JPS63170396A - 簡易タンパク質除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は簡易タンパク質除去法に関する。さらに詳し
くは菌体または細菌等の細胞破砕液等からｌ）　ＮΔを
分離・抽出ケる際のｍ１易タンパク質除ノ２法に関する
。

（（１）従来の技術 従来菌体または細菌等からｌ）　ＮΔｈを遠心分離ずろ
際に行われる除タンパク処理としては、集菌後通常すゾ
チーノ９、等を用いた酵素処理等により細胞を破砕し、
破砕した細胞の懸濁液等に界面活性剤を用いてＩ）　Ｎ
Δに付着しているタンパク質とミセルを形成しこれを０
工溶化するごとによって除タンパク処理４°る方法、よ
ノニ」、記懸蜀肢にフェノールまたはりＣＩ　ＣＪホル
１１等を加え振とうしてタンパク質を変性した後この混
合液を遠心によって水層とイ１゛機層に分ＩＪＩ）　Ｎ
Δを水層に移行さけて除タンパク処理する方法、またさ
らに高速液体クロマトグラフィ（Ｉｆ　Ｉ）　Ｌ　に　
）で除タンパク処１！ｌ！−１４方法等が知られている
。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 ″１５かしながら、」―記界面活性剤を用いる除タンパ
ク処理では、界面活性剤の種汀１により該処理以降の遠
心分離で沈殿４°ろらのとしない乙のとかありｒ＋ンタ
ミイ、−ン：Ｉ７ブンの恐れかあろごと、　力フェノー
ルまたはり【１０ホルム等を用いろ方法ではこれらの有
機溶媒を予め蒸留して不純物等を除去しておく必要かあ
り、また有機層と水層とに分離づ゛る遠心操作が必要な
ことおよび得られる水層に若干溶解している有機層を除
く処理（例えば透析等）がさらに必要なこと等処理が煩
雑になり非常に時間を変する処理となっていること、ま
たＨ１’　ｌ、　Ｃに、にる除タンパク処理では、Ｌｌ
的とするＤＮＡの長さが１０〜２０ｍｅｒぐらいまでし
か可能てはなく、長鎖（１〜２　ｋｂ、ｐ、）　Ｄ　Ｎ
Ａとタンパク質との分離は不可能であり、さらにこのＨ
Ｐ　Ｌ　Ｃでは大量に除タンパク処理することが困難で
ある等の問題点がある。

この発明はかかる状況に鑑み為されたものであり、こと
に遠心分離を伴う除タンパク処理において簡便でかつ時
間的に短縮して除タンパク処理する方法を提供し、にう
とするものである。

（ニ）問題点を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、タンパク質を夾雑物として
混在するＤＮＡ含有水性溶液にキレート性を有する２価
の重金属イオンを添加した後加熱処理し、該溶液中に生
成ずろ沈殿を除去することによりタンパク質を除去する
ことからなる簡易タンパク質除去法が提供される。

この発明の方法は、ＤＮＡ分離操ｆ１における除タンパ
ク処理としてとくに好適なしのである。従ってこの発明
の方法の対象となるタンパク質を夾雑物として混在する
ＤＮＡ含有水性溶液としては、分離対象物としてのＩ）
　ＮＡを含イｆしかつタンパク質が混在する水性溶液が
好ましく、細胞破砕液がとくに好ましい。通常細胞破砕
液は細菌または菌体等を集菌後リゾデーム等の酵素で細
胞壁を破砕して調製され、細胞質に存在するタンパク質
およびｌ）　ＮＡ等が混在した溶液であり従ってこの発
明の方法に用いる好適な材料となる。しかしこの発明の
方法はＪ：、記溶液に限定されず分離対象物にタンパク
質が夾雑物として混在しているものであればいずれのも
のであってもよい。

