JPH09504690A - 汚染を最小限にするための反応チューブおよび使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸増幅アッセイを行うための使い捨て反応チューブ。使い捨て反応容器は、自動ピペッターによって貫通し、増幅反応生成物の一部を吸引することができる貫通可能なキャップを有する。使い捨て反応容器は、核酸増幅アッセイを行うのに必要な試薬を含む。患者の試料を、使い捨て反応容器中の単位用量試薬に添加し、貫通可能なキャップを閉じる。反応混合物および試料を含む使い捨て反応容器は、典型的には熱サイクラーに置くことによって増幅を受ける。増幅後、使い捨て反応容器をそのまま自動分析機に移す。そこでは、反応容器のキャップを取り除くことなく、自動ピペッターが閉じた膜を貫通し、さらに処理するために増幅サンプルの一部を吸引する。こうすることにより、汚染の可能性のあるエーロゾルまたは飛沫の発生が避けられる。

Description

【発明の詳細な説明】 汚染を最小限にするための反応チューブおよび使用方法 発明の詳細な説明 本発明は、増幅反応に適する反応チューブ、特に、自動熱サイクルおよび検出 装置で使用するためのチューブに関する。本発明はまた、該チューブの自動的使 用方法に関する。 本出願は、本出願人による米国出願No.08/141,243（1993年10月22日出願）「 チューブ輸送システムおよび使用方法」（代理人名簿5453.US.01）（現在は放棄 ）に関する。発明の背景 生物学的サンプル中の標的核酸を検出するための増幅技術は、感染性のある微 生物および遺伝子欠陥の検出に対して高い感度および特異性を提供する。核酸の 特定の配列のコピーは、増幅法によって指数関数的速度で合成される。これらの 技術の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)（米国特許No.4,683,202およ びNo,4,683,195(Mullis)）；リガーゼ連鎖反応法(LCR)（EP-A-320308(Backmanら )）；ならびにギャップフィリングＬＣＲ法（ＧＬＣＲ）またはその変法(W0 90/ 01069(Segev)、EP-A-439-182（Backmanら）、GB 2,225,112A (Newtonら)およびW0 93/00447(Birkenmeyerら))がある。 他の増幅技術としては、文献に記載のＱ−βレプリカーゼ法；EP-A-497272(Walk er)、EP-A-500224(Walkerら)およびWalkerら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，89 ：392(1992)に記載のStrand Displacement Amplification法(SDA)；Fahyら、PCR Methods and Applications 1:25(1991)に記載のSelf-Sustained Sequence Repl ication法(3SR)；ならびにkievitsら，J，Virol．Methods，35:273-286(1991)に 記載のNucleic Acid Sequence-Based Amplification法(NASBA)が挙げられる。 これらの反応、特に熱サイクルを必要とする反応は、通常、National Scienti fic(San Rafael，CA)製のSlickSeal（登録商標）チューブなどのマイクロフュー ジ(microfuge)型チューブまたはPerkin-Elmer(Norwalk，CT)製のThin-Walled Ge neAmp（登録商標）チューブで行われる。別の型の反応容器は、EP-A-488769に記 載され、Perkin-Elmer(Norwalk，CT)から、Perkin-Elmer 9600熱サイクラーとと もに使用するためのMicroAmp（登録商標）として市販されている、ストリップ状 の半球形キャップと結合したストリップ状のマイクロフュージ反 応容器である。典型的方法では、増幅反応を行った後、チューブを開けて、増幅 反応生成物の一部をマイクロタイタープレート、ゲルまたは他の検出装置などの 検出装置に移す。 そのような核酸増幅方法に伴う主な問題は、増幅容器を開けるときの汚染の危 険である。増幅反応生成物の一部を取り出して検出分析を行うためにキャップを 取り除くときに、こぼしたり、飛沫が生成したり、および／またはエーロゾルが 発生する可能性がある。これは、飛沫が空気で運ばれることにより実験室中に、 または装置上に増幅産物を撒き散らしたり、未増幅サンプルおよび／または試薬 を汚染する可能性がある。これは、すぐに、擬陽性(false positive results)の 結果を招くことになる。そのような汚染を防ぐためには、極度の注意を払わなけ ればならない。その分野では、習慣的に、サンプル調製、増幅および検出領域の 間を物理的に分離している。それは、かなり複雑で費用もかかり、そのような隔 離した領域間での実験室用の上着、手袋、ピペットまたは実験室装置の移動を防 ぐための厳しい訓練が必要である。 USP 5,229,297および対応のEP-A-0381501（Kodak）は、閉じた環境で核酸物質 の増幅および検出を行って汚染の危険を防 ぐためのキュベットを開示している。そのキュベットは、一連の通路によって連 結している複数の部屋(compartment)を有する閉じた装置である。部屋のいくつ かはＤＮＡ鎖を増幅するための反応室であり、いくつかは増幅されたＤＮＡを検 出するための検出位置を有する検出室である。試薬を保持するための貯蔵室を備 えることもできる。核酸物質のサンプルを貯蔵室の試薬とともに通路を経由して 反応室に入れる。貯蔵室から出る通路には、増幅した物質が貯蔵室に逆流するの を防ぐための一方向逆止め弁を備えている。サンプルを反応室で増幅し、増幅産 物を反応室から通路を通って検出室に押し入れるために軟質壁に外圧をかけるこ とにより、相互連絡している通路を通って検出室の検出位置に移す。あるいは、 反応室から検出室へ試薬および／または増幅産物をポンプで送るためのピストン 装置をキュベットに備えてもよい。 EP 0381501 A2（kodak）に開示されたキュベットは、閉じた反応および検出環 境を提供するものであるが、いくつかの重要な欠点がある。例えば、多重室、多 重通路、逆止め弁およびポンプ機構は比較的複雑な構造であって、製造するのに かなりの努力を要する。また、EP 0381501 A2に開示されたキュベット の形および立体配置は、従来の熱サイクル装置に容易に挿入できるものではない 。さらに、そのキュベットが利用する流体移動法は、軟質側壁に適用されるロー ラー装置または小さいピストンの移動などの機械的外圧源を必要とする。通常の 熱サイクル装置は、そのような外圧源を含むように容易に改造されるものではな く、又、軟質壁にかかる機械的圧力は、特にキュベットが一列に並んでいない場 合は、これらの壁を破裂させる可能性がある。増幅反応生成物を含む外部室の軟 質壁の破裂は、装置内部、そして恐らくは実験室全体を汚染するであろう。最後 に、この文献に記載された装置は、開示された装置のスループットの点でかなり 制限される。そのシステムは、製造のための所望の柔軟性を提供するものではな い。 フランス特許公開No.FR 2672301（Larzul）は、ＤＮＡ増幅のための、同様に 密閉されたテスト装置を開示している。それはまた、多重室および通路を有し、 サンプルおよび／または試薬はその通路を経由して移動する。流体輸送のための 原動力は、水圧変位、磁気変位、受動型毛細管作用、熱勾配、蠕動性ポンプおよ び機械的に誘発される圧力差動（例えば、押し出し）として記載されている。 この分野で、汚染の問題の処理に適用される他の方法は化学的である。そのよ うな方法の一つは、USP 5,035,996(Hartley,Life Technologies，Inc.)に記載さ れている。それは、増幅産物に、分析すべきサンプルに一般には存在しないリボ ヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ ｄＮＴＰ）塩基（例えば、ＤＮＡ分析の場合は、ｄＵＴＰ）を混入させることを 含む。