JPH09504859A - 親和性及び反応速度特性の決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 低分子量リガンドと共通レセプターとの相互作用について、該低分子量リガンドの親和性及び反応速度特性を決定するための方法は、感知構造体上にレセプターを固定化し、感知構造体上での応答が低分子量リガンドの応答よりも実質的に高いリガンド類似体と各リガンドとを既知の比率で混合し、各混合物を検出構造体と接触させ、応答を測定し、各混合物の応答をリガンド類似体単独の場合と比較する段階からなり、リガンド類似体応答の歪みがリガンドの親和性及び反応速度特性を表す。

Description

【発明の詳細な説明】 親和性及び反応速度特性の決定方法 本発明は、特に低分子量化合物とレセプター分子との相互作用に関連する該化 合物の親和性及び反応速度特性の決定に関する。 リガンド−レセプターの相互作用は通常、結合親和性によって特徴付けられる 。速度定数の決定は相互作用を特徴付けるのに有用であるが、残念ながらその相 互作用の反応速度特性を直接可視化できる方法は僅かしかない。最近の文献に記 載された一方法（Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｒ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １４５，２２９−２４０，１９９１）は、質量感知検出や、センサー面に固定化 したレセプターと相互作用するリガンドの反応速度を直接分析するフローシステ ムを使用している。しかしながら、この方法は高分子量リガンドの研究に限定さ れ、固定化したレセプターと相互作用する低分子量成分（分子量は約３０００Ｄ ａ未満）の場合、センサー面の質量増加が小さすぎて、正確に測定することがで きない。 ヨーロッパ特許出願公開第２７６ １４２号は、競合アッセイ方式を用いて、 表面プラスモン共鳴（surface plasmon resonance）（ＳＰＲ）を示し得る光学 構造体の表面上 で、薬剤やホルモンのような小分子を定量する方法を開示している。この方法は 、試料抗原が、固定化したレセプターとの結合のために、比較的大きい（光学厚 さが増加した）“ラベル粒子”（例えばラテックス粒子）と結合した同一抗原（ 又は抗原類似体）と競合することを特徴とする。従って、結合した標識抗原の量 は、試料中の抗原濃度に反比例する。 Ｒｏｇｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．等，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒ ｏｎｉｃｓ ６（１９９１）５０７−５１６は、蛍光標識リガンドを用いて、光 ファイバーバイオセンサーに結合したレセプター上の遊離部位数を決定すること を記載している。非標識リガンドとレセプターとの反応の親和性を調べるために 、レセプターを非標識リガンドと共にインキュベートし、蛍光標識したリガンド を添加し、蛍光を測定し、測定した蛍光シグナルを、レセプターを蛍光標識した リガンドと直接反応させて得られた結果と比較する。非標識リガンドを幾つかの 濃度で用いてこの手順を繰り返すと、非標識リガンドとレセプターとの相互作用 の親和性定数を計算することができる。 本発明によれば、今回、レセプター分子寸法が検出すべ き分子よりも遥かに大きい場合、低分子量分子を正確に検出するための質量感知 方法の感度が不足していることを有利に利用し、前述のヨーロッパ特許出願公開 第２７６ １４２号の濃度測定で使用したのと同様のアプローチを用いて、同一 レセプターと相互作用する様々な低分子量成分の親和性や反応速度特性を競合動 力学法により比較することができることが知見された。 競合動力学法のこの新たな概念により、２個のリガンドを、固定化した共通レ セプターの結合部位と同時に反応させることができる。一方のリガンドは高分子 量であり、他方は低分子量である。各リガンド単独の場合、及び高分子量リガン ドと低分子量リガンドとがレセプターの結合部位に対して競合する場合の結合曲 線（検出機応答対時間のプロッティング）を記録することにより、レセプターと の結合相互作用の進行を調べる。後者の場合、両リガンドはレセプターに結合す るが、大半のシグナルは高分子量成分の結合によるものである。