この発明の方法において、タンパク質との沈殿生成に用
いるキレート性を有する２価の重金属イオンは、タンパ
ク質とキレート形成しかつ生成するキレートが沈殿しう
るちのが選択され、銅イオン（Ｃｕ″′）または亜鉛イ
オン（Ｚｎ”）が好ましい。

ごれらのイオンは通常単独で用いられるが、これらを混
合して月１いてもよい。上記以外の重金属イオンとして
は（１０”、　Ｍ　ｎ”、　Ｎ　＋”等が挙げられろ。

まノニその他３価のもの例えばＦＣ″′等ら用いること
ができる。」二記挙げた金属イオンはＤＮＡ等のｌｆｒ
＆括と親和性ら（Ｔ４°るらのであり、従ってＤＮＡを
分離対象と４−るタンパク質夾雑溶液に対して、ｌ）　
ＮＡの変性を起こさずまたは可逆的な変性の範囲内で除
タンパク処理しうる点て好ましいものである。

上記金属イオンは、該金属イオンを含む易水溶性の塩の
形態で、タンパク質を夾雑物として混在するＩ）　ＮΔ
含有水性溶液に直接添加されてもよく、またこれらの塩
を溶解して水溶液に具ｌ製されたものを添加してもよい
。

上記金属イオン添加後のタンパク質の混在水性溶液は加
熱処理に付されるが、この場合核酸の液性を比較的高ア
ルカリ側（ｐｌＩ９程度）に調整しておくことにより、
タンパク質の分解が効率よく行われ従って生成するキレ
ートの沈殿が効率良く行なわれる。上記加熱処理条件と
しては、分離されるＤＮＡに生ずる変性が可逆的な範囲
に押さえられる必要から、６５〜１００℃で数分間加熱
することが適しており、例えば１００°Ｃて５分程度の
処理等が挙げられろ。

」−記加熱処理後の溶液は、室温以下に冷却され生成し
た沈殿物が除去されろ。該除去法としては濾過により分
離するのが好ましい。この操作によりタンパク質が除去
された溶液が得られることとなる。

上記濾液からのＤＮＡの分離・精製には、当該分野で公
知の方法が用いられ、例えば超遠心操作よｊよび透析操
作等を伴った塩化セシウムによる密度勾配法およびエタ
ノールによるＤＮＡの沈降化等が挙げられる。

（ホ）作用 この発明によれば、タンパク質を夾雑物とじて混在する
Ｄ　ＮＡ含有水性溶液中で、タンパク質はその（１′４
成成分であるアミノ酸が該溶液に添加されろ２価の重金
属イオンとの間でキレートを生成しかつ加熱によりタン
パク質の分解が促進されるととらに該キレートは沈殿し
タンパク質がＤＮＡから分離される。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（ｌ＼）実施例 実施例１ 水酸化第二銅とアミノ酸からなるタンパク質として１１
　ＳΔ（ウシ血清アルジミン）とを用い、このタンパク
質と銅（１１）イオンとの間にキレートが形成されかつ
沈殿化しうるかどうかを検討した。

水酸化第二銅の調製 ｌｌｌと酸銅２ｇを水１．００−に溶解し１Ｎ−水酸化
すｌ−リウム溶液１６ｍ１２を撹拌しながら加え、生成
した沈殿を濾別し、水でよく洗浄した後、青銅色の水酸
化第二銅の結晶を得ノこ。

キレート化 Ｑ、１％Ｕ３　Ｓ　Ａ溶液をＷ！、Ｉ製しこの溶液につ
いてよＪ’　２００−３００ｎｍの吸光度を測定しく第
１図）、ざらにキサントプロテイン反応（表ＩＮｏ、ｌ
）を行った。

次に上記溶液１０ｍｆ２に１１１１記の水酸化第二銅Ｃ
ｕ　（Ｏｌｌ　）　２を約５ｇ加え撹拌後、５分間１０
０℃で加熱処理をした。その後素層まで放冷した後生成
した沈殿を濾別し濾液についてその１部は２００−３０
０ｎｍの吸光度を測定しく第２図）、別の１部はキサン
トプロティン反応を行っノこ（表Ｉ　Ｎｏ、２）。