こうして、増幅産物は、多重位置にウラシルを有する配列を有することに なる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素を増幅の前にサンプルに添 加する。こうすると、サンプル中の天然ＤＮＡに影響を及ぼすことなく汚染反応 生成物（ウラシルを含む）が消化される。 この方法は、ＰＣＲ法には作用するが、ＬＣＲ法に対しては、能力が制限され る。それは、平滑末端ＬＣＲ法には適用できないし、ギャップＬＣＲ法に対して は能力が非常に制限される。ギャップＬＣＲ法の場合、ギャップを満たすために ２、３個より多くのウラシル塩基を入れることは実際的でない。ＵＤＧの作用は 、ＰＣＲ増幅では多数の部位で働くのに対して、一つの部位でのみ働く。この方 法は、Roche Diagnosticsにより、Amplicor（登録商標）ＤＮＡ増幅アッセイの 不活性化法として 市販されているが、種々の増幅反応に適用することはできない。 汚染の危険を最小限にするために使用される他の方法として、検出反応完了後 に、増幅反応生成物およびポリヌクレオチド試薬を破壊する方法がある。該方法 は、本出願人による審査中の米国特許出願07/863,662（Celebuski）「ヌクレオ チド配列を不活性化するための方法およびその方法で使用するための金属キレー ト」（1992年4月3日出願）に記載されている。その不活化法は、反応生成物およ び、所望により全装置に添加される銅フェナントロリン錯体などの二価の金属キ レートおよび過酸化水素の希水溶液を利用するものである。この組成物は、全Ｄ ＮＡを増幅できない小さい断片に切断するのに非常に有効である。従って、増幅 の前よりもむしろ増幅産物の検出後に使用される。ＵＤＧおよび金属キレートな どの化学的方法は、少量の汚染防止に有効であるが、反応生成物の小滴の様なよ り大きい汚染の場合にはあまり十分ではない。すなわち、閉じた系で増幅反応を 行うことの必要性は、EP 0381501 A2、EP 0550090 A1およびUS 5,229,297などの 文献で認識されている。これらの文献は、そのような閉じた反応の使い捨て用品 を記載している。 さらに、PCT公開WO 91/12342(Cetus)は、マグネシウムなどの種々の成分が分 離されるＰＣＲ反応組成物を開示している。例えば、一つの態様では、マグネシ ウムを、油性または蝋質層によって他の反応成分から分離し、別の態様では、マ グネシウム（ステアリン酸脂肪酸塩など）が蝋質バリヤ層の成分である。いずれ の場合も、分離した成分は、反応混合物を加熱して標的核酸を解離するとき、ま たはＰＣＲを開始するときに結合して、蝋は溶融する。しかし、この系は、特に 自動化されたピペッティングを必要とする場合に、自動化の助けとはならない。 検出のために冷却すると、蝋は再び凝固して、ピペットの先端を塞ぐ可能性があ る。蝋はまた、自動化検出システムでは通常使用される液体レベル感知検出系を 妨げる。これらの理由により、最初に分離した試薬（例えば、マグネシウム）を 結合するための改善された組成物および結合方法が所望される。 特に上記または下記で挙げた特許、特許出願および文献の各々は、参考文献と して本明細書に添付する。 すなわち、先行技術のこれらの制限により、汚染の危険を最小限にする増幅反 応容器および使用方法を求めることが本発明の重要な目的である。さらに別の目 的は、増幅反応サンプルを、 密封キャップを取り除くことなく除去することができる使い捨ての反応容器およ び方法を提供することである。なぜならば、キャップの取り外しはエーロゾル汚 染を撒き散らす傾向があるからである。本発明のさらに別の目的は、増幅反応サ ンプルを、容器の密封の妨害を最小限にして取り出すことができる密閉使い捨て 反応容器および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、ここに記載したような反応容器の単位用量調製物、特に 自動化ピペットを使用する自動検出装置と適合する単位用量容器に適する組成物 を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、市販の熱サイクル、例えばPerkin-Elmer 480、お よび微粒子酵素イムノアッセイ（Microparticle Enzyme Immuno Assay：ＭＥＩ Ａ）法を使用する装置などの自動検出装置とすぐに適合する反応容器を提供する ことである。 これらおよび他の目的は、下記に記載する本発明で満たされる。本発明の要旨 第一の態様において、本発明は、下記工程： ａ．標的の核酸物質を含むことが疑われるサンプルを、その疑 わしい標的核酸を増幅するために、標識試薬とともに増幅容器に添加して反応混 合物を形成する工程； ｂ．該容器内の反応混合物を、ピペッタープローブ(pipettor probe)によって貫 通可能な膜を有するぴったり密閉するキャップを閉じることにより密閉する工程 ； ｃ．該容器内の標的核酸物質を増幅する工程； ｄ．反応混合物の一部を該容器から検出用に取り出す工程；および ｅ．前記標識試薬を検出することによって増幅した標的核酸の有無を検出する工 程 を含み、前記取り出す工程が、該キャップ膜をピペッタープローブで突き刺し、 反応混合物の該一部を該ピペッターに吸引して、該一部を該容器のキャップを取 ることなく別個の検出室に分配することにより行われ、それによって、環境、未 反応サンプルもしくは試薬を汚染する可能性のある増幅された物質の飛沫または エーロゾルを回避する、核酸物質を増幅して検出するための方法に関する。 増幅法は、ＰＣＲまたはＬＣＲまたは別の増幅法であってもよい。 その方法は、好ましくは、さらに、容器および検出室に残っている全核酸物質 を、ピペッターから核酸不活性化試薬を分配することにより不活性化する工程を 含む。不活性化は、銅フェナントロリンキレートおよび過酸化水素溶液の連続添 加を含むことができる。 好ましくは反応容器は、厚さが0.002〜0.015インチ、より好ましくは0.005〜0 .009インチの範囲である膜を有するキャップのついたチューブである。 ピペッティングプローブは、好ましくは外径が0.050インチ以下である楔形ま たは鑿形の先端を有する薄い金属チューブであってもよい。 典型的には、密閉した増幅容器は、自動検出のための自動ピペッタープローブ 装置で使用し、取り出す工程および検出工程は共に、自動装置によって行われる 。より好ましくは、その方法はさらに、容器および検出室に残っている全核酸物 質を不活性化する工程を含み、取り出す工程、検出工程および不活性化工程は全 て、自動ピペッター装置によって行う。 第二の態様では、本発明は、マグネシウムイオンを省いたＰＣＲまたはＬＣＲ 増幅反応用の安定した組成物を、マグネシ ウムの補助源とともに含むキットに関する。組成物は、典型的には、単位用量反 応容器を満たすように使用する。すなわち、増幅組成物は、増幅に必要な全反応 物をマグネシウム補助因子を除いて含み、第二のサンプル調製組成物はマグネシ ウムを含む。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するための単位 用量反応容器を調製するための組成物は、本質的に、 −各々、1.6nM以上、好ましくは1.6nM〜160nMで存在する、所望の標的核酸をＰ ＣＲによって増幅するための少なくとも一組のオリゴヌクレオチドプライマー； −1.0μM以上、好ましくは1,0〜200μMで存在する、デオキシヌクレオチド三リ ン酸（ｄＮＴＰ）の補給； −熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬、好ましくはThermus種微生物由来の ポリメラーゼ酵素； −所望により、界面活性剤および不活性担体核酸；ならびに −ポリメラーゼ活性の効果をなくすのに十分低い濃度、好ましくは10^-4M以下の 濃度のＭｇ²⁺イオン から成る。 