液、あるいはその部分的精製液た
とえば、イオン交換樹脂脱着液，濃縮液，晶出母
液等が用いられ、とりわけＤ―CPCを含有する
場合には塩類が混在している部分精製液に本方法
を適用するのが効果的である。すなわち、たとえ
ば塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化マグネシ
ウム，硫酸ナトリウム，硝酸ナトリウム，ギ酸ナ
トリウム，酢酸ナトリウム，クエン酸ナトリウ
ム，リン酸ナトリウムなどの塩類が0.01〜２モ
ル、好ましくは0.05〜0.5モル共存している場合
に活性炭への吸着量が増大するためである。
一方本発明方法において使用される活性炭は、
たとえば、オガクズ，ヤシガラ，石炭等を水蒸気
賦活，薬品賦活（たとえば塩化亜鉛などによる）
して得られるもの等は、いずれも使用されるが、
塩化亜鉛賦活によつて得られる活性炭がことに適
当である。また、10〜50メツシユの粒状のものが
好んで用いられる。
本発明方法を実施するには、まずCPC，Ｄ―
CPC，DA―CPCのすくなくとも二種類以上を含
む粗水溶液を活性炭に接触させて、含有するセフ
アロスポリン類を吸着させる。その際の接触の吸
着操作は、たとえばカラム法で、溶出の際の分離
能をよくするために上部から吸着させるのが良
い。活性炭カラムの長さおよび接触速度は適宜に
調節する必要があるが、接触速度は通常SV（１
時間当りカラムに充填された活性炭の量に相当す
る溶液が流れる速度）0.1〜2.0、好ましくは0.5〜
1.0である。このようにして活性炭に吸着された
CPC，Ｄ―CPC，DA―CPCのすくなくとも二種
類以上の目的物は、有機溶剤を０〜20％（Ｖ／
Ｖ）含む水溶液｛水に20％（Ｖ／Ｖ）以上溶けな
い溶剤においてはその飽和溶解度以下の溶剤を含
む水溶液｝で溶出するとＤ―CPC，DA―CPC，
CPCの順に溶出されてくる。用いられる有機溶
剤としては、水にすこしでも溶ける溶剤であれば
殆んどすべての有機溶剤が使用できるが、経済性
を考慮してたとえばアルコール類（メタノール，
エタノール，プロパノール，イソプロパノール，
ブタノール，イソブタノール，アミルアルコー
ル，イソアミルアルコール，シクロヘキサノール
等），エーテル類（ジオキサン，テトラヒドロフ
ラン，メチルエチルエーテル等），ケトン類（ア
セトン，メチルエチルケトン，ジエチルケトン
等），エステル類（酢酸エチル，酢酸ブチル等）
などが適宜用いられる。なかでも、アルコール類
がよく、メタノールが最適である。溶出方法は、
溶出の途中で溶剤濃度を変化させない通常の溶出
方法が最も簡単であるが、溶出の途中で溶剤濃度
を変化させる溶出方法も適宜利用できる。たとえ
ばＤ―CPCが吸着されている場合には、溶剤と
して水を用いて溶出してＤ―CPCのみを含むフ
ラクシヨンを採取した後に、有機溶剤を0.1〜20
％（Ｖ／Ｖ）含む水溶液を用いて溶出するのが有
利である。また分離効率を高めるために再クロマ
トグラフイー等通常カラムクロマトグラフイーで
用いられる一般的な手法はいずれも適用出来る。
溶出液は、一定量ずつ分画採取され適当な検出方
法（たとえば薄層クロマトグラフイー，紙電気
泳動，高速液体クロマトグラフイー等）により目
的物のフラクシヨンを集めることが出来る。
得られた各目的物含有のフラクシヨンをたとえ
ばNaOH，KOH，アンモニア等の塩基で中和後
濃縮し、濃縮液をたとえば凍結乾燥，溶媒添加等
の通常用いられる手段により、塩として回収され
る。また所望により分画フラクシヨンあるいは一
旦塩として採取したものを水に溶解し、イオン交
換樹脂で脱塩して遊離酸とした後たとえば濃縮，
溶媒沈澱などを行なうか、凍結乾燥等一般的精製
手段を用いて遊離酸として回収することも出来
る。また、本発明方法で精製分画した各目的物含
有フラクシヨンをたとえば直接アシル化試薬と接
触させ脂溶性誘導体として溶媒抽出法により回収
する等、種々の精製法を組み合わせることも可能