」ユ記結果から、まず第１図に示されるごとくこ（１）
　［３ＳΔは２７８ｎｍに吸光度０．６８６（イ）の吸
収極大を有することが示されており、次にこの１３ＳＡ
は銅（１１）イオン（Ｃｕ″″）とキレートを形成しへ
際沈殿を生成し、この沈殿を除去した溶液にフいては第
２図に示されるごと＜　１３　Ｓ八に基づく吸収極大が
消失していることおよびキサントプロテイン反応が陰性
（表Ｉ　Ｎｏ、２）であることから該溶液中にはＬ３Ｓ
Ａが除去されていることが示されている。

実施例２ １）　ＮＡとヒ紀［３ＳΔとの混合溶液に銅（１１）イ
オンを添加してＩ）　ＮＡがＢＳΔから分離されるかど
うかを検討した。

１）　ＮＡの！ｌＩＩ？Ｌ １）　Ｎ　Ａとしては市販のＩｌｅｒｒｉｎｇｓ　ｓｐ
ｏｒｍａ　（崖井化学薬品株式会社製）を用い、これを
水に溶解して０．３５％のＤＮＡ水溶液を調製した。こ
の溶液についてまず２００−３００ｎｍの吸光度を−１
り定しく第３図）、ざらにキサントプロテイン反応（表
Ｉ　Ｎｏ、３）を行な　っ　ノこ　。

除タンパク処理 上記１）　Ｎ　Ａ水溶液１２５７１ｇに０．１％１３　
ＳΔ溶液を混合して全ｆｆ１２．５ｍσとした。まずこ
の溶液について２００−３００ｎｍの吸光度を測定しく
第４図）、さらにキサンｉ・ブ【１ティン反応（表Ｉ　
Ｎｏ、４）を行った後、この溶液に実施例１で調製した
水酸化第２銅の結晶を約６ｇ加え撹拌後、該溶液を５分
間１００℃で加熱処理した。該溶液を室温まて放冷した
後肢溶液ついてま４’　２００−３００ｎｍの吸光度を
測定しく第５図）、さらにキサンドブ【ｌティン反応（
表ＩＮｏ。

５）を行った後攻溶液中に生成しノニ沈殿を濾別し、得
られた濾液についてキサンドブ［ｌティン反応を行なっ
た（表Ｉ　Ｎｏ、６）。

〔表１〕 」−陽性、−陰性 以上の結果から、まず第３図に示されろごとくこのＤ　
ＮＡは２５８ｎｍに吸光度０．１（ロ）の吸収極大を有
４°ることか示されており、次にこのＤ　Ｎ　Ａ　ｉ、
：１３ＳΔを添加した溶液については第４図に示される
ごとり２５８０ｍおよび２７８ｎｍにそれぞれ吸光度１
．１４９（ハ）および１．３２２（ニ）の吸収が観察さ
れ、さらに銅（ＩＩ）イオンを１６加して加熱処理後の
キレート形成をした際の溶液については第５図に示され
るごと＜　２５８ｎｍのみにＤＮＡに基づく吸光１１．
６１１１６（ホ）がｊ車外され［３ＳΔに基づく吸光度
が消失していることおよび表ＩＮｏ、３〜６の各キサン
トプロティン反応の結果より」二足操作により＋３９Δ
とＤＮＡとの、混合溶液からＩ）　ＮΔが除タンパク処
理されていることが分かる。

実施例３ 炭酸亜鉛（塩基性）とアミノ酸からなるタンパク質とし
てｍ製の即製アルブミン（以下［ＥＡ）とを用い、この
タンパク質と亜鉛イオン（Ｚｎ”）との間に安定なキレ
ートが形成されかつ沈殿化しつる条件（／ＢＬ度、バッ
ファ、ｐｏ等）の検討を行っｌ二　。