リガーゼ連鎖反応(LCR)又はギャップリガーゼ連鎖反応(GLCR)による増幅用の 単位用量反応容器を調製するための別の 組成物は、本質的に、 −各々、約1.6nM以上、好ましくは1.6nM〜16nMで存在する、所望の標的核酸をＬ ＣＲまたはＧＬＣＲによって増幅するための少なくとも二組の相補的オリゴヌク レオチドプローブ； −熱安定性リガーゼ活性を有する試薬、好ましくはThermus種微生物由来のリガ ーゼ酵素； −所望により、1.0μM以上で存在する、全４種類より少ないデオキシヌクレオチ ド三リン酸（ｄＮＴＰ）の補給および熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬、 好ましくはThermus種ポリメラーゼ酵素由来の試薬； −所望により、界面活性剤および不活性担体核酸；ならびに −リガーゼ活性の効果をなくすのに十分低い濃度、好ましくは10^-4M以下の濃度 のＭｇ²⁺イオン から成る。 最も好ましくは、組成物が、ギャップＬＣＲを行うためのｄＮＴＰおよび熱安 定性ポリメラーゼ活性を有する試薬を含む。いずれの場合も、マグネシウムの補 助的供給は、組成物外の源に由来する。好ましくは、マグネシウムは、キットに 含まれるサンプル希釈剤または緩衝液中に、希釈された適容量のサン プルの添加が、必要なマグネシウム補助因子を、約１mM〜約40mMの最終濃度で供 給するのに十分な濃度で存在する。 最後の態様では、本発明は、以下の通り、増幅反応で使用するための密閉可能 な使い捨て装置に関する。 すなわち、 −外径が熱サイクル装置に適合する大きさであり、内部に対して開口部を有する 熱安定性ポリマー物質のチューブ； −厚さが0.0015インチ以下の穴があけられる膜を含み、その膜によって、チュー ブを開けることなく自動ピペッターで閉じたチューブから増幅反応生成物のサン プルを採取することができる、チューブの開口部をぴったり密閉するためのキャ ップ；および−キャップをチューブに対して保持し、キャップを開口部の中に折 り畳むことができる軟質蝶番 を含む、核酸増幅アッセイを行うための反応容器装置である。 好ましくは、穴があけられる膜の厚さは、0.002〜0.015インチ、特に、0.005 〜0.009インチである。 −外径が熱サイクル装置に適合する大きさであり、内部に対して開口部を有する 熱安定性ポリマー物質のチューブ； −穴があけられる薄い膜を含み、その膜によって、チューブを 開けることなく自動ピペッターで閉じたチューブから増幅反応生成物のサンプル を採取することができる、チューブの開口部をぴったり密閉するためのキャップ ；および −キャップをチューブに対して保持し、キャップを開口部の中に折り畳むことが でき、折り畳み蝶番を含む軟質蝶番を含む、核酸増幅アッセイを行うための反応 容器装置である。 好ましくは、穴があけられる膜の厚さが、0.002〜0.015インチ、特に、0.005 〜0.009インチである。 反応容器は、閉じたチューブの最大半径を規定する蝶番を有し、チューブの外 径から最大半径までの距離は約0.154インチ未満である。所望により、折り畳み 蝶番は、さらに、蝶番の材料に２個の溝を含み、ｇ／ｈの比は約0.8±20%である 。ｇは二つの溝の中央線間の距離であって、好ましくは2〜2.5mmであり、ｈは、 ふたが密閉位置にあるときに測定したチューブへの付着点からふたの上部までの 蝶番部品全体の高さである。図面の簡単な説明 図１は、フリップキャップが開いている、先行技術のSlickSeal（登録商標） 使い捨て反応容器の縦断面図である。 図２は、本発明に係る使い捨て反応容器の縦断面図である。 フリップキャップは開いており、図３の線ａ−ａ’に沿って切断した断面を示す 。 図３は、図２の反応容器の平面図である。 図４は、図２および３の反応容器の側面図である。 図５は、図１（上）および図２（下）の反応容器の複合部分断面図であり、共 に、蝶番構造を説明するために、フリップキャップを閉じた位置にして示す。 図６は、図２の反応容器の側面図、特に、はっきり示すために部分的に切断し た断面図であり、蝶番式のキャップは部分的に閉じた位置にある。 図７は、自動検出装置で使用するための、図２の反応容器を保持するように作 られた反応容器ホルダーの上から見た斜視図である。 図８は、実施例６の結果のグラフである。発明の詳細な説明 本発明は、核酸増幅アッセイを行うための使い捨て反応容器である。使い捨て 反応容器は貫通できるキャップを有し、そのキャップは、自動ピペッターで貫通 して、増幅反応生成物の一部を吸引することができる。使い捨て反応容器は、リ ガーゼ連 鎖反応(LCR)またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの核酸増幅アッセイを行うの に必要な試薬を含む。患者の試料を使い捨て反応容器中の単位用量試薬に添加し て、貫通可能なキャップを閉じる。反応混合物および試料を含む使い捨て反応容 器は、典型的にはそれを熱サイクラーに置くことによって、増幅を行う。増幅後 、使い捨て反応容器をそのまま、自動分析機に移す。そこでは、反応容器のキャ ップを取り除くことなく、自動ピペッターが閉じた膜を貫通し、さらに処理する ために増幅されたサンプルの一部を吸引する。こうすることにより、汚染の可能 性があるエーロゾルおよび飛沫の発生が回避される。 １．定義 「増幅反応」は、元の核酸の配列の多数のコピーを、典型的には酵素による複 製工程を多数回繰り返すことにより生じさせる反応である。その前のサイクルで 作られた２つのコピーの各々から別のコピーを作ることができる場合、その増幅 法は、サイクル数に関して指数関数的であると言う。アッセイ感度の改善には指 数関数的増幅が好ましいけれども、増幅産物が注意深く封じ込めることができな いで、その結果汚染を招く場合は、この感度の増大は欠点でもある。汚染および いくつかの増幅法 の問題に関しては、特に、背景の項で述べてある。 いくつかの増幅反応、例えばＰＣＲおよびＬＣＲは、高温と低温が交互になる サイクル、すなわち「熱サイクル」として知られる工程を含む。ＰＣＲ、すなわ ち「ポリメラーゼ連鎖反応」は、通常は熱安定性であるポリメラー酵素が、元の 核酸を鋳型として使用するプライマーの伸長により元の配列の多数のコピーを生 じさせる増幅反応である。ＰＣＲのより詳細については、USP 4,683,202およびU SP 4,683,195に記載されている。ＬＣＲ、すなわち「リガーゼ連鎖反応」は、通 常は熱安定性であるリガーゼ酵素が、２個以上のオリゴヌクレオチドプローブを 標的にハイブリダイゼーションさせながらそれらのプローブを連結することによ り、元の配列の多数のコピーを生じさせる核酸増幅反応である。ＬＣＲおよびそ の変法であるギャップＬＣＲのより詳細については、EP-A-320-308（Backmanら ）、EP-A-439-182（Backmanら）およびWO 93/100447（Birkenmeyerら）などに記 載されている。 「熱サイクラー」は、核酸増幅反応混合物を、設定した時間、設定した温度で 又は温度間で、加熱、冷却および／または保持するために使用する装置である。 「単位用量」は、１個の反応容器が、反応をなしとげるのに必要な、サンプル 以外の全部またはほぼ全部の試薬を含む系を意味する。一般に、使用者は、ただ サンプルを添加して反応を開始するだけである。典型的には、単位用量反応容器 は使い捨てであり、１回の使用の後に捨てる。 ２．反応容器 本発明の反応容器10を図２〜６に示す。反応容器10は、本明細書では「チュー ブ」、「使い捨てのもの」および「容器」とも言い、それらの用語は交換可能に 使用される。先行技術のチューブの多くの部分が類似しているので、それらは、 同じ参照番号に「ａ」を添えて、例えば図１の先行技術のチューブは10aとして 記載する。 容器は、閉じた端13を有する円錐状の先が細くなった底部12および円筒部分14 を含む縦方向の胴部を含む。先が細くなった部分12の逓減度および長さは、市販 の熱サイクル加熱ブロック（図示していない）に適合するようにしてある。例え ば、逓減度は中央線から約9°であり、先細部分12の高さは約13mmであり、先細 部分12の最も広い点の直径は約7mmである。これらの寸法は、装置の操作に対し て決して臨界的なものではない。 それらは単に、Perkin Elmer 480などの市販の熱サイクラーへの密接な適合を容 易にするだけである。熱サイクラーによく適合し、チューブ壁が薄いと、熱ブロ ックと反応混合物との間の熱エネルギーのより効率的な移動が促進される。一般 に、チューブ壁は、約0.040インチ未満、好ましくは、約0.030インチ未満である 。