である。以下実施例をもつてさらに詳細に本発明
の内容を具体的に説明するが、これによつて本発
明が限定されるものではない。
実施例 １ CPC，DA―CPC，Ｄ―CPC各々25ｇを酢酸ソ
ーダ緩衝液（PH6.0，0.2M）25に溶解し、あら
かじめ水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭（武
田薬品工業株式会社製；以下武田薬工製と略す）
80を充填したカラム（直径25cm×高さ163cm）
にSV＝1.0（80／Hr）で流し、純水80で洗
う。次に10％EtOH240をSV＝1.0（80／Hr）
で流し、溶出液を８ずつ分取し、CPC，Ｄ―
CPC，DA―CPC含量を高速液体クロマトグラフ
イーにより検出すると図１前半の溶出曲線が得ら
れた。Ｄ―CPCとDA―CPCが明瞭に分別されて
溶出されていることがわかる。（CPCの溶出は10
％EtOHをそのまゝ流し続けても可能であるが、
時間の節約と溶出曲線をよりシヤープにするため
に）溶出溶剤を20％EtOHに切り替え、８ずつ
分取し、高速液体クロマトグラフイー（以下高速
液クロと略す）により検出すると図１の後半の溶
出曲線が得られた。各分画液を微結晶セルロース
粉末を用いる薄層板（東京化成製）にスポツト
し、ｎ―ブタノール：酢酸：水＝３：１：１
（Ｖ／Ｖ）で展開し、風乾後、ニンヒドリンで呈
色させると、Ｄ―CPC Rf＝0.15，CPC Rf＝
0.28，DA―CPC Rf＝0.30に各spotが認められ
る。
フラクシヨンNo.10〜17迄の主としてＤ―CPC
を含むフラクシヨンを集め、NaOHでPH6.5に補
正後減圧濃縮し、得られたシロツプにエチルアル
コールを加えＤ―CPCをモノナトリウム塩とし
て結晶化させた。析出した結晶を取乾燥すると
Ｄ―CPC・Na・3.5H2Oとして20ｇが得られた。
ここで得られた結晶をＤ―CPC標品と比較した
ところ、抗菌スペクトル，ペーパークロマトグラ
フイー，薄層クロマトグラフイー，紫外部吸収ス
ペクトル，NMRスペクトル，IRスペクトルなど
理化学的・生物学的性質において同一の性質を示
した。
次にNo.18〜28の主としてDA―CPCを含むフラ
クシヨンを集め、NaOHでPH6.5に補正後、減圧
濃縮し、得られたシロツプにエチルアルコールを
加えるとDA―CPCのNa塩が結晶状に析出した。
結晶を取し、乾燥するとDA―CPCのNa塩とし
て18ｇが得られた。ここで得られた結晶をDA―
CPC標品と比較したところ抗菌スペクトル，ペ
ーパークロマトグラフイー，薄層クロマトグラフ
イー，紫外部吸収スペクトル，IRスペクトル，
NMRスペクトルなどの理化学的・生物学的性質
において同一の性質を示した。
最後にNo.41〜51の主としてCPCを含むフラク
シヨンを集めNaOHでPH6.5に補正し、減圧濃縮
した。得られたシロツプにエチルアルコールを加
えるとCPC・Na塩が結晶状に析出した。結晶を
取し、乾燥するとCPC・Na・2H2Oが15ｇ得ら
れた。ここで得られた結晶をCPCの標品と比較
したところ、抗菌スペクトル，ペーパークロマト
グラフイー，薄層クロマトグラフイー，紫外部吸
収スペクトル，IRスペクトル，NMRスペクトル
など理化学的・生物学的性質において同一の性質
を示した。
かくして得られたCPC，Ｄ―CPC，DA―CPC
のNa塩をそれぞれ５ｇずつ取り、水各50mlに溶
解し、アンバーライトIR―120（H+型，ロームア
ンドハース社製，米国）15mlを充填したカラムを
あらかじめ５℃附近の冷水を流して冷却しておい
た所へSV＝３〜５の流速で通過させ脱塩する。
脱塩液を凍結乾燥すると、CPC3.2ｇ，Ｄ―
CPC3.5ｇ，DA―CPC3.3ｇが得られた。
実施例 ２ CPC2.475γ／ml，Ｄ―CPC2.200γ／mlを含む
クエン酸ソーダ緩衝液（PH8.0，0.2M）250ml
を、あらかじめ水で懸濁したクロマトグラフ用活