キレート化 ０．１％Ｅ△溶液を調製しこの溶液についてまず２００
−３００ｎｍの吸光度を測定しく第６図）、さらにキサ
ントプロテイン反応およびニンヒドリン反応を行った（
表２Ｎｏ、１）。次に」−記溶液１０ｍ１２に炭酸！Ｉ
１１．鉛（市販のもの）　Ｚ　ｎ　ＣＯ１を約５１１１
ｇ加え撹拌後、５分間１００℃で加熱処理をした。その
後室温まで放冷した後生成した沈殿を濾別し濾液につい
てその１部は２００−３００ｎｍの吸光度を測定しく第
７図）、別の１部はキサントプロティン反応およびニン
ヒドリン反応を行った（表２Ｎｏ、２）。

上記結果から、まＶ第６図に示されるごとくこの１εＡ
は２７８ｒ＋＋ｎに吸光度０．２０（へ）の吸収極大を
示し、次にこのＩＣΔはＺｎ’°イオンとキレートを形
成１−た際沈殿を生成し、この沈殿を除去した溶液につ
いては第７図に示されるごと＜ＥＡに基づく吸収極大が
消失していること並びにキサントプロティン反応および
ニンヒドリン反応がい「れも陰性（表２　Ｎｏ、２）で
あることから該溶液中がらＩＥＡが除去されていること
が示されている。

実施例４ １）　Ｎ　Ａと上記ＥΔとの混合溶液に亜鉛イオンを添
加してＩ）　ＮΔがＥＡから分離されるかどうかを検討
した。

１）　ＮΔの調製 実施例２で用いたＤＮＡを使用して、１％のＤＮＡ水溶
液を調製した。この溶液についてまず２０Ｏ−３００ｎ
ｍの吸光度を測定しく第８図）、さらにキサントプロテ
ィン反応（表２　Ｎｏ、３）を行った。

除タンパク処理 」二進１）　Ｎ　Ａ水溶液３００７１ｇ　ニｏ、１％Ｉ
Ｅ　Ａ溶液を混合して全ＨｔｌＯＪとした。ま４ミの溶
液について２゜Ｏ−３００ｎｍの吸光度を測定しく第９
図）、さらにキサントブ〔Ｊティン反応およびニンヒド
リン反応を行った（表２Ｎｏ、４）後、炭酸亜鉛の結晶
を約１ｇ加えさらに緩衝液として５ｏｌＡを用いてｐｌ
＋を８．０にＪ、！Ｊ　１ｉｔｕして撹拌後、該溶液を
５分間＋　００　”Ｃで加熱処理した。該溶液を室温ま
で放冷した後膣溶液についてまず２００−３００ｎｍの
吸光度を測定しく第１’Ｏ図）、ざらにキサントプロテ
イン反応（表２Ｎｏ、５）を行っノニ後、該溶液中に生
成した沈殿を濾別し得られた濾液についてキサントプロ
ティン反応およびニンヒドリン反応を行なった（表２Ｎ
ｏ、６）。

ＳｏｌΔ：　Ｎａ＞１ｌＰＯａ　・Ｎａ１ｌｚＰＯｔ　
（ｐＨ−７，０）　ｂｕｆｆｅｒ（以下余白） 〔表２〕 １−陽性、−陰性 以上の結果から、まず第８図に示されるごとくこのＤＮ
Ａは２５８ｎｍに吸光度１．４２（＋−）の吸収極大を
示し、次にこのｌ）　ＮΔにＥＡを添＋１１１　Ｌ、た
溶液については第９図に示されるごと＜　２５８ｎｍお
よび２７８ｎｉｌにそれぞれ吸光度０．５１（チ）およ
び０．ＦＪ（す）の吸収が観察され、さらにｉｎ：鉛イ
オンを添１ｊｌｌ　Ｌで加熱処理後のキレート形成をし
た際の溶液については第１０図に示されるごと＜　２５
８ｎｍのみにｌ）　ＮΔに基づく吸光度０．０１（ヌ）
が観察されＥＡに３＋’ｉづく吸光度が完全に消失して
いること・１１ζびに表２Ｎｏ、３〜６の各キサントプ
ロティン反応の結果および表２Ｎｏ。