本明細書に記載する特定の態様では、0.024±0.004インチの壁を必要とする。 容器の胴部は、先細部分と結合した円筒部分14も含む。その円筒部分は、先細 部分の最も広い部分と同じ外径、すなわち好ましい態様では約7mmを有する。円 筒部分の長さは重要ではなく、容器内部の必要な容積、キャップ機構の高さおよ び型、ならびに熱サイクラーになんらかの型のふた(lid)が使用されているかど うかによって支配される。全体の長さは約5〜30mm、好ましくは10〜20mmである 。好ましい態様では、円筒部分14は、容器の胴部にバーコードラベルなどのラベ ルを付着することができるように、約17mmの長さである。 円筒部分14の上端は、外側に向かって放射状に広がって、開口部16を規定して いる。先細部分12および円筒部分14が一緒になって内部15を規定し、その中に反 応サンプルおよび試薬を入 れることができる。開口部16は、キャップ20によって容易にかつぴったり密閉す るための射出縁(radiused edge)18を含む。 キャップ20は、キャップの開閉を容易にするためのタブ手段22を含む。キャッ プはさらに、開口部16にぴったり適合し、射出縁18またはその射出縁のすぐ下の 内部壁に対して効果的な密閉が得られるように作った外周26を有する、一般的に 円筒状のシール部材24を含む。この理由により、シール部材24は、図２および４ に最も良好に示すように、わずかに先細りになっており、キャップ本体20から最 も離れた端の外周26の方が大きくなっている。 円筒状のシール部材24の閉じる一端は上部カバーである。図２では、これを薄 い膜28として示す。一方、図１では、本発明の膜28と有意に異なるので、先行技 術のカバーを29として示す。先行技術のチューブのカバー29の目的は、単に、容 器を閉じて中身が漏れるのを防ぐことである。従って、そのカバーは、チューブ 10aの残りの壁と同じ材料およびほぼ同じ厚さで成形される。これに対して、本 発明に係る容器10の膜28は、下記の方法の項で記載するように、装置のプローブ によって貫通することができるように有意に薄くなっている。 好ましいカバー28は、厚さが0.005±0.001インチ(0.125±0.025mm)であるが、 該厚さは、0.002〜0.015インチ（0.05〜0.375mm）、好ましくは0.002〜0.01イン チ（0.05〜0.25mm）、より好ましくは0.005〜0.009インチ(0.125〜0.225mm)の範 囲でもよい。本質的に、膜28は、通常の取扱いの際に破れたりしないよう十分強 くなければならないが、装置のプローブによる穴あけに耐えるほど強くてはいけ ない。すなわち、最大強度／厚さは、膜組成物の引張強度、膜サポートの形状、 ならびに特定の装置のプローブの強度および下方への押圧力によって支配される 。これらの規準は、チューブの組成および使用する装置システムにかなり依存す る。本発明の好ましい厚さは、改良したIMx（登録商標）装置（下記４項参照） の、先端が45度の傾斜を有する、直径が0.040インチのステンレス鋼製プローブ により 900g以下の力を受けるHimont PD701樹脂(Himont USA，Inc.，Wilmingto n，DE)に対して選択した。他の組成物に関する、または他の装置システムにおけ るこれらのパラメーターの評価および最適化は、当業者であれば容易に実施され る。 一般に、図２では30として、図１では31として示す蝶番は、キャップ20を、薄 くて柔軟な峡部を介して容器の胴部に対し保 持する。蝶番30、31は、キャップ20を取扱いやすく保持するが、円筒形のシール 部材24をチューブの開口部16に挿入できるよう折り重ねることができるのに十分 な柔軟性を有する。外周26とチューブの開口部16との間のぴったりした密閉は、 これらの部分の間の公差がぴったり合っていることを必要とし、また、そのよう な蝶番は、キャップをチューブの開口部からはずすための柔軟性を有するという ことは、直ちに理解される。これらの部分がぴったり適合していると、キャップ の最も滑らかな挿入は、円筒状シール24の側面が縦方向部分14の壁にほぼ平行で あるとき、言い換えると、「迎え角」θ（図６参照）がほぼ０であるときに生じ ることも明らかである。すなわち、蝶番の構成には考察の兼ね合いがある。一方 では、蝶番の材料を最少限にして、キャップ本体20をチューブの胴部14に近づけ るのが望ましいが、こうすると、図６に示すように、キャップシール部材24が過 酷で最適でない迎え角θで開口部16に入ることになる。他方、迎え角θの最適化 は、かなり長い蝶番部分を使用することを必要とし、これはすなわち、材料の浪 費および反応容器の有効な最大半径の大きさの増加を意味する。 本発明は、これらの兼ね合いの問題を、先行技術の蝶番31と は有意に異なる新規の「折り畳み式」蝶番30を提供することにより克服するもの である。「折り畳み式」蝶番は、折り畳み箇所または「コーナー」が２個以上存 在し、これらの折り畳みの角度の和は、キャップがチューブを密閉するために折 り返されなければならない円弧であるため、約180度であることを特徴とする。 蝶番30は、縦方向の部分14のフレアー部分の延長部分32およびキャップ本体20の 延長部分34を含む。二つの延長部分32および34は、中央の突起部分(spine ridge )35から、各々、溝36および38によって分離されている。二つの溝は互いに距離 ｇの間隔を置いている（図２および３参照）。図５に最もよく示されているよう に、折り畳み構造は、溝36および38に二つ（またはそれ以上）の柔軟点を可能と し、実際には図５の量ｄだけ、有効な全体の半径が減少するけれども、より好ま しい迎え角が容易に得られる。図５のもとになる実際の態様では、ｄは約0.02イ ンチである。 距離ｘは、キャップが閉じた位置にある場合の、胴部14の外側からはみ出た蝶 番の最大の量を表す。キャップタブ22は蝶番30以上には伸びていないので、蝶番 が全体の最大半径を表すと考えられる。本発明の好ましい態様では、ｘが約0.15 4インチ 以下、好ましくは約0.149インチ以下である。距離ｒは、有効な全体の半径の別 の目安であるが、ｒは円筒部分14の直径とともに変わる。 距離ｈは、キャップを閉じたときの蝶番部品の全体の高さであり、キャップ本 体20および円筒部分14の外側に広がった、蝶番がチューブと結合しているところ のフランジを含む。典型的には、突起部分35とほぼ同じ高さである。距離ｈは、 二つの溝36および38の間の距離ｇにも関連する。示した好ましい容器では、ｈは 約0.103インチであり、ｇは約0.087インチである。すなわち、この態様のｇ／ｈ 比は0.84であるが、0.8の比から20%、好ましくは、約10%以下だけ変わってもよ い。図５に示すように、延長部32および34はほぼ等しく、突起部35は、実質的に 延長部に対して垂直になり、チューブの胴部の縦軸に対して平行になり、各柔軟 点または「コーナー」は約90度の角度を規定する。 約0.8よりかなり大きいｇ／ｈ比は、延長部32および34の長さの違いに対応し て「コーナー」に一つの鋭角および一つの鈍角を作る傾向にある。これはまた、 曲がった突起部35を生じる傾向にある。 本発明の使い捨て容器10は、反応混合物の成分または増幅反応生成物との相互 作用に関して不活性であるポリマー材料から成る。その材料は、蝶番のはたらき を可能にし、プローブによる膜28の貫通を可能にするために、幾分柔軟性がある べきであり、好ましくはオートクレーブに入れることができるものである。好ま しいポリマーはポリプロピレンであり、それによって、膜28を含む装置全体を成 形することができる。多くの等級のポリプロピレンが市販されている。Himont P D701ナチュラル(Himont USA，Inc.，Wilmigton，DE)などの樹脂は、十分な不活 性性および柔軟性を示し、オートクレーブに入れることができるので、好ましい 。薄い膜28の領域のキャビティーを均一に充填するために、高い射出圧および／ または「コイニング」として知られる技術が必要であるかもしれないが、装置全 体は射出成形することができる。 