その代わり、低 分子量成分の結合は、高分子量リガンドだけで得られた結合曲線の歪みとして確 認される。従って、競合条件下で得られた結合曲線の形状や位置の変化は、低分 子量リガンド−レセプターの相 互作用の反応速度特性や親和性を反映している。 このように考察していくと、例えば高分子量リガンド類似体と同一レセプター との結合に低分子量リガンドが及ぼす影響を検討することにより、低分子量リガ ンド同士を親和性でランク付けすることができる。これはとりわけ薬剤スクリー ニングに好適に適用され得る。 従って、本発明は一般に、低分子量リガンドと共通レセプターとの相互作用に ついて、該低分子量リガンドの少なくとも相対的な親和性及び反応速度特性を決 定するための新たな方法に関する。この方法は、感知構造体上にレセプターを固 定化し、その構造体上での応答が低分子量リガンドの応答よりも実質的に高いリ ガンド類似体と各低分子量リガンドとを既知の比率で混合し、各混合物を感知構 造体と接触させ、応答を測定し、各混合物の応答をリガンド類似体単独の場合と 比較することからなり、リガンド類似体応答の歪みがリガンドの親和性及び反応 速度特性を表すことを特徴とする。 リガンド類似体応答に関して“よりも実質的に高い”とは、低分子量リガンド との混合物でのリガンド類似体応答の寄与が混合物の応答の主要部分を占めるこ とであると理 解すべきである。好ましくは、リガンド類似体の応答は、低分子量リガンドの応 答の約２０倍（即ち約９５％）から、低分子量リガンドの応答の約１００倍であ る。リガンド類似体のこのように比較的高い応答は、基本分子自体によるもので あり得るか、又は基本リガンド類似体分子に結合した化学種（species）により もたらされ得る。 本発明の有利な特徴は、前述のヨーロッパ特許出願公開第２７６ １４２号で 提案された濃度測定の場合のように結合曲線を定常状態又は平衡になるまで検討 する必要はなく、結合曲線の初期部分だけで十分なことである。これによりかな りの時間が節約されることは容易に理解されよう。 しかしながら、解離相、即ち表面がもはやリガンド溶液と接触していないとき のセンサー面からの結合リガンドの解離を検討することも好ましい。 低分子量リガンドは、レセプターと反応する薬剤又は潜在的薬剤であってもよ いし、親分子の結合パートナーと相互作用するより大きな分子から得られた結合 部分であってもよい。 好ましい実施態様では、リガンド類似体は高分子量分子である。 このような高分子量リガンド類似体は、抗体であってもよいし、抗体の結合部 分であってもよいが、高分子量リガンドは低分子量リガンドのひとつと高分子量 成分との結合体であることが好ましい。“高分子量”という用語は広義に解釈す べきではあるが、本発明では約５０００Ｄａから低分子量成分の分子量の約１０ ００倍であり得る。低分子量リガンドがより大きな分子から得られる場合（低分 子量成分は例えばペプチド又はオリゴヌクレオチドである）、高分子量リガンド は親分子であり得る。 高分子量リガンドが、固定化した結合パートナーと一対一で反応することが好 ましく、相互作用は好ましくは、解離速度定数が高い（０．００１＜ｋ_diss＜０ ．１）であることを特徴とする。 各成分の濃度を経時的な定数とみなして、擬一次反応速度を想定できるように 、低分子量リガンド及びリガンド類似体をセンサー面上に導入することが好まし い。 固定（stationary）アッセイ方式を使用できるが、動的（dynamic）方式を使 用することが好ましく、低分子量リガンド及びリガンド類似体はそれぞれ、液体 流でセンサー面上に導入する。 スクリーニングのために、種々のレセプターを固定化するか又は単一のレセプ ターを異なる量で固定化して、低分子量リガンド及びリガンド類似体をセンサー 面のアレイ（このようなセンサ一面のアレイは当業界では公知である）上に同時 に提供することができる。 本発明は一般に、例えば質量、電荷、誘電率等のような測定するパラメーター がリガンド及びリガンド類似体の両方から得られる検出方法に適用される。これ らの方法としては例えば、圧電気法、光学法及び熱光学法のような質量検出方法 、並びに電位差法、電導度法及び電流法のような電気化学法がある。 光学法としては特に、内面反射法及び外面反射法の両方を含む反射光学法のよ うな質量表面濃度検出法、例えばエリプソメトリー及びエバネッセント波分光分 析法（ＥＷＳ）を挙げることができる。