４、　Ｎｏ、６の各ニンヒドリン反応の結果、」；す」
−足操作によりＥ　ＡとＩ）　ＮΔとの混合溶液からＤ
ＮＡが除タンパク処理されていることが分かる（ただし
、表２Ｎｏ、６のニンヒドリン反応については「」視」
二のことである）。

実施例５ 炭酸亜鉛（塩基性）と酢酸を混合することによりｐｌ＋
４．６５のＺｎ”イオンを含む酸性溶液を調整し、この
溶液による即製アルブミ、ン（以下ＩＥ　Ａ　）と実施
例２で用いたＩ）　ＮΔ（Ｉｌｅｒｒｉｎｇ　ｓｐｅｒ
ｍ）からなる溶液に対する除タンパク処理を検討した。

０．１％ＥＡにＩ）　ＮΔ溶液２０Ｂ／＋ｎＱを６００
μＱ加え、予め調製した酢酸亜鉛溶液（１ｇ炭酸亜鉛に
２１１ＩＱの酢酸を加えさらに８−の水を加えて１０ｍ
１２としたもの）　ｌｏｎ＋Ｑ加えた後、１００℃の湯
浴て５分間反応させた。生じたコロイド状の沈殿物を濾
別し、濾液０’）２００ｔｔＱにライて２００−３００
ｎｍの吸光度を／ｌｌｌ＋定したところ、第１１図に示
す吸光度曲線を得た。この図から２６０ｎｍに吸光度１
．１０３の吸収極大（ル）が観察されたが、これは該曲
線の２６０ｎｍと２８０ｎｍとの吸光度比（Δｂｓ２ｅ
ｏ／Δ＋）Ｓｔｎｏ）　１．４がＩ）　ＮΔ（ｐＢＲ）
の同吸光度比＝１．５とよく一致してよｊす、さらに膣
液についてキサンドブ【ノティン反応およびニンヒドリ
ン反応によりタンパク質の定性試験を行ったところ、結
果はいずれら陰性であったことから、上記吸収極大はＤ
ＮＡのみに基づく吸光度（ル）と断定された。さらにこ
の場合の該ＤＮＡの回収率は７３％（０，１）、＊ｎ。