性炭（武田薬工製）100mlを充填したカラム（直
径２cm×高さ32cm）にSV＝1.0（100ml／Hr）で
流し、純水100mlで水洗する。次に５％メタノー
ルをSV＝1.0（100ml／Hr）で流すと溶離液200ml
が得られた。この溶離液中のCPCとＤ―CPC含
量を高速液クロにより測定するとＤ―CPC523mg
（95％収率）が含まれ、CPCは殆んど認められな
かつた。ひき続き５％メタノールをSV＝1.0で流
し、30mlを分画したのち、さらに30mlを集めた。
次に20％メタノールをSV＝1.0で流し、溶離液
340mlを得た。前記５％メタノールの最終溶離分
画30mlと20％メタノール溶離液340mlを混合し、
高速液クロ法で測定するとCPC464mg（75％収
率）が検出され、Ｄ―CPCは殆んど認められな
かつた。これらの溶離液から実施例１の方法に準
じて濃縮・結晶化しＤ―CPC・Na・3.5H2Oとし
て420mg，CPC・Na・2H2Oとして390mgを得た。
実施例 ３ CPC269mg，Ｄ―CPC1522mgを含む酢酸ソーダ
緩衝液（PH7.0，0.2M）436mlを予め水で懸濁し
たクロマトグラフ用活性炭（武田薬工製）200ml
を充填したカラム（直径２cm×高さ64cm）にSV
＝1.0（200ml／Hr）で流し、Ｄ―CPC，CPCを
吸着させた。次に10℃に冷却した１％アセトンを
SV＝1.0で流し、溶出液を50mlずつ分画採取し
た。各分画液を実施例１記載の薄層クロマトグラ
フイーに対し、適当な分画（この例では２〜12分
画）を合併し高速液クロ法で測定したところＤ―
CPC1430mg（収率94％）が検出され、CPCは殆
んど認められなかつた。次に14〜24分画を集めた
後20％アセトンをSV＝1.0で流し29分画まで採取
した。分画番号14〜29を合併し、溶出液中のＤ―
CPCとCPCを高速液クロ法で測定するとCPC172
mg（収率63.9％）が検出され、Ｄ―CPCは認めら
れなかつた。これらの溶出液から実施例１の方法
に準じて結晶化し、Ｄ―CPC・Na・3.5H2Oとし
て1.2ｇ，CPC・Na・2H2Oとして150mgを得た。
実施例 ４ CPC272ｇ，Ｄ―CPC1539mgを含む酢酸ソーダ
緩衝液（PH7.0，0.2M）441mlを予め水で懸濁し
たクロマトグラフ用活性炭（武田薬工製）200ml
を充填したカラム（直径２cm×高さ64cm）にSV
＝1.0（200ml／Hr）で流し、CPCとＤ―CPCを
吸着させた。純水200mlを用いて水洗したのち10
℃に冷却した１％酢酸エチルをSV＝1.0で流し、
溶出液を50mlずつ分画採取した。各分画液を薄層
クロマトグラフイーに付し適当な分画を合併し高
速液クロ法でＤ―CPC，CPC含量を測定した。
２〜18分画にはＤ―CPCが1462mg（収率95％）
検出され、CPCは認められなかつた。また20〜
25分画にはCPCが283mg（収率85.6％）検出さ
れ、Ｄ―CPCは殆んど認められなかつた。
実施例 ５ CPC275mg、Ｄ―CPC1560mgを含む酢酸ソーダ
緩衝液（PH7.0，0.2M）447mlを予め水で懸濁し
たクロマトグラフ用活性炭（武田薬工製）200ml
を充填したカラムにSV＝1.0（200ml／Hr）で流
し、CPCとＤ―CPCを吸着させた。純水200mlを
用いて水洗した後10℃に冷却した0.1％テトラヒ
ドロフランをSV＝1.0で流し、溶出液を50mlずつ
分画採取した。分画１〜15にはＤ―CPC1443mg
（収率92.5％）が含まれ、CPCは殆んど検出され
なかつた。次に10℃に冷却した0.5％テトラヒド
ロフラン250mlをSV＝1.0で流した後、10℃に冷
却した１％テトラヒドロフランをSV＝1.0で流し
た。分画21〜33を合併し高速液クロで測定すると
CPC213.2mg（収率78％）が含まれ、Ｄ―CPCは
殆んど認められなかつた。
