JP2010500009A - 標的核酸増幅産物高速検査方法、および完全密封式標的核酸増幅物高速検査装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は完全密封標的核酸増幅物検査装置に関するものであり、核酸薄膜クロマトグラフィー(テスト・ストリップ)技術を完全密封した検査装置に利用した、標的核酸配列増幅物を高速検査する方法及び増幅産物の交錯汚染を防止し偽陽性を防ぐ技術に関するものである。また、本発明は完全密封の高速検査装置に関連するものであり、伝染病病原体の検査、食品工業、農業、牧畜、税関検疫、遺伝子突然変異及びDNA鑑定の分野での応用に関するものである。
【選択図】図1
Description
第一に、標的核酸増幅物を高速検査する方法を提供した。
第二に、核酸増幅物交雑汚染を防止し、偽陽性を防ぐ方法を提供した。
本発明はPCR、恒温増幅またはその他の方法で増幅された産物に核酸検査テスト・ストリップを応用した完全密封高速検査装置を提供した。
具体的には、本発明は完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を提供し、それには内部構造及び外ボックスが含まれ、内部構造には固定ボックス部分及び台座部分が含まれ、固定ボックス部分には対応する孔があり、洗浄液パック及び増幅物を含有するPCR管を入れるのに用い、台座部分には液パック突き刺し針を有する洗浄液収納ユニット、カッターを有する増幅物収納ユニット、密封仕切り、グラスファイバー・ペーパー、並びにテスト・ストリップ及び透明窓を有するテスト・ストリップ密封部分が含まれ、さらに外ボックスにはレバー・カバー、固定ボックス圧迫部分、洗浄液パック圧迫部分及び透明窓が含まれる。
本発明はPCR、恒温増幅またはその他の方法で増幅した産物を完全密封した装置中で核酸高速検査テスト・ストリップを応用して検査を行う。この方法は操作が簡単、高速であるほか、最も重要なのは増幅物が実験室を汚染し偽陽性を引き起こすのを防ぎ、大幅に体外診断試薬の信頼性をアップさせることができる、全く新しい検査方法であるということである。この病原微生物に対する検査には非常に重要な意義があり、かつ国家衛生部門の関連規定にも適合する。
本発明のすぐれた実施方案において、完全密封検査装置にはさらにPCR管に対応する孔と台座5の間に位置するガスケット・リングを含み、それによってPCR管に対応する孔と台座の接触が、吻合、密封されていることを確保し、それによって増幅物が固定ボックス部分に逆流しないことを確保する。
全体の操作プロセスが完全密封の状態で行われるので、物理的隔離方式で増幅物が実験室を汚染するのを防止し、それによって体外診断試薬の正確性を向上させることができる。本発明の完全密封検査装置の具体的操作手順及び検査メカニズムは以下の通り。
とき固定ボックス圧迫部分17の圧迫で、台座のカッター9が増幅物を含有するPCR管11を割り、洗浄液パック圧迫部分18の作用で、台座の洗浄液パック突き刺し針4がプラスチック
の洗浄液パック底部を突き破る。
核酸増幅物反応の最大の特徴は、大きな増幅能力及びきわめて高い感度を有することであるが、重大な問題は増幅産物が非常に実験室の汚染を招きやすいことである。きわめて微量の増幅物汚染でも偽陽性を引き起こす可能性がある。増幅後の産物のコピー量が大きく(一般に1011コピー/μl)、さらに増幅物が小分子の物質であるので、空気中に漂ったり、実験台上及び各種実験用品の表面に散乱したりしやすい。操作にわずかな不注意があれば(避けられないときもある)、偽陽性を引き起こす。一方通常のPCR増幅反応終了後、PCR管の管カバーを開け、増幅産物のすべてまたは一部を吸い出し、アガロース・ゲル電気泳動またはその他の方法で検査を行わなければならない。この開放式検査は実験室環境の汚染を招きやすい。そのためいかに汚染を防ぐか、または密封条件で増幅産物の検査を実現するかが科学研究者たちの研究の重点となっている。現在、蛍光定量PCR以外には完全密封という条件で核酸に対する検査プロセスを完成することができる方法はない。
該装置によって核酸増幅物の検査及び分析をともに密封状態で完成できるようにしたため、通常の増幅後の核酸検査法中の交雑汚染の危険性を最大限度低下した。この方法は操作が簡単で、時間が短く、同時に検査コストも低減し、検査結果をさらに高速にし、信頼できるものにする。本密封式標的核酸増幅物高速検査装置は、臨床検査での使用において、伝染性疾病診断の正確性を大幅に増加し、患者の医者にかかる時間を短縮し、医療保険システム全体のコストをも低減することができる。この装置は操作が簡単、高速であり、コストは低廉であり、さらに核酸増幅物の実験室に対する汚染を防止するので、生命科学分野で作業し標的核酸増幅物検査が必要な科学技術者にとっても大きな助けとなる。
子置き換え等の遺伝子突然変異を含む。本発明の密封式核酸増幅物検査装置は人類遺伝病系列診断製品の開発に用いることができ、この巨大な市場需要を満たすことができる。
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は血縁鑑定、遺伝子身分証、集団遺伝子データベース等の面に用いることができる。
増幅物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる。
(洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる)
固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉じる。
検査装置を圧迫するレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所へ廃棄する。
増幅物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる。
(洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる)
固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉じる。
検査装置を圧迫するレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所へ廃棄する。
被験者の抹消静脈抗凝血(凍結保存)5μlに、杭州優思達生物技術有限公司が生産した微量DNA高速抽出試薬キットを応用して核酸抽出を行い、それによって遺伝子増幅を行う。
ゲノム中偽遺伝子のミトコンドリア遺伝子増幅に対する干渉を排除するため、2回増幅を行う必要があり、1回目の増幅産物をテンプレートとして2回目の増幅を行い、その後2回目の増幅産物を利用してSBEを行う。