より求めた）であり、この方法によりＩ）　Ｎ　Ａ　ｈ
（ＥＡから効率よく分離されていることが分かる。

（ト）発明の効果 この発明によれば、タンパク質を夾雑物として混在する
Ｄ　Ｎ　Ａ含イイ水性溶液中からの除タンパク処理が複
雑な装置を用いて煩雑な操作を経ることなく簡便にかつ
短時間で行えＩ）　Ｎ　Ａの分離・精製が簡便に行える
。またこの方法により分離されるＤＮＡは条件の選択に
より変性を生じないのでそのままハイブリダイゼーショ
ンに使用てき、またさらにプラスミドＤＮＡの抽出にし
有効なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＯＳ△溶液の２００−３００ｎｍ間の吸光度変
化を示すグラフ図、第２図はキレート生成後のＢＳΔ溶
液の第１図相当図、第３図はＩ）　Ｎ　Ａ溶液の第１図
相当図、第４図はＤＮＡとＵＳＡとの混合溶液の第１図
相当図、第５図はＤＮＡとＢＳＡとの混合溶液にキレー
ト化処理した後の該溶液の第１図相当図、第６図はＩ・
〕Ａ溶液の２００−３００ｎｍ間の吸光度変化を示すグ
ラフ図、第７図はキレート生成後のＥΔ溶液の第６図相
当図、第８図は１）ＮＡ溶液の第６図相当図、第９図は
ＤＮＡとＥＡとの混合溶液の第６図相当図、第１Ｏ図お
よび第１１図はそれぞれＤＮＡとＥＡとの混合溶液にキ
レート化処理した後の該溶液の第６図相当図である。 第１図　　　第２図　　第３図 第９図 ＃Ｊ１０ＷＪ ２０（）□　　　　　　　　　　　　　　　　　ｊｌＪ
（Ｊ、ｔＪ（ｎｍ）ｆＩ１１１ｒｊ！Ｊ 手続補正書 昭和６１年１２月２４日 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２５３９８７号 ２、梵明の名称 簡易タンパク質除去法 ３、補正をする呑 事件との関係　　特許出願人 住　所　　京都市中京区河原町通二条下ルーツ船大町３
７８番地名　称　　　（１９９）株式会社　島津製作所
代表者　　西ハ條　寅 ４、代理人〒５３０ 住　所　　大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・
ワンビル補正の内容 ｌ、明細書第１６頁第１０行と第１１行との間に次の文
章を挿入する。 「実施例６ 下記ｉ）により調製した菌体濃￥Ｍ液をリゾチーム処理
した後、下記ｉｉ）により除タンパク処理を行いさらに
イソプロパツールによりＤＮＡを沈殿化させ回収した。 ｉ）菌体濃縮液の調製 ５００−のｚ　−Ｂ　ｒｏｔｈ　（１００μｇ／　ｍＱ
のアンピシリンを含む）（培養液）にプラスミドＤＮＡ
−（ｐＢＲ３２２）を含む大腸菌ＨＢ　１０１を１％殖
菌し、０．Ｄ。 ＃１．７で、１８０μｇ／ｍＱのクロラムフェニコール
を含む上記ｚ　−Ｂ　ｒｏｔｈをさらに５００ｍ（！加
え、３７°Ｃで１晩振とう培養を行った。次に５００Ｏ
ｒｐｍ、、　　５　ｍｉｎ、の遠心分離により菌体を集
菌し、上清をデカンテーションにより除去した後、５０
ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）　４０ｔａＱに溶かし
て菌体濃縮液を調製した。 １ｉ）Ｚｎ’″イオンキレート化による除タンパク処理 まず、炭酸亜鉛（塩基性）１０％（ｗ／ｖ）を含む２０
％酢酸溶液（ｐＨ４，６５）を調製し、３３００ｒｐｍ
、　。 ５　ｍｉｎ、で遠心処理に付してＺｎ”イオン含有溶液
を得た。前記ｉ）で調製した菌体濃縮液４００μｇに、
５ＴＥＴ溶液〔８％スクロース、０．５％　トリトンＸ
−１００，５０ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　１０ｍＭ　　
）リス（ｐＨ８，０））溶液７００μＱを加え転倒混和