実施例 ６ CPC1125mg、Ｄ―CPC1075mgを含むギ酸ソー
ダ緩衝液（PH6.0，0.2M）250mlを、予め水で懸
濁したクロマトグラフ用活性炭（武田薬工製）
200mlを充填したカラムにSV＝1.0（200ml／Hr）
で流し、CPCとＤ―CPCを吸着したのち純水200
mlで水洗した。更に10℃に冷却した水800mlをSV
＝1.0（200ml／Hr）で流し溶出液を50mlずつ分
画採取した。次に20％メタノール1100mlをSV＝
1.0で流す。分画５〜16にはＤ―CPC908mg（収率
84％）が含まれ、CPCは殆んど含まれていなか
つた。また分画18〜38にはCPCが825mg（73％収
率）が含まれているのに対し、Ｄ―CPCは殆ん
ど認められなかつた。
実施例 ７ シユクローズ3.0％，肉エキス1.5％，コーンス
チープリカー0.5％およびCaCO30.15％からなる
種培地500mlを２容の坂口フラスコに分注滅菌
し、これにセフアロスポリウム アクレモニウム
（Cephalosporium acremcnium）ATCC 14553を
接種し、往復振盪機上で28℃，３日間培養した。
別にステンレス製50醗酵槽にシユクローズ3.0
％，生大豆粉3.2％，DL―メチオニン0.5％およ
びCaCO30.15％からなる培地30を仕込み、常法
により滅菌冷却しておく。これに上記種培養液を
無菌的に接種し、28℃で通気撹拌培養（通気量毎
分100％，撹拌200r.p.m.）した。120時間培養
後、培養物をとり出し、過後液中のCPCと
Ｄ―CPC含量を高速液クロ法で測定すると
CPC135γ／ml，Ｄ―CPC25γ／mlであつた。こ
の培養液25.7にペニシリナーゼ（シユワルツ
マン社製）を加えセフアロスポリンＮを完全に分
解したのち、これを稀硫酸でPH4.0に調節した後
不溶物を去し、液を10℃に冷却したのち、予
め水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭（武田薬
工製）５を充填したカラム（直径10cm×高さ64
cm）に通じ冷却した純水５を用いて水洗した。
次にカラムを10℃に冷却した40％アセトン水を用
いて溶離し、溶離液15を10℃に冷却し、アンバ
ーライトIRA―402（酢酸型，ロームアンドハー
ス社製）500mlを充填したカラム（直径３cm×高
さ71cm）に通じ、Ｄ―CPC，CPCを吸着させた
のち、純水２を用いて水洗した。水洗終了後、
10℃に冷却した0.2モル酢酸ソーダ緩衝液（PH
7.0）2.5を用いSV＝1.0（500ml／Hr）で溶離し
た。
この樹脂溶離液を予め水で懸濁したクロマトグ
ラフ用活性炭（武田薬工製）400mlを充填したカ
ラム（直径２cm×高さ127cm）にSV＝1.0（400
ml／Hr）で流し、次に純水400mlで水洗した。水
洗終了後10℃に冷却した１％メタノールをSV＝
1.0で流し、溶離液を100mlずつ分画採取した。５
〜11分画を合併し、溶離液中の組成をｎ―ブタノ
ール：酢酸：水＝３：１：１の展開系における微
結晶セルロース上での薄層クロマトグラフに付す
と、Rf＝0.15に実質的にＤ―CPC単一のスポツト
を示し、CPCは殆んど検出されなかつた。次に
ひき続き20％メタノールをSV＝1.0で流し、適当
な分画（この例では12〜32）を合併し、前記薄層
クロマトグラフに付すとRf＝0.28に実質的にCPC
単一のスポツトを示しＤ―CPCは検出されなか
つた。
次いで前記Ｄ―CPC画分（５〜11）をNaOHで
中和後、Ｄ―CPC遊離酸として25〜30％（Ｗ／
Ｖ）になる迄、減圧濃縮（内温20℃以下）し、こ
の濃縮液にエタノールを加え結晶を析出させる。
５℃一夜晶出後、別・乾燥したところ淡黄色の
Ｄ―CPC・Na塩が得られた。同様に晶出母液か
らくり返し結晶を析出させると全量60mgのＤ―
CPC・Na塩が得られた。ここで得られた粗結晶
をさらに精製し、得られたＤ―CPC・Na塩結晶