SBE反応物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる(洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる)固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉める。
検査装置のレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所に廃棄する。
Claims (13)
- 標的核酸増幅産物の交錯汚染を防止、偽陽性を防ぐ、標的核酸増幅産物を高速検査する方法であって、
a) 増幅反応完了後、標的核酸増幅産物が漏れ出して汚染を引き起こさないよう反応管のキャップを開けないこと、
b) キャップを開けていない反応管を密封式の装置に入れ、標的核酸幅産物を物理的に密封された環境中で反応管から検査試験紙まで移動すること、
c) 肉眼で見ることができる形式で検査を行い、結果を判定すること、
及び
d) 検査後は密封式装置を開けずに全体を安全な場所に廃棄すること、
を特徴とする標的核酸増幅産物高速検査方法。 - その中で述べた密封式装置はいったんロックされれば二度と開くことができず、それによってボックス内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する
請求項1に記載の標的核酸増幅産物高速検査方法。 - 前記措置b)では、反応管と清洗液を物理的に密封された環境中で開け、標的核酸増幅産物を清洗液から動かし検査試験紙まで移動する
請求項1または請求項2に記載の標的核酸増幅産物高速検査方法。 - 内部構造(1)及び外ボックス(15)を含み、
内部構造(1)には固定ボックス部分(2)及び台座部分(5)を含み、そのうち、
固定ボックス(2)部分には対応する孔があり、洗浄液パック(3)及び増幅物(7)を含有するPCR管(11)を入れるのに用い、
台座部分(5)には液パック突き刺し針(4)を有する洗浄液収納ユニット(21)、カッター(9)を有する増幅物収納ユニット(22)、密封仕切り(6)、グラスファイバー・ペーパー(8)、及びテストストリップ(13)・透明窓(12)を有するテスト・ストリップ密封部分(14)を含み、さらに、
外ボックス(15)にはレバーカバー(16)、固定ボックス圧迫部分(17)、洗浄液パック圧迫部分(18)及び透明窓(20)を含む
完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - 内部構造(1)及び外ボックス(15)を含み、
内部構造(1)には固定ボックス部分(2)及び台座部分(5)を含み、そのうち、
固定ボックス部分(2)には対応する孔があり、洗浄液パック(3)及び増幅物(7)を含有するPCR管(11)を入れるのに用い、
台座部分(5)には洗浄液パック(3)に対応した液パック突き刺し針(4)を有する洗浄液収納ユニット(21)、PCR管(11)に対応したカッター(9)を有する増幅物収納ユニット(22)、両ユニット(21)の間にある密封仕切り(6)、両収納ユニット(21)中に入れられテスト・ストリップ(13)底部につながるグラスファイバー・ペーパー(8)、及びテスト・ストリップ(13)及びテスト・ストリップ(13)に対応する透明窓(12)を有するテスト・ストリップ密封部分(14)を含み、さらに、
外ボックス(15)には密封カバー(16)、固定ボックス圧迫部分(17)、洗浄液パック圧迫部分(18)及び透明窓(12)に対応する透明窓(20)を含む
完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - さらにPCR管(11)に対応する孔と台座(5)の間に位置するガスケット・リング(10)を含み、これによりPCR管(11)に対応する孔と台座(5)の接触が吻合し、密封され、増幅物が固定ボックス部分(2)まで逆流しないことを保証する
請求項4または請求項5に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - さらに三層上下交替を採用した密封仕切り(6)を含み、それによって増幅物が逆流せず、単方向流動する洗浄液と混合後、テスト・ストリップ(13)によって吸収されることを保証する
請求項4または請求項5に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - さらに外ボックス(15)が完全密封された環境を構成し、実験プロセスにおいて、いったんロックされれば、二度と開くことができず、それによってボックス内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する
請求項4または請求項5に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - さらにPCR管(11)に対応する孔と台座(5)の間に位置するガスケット・リング(10)を含み、これによりPCR管(11)に対応する孔と台座(5)の接触が吻合し、密封され、増幅物が固定ボックス部分(2)まで逆流しないことを保証し、また、三層上下交替を採用した密封仕切り(6)を含み、それによって増幅物が逆流せず、単方向流動する洗浄液と混合後、テスト・ストリップ(13)によって吸収されることを保障し、さらに外ボックス(15)が完全密封された環境を構成し、実験プロセスにおいて、いったんロックされれば、二度と開くことができず、それによってボックス内の汚染の可能性ある物品が事故によって外漏れするのを防止する
請求項4または請求項5に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。 - 請求項4から請求項9のうちいずれか1項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して、核酸配列増幅物を検査する
標的核酸増幅物高速検査方法。 - 請求項4から請求項9のうちいずれか1項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して、核酸配列増幅物を高速検査し、核酸増幅物交雑汚染を防止し、偽陽性を防ぐ
標的核酸増幅物高速検査方法。 - 請求項4から請求項9のうちいずれか1項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用した請求項1から請求項3のうちいずれか1項に記載の標的核酸増幅物高速検査方法。
- 請求項1−3,9−12のうちいずれか1項に記載の標的核酸増幅物高速検査方法、あるいは請求項10−12のうちいずれか1項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置における、伝染病病原体検査、食品工業、農業、牧畜、税関検疫、遺伝子突然変異検査及びDNA単一ヌクレオチド多型(SNP)鑑定分野における応用。
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