後、ｔｏｍｇ／　ｍ１２（１％）リゾチームを含む５０
ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）を５０μＱ加えて再び
転倒混和して試料を調製した。 同様にして上記試料を５つ用意し、それぞれに対してさ
らに上記調製Ｚｎ”イオン含有溶液をそれぞれＯ（Ｎｏ
、１）、　１０（Ｎｏ、２）、　４０（Ｎｏ、３）、８
０（Ｎｏ、４）。 ｔｏｏ（Ｎｏ、５）　（単位μＱ）ずつ加えた後、それ
ぞれに対して以下の処理を行った。すなわち、１００℃
で３分間熱処理した後室温まで冷却し、ミリボア（ＧＶ
、０．２２μＭ）フィルタでろ退役、得られたろ液に対
して３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）を該ろ液の
ｌ／１０体積量に相当する量で加え、得られた溶液に対
して次にイソプロパツールを該溶液と等体積量加えて一
２０℃で１時間放置した後、３５００ｒｐａ＋、、　６
０ｍ１ｎ、で遠心分離し、この上清を除去した後、４０
ｕＱのＴＥｖｌ衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　トリ
ス（ｐＨ８，０））に溶かした。得られた５つの試料溶
液それぞれについてニンヒドリン反応およびキサントプ
ロティン反応を行い、下表３に示す結果を得た。 〔表３〕 （＋陽性１士疑陽性、−陰性） 次に、上記データ番号Ｎｏ、２〜４のそれぞれの溶液を
、上記菌体濃縮液を従来のフェノール法で除タンパク処
理して得られた溶液（イ）と比較した。まず、上記デー
タ番号Ｎｏ、２．　Ｎｏ、３．　Ｎｏ、４およびイの４
つの溶液それぞれについて、２００−３００ｎｍの吸光
度を測定し、第１２〜１５図に示すそれぞれの吸光度曲
線を得た。またこれらの吸光度測定値から２６０ｎＩ＋
＋と２８０ｎｍとの吸光度比（Ａ　ｂｓｔｓａ／　、八
ｂＳ：ｅｅ）を求めたところ、順に１．９６．１．９９
．２．１および２．１を得た。 またさらに上ｇｉｌ！　４つの溶液それぞれについて、
その一部をアガロースゲル電気泳動に付し第１６図に示
す結果を得た。 上記吸光度測定およびゲル電気泳動の結果から、Ｚｎ２
°イオン含有溶液を８０μＱ添加して除タンパク処理し
たもの（Ｎｏ、３）は、従来法（フェノール法）と全く
同じ結果が得られている。またＺｎ”″イオン含有溶液
の添加量が少ないものではタンパクが若干台まれている
が、ゲル電気泳動に回答影響しない程度である。 以上のことから、Ｚｎ”イオンのキレート化を利用した
除タンパク処理は、従来法により得られるＤ　Ｎ　Ａ　
（ｃｒｕｄｅ　ｔｉｐｅ）と同等なものを、従来法に比
べて簡便かつ迅速に得ることができる。 実施例７ 下記ｉ）の大量培養により得た菌体濃縮液をリゾチーム
処理した後、下記ｉｉ）により除タンパク処理を行いさ
らにイソプロパツールによりＤＮＡを沈殿化させ回収し
た。 １）菌体濃縮液の調製 ５００ｍＮのＺ　−Ｂ　ｒｏｔｈ　（１００μｇ／　ｍ
（ｌのアンピシリンを含む）（培養液）にプラスミドＤ
ＮＡ（ｐＢＲ３２２）を含む大腸菌ＨＢ　１０１を１％
殖菌し、Ｏ，Ｄ。 ＃１．７で、１８０μｇ／ｍｆ２のクロラムフェニコー
ルを含む上記χ−Ｂ　ｒｏｔｈをさらに５００ｍ１２加
え、３７℃で１晩振とう培養を行った。次に５０００ｒ
ｐｍ、、　　５　ｍｉｎ、の遠心分離により菌体を集菌
し、上滑をデカンテーションにより除去した後、５０ｍ
Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）　４０ｍＱに溶かして菌
体濃縮液を調製した。 １ｉ）Ｚｎ”イオンキレート化による除タンパク髭棗 まず、２％炭酸亜鉛を含む２０％酢酸溶液（ｐＨ４，６