をＤ―CPC標品と比較したところ理化学的・生
物学的性質がよく一致した。次にCPC画分（12
〜32）を中和後、前記Ｄ―CPC画分の処理方法
に準じてCPCを析出させたところ、全量240mgの
CPC・Na塩粉末が得られた。これを更に精製し
て得られたCPC・Na塩結晶をCPC・Na塩標品と
比較したところ理化学的・生物学的性質がよく一
致した。
実施例 ８ 実施例７に記載された方法にしたがつてセフア
ロスポリウム アクレモニウム
（Cephalosporium acremonium）Ｋ―121
（ATCC20427）を前培養した。別にステンレス製
50醗酵槽にシユクローズ6.0％，グルコース5.0
％，落花生粕3.0％，DL―メチオニン1.0％およ
びCaCO30.15％からなる培地30を仕込み、常法
通り滅菌・冷却した。これに上記前培養液を無菌
的に接種し、28℃で190時間通気撹拌培養（通気
量毎分100％，撹拌250r.p.m.）した。培養終了
後、培養物をとり出し固形分を除くと液25が
得られた。この液に含まれるCPCは10500γ／
mlであつた。これに特開昭49―491の方法に従つ
て調製したＤ―CPCを1000γ／mlになるように
添加した。
上記で得られたCPC10500γ／ml，Ｄ―
CPC1000γ／mlを含む培養液25を10℃に冷
却し、アンバーライトIRC―50（H+型，ローム
アンドハース社製）2.8を充填したカラムとア
ンバーライトIRA―402（CH3COO-型，ロームア
ンドハース社製）17.8を充填したカラムに連続
して１時間17.8の速度で通じ、Ｄ―CPCとCPC
を吸着させた。次に10℃に冷却した純水70を用
いて連続して水洗したのち、アンバーライトIRA
―402カラムを10℃に冷却した酢酸ソーダ緩衝液
（PH7.5，0.2M）を用いて１時間17.8の速度で溶
離し溶離液89（PH7.5）を集めた。この溶離液
を予め水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭21
（直径14cm×高さ136cm）を充填したカラムに10℃
で１時間10の速度で通じCPCとＤ―CPCを吸
着させ、カラムを水21を用いて水洗したのち10
℃に冷却した１％メタノール水58を１時間10
の速度で流し溶離液を5.3ずつ分画採取した。
次に10℃に冷却した20％メタノール水110を１
時間10の流速で流し溶離液を5.3ずつ分画採
取した。各分画液につき薄層クロマトグラフイー
に付し、実質的にRf＝0.15のＤ―CPCの単一スポ
ツトを与える分画５〜11と、Rf＝0.28にCPCの単
一スポツトを与える分画12〜32を夫々合わせる。
Ｄ―CPC含有画分５〜11をNaOHで中和後、実施
例１に記載の方法に従つて濃縮・晶出すると全量
15ｇのＤ―CPCナトリウム塩結晶が得られた。
またCPC含有画分（12〜32）を中和後、実施例
１に記載の方法にしたがつて濃縮・晶出すると全
量135ｇのCPCのナトリウム塩結晶が得られた。
実施例 ９ 実施例７に記載された方法にしたがつてセフア
ロスポリウム アクレモニウム
（Cephalosporium acremonium）Ｋ―121
（ATCC 20427）を96時間培養した。培養終了後
培養物を取り出し固形分を除くと液26.5が得
られた。この液中に含まれるCPCは4700γ／
mlであつた。これに特開昭49―491の方法にした
がつて調製したＤ―CPCを5000γ／mlになる様
に添加した。
上記で得られたCPC4700γ／ml，Ｄ―
CPC5000γ／mlを含む培養液26.5を10℃に冷
却し、アンバーライトIRC―50（H+型，ローム
アンドハース社）2.5を充填したカラムとアン
バーライトIRA―402（CH3COO-型，ロームアン
ドハース社）を充填したカラムに連続して１時間
16の速度で通じCPCとＤ―CPCを吸着させ
た。次に10℃に冷却した純水64を用いて連続し