後者には、表面プラスモン共鳴分光分析 法（ＳＰＲＳ）、ブルースター角反射測定法、臨界角反射測定法、フラストレイ テッドトータルレフレクション（ＦＴＲ）、エバネッセント波エリプソメトリー 、散乱全内面反射（ＳＴＩＲ）、光導波路形センサー等が含まれる。 ＳＰＲベースの検出方法は最近かなり注目を浴びている。ＳＰＲの現象はよく 知られている。要するに、ＳＰＲは光学的に透明な材料（例えばガラス）と金属 薄膜（通常銀又は金）との界面から特定角度で反射した光の強さの低下（dip） として観察され、とりわけ金属面に近い媒質（例えば試料溶液）の屈折率に依存 する。例えば材料の吸着又は結合により金属面で反射率が変化すると、それに対 応してＳＰＲの発生角度がシフトする。光を界面に結合してＳＰＲを発生せしめ るために、２つの代替配置、即ち金属化回折格子（Ｗｏｏｄ作用）又は金属化ガ ラスプリズムもしくは金属ガラス基板と光学的に接触するプリズム（Ｋｒｅｔｓ ｃｈｍａｎｎ作用）を使用する。ＳＰＲの更なる詳細については、本発明者らの ＷＯ９０／０５２９５号を参照されたい。ＳＰＲベースのアッセイでは、レセプ ターを金属面に結合し、表面と接触する溶液中のリガンドとレセプターとの相互 作用を監視する。 本発明の方法を例示する以下の非制限的な実施例では、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎ ｎ作用をベースとする市販のＳＰＲベースのバイオセンサーシステム（ＢＩＡｃ ｏｒｅ^TMシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ製）を使用した。 実施例１ センサー面の調製 ＢＩＡｃｏｒｅ^TMセンサーチップＣＭ５（単層の長鎖炭化水素によりカルボキ シメチルデキストラン層を支持する金めっきガラススライド、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ製）上で、ＨＢ Ｓ連続流（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３．４ｍＭＥＤＴＡ及び０．０５％界面活性 剤Ｐ２０を含む１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））を維持した。０．２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ） 及び０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む溶液を３分注 入して、センサー面上のカルボキシル化マトリックスを活性化した。次いで、１ ０ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４．７５）中の１００μｇ／ｍｌのウサギ抗−マ ウスＦｃ（ＲＡＭＦｃ）抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を注入し、次いでエタノールアミン塩酸塩（ ｐＨ８．５）をパルスして、残存ＮＨＳ−エステル基をブロックした。抗−ｐ２４−Ｍａｂとセンサー面との結合及びｐ２４リガンド相互作用の反応速 度分析 先に製造したセンサー面をＢＩＡｃｏｒｅ^TM機器内に組み込み、精製モノクロ ーナル抗−ｐ２４抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（以後Ｍａｂ ７と称する）の溶液を注入して 、抗−ｐ２４モノクローナル抗体を固定化したＲＡＭＦｃにより捕捉した。次い で、ＨＩＶコアタンパク質ｐ２４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）の種々の溶液（濃度は１８ ．７５〜３００ｎＭで変動）を注入し、相対応答（共鳴単位（ＲＵ））対時間（ 秒）の結合曲線を記録した（１ＲＵは、約１ｐｇ／ｍｍ²のセンサー面上で、タ ンパク質の結合により生ずる質量変化に相当する；Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．等， Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．１４３（１９９１ ）５１３−５２６）。 