シリコーン油または鉱物油などの成形離型化合物を使用することができるが、 ステアリン酸またはパルミチン酸マグネシウムもしくは亜鉛などの２価のイオン を含む成形離型化合物は、そのようなイオンが増幅工程で使用する酵素の活性に 影響を及ぼす場合は、避けることが重要である。 ３．使用方法 上記反応容器は、汚染の可能性のあるかなりの量の核酸が生じる増幅反応、特 に熱サイクル増幅反応で有用である。本発明の好ましい方法は、ＬＣＲ反応との 使用であり、この詳細を本明細書に記載するが、その方法は、他の増幅反応でも 等しく有用であることは認識されるべきである。 好ましい方法によれば、反応チューブをまず熱サイクラーなどの増幅装置にお き、適切な温度で予め定めた時間、インキュベートする。ＬＣＲは４個一組のプ ローブを二つの相補対で使用し、それらの対は、標的にハイブリダイゼーション するとき、互いに実質的に隣接して置く。リガーゼ酵素は好ましくは熱安定性で 、隣接するプローブと共有結合する。分離した後、結合したプローブは、次のサ イクルで相補的プローブに対する鋳型または標的となる。典型的な変性温度は75 〜90℃の範囲であり、典型的なアニーリング温度は50〜65℃の範囲であり、当業 界で周知のように、プローブの溶融特性に依存する。 特に好ましい変形では、「単位用量」使い捨てチューブを有するキットが提供 される。これは、そのチューブが、予め測定された適量のプライマーまたはプロ ーブ、緩衝液およびリガー ゼまたは他の酵素を含むことを意味する。典型的には、患者のサンプルだけを反 応チューブに添加すればよい。しかし、一つの変形では、２価の金属イオン、特 にＭｇ²⁺を単位用量組成物から除くと、安定性が長くなり、標的に依存しないバ ックグランドの連結の発生を減少させることができることが分かった。典型的な 単位用量チューブは、約100μｌのＬＣＲまたはＰＣＲ反応混合物を含む。ＰＣ Ｒの場合、これは、増幅すべき標的配列に隣接するプライマーの混合物（好まし くは、少なくとも１つのプライマーは、検出用に標識化する。）、デオキシヌク レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、熱安定性ポリメラーゼ、サケの精液ＤＮＡなど の非妨害ＤＮＡ、界面活性剤および緩衝液を含む。ＬＣＲの場合、組成物は典型 的には、検出する標的配列に対して特異的なＬＣＲプローブ、熱安定性リガーゼ 、サケの精液ＤＮＡなどの非妨害ＤＮＡ、ＮＡＤ、界面活性剤および緩衝液を含 む。ギャップＬＣＲの場合は、特異的ｄＮＴＰおよび熱安定性ポリメラーゼも存 在する。しかし、ＰＣＲ、ＬＣＲおよびギャップＬＣＲにおいて、補助因子であ るＭｇ²⁺イオンは除くのが好ましく、その場合は、キットに供給される補助溶液 からも添加することができる。単位用量組成物中のＭｇ²⁺イオ ンの濃度は、０または少なくとも十分低くして、酵素の活性化には不十分である ようにすべきである。一般に、酵素活性を阻害するのに十分な濃度は、10^-4Ｍ以 下である。 単位用量試薬チューブは、箱の中に入れて密閉し、室温以下、好ましくは2〜8 ℃、または凍らせて保存するが、使用前に室温と平衡にさせる。単位用量チュー ブを開けて、100μｌの前処理したサンプル試料を添加する（全反応体積が約200 μｌの場合）。この態様では、Ｍｇ²⁺イオンがサンプル希釈緩衝液に存在する。 使用に際しては、サンプルを、適量のマグネシウムを含む緩衝液または希釈液に 入れて混合する。サンプル（例えば、100μｌ）を抽出して増幅単位用量に添加 するとき、マグネシウムも添加される。サンプル処理緩衝液中のマグネシウムの 濃度は添加するサンプルの体積および抽出される体積に依存する。あるいは、マ グネシウムを、サンプル緩衝液を受け取らないコントロール反応に添加する場合 、マグネシウム（または単位用量から除いた他の補助因子）は、マグネシウムイ オンの補助溶液から反応溶液に添加することができる。一般に、添加量は、最適 な酵素活性を付与するのに十分であるようにすべきであり、本発明のＬＣＲ反応 では約30mMである。 これらの方法によってテストされる生物学的試料としては、子宮頸管内膜スワ ブ、尿道スワブ、尿、血液、スミア(smears)、皮膚および頭髪抽出物などが挙げ られる。 次いで、チューブを閉じて、Perkin-Elmer 480核酸サイクラーなどの熱サイク ル装置に移し、そこで増幅反応を行う。チューブを作業台から熱サイクラーに移 す（および再び戻す）ための一つの方法およびシステムは、本出願人による米国 出願No.08/141,243（1993年10月22日出願）「チューブ輸送システムおよび使用 方法」（代理人名簿5453.US.01）（現在は放棄）に開示されている。 増幅した後、チューブを、好ましくは自動化された検出装置へ移す。検出の好 ましい方法は、増幅産物の自動検出に対して微粒子捕獲酵素イムノアッセイ（Ｍ ＥＩＡ）を使用することである。ＭＥＩＡは、Fioreら、Clin．Chem．34(9):172 6-1732(1988)およびEP-A-288,793に記載されており、この方法を利用した市販の 臨床分析機は、Abbott Laboratories（AbbottPark，IL）から市販されている I Mx（登録商標）装置である。増幅産物のＭＥＩＡ検出の場合、捕獲ハプテン（ca pturehaptens：ハプテン１）および検出ハプテン（ハプテン２）の 両方が各増幅産物に会合（例えば、共有結合）しなければならい。ハプテンをＬ ＣＲまたはＰＣＲ反応生成物に混入することは、例えば、EP-A-0357011およびEP -A-0439182で公知である。簡単に述べると、その方法は、対の反応性物質と結合 したプライマー（ＰＣＲ反応において）を使用するものである。対の反応性物質 は、固相に結合することができ、および／または標識化されたコンジュゲートに よって検出することができる。対の反応性物質は、ハプテンおよび抗体、ビオチ ンおよびアビジン、酵素および酵素受容体、炭水化物およびレクチン、ならびに 対の相補的ＤＮＡ鎖の群から選択した。 異なる多くのハプテンが知られており、本質的に、どんなハプテンも本発明に 使用することができる。プローブにハプテンを添加する多くの方法が文献で知ら れている。プローブ標識化方法は、Enzo Biochemical（New York）およびClonte ch(Palo Alto)が共に記載し、市販している。例えば、第一アミンは、３’−ア ミン−ＯＮ ＣＰＧ（登録商標）（Clontech，Palo Alto，CA）を使用して３’ オリゴ末端に結合することができる。同様に、第一アミンは、Aminomodifier II （登録商標）(Clontech)を使用して５’オリゴ末端に結合することができる。 アミンは、通常の活性化を使用し、化学作用を組みあわせることにより、種々の ハプテンに反応させることができる。あるいは、標識−ホスホルアミジト試薬を 調製し、それを使用して、合成中にオリゴヌクレオチドのいずれかの位置に標識 を付加する。例えば、Thuong，N.T.ら、Tet．Letters，29(46):5905-5908(1988) ;またはCohen，J.S.らの米国特許出願07/246,688(NTIS ORDER No．PAT-APPL-7-2 46,688)(1989)参照。 ハプテンのいくつかの例としては、多くの薬剤（例えば、ジゴキシン、テオフ ィリン、フェンシクリジン（phencyclidine：ＰＣＰ）、サリチル酸塩(Salicyla te)など）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２，４ −ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；ならびにブロモウラシルなどの修飾ヌクレオ チドおよびＮ−アセチル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の 挿入により修飾した塩基などが挙げられる。本明細書に記載するハプテンは、本 出願人による審査中の特許出願US 07/808,508（アダマンタン酢酸）、US 07/808 ,839（カルバゾールおよびジベンゾフラン）（共に1991年12月17日出願）；US 0 7/858,929（アクリジン）およびUS 07/858,820（共に1992年3月27日出願）（本 明細書では、合わせ て、「ハプテン出願」と言う。）