て水洗したのち、アンバーライトIRA―402カラ
ムを酢酸ソーダ緩衝液（PH7.0，0.2M，10℃）を
用いて16／Hrの流速で溶離し溶離液80（PH
7.0）を得た。
この溶離液を予め水で懸濁したクロマトグラフ
用活性炭（武田薬工製）19を充填したカラム
（直径14cm×高さ136cm）に10／Hrで通じCPC
とＤ―CPCを吸着させ、カラムを冷水19で水
洗したのち、10℃に冷却した水を更に19／Hr
で流すと無色澄明の溶離液42.8が得られた。こ
の溶離液は薄層クロマトグラフイーで実質的にＤ
―CPCの単一スポツトを示した。次に10℃に冷
却した３％エタノール33.3を19／Hrで流し
前区分9.5を分画したのち、後区分23.8を集
めると後区分にはCPCのみが溶出される。つぎ
に10℃に冷却した15％エチルアルコール水57を
19／Hrの流速で流し、３％エタノール水溶離
液23.8と混合した。この溶離液80.8中の組成
を高速液クロ法で測定するとCPC86ｇが検出さ
れ、Ｄ―CPCは殆んど認められなかつた。
この様にして得られたＤ―CPC画分および
CPC画分を実施例１に記載の方法に準じて濃
縮・晶出するとＤ―CPCナトリウム塩結晶が80
ｇ，CPCナトリウム塩結晶が66ｇ得られた。
実施例 10 実施例７に記載された方法にしたがつてセフア
ロスポリウム、アクレモニウム
（Cephalosporium acremonium）Ｋ―121
（ATCC 20427）を48時間培養した。培養終了後
培養物を取り出し固形分を除くと液27.2が得
られた。この液中に含まれるCPCは1020γ／
mlであつた。これに特開昭49―491の方法にした
がつて調製したＤ―CPCを9000γ／mlになるよ
うに添加した。
上記で得られたCPC1020γ／ml，Ｄ―
CPC9000γ／mlを含む培養液27.2を10℃に冷
却し、アンバーライトIRC―50（H+型，ローム
アンドハース社）2.7を充填したカラムとアン
バーライトIRA―410（CH3COO-型，ロームアン
ドハース社）17を充填したカラムに連続して17
／Hrの速度で通じCPCとＤ―CPCを吸着させ
た。次に冷水68で水洗したのち、アンバーライ
トIRA―410カラムを10℃の酢酸ソーダ緩衝液
（PH7.0，0.2M）を用いて１時間17の速度で溶
離し、溶離液85（PH7.0）を得た。この溶離液
を予め水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭（武
田薬工製）20（直径14cm×高さ130cm）を充填
したカラムに20／Hrで通じCPCとＤ―CPCを
吸着させた。次に冷水20で水洗したのち、10℃
に冷却した１％イソプロパノール水75を20／
Hrで流し溶離した。高速液クロ法測定よりこの
溶離液75中にはＤ―CPC204ｇが含まれ、CPC
は殆んど認められなかつた。次に５％イソプロパ
ノール水を20／Hrで流し前区分10を捨てた
後、さらに60流すと微黄色澄明の溶離液が得ら
れ、高速液クロ法により12ｇのCPCが含まれて
いることがわかつた。この様にして得られたＤ―
CPCおよびCPC画分を実施例１記載の方法に準
じて濃縮・晶出するとＤ―CPCナトリウム塩結
晶190ｇとCPCナトリウム塩結晶６ｇが得られ
た。
実施例 11 グルコース５％，綿実粉１％，生大豆粉0.5
％，酵母エキス0.5％，ペプトン0.5％および
CaCO31％からなる培地500mlを２容坂口フラ
スコに分注滅菌した後、これにペシロミセス カ
ーネウス（Paecilomyces carneus）Ｃ―2237
（IFO 9729）を接種し、往復振盪機上で28℃，３
日間培養した。別にステンレス製50醗酵槽にグ
ルコース８％，綿実粉２％およびCaCO31％から
なる培地30を仕込み、常法通り滅菌・冷却し
た。これに上記培養液を無菌的に接種し、24℃で
164時間通気撹拌培養（通気毎分20，撹拌230r.