５）を調製し、３３００ｒｐｍ、　、　　５　ｍｉｎ、
で遠心処理に付してＺｎ”イオン含有溶液を得た。上８
己１）で調製した菌体濃縮液７．５Ｉｎ（ｌに、１０ｍ
ｇ／　ｍＱＲＮ　ａｓｅＡ　（Ｄ　Ｎ　ａｓｅ　ｆｒｅ
ａ）をＬＯｕＱ加え静かに振とうした。次にスクロース
６．６ｍｇ、１０ｍｇ／　ｍ！２（１％）リゾチーム、
　５Ｇ＋ｏＭ　　）リス（ｐＨ８，０）溶液、　０．５
Ｍ　ＥＤＴＡ、２％　トリトンＸを各々１．９ｏ＋Ｑ、
　２．２５ｍｆ２．４６５μＱ加え、１０分間静かに振
とうした。次に上記Ｚｊ＋イオン含有溶液を１．５ｍｆ
２加え、１００℃で３分間熱処理した後室温まで冷却し
、菌体由来白色固体を除去するためにミリポア（ＧＶ、
０．２２μＭ）フィルタでろ過しｒこ。得られたろ液に
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）を該ろ液のＩ／
ｌｏ体積量体積当する量で加え、この得られた溶液に対
して次にイ゛ツブロバノールを該溶液と等体積量加えて
−２０６Ｃで１時間放置した後、３５００ｒｐｆｆ１．
、６０ｍ１ｎ、で遠心分離し、この上清を除去した後、
５００μＱのＴＥ緩新液（１ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、
　１０＋＋＋Ｍ）リス（ｐＨ８，０））に溶かした。 上記のごとく行って得られた試料溶液５００μＱを１％
アガロースゲル電気泳動により分離し、常法によりプラ
スミド部分を回収しｆこ。この回収したＤＮＡの１部（
〜０．８μｇ）を制限酵素、ＢｓｔＮＩ（ＭｖａＩ）お
よびＢａｍＨＩによるダブルダイジエスチョン（ｄｏｕ
ｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行い第１７図に示すご
とく分子量マーカーを作製した。 上図において、レーン１はまだ制限酵素により切断され
ていないｐＢ　Ｒ３２２（ｆｏｒｍ　Ｉ　）、レーン２
はｐＢ　Ｒ３２２をＢｓｔＮＩにより切断したもの、レ
ーン３はＢｓｔＮＩでｐＢ　Ｒ３２２を切断した溶液を
さらにＢａｍＨＩで切断したもの、それぞれのアガロー
スゲル電気泳動を示している。レーン２からは約４つの
フラグメント（塩基対、　ｂ、ｐ、）　、すなわち１８
５７（イ）、　　１０６０（ロ）、　　９２８（ハ）、
　　３８３（ニ）、が確認され、レーン３からは６つの
フラグメント、すなわち１８５７（イ）、　　１０６０
（ロ）、　　６８３（ホ）、　　３８３（ニ）、２４５
（へ）、　１２１（ト）が確認された。このことかろ菌
体からのＤ　Ｎ　Ａプラスミド大量抽出におけるＺｎ”
イオンのキレート化による除タンパク処理は、得られる
精製プラスミド（ｆｏｒｍＴ）を変性せず、制限酵素に
より切断して分子量マーカーを作製できることが示され
ている。 以上のことから、Ｚｎ″″イオンのキレート化を利用し
た除タンパク処理は、従来法により得られるＤ　Ｎ　Ａ
　（ｃｒｕｄｅ　ｔｉｐｅ）と同等なものを、従来法に
比べて簡便かつ迅速に得ることができる。」２、明細書
第１７頁第１４行の記載「相当図」と「である。」との
間に「、第１２〜１４図はＺｎ”イオン含宵溶液のそれ
ぞれ異なる添加量による除タンパク処理液の２００−３
００ｎｍの吸光度変化を示すグラフ図、第１５図は従来
法による除タンパク処理液の２００−３００ｎｍの吸光
度変化を示すグラフ図、第１６図はＺｎ”°イオン含有
溶液による除タンパク処理液および従来法による除タン
パク処理液のゲル電気泳動の結果を示す泳動図、第１７
図はこの発明の方法に基づいて得られるプラスミドのダ
ブルダイジェスチョンの結果を示す