Ｍａｂ ７−ｐ２４の相互作用の反応速度を分析すると、システムが１０^-5（ ｓ^-1）より低い解離速度定数で極めて安定し、会合速度定数が２．２・１０⁵（ Ｍ^-1ｓ^-1）であ ることが判明した。以下の競合実験で妥当な応答レベルを得るために、６０ｎＭ のｐ２４濃度を選択した。６０ｎＭ濃度の結合曲線を図１に示す。抗−ｐ２４ Ｍａｂに対する合成ｐ２４誘導ペプチドの親和性 容量１００μｌのｐ２４のＨＢＳ ６０ｎＭ溶液を、（Ｄｒ Ａｋｅ Ｅｎｇ ｓｔｒｏｍ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍｅ ｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓ ｗｅｄｅｎから入手した）（ｉ）領域３２９−３５２（ペプチド７）：DCKTILKA LGPAATLEEMMTACQG（分子量＝２４９４）及び（ii）領域３３２−３４９（ペプチ ド５）：TILKALGPAATLEEMMTA（分子量＝１８４１）に対応する濃度の異なる（５ ｎＭ〜１ｍＭ）２種の合成ｐ２４誘導ペプチド１００μｌと混合した。ペプチド 配列はＲａｔｎｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，２２７−２８４，１９８５に基 づき、Ｍｙｅｒｓ Ｇ．等，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ ｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８ ８の方法で番号付けする。各混合物を捕捉した抗−ｐ２４抗体を含むセンサー面 上に１０μｌ／分で２分間注入し、各ペプチドのそれぞれの結合曲線を記録した 。ペプチド５を０μＭ、４．９１μＭ、１４．７５μＭ、４４．２６μＭ、１３ ２．７８μＭ、３９８．３３μＭ及び１１９５．００μＭの濃度で使用し、ペプ チド７は０μＭ、０．００５μＭ、０．０１６μＭ、０．０４９μＭ、０．１４ ７μＭ、０．４４１μＭ及び１．３２３μＭの濃度で使用した。 ペプチド５の結合曲線を図２にオーバーレイプロットで示し、ペプチド７の結 合曲線の対応するオーバーレイプロットを図３に示す。図３は、ペプチド７では ５ｎＭ濃度で既に競合反応速度が見られるのに対し、ペプチド５では、図２に示 すようにμＭ濃度でようやく競合が明白となることを示している。明らかに、こ れら２種のペプチドは、固定化した抗体に対して全く異なる親和性を示す。これ をより直接的に実証するために、２種のペプチドを同一濃度で用いたｐ２４／ペ プチド混合物を注入し、結合曲線を記録した（ｐ２４は６０ｎＭ、ペプチドは４ ４μＭ）。結果は図４に示す。この図は、ペプチド７は抗体に対する親和性が高 いが、ペプチド５は抗体に対する親和性が低いことを示 している。 実施例２ コンアルブミン−アミノテオフィリン結合体の調製 ３０．８ｍｇのコンアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ ｐＨ７．５）に溶解した。エタノール中のＳＰＤＰ（３．１２ｍｇ／ｍｌ）（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌ ａ，Ｓｗｅｄｅｎ）溶液４４μｌをタンパク質溶液に添加して、室温で１時間反 応させた。ＮＡＰ５−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での緩衝液交換により、Ｓ ＰＤＰ変性コンアルブミンを０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）に移した 。 ６．７ｍｇのＳＰＤＰ変性コンアルブミンをＤＴＥで還元し、過剰ＤＴＥをＮ ＡＰ５−カラムで脱塩して除去し、ＳＨ−コンアルブミン調製物を再度ＳＰＤＰ と反応させた。但し、ｐＨは４．５とした。過剰試薬をＮＡＰ５−カラムで脱塩 して除去し、１００μｌの２０ｍＭアミノテオフィリン溶液を添加し、コンアル ブミンのスクシンイミドエステルと反応させた。ＮＡＰカラムでの緩衝液交換に より過 剰試薬を再度除去し、結合体を１０ｍＭ ＨＢＳ緩衝液中に取り込んだ。生成し た結合体をＳｕｐｅｒｏｓｅ^TM１２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でのゲル濾過 により精製した。