に開示されている。 ＬＣＲ（もしくはＰＣＲまたはその他）の増幅産物を含む閉じた単位用量容器 を、改良IMx（登録商標）分析機の楔形ホルダーに移す。楔形ホルダーおよびIMx 分析機に対する改良を以下に記載する。 装置内では、ロボットアーム上の中空(hollow-bore)のプローブがマイクロプ ロセッサーおよび適するソフトウェアによって反応容器の上の位置に誘導され、 該プローブは、膜28を破壊することにより容器内に下ろされる。蝋またはグリー スがないので、正確な液体レベルを感知することができる。サンプル流体に到達 すると、プローブが予め定めた量の増幅反応混合物を吸引し、吸引した増幅反応 混合物を付随したインキュベーションウェルに自動的に移し、そこで、抗ハプテ ン１抗体で被覆された微粒子を含むＭＥＩＡ捕獲相と共にインキュベートする。 反応生成物の増幅チューブからインキュベーションウェルへの移動は、チューブ を開けることなく、また、反応混合物をこぼす可能性またはエーロゾルの生成も なく行われる。このことはまた、反応していないサンプルが増幅可能な増幅産物 で汚染される可能性をかなり減少させることになる。さらに、プローブ は、反応混合物から蓄積する蝋状物質により塞がれることがない。 プローブは、別の反応容器を貫通する前に洗浄するために、洗浄位置へ移動し 、この工程は、全反応チューブのサンプリングが行われるまで続き、そして、イ ンキュベートされる。この洗浄工程は、あるサンプルから次のサンプルへの汚染 の持ち越しを回避するものである。インキュベーションの後、微粒子懸濁物の一 部をプローブで吸引し、付随した検出セルのガラス繊維マトリックス上に置く。 そこでは、微粒子を溶液の残りから分離し、マトリックス上に保持する。捕獲さ れた粒子を洗浄し、IMx（登録商標）アッセイで通常行われるように、酵素標識 コンジュゲート（抗ハプテン２に結合したアルカリホスファターゼ）を添加し、 インキュベートする。マトリックス上に捕獲された、インキュベートされた捕獲 微粒子／増幅産物／コンジュゲート複合体を洗浄した後、コンジュゲートの酵素 標識に対する基質を添加する。被分析物ＤＮＡの有無を、基質である４−メチル ウンベリフェリルホスファートの蛍光性４−メチルウンベリフェロンへの変換に よる蛍光シグナル発生の速度を測定することにより検出する。基質転換の「速度 」は、カウント／秒 ／秒(c/s/s)で表し、「装置ノイズ」バッククランドは8〜12c/s/sが典型的であ る。 検出完了後、プローブは好ましくは、インキュベーションウェル、検出セルお よび反応チューブの全領域に化学的不活性化試薬を分配する。これは、存在する 全てのＤＮＡを化学的に破壊して、今後のサンプルまたは試薬の不注意な汚染を 排除するものである。適する銅フェナントロリン化学的不活性化組成物は、本出 願人による、審査中の米国特許出願07/863,662「ヌクレオチド配列の不活性化法 およびそこで使用するための金属キレート」（1992年4月3日出願）に記載されて いる。 ４．反応容器ホルダーおよびIMx（登録商標）分析機に対する改良 本発明の別の態様は、反応チューブの容器ホルダー60に関し、それは、寸法安 定性を有する構造物を支持するのに十分な剛性を有する適切なプラスチック材料 で作ることができる。プラスチックの例としては、ＡＢＳまたはスチレン−アク リロニトリル（ＳＡＮ）などのポリカルボネートおよびポリスチレンがある。ホ ルダーは図７に示す。それは、実質的に平面の土台62を有し、それは、一方の端 64が他方の端66より広くなってい る。こうすると、いくつか（20〜40個）のホルダーが円形コンベヤ（図示してい ない）の扇形に合うようにした台形または楔形になる。土台は、容易に握れるよ うにするため、放射状の内側の端に型タブ68を含む。 土台62には３個の構造物が型取られている。これらの構造物のどれも正確な形 状は臨界的でない。唯一必要なことは、それらが、下記に述べる目的に対して十 分な容積を有し、楔形ホルダーを円形コンベヤの定位置に載せるときに妨げにな らない様に形成されていることである。第一の構造物はタブ68に隣接しているウ ェル70であり、図に示した態様では長方形である。ウェル70は底が閉じており、 反応混合物を保持し、インキュベートするように作られている。隣の構造物は、 楔形ホルダーの中央近くの穴72である。好ましくは、下方に伸びる側壁74（この 場合は円筒状）で補強する。穴72は、上記反応容器を受け入れるように作られる 。穴の面積は、反応容器の横断面積に対応し、反応容器がホルダー内で有意に動 き回らない程度に、ほんのわずかに大きくすべきである。 第三の構造物は、検出セルまたは区画76である。検出セルは、市販のIMx（登 録商標）装置の検出セルと本質的に同一である。 それは、最初に入れる反応サンプルを保持するための斜めに曲がった漏斗状の構 造物；漏斗の底部にあり、典型的にはガラス繊維である反応マトリックス80、お よび反応マトリックスの下に置いた吸収部材82（図７の部分的に切断した図によ り、セル76の内部に示す）を含む。IMx（登録商標）装置と同様に、検出セル76 は、捕獲微粒子をガラス繊維マトリックス80に集め、液体試薬および洗浄溶液が マトリックス80を通って吸収部材82に入るのを可能にする。 ホルダー60は、ホルダーを円形コンベヤに取りつけてロックするとともに、下 方に伸びている構造物70、74および76の間のヘリ(webbing)を補強するための手 段も含む。 改良された容器ホルダー60は、穴72が反応チューブを受け入れるように作られ ているので、先行技術のIMx（登録商標）楔形とは異なる。IMx（登録商標）楔形 は、その穴の代わりに、この位置に１個以上の別のサンプルウェルを含んでおり 、別の物理的構造物または成分を受け入れるようには作られていない。 円筒状の反応チューブ10および対応する丸い穴72の場合、反応チューブは、土 台62において回転できることが理解される。典型的には、キャップタブ手段22お よび蝶番30の一方または他 方が最大半径の先端を規定するので、これらの先端によって描かれる弧（図７の 84の点線で示す）が、チューブが穴の中で自由に回転できるような明確な経路を 規定することが保証されることが好ましい。 市販のIMx（登録商標）装置に対して成されるハードウェアの改良としては、 以下のことが挙げられる。ソフトウェアの改良がいくつかの変更に伴うが、当業 者によって容易に最適化されるので、ここには記載しない。そのように改良した 装置は、本明細書ではLCx（商標）装置と言う。 １）自動ピペッター機構を補強して、使い捨て増幅チューブ10上の膜シール28の 貫通を、プローブを損傷することなく可能にした。これらの変更は、ガイドロッ ドを強化し、ガイドロッドおよびトップクロスロッドを加えることであった。 ２）膜シール28の貫通を容易にするために45度の角度の鑿状にした、直径約0.04 0インチのステンレス鋼製の単一先端ピペッティングプローブを、IMxの標準ピペ ットおよび電極と置き換えた。 ３）単一先端プローブの使用は、コンダクタンスモード液体レベル感知装置(con ductance mode liquid level sense apparat us)を放棄しなければならなかった。その代わりに、キャパシタンスレベル感知 機構(capacitance level sense mechanism)を採用した。これは、ピペッティン グプローブが発信機(transmitter)として作用し、受信プレート(receiver plate )が試薬パックおよび円形コンベヤの下に位置することを必要とした。そのよう なキャパシタンスレベル感知装置は公知である。 ４）プローブの洗浄ステーションを、プローブの先端以外も洗浄できるようによ り深いものにした。プローブによって膜シール28を貫通するので、膜の裏側から プローブ先端上のより高いところに汚染が蓄積する可能性があった。 ５）プローブの先端を容器から引き上げているときに、ホルダー60に入っている チューブ10を保持するために、チューブ保持機構を加えた。保持器は、反応チュ ーブ上で、プローブを引き上げようとする位置にブームアームの向きを変えるこ とができる回転可能な軸受台を含む。