p.m.）した。
培養終了後、培養物を取り出し固形分を除くと
液25が得られた。この液中にはCPC110
γ／ml，Ｄ―CPC30γ／ml，DA―CPC155γ／
mlが含まれていた。この培養液にペニシリナー
ゼ（シユワルツマン社製）を加えセフアロスポリ
ンＮを完全に分解したのち稀流酸でPH4.0に補正
し、不溶物を去する。液を５℃に冷却したの
ち、予め水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭
（武田薬工製）5.0を充填したカラム（直径10cm
×高さ64cm）に通じる。冷水で水洗したのち、５
℃に冷却した50％アセトン水で溶離した。溶離液
15（PH5.0）を10℃に冷却し、アンバーライト
IRA―410（Cl-型，ロームアンドハース社）3.5
を充填したカラムに通じCPC，Ｄ―CPCおよ
びDA―CPCを吸着させた。水洗終了後、５℃に
冷却した0.2M食塩溶液10を用いてSV＝1.0
（3.5／Hr）で溶離した。この樹脂溶離液を予
め水で懸濁したクロマトグラフ用活性炭（武田薬
工製）６を充填したカラム（直径５cm×高さ
300cm）にSV＝1.0（６／Hr）で流す。水洗終
了後５℃に冷却して５％メタノール水をSV＝1.0
（６／Hr）で流し溶離液を1.2ずつ分画採取
した。各画分を薄層クロマトグラフイーに付すと
先ずＤ―CPCが溶離し、次いでDA―CPCが溶離
した。DA―CPCが完全に溶離したのち20％メタ
ノール水をSV＝1.0（６／Hr）で流すと最後に
CPCが溶離した。
主としてＤ―CPCを含む画分（フラクシヨン
No.６〜10）を集めNaOHで中和後濃縮・晶出・乾
燥すると全量35mgのＤ―CPCNa塩が得られた。
次に主としてDA―CPCを含むフラクシヨンNo.11
〜17を集めNaOHで中和後、濃縮・晶出・乾燥す
ると380mgのDA―CPCナトリウム塩が得られ
た。また主としてCPCを含むフラクシヨンNo.22
〜40を集め、NaOHで中和後、濃縮・晶出すると
130mgのCPCナトリウム塩が得られた。
実施例 12 シユクローズ５％，綿実粉１％，コーンスチー
プリカー３％，およびCaCO30.15％からなる培地
500mlを２容坂口フラスコに分注し、滅菌した
のちアニキシオプシス ペルビアーナ
（Anixiopsis peruviana）BS―301・67）を接種
し、往復振盪機上で28℃，４日間培養し、別にス
テンレス製50醗酵槽にグルコース８％，綿実粉
２％，生大豆粉１％，コーンスチープリカー１
％，DL―メチオニン0.5％およびCaCO31％から
なる培地30を仕込み、常法通り滅菌・冷却し
た。これに上記の前培養液を無菌的に接種し、28
℃で通気撹拌培養（通気量100％，撹拌280r.p.m.
）した。184時間後培養物をとり出し固形分を除
くと液25が得られた。この液中には
CPC30γ／ml，Ｄ―CPC110γ／mlおよびDA―
CPC415γ／mlが含まれていた。
この培養液にペニシリナーゼ（シユワルツマ
ン社製）を加えセフアロスポリンＮを完全に分解
したのち、稀硫酸でPH4.0に補正し不溶物を去
する。液を５℃に冷却したのち予め水で懸濁し
たクロマトグラフ用活性炭（武田薬工製）５を
充填したカラム（直径10cm×高さ64cm）に通じ、
冷水を用いて水洗した。次に５℃に冷却した40％
アセトン水を用いて溶離し、溶離液15（PH
5.0）をアンバーライトIRA―402（CH3COO-
型，ロームアンドハース社）２を充填したカラ
ムに通じ、CPC，Ｄ―CPCおよびDA―CPCを吸
着させた。水洗終了後0.2M酢酸ソーダ緩衝液
（PH7.0，５℃）10を用いてSV＝1.0（２／
Hr）で溶離した。
この樹脂溶出液を予め水で懸濁したクロマトグ
ラフ用活性炭（武田薬工製）６を充填したカラ
ム（直径６cm×高さ208cm）にSV＝1.0（６／
Hr）で流し、次に冷水８で水洗した。水洗終
了後、１％イソプロパノール（５℃）をSV＝1.0
で流し、溶離液を1.2ずつ分画採取した。各画
分を薄層クロマトグラフイーに付すと、先ずＤ―
CPCが溶離し、次いでDA―CPCが溶離してい
た。DA―CPCが完全に溶離したのち、５％イソ
プロパノール水（５℃）をSV＝1.0で流すと最後
にCPCが溶離した。
主としてＤ―CPCを含むフラクシヨンNo.５〜
10を集めPH6.5に補正後、濃縮・晶出すると200mg
のＤ―CPCナトリウム塩が得られた。次に主と
してDA―CPCを含むフラクシヨンNo.11〜19を集
めPH6.5に補正後、濃縮・晶出するとDA―CPCナ
トリウム塩が得られた。また主としてCPCを含
むフラクシヨンNo.24〜43を集めPH6.5に補正後濃
縮・晶出すると、40mgのCPCナトリウム塩が得
られた。
実施例 13 実施例７に記載された方法にしたがつてセフア
ロスポリウム アクレモニウム
（Cephalosporium acremonium）Ｋ―121
（ATCC 20427）を96時間培養した。培養終了
後、培養物を取り出し固形分を除くと液25が
得られた。この液中に含まれるCPCは450γ／
mlであつた。これに特開昭49―491の方法にした
がつて調製したＤ―CPCを5000γ／mlになる様
に、さらにCPCを接触水素添加して調製したDA
―CPCを5000γ／mlになる様に添加した。
上記で得られたCPC4500γ／ml，Ｄ―
CPC5000γ／ml，DA―CPC5000γ／mlを含む培
養液25を５℃に冷却し、アンバーライトIRC