高分子量画分を除去し、アミノテオフィリン−コンアルブミン 結合体と、固定化したアミノテオフィリンモノクローナル抗体（Ｋａｂｉ Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）との反応をＢＩＡｃｏ ｒｅ^TMシステムで検出して該結合体を同定した。最終収量は０．１５ｍｇであっ た。抗−テオフィリンＭａｂとセンサー面との結合及びコンアルブミン−アミノテオ フィリンリガンド相互作用の反応速度分析 精製モノクローナル抗−テオフィリン抗体（Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）溶液を実施例１と同様にＢＩＡｃｏｒｅ^TM システムに注入し、抗−テオフィリン抗体を固定化したＲＡＭＦｃで捕捉した 。次いで、先に調製したコンアルブミン結合体の種々の溶液（濃度は１００〜１ ０００ｎＭで変動）を注入し、結合曲線を記録した。反応速度分析により、会合 速度 定数が３．０・１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1であり、解離速度定数が２．２・１０^-2ｓ^-1であ ることが判明した。以下の競合実験では、６２０ｎＭの濃度を選択した。この濃 度はＫ_D（ｋ_ass／ｋ_diss）濃度（７３０ｎＭ）に近い。固定化した抗−テオフィリンモノクローナル抗体に対するテオフィリン誘導体の 親和性 容量１００μｌのアミノテオフィリン／コンアルブミン結合体６２０ｎＭ溶液 をそれぞれテオフィリン（Ｆｌｕｋａ Ａ．Ｇ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、 ７−テオフィリン酢酸（Ｆｌｕｋａ Ａ．Ｇ．）及びアミノテオフィリン（Ｆｌ ｕｋａ Ａ．Ｇ．）の５００ｎＭ溶液各１００μｌと混合した。各混合物を、捕 捉した抗−テオフィリンモノクローナル抗体を含む表面上に１０μｌ／分で９０ 秒間注入し、各結合曲線を記録した。結果を図５に示す。この図から、アミノテ オフィリンが抗体に対して最も高い親和性を示し、テオフィリンの酢酸誘導体が 遥かに低い親和性で反応することは明白である。テオフィリン自体は中間の親和 性を示す。 実施例３ コンアルブミン−ヒスタミン結合体の調製 実施例２で調製したＳＰＤＰ変性コンアルブミン６．７ｍｇをＤＴＥで還元し 、過剰ＤＴＥをＰＢＳ緩衝液に対するＮＡＰ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で 脱塩して除去し、ＳＨ−コンアルブミン調製物を６倍モル過剰のピリジル−ヒス タミン誘導体（Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅ ｄｅｎ）と一晩反応させた。コンアルブミン−ヒスタミン結合体を前述のように 精製し、結合活性について試験した。精製結合体の最終収量は１．５ｍｇであっ た。抗−ヒスタミンＭａｂとセンサー面との結合及びコンアルブミン−ヒスタミンリ ガンド相互作用の反応速度分析 精製モノクローナル抗−ヒスタミン抗体（Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａ Ｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の溶液を実施例１と同様にＢＩＡｃｏｒｅ^TM 機器に注入し、固定したＲＡＭＦｃで抗−ヒスタミン抗体を捕捉した。次いで 、先に調製したコンアルブミン結合体の種々の溶液（濃度は１００〜１０００ｎ Ｍで変動）を注入し、結合曲線を記録した。反応速度分析によれば、ヒスタミン 結合体と固定化した抗−ヒスタミン抗体との会合のための会合速 度定数（ｋ_ass）値は２．１・１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1であり、固定化した抗−ヒスタミン 抗体からヒスタミン結合体を解離するための解離速度定数（ｋ_diss）は４．３・ １０^-4ｓ^-1であり、即ち実施例２のテオフィリン結合体の場合よりも実質的に低 い値であった。以下の競合実験では、８０ｎＭの濃度を選択した。固定化した抗−ヒスタミンモノクローナル抗体に対するヒスタミン及びメチルヒ スタミンの親和性 容量１００μｌのヒスタミン／コンアルブミン結合体８０ｎＭ溶液をヒスタミ ン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．Ｍｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びメチルヒスタ ミンの２２０ｎＭ溶液それぞれ１００μｌと混合した。各混合物を１０μｌ／分 で８分間、捕捉した抗−ヒスタミンモノクローナル抗体を含む表面に注入し、各 結合曲線を記録した。結果を図６に示す。この図から、ヒスタミン自体よりもメ チルヒスタミンの方が親和性が高いことは明白である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年９月７日 【補正内容】 ３４条補正 請求の範囲 １．低分子量リガンドと共通レセプターとの相互作用について、該低分子量リガ ンドの親和性及び反応速度特性を決定するための方法であって、質量感知装置の 感知面上にレセプターを固定化し、感知面上での応答が低分子量リガンドの応答 の少なくとも約２０倍であるリガンド類似体と各低分子量リガンドとを既知の比 率で混合し、各混合物を検出面と接触させ、応答を測定し、各混合物の応答をリ ガンド類似体単独の場合と比較することからなり、リガンド類似体応答の歪みが リガンドの親和性及び反応速度特性を表すことを特徴とする前記方法。 ２．リガンド類似体が高分子量分子であることを特徴とする請求項１に記載の方 法。 ３．リガンド類似体及び各混合物に対する部分結合曲線（応答対時間）をそれぞ れ記録することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 ４．結合曲線が平衡に達することを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．結合曲線が会合／解離曲線である請求項３又は４に記 載の方法。 ６．Ｋ_D濃度に近いリガンド類似体濃度が選択されることを特徴とする請求項１ から５のいずれか一項に記載の方法。 ７．前記質量感知検出器がエバネッセント波検出に基づく検出器であることを特 徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 ８．前記エバネッセント波検出が表面プラスモン共鳴に基づくことを特徴とする 請求項７に記載の方法。 ９．前記低分子量リガンドが潜在的薬剤であることを特徴とする請求項１から８ のいずれか一項に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．低分子量リガンドと共通レセプターとの相互作用について、該低分子量リガ ンドの親和性及び反応速度特性を決定するための方法であって、感知構造体上に レセプターを固定化し、感知構造体上での応答が低分子量リガンドの応答よりも 実質的に高いリガンド類似体と各低分子量リガンドとを既知の比率で混合し、各 混合物を感知構造体と接触させ、応答を測定し、各混合物の応答をリガンド類似 体単独の場合と比較することからなり、リガンド類似体応答の歪みがリガンドの 親和性及び反応速度特性を表すことを特徴とする前記方法。 ２．リガンド類似体の応答が低分子量リガンドの少なくとも約２０倍であること を特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．リガンド類似体が高分子量分子であることを特徴とする請求項１又は２に記 載の方法。 ４．リガンド類似体及び各混合物に対する部分結合曲線（応答対時間）をそれぞ れ記録することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 ５．結合曲線が平衡に達することを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．結合曲線が会合／解離曲線である請求項４又は５に記載の方法。 ７．Ｋ_D濃度に近いリガンド類似体濃度が選択されることを特徴とする請求項１ から６のいずれか一項に記載の方法。 ８．前記感知構造体が質量感知器であることを特徴とする請求項１から７のいず れか一項に記載の方法。 ９．前記質量検出器がエバネッセント波検出に基づく検出器であることを特徴と する請求項８に記載の方法。 １０．前記エバネッセント波検出が表面プラスモン共鳴に基づくことを特徴とす る請求項９に記載の方法。 １１．前記低分子量リガンドが潜在的薬剤であることを特徴とする請求項１から １０のいずれか一項に記載の方法。