ブームアームは、プローブが通過するスロ ットまたは開口部、ならびにチューブをホルダー60の正しい位置に保持するため にチューブキャップ20を接触させるデフレクター(deflector)部分を含む。 ６）ＦＰＩＡ希釈緩衝液ボトルを、不活性化希釈剤（5%の過酸 化水素溶液）を含むボトルで置き換え、ソフトウェァを、標準のＭＥＩＡ希釈剤 および不活性化希釈剤の両方が利用できるように変更する。 実施例 実施例１．貫通可能なキャップチューブ： 図２〜４に示すチューブを成形するために射出鋳型を作った。使用した樹脂は 、Himont PD701ナチュラル(Himnont USA，Inc.,Wilmington，DE)であり、添加物 または離型剤は使用しなかった。成形中、膜の部分は、貫通可能な膜の厚さがよ り均一になるように鋳造(coin)し、0.005±0.001インチに調整した。チューブを オートクレーブに入れて滅菌し、可能なヌクレアーゼ汚染を排除した。 実施例２．LCx（商標）装置 IMx（登録商標）装置を、上記４項に記載したように改良した。 実施例３．Chlamydia trachomatis ＬＣＲ単位用量チューブ 実施例１に係る反応チューブは、多重ピペッター(multiplepipettor)またはリ ピーターピペッター(repeater pipettor)を使用して充填し、100μｌのマスター 試薬を各チューブに分 配した。その結果、各単位用量試薬チューブは、2xＬＣＲ緩衝液（100mMのＥＰ ＰＳ、40mMのＫ⁺〔ＫＯＨおよびＫＣｌ由来〕、200μMのＮＡＤ）中に次の成分 を含んだ。 ・Chlamydia trachomatis 潜在(cryptic)プラスミドの6917〜6964の位置に特異 的な４個一組のギャップＬＣＲプローブ。これらのプローブの詳細は、審査中の 米国出願No．08/116,389(1993年9月3日出願)(代理人名簿 5372.US.01)に記載さ れており、各プローブは、1.2×10¹²分子／100μｌで存在する； ・１μgのアセチル化牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、1.0mMのＥＤＴＡ、および0. 04重量％のアジ化ナトリウム； ・3.4μMのｄＴＴＰおよび3.4μMのｄＣＴＰ（ギャップ充填ヌクレオチド）； ・２単位のThermus flavus ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに ・1,800単位のThermus thermophilus ＤＮＡリガーゼ 単位用量チューブには、Ｍｇ²⁺（またはＭｎ²⁺）イオンは存在させかった。チ ューブのキャップは閉じて、使用するまで８℃で保存した。 実施例４．実験手順 100μｌのChlamydia trachomatis標準物質またはその標準 物質の１：２希釈物を、実施例３で作ったいくつかの単位用量チューブの各々に ピペットで入れた。標準物質中のChlamydiaＤＮＡの量は、標準曲線により、100 μｌにつき2.0封入体形成単位に等しいと推定する。ネガティブコントロールは 、150ngのサケの精液ＤＮＡであった。ＭｇＣｌ₂を活性化試薬として、30mM（20 0μｌ中）の最終濃度で添加した。実際のテストサンプルの場合、Ｍｇ²⁺は、試 料移動緩衝液に入れて供給し、サンプルを含む単位用量チューブに添加する。 チューブをPerkin Elmer 480熱サイクラーに置いた。サイクル条件は、97℃で １秒、55℃で１秒および62℃で50秒を全40サイクルであった。 熱サイクル工程完了後、チューブをLCx（商標）装置に移した。各チューブを 円形コンベヤ上に置いたホルダー（楔形）に設置し、円形コンベヤを装置に入れ た。サンプルチューブ保持器を円形コンベヤの上部に束縛して、ピペッティング プローブを引き抜くときにチューブが持ち上がるのを防いだ。試薬パックを装置 に置いた。試薬パックには、下記組成物のボトルが含まれていた。１）抗−カル バゾール被覆微粒子、２）アルカリホスファターゼ標識化抗アダマンタン、３） 基質のメチルウン ベリフェリルホスファート、および４）銅フェナントロリン／トリス緩衝液。 二重サンプルの４回の実験に対する結果を表１に示す（ｎ＝８）。 実施例５．不活性化 不活性化溶液は、0.1Mの銅フェナントロリン／トリス緩衝液であった。不活性 化希釈液は、5%の過酸化水素溶液であった。LCx（商標）装置は、インキュベー ションウェル、反応チューブおよび検出セルの各々に50〜60μｌの不活性化溶液 をピペットで移し、次いで、60〜80μｌの不活性化希釈液が円形コ ンベヤの全楔形ホルダー上の各位置にピペット移されるようにプログラムする。 実施例６．試料の処理および結果 標準的な培養法でChlamydia trachomatisのテストを行った72個の子宮頸管内 膜スワブの集団を、実施例１の反応チューブを使用して、実施例４の方法でもテ ストした。試料は、ＭｇＣｌ₂を十分含む試料緩衝液で希釈して、最終濃度を約3 0mM(200μｌ中)にした。図８は、サンプル数対速度シグナル（カウント／秒／秒 ）の度数分布を示す。培養法のテストにより陽性であった３個のサンプルは、シ グナルが500カウント／秒／秒より高かった。培養法のテストにより陰性であっ た69個のサンプルは、平均シグナルが30カウント／秒／秒未満であった。陰性の 集団＋２標準偏差の平均は、500カウント／秒／秒未満であった。 実施例は、本発明の種々の態様を説明するだけのものであり、保護範囲は添付 の請求の範囲によって規定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 リー，ヘレン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイ ク・フオレスト、モーニングサイド・ドラ イブ・825 (72)発明者 ペペ，カーテイス・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60050、マク ヘンリー、コーネル・コート・3609 (72)発明者 ペルコ，テイモシー・ジエイ アメリカ合衆国、ミズーリ・63130、セン ト・ルイス、ウエストモアランド・ドライ ブ・7017 (72)発明者 ズレツク，トーマス・エフ アメリカ合衆国、イリノイ・60305、リバ ー・フオレスト、アツシユランド・752

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸物質の増幅及び検出方法であって、下記工程： ａ．標的の核酸物質を含むことが疑われるサンプルを、その疑わしい標的核酸を 増幅するために、標識した試薬とともに増幅容器に添加して反応混合物を形成す る工程； ｂ．該容器内の反応混合物を、ピペッタープローブによって貫通可能な膜を有す るぴったり密閉したキャップを閉じることにより密閉する工程； ｃ．該容器内の標的核酸物質を増幅する工程； ｄ．反応混合物の一部を該容器から検出用に取り出す工程；および ｅ．標識した試薬を検出することによって増幅した標的核酸の存在を検出する工 程 を含み、取り出す工程が、該キャップ膜をピペッタープローブで突き刺し、該反 応混合物の一部を該ピペッターに吸引して、該一部を該容器のキャップを取るこ となく別個の検出室に分配することにより行われ、それによって、環境、未反応 サンプルもしくは試薬を汚染する可能性のある増幅された物質の飛沫ま たはエーロゾルを回避する、核酸物質の増幅及び検出方法。 ２．さらに、容器および検出室に残っている全核酸物質を、ピペッターから核酸 不活性化試薬を該容器および検出室に分配することにより不活性化する工程を含 むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．不活性化が銅フェナントロリンキレートおよび過酸化水素溶液の連続添加を 含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．反応容器が、厚さ0.002〜0,015インチの膜を有するキャップのついたチュー ブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．反応容器が、厚さ0,005〜0.009インチの膜を有するキャップのついたチュー ブであることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．