―50（H+型，ロームアンドハース社）3.6を充
填したカラムとアンバーライトIRA―402
（CH3COO-型，ロームアンドハース社）22を
充填したカラムに連続して22／Hrで通じた
後、冷水88を用いて連続して水洗した。次にア
ンバーライトIRA―402カラムを５℃に冷却した
酢酸ソーダ緩衝液（PH7.2，0.2M）を用いて22
／Hrで流し、溶離液110（PH7.0）を得た。
この溶離液を予め水で懸濁したクロマトグラフ用
活性炭（武田薬工製）27を充填したカラム（直
径10cm×高さ343cm）に27／Hrで通じ、CPC，
Ｄ―CPCおよびDA―CPCを吸着させた。カラム
を冷水27で水洗したのち、更に５℃に冷却した
水40を27／Hrで流し、溶離液を2.7ずつ分
画採取した。各画分を薄層クロマトグラフイーに
付したところ、先ずＤ―CPCが溶離した。次い
で５％メタノール水を27／Hrで流すとDA―
CPCが溶離していることがわかつた。DA―CPC
が完全に溶離したのち20％メタノール水を27／
Hrで流すと最後にCPCが溶離してきた。
主としてＤ―CPCを含むフラクシヨンNo.５〜
25を集めPH6.5に補正後、濃縮・晶出すると50ｇ
のＤ―CPCナトリウム塩が得られた。次に主と
してDA―CPCを含むフラクシヨンNo.26〜43を集
めPH6.5に補正後濃縮・晶出すると45ｇのDA―
CPCナトリウム塩が、また主としてCPCを含む
フラクシヨンNo.47〜75を集め、PH6.5に補正後濃
縮・晶出すると80ｇのCPCナトリウム塩が得ら
れた。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１の活性炭クロマトグラフイー
の溶出曲線を示す。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ セフアロスポリンＣ、デアセチルセフアロス
    ポリンＣ、デアセトキシセフアロスポリンＣのす
    くなくとも二種類以上を含有する粗水溶液を活性
    炭と接触させて、含有するセフアロスポリン類を
    吸着させ、有機溶剤を０〜20％（Ｖ／Ｖ）含む水
    を用いて分別溶出することを特徴とするデアセチ
    ルセフアロスポリンＣ、デアセトキシセフアロス
    ポリンＣ、セフアロスポリンＣの分離、精製法。
JP11309678A 1978-09-14 1978-09-14 Separation and purification of cephalosporins Granted JPS5540615A (en)

Priority Applications (5)

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DE7979301861T DE2964213D1 (en) 1978-09-14 1979-09-11 Method of separating cephalosporins
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ES2042383B1 (es) * 1991-12-17 1994-07-01 Univ Madrid Complutense Procedimiento de purificacion de cefalosporina c por adsorcion con resinas funcionalizadas tipo divinilbenceno estireno.
US10590223B2 (en) 2013-06-18 2020-03-17 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Polyphenylene ether resin composition, prepreg, metal-clad laminate and printed wiring board

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US3709880A (en) * 1970-12-09 1973-01-09 Merck & Co Inc Antibiotic purification process
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SE425254B (sv) * 1973-06-16 1982-09-13 Takeda Chemical Industries Ltd Sett att framstella deacetoxiefalosporin c genom odling av vissa organismer, i nagra fall pa medier med visst aminosyrainnehall
US3983108A (en) * 1975-02-10 1976-09-28 Merck & Co., Inc. Antibiotic purification process

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DE2964213D1 (en) 1983-01-13
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ES484144A1 (es) 1980-04-16

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