ピペッティングプローブが、鑿形の先端を有する細い金属チューブであるこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．該プローブの外径が0.050インチ以下であることを特徴とする請求項６に記 載の方法。 ８．増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むことを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ９．増幅工程がリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むことを特徴とする請求項１に 記 載の方法。 １０．さらに、自動検出するために、密閉した増幅容器を自動ピペッタープロー ブ装置に置く工程を含み、該置く工程が工程ｄの取り出し工程の前であることを 特徴とする請求項１に記載の方法。 １１．取り出し工程および検出工程が共に自動装置によって行われることを特徴 とする請求項１１に記載の方法。 １２．さらに、容器および検出室に残っている全核酸物質を、核酸不活性化試薬 を該容器および検出室に分配することによって不活性化する工程を含み、前記取 り出す工程、検出工程および不活性化工程は全て、自動ピペッター装置によって 行うことを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １３．核酸配列を増幅するためのキットであって、 ａ）本質的に、 −各々、1.6nM以上存在する、所望の標的核酸をＰＣＲによって増幅するための 一組以上のオリゴヌクレオチドプライマー； −1.0μM以上存在する、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の補給； −熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬； −所望により、界面活性剤および不活性担体核酸；ならびに −ポリメラーゼ活性の効果をなくすのに十分低い濃度のＭｇ²⁺イオン から成る、一つの容器におけるＰＣＲ増幅組成物；および ｂ）Ｍｇ²⁺イオンを、サンプルの希釈および希釈サンプルとキット取扱説明書に 従う増幅組成物との混合により、混合物中にポリメラーゼ活性の活性化に十分な 最終濃度のＭｇ²⁺イオンが得られるような濃度で含む、第二の容器におけるサン プル処理溶液 を含むキット。 １４．プライマーの濃度が1.6nM〜160nMであり、ｄＮＴＰｓの濃度が1.0〜200μ Mであることを特徴とする請求項１３に記載のキット。 １５．熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬が、Thermus種微生物由来のポリ メラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１３に記載のキット。 １６．熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬が、Thermus種微生物由来のポリ メラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１４に記載のキット。 １７．前記ＰＣＲ増幅組成物中のＭｇ²⁺イオンの濃度が約10^-4M以下であり、前 記混合物におけるＭｇ²⁺イオンの最終濃度が1〜40mMであることを特徴とする請 求項１３に記載のキット。 １８．核酸配列を増幅するためのキットであって、 ａ）本質的に、 −各々、約1,6nM以上存在する、所望の標的核酸をＬＣＲまたはＧＬＣＲによっ て増幅するための少なくとも二対の相補的オリゴヌクレオチドプローブ； −熱安定性リガーゼ活性を有する試薬； −所望により、1.0μM以上で存在する、全４種類より少ないデオキシヌクレオチ ド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の補給および熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬 ； −所望により、界面活性剤および不活性担体核酸；ならびに −リガーゼ活性の効果をなくすのに十分低い濃度のＭｇ²⁺イオン から成るＬＣＲ増幅組成物；および ｂ）Ｍｇ²⁺イオンを、サンプルの希釈および希釈サンプルとキット取扱説明書に 従う増幅組成物との混合により、混合物中に リガーゼ活性の活性化に十分な最終濃度のＭｇ²⁺イオンが得られるような濃度で 含む、第二の容器におけるサンプル処理溶液を含むキット。 １９．プローブの濃度が1.6nM〜160nMであることを特徴とする請求項１８に記載 のキット。 ２０．熱安定性リガーゼ活性を有する試薬が、Thermus種微生物由来のリガーゼ 酵素であることを特徴とする請求項１８に記載のキット。 ２１．熱安定性リガーゼ活性を有する試薬が、Thermus種微生物由来のリガーゼ 酵素であることを特徴とする請求項１９に記載のキット。 ２２．前記ＬＣＲ増幅組成物中のＭｇ²⁺イオンの濃度が約10^-4M以下であり、前 記混合物におけるＭｇ²⁺イオンの最終濃度が1〜40mMであることを特徴とする請 求項１８に記載のキット。 ２３．ｄＮＴＰｓおよび熱安定性ポリメラーゼ活性を有する試薬が存在し、ＬＣ Ｒ増幅組成物中のＭｇ²⁺イオンの濃度が、該ポリメラーゼ活性の効果をなくすの に十分低いことを特徴とするＧＬＣＲ用の請求項１８に記載のキット。 ２４．Ｍｇ²⁺イオンの濃度が、約10^-4M以下であることを特徴とする請求項２３ に記載のキット。 ２５．核酸増幅アッセイを行うための反応容器装置であって、 −外径が熱サイクル装置に適合する大きさであり、内部に対して開口部を有する 熱安定性ポリマー材料のチューブ； −厚さが0.0015インチ以下の穴をあけることができる膜を含み、その膜によって 、チューブを開けることなく自動ピペッターで閉じたチューブから増幅反応生成 物のサンプルを採取することができる、チューブの開口部をぴったり密閉するた めのキャップ；および−キャップをチューブに対して保持し、キャップを開口部 の中に折り畳むことができる軟質蝶番 を含む、反応容器装置。 ２６．穴をあけることができる膜の厚さが、0.002〜0.015インチであることを特 徴とする請求項２５に記載の反応容器。 ２７．穴をあけることができる膜の厚さが、0.005〜0.009インチであることを特 徴とする請求項２６に記載の反応容器。 ２８．穴をあけることができる膜の厚さが、0.005±0.001インチであることを特 徴とする請求項２６に記載の反応容器。 ２９．核酸増幅アッセイを行うための反応容器装置であって、 −外径が熱サイクル装置に適合する大きさであり、内部に対して開口部を有する 熱安定性ポリマー材料のチューブ； −穴をあけることができる薄い膜を含み、その膜によって、チューブを開けるこ となく自動ピペッターで閉じたチューブから増幅反応生成物のサンプルを採取す ることができる、チューブの開口部をぴったり密閉するためのキャップ；および −キャップをチューブに対して保持し、キャップを開口部の中に折り畳むことが でき、折り畳み蝶番を含む軟質蝶番を含む、反応容器装置。 ３０．穴をあけることができる膜の厚さが、0,002〜0.015インチであることを特 徴とする請求項２９に記載の反応容器。 ３１．穴をあけることができる膜の厚さが、0.005〜0.009インチであることを特 徴とする請求項３０に記載の反応容器。 ３２．穴をあけることができる膜の厚さが、0.005±0.001インチであることを特 徴とする請求項３０に記載の反応容器。 ３３．蝶番が閉じたチューブの最大半径を規定し、チューブの外径から該最大半 径までの距離は約0.154インチ未満であることを特徴とする請求項２９に記載の 反応容器。 ３４．折り畳み蝶番が、さらに、蝶番材料に刻まれた２個の溝 を含み、ｇ／ｈの比が約0.8±20%であり、ｇは二つの溝の中央線間の距離であり 、ｈは、キャップが密閉位置にあるときに測定したチューブへの付着点からキャ ップの上部までの蝶番部品全体の高さであることを特徴とする請求項２９に記載 の反応容器。 ３５．ｇが2〜2.5mmであることを特徴とする請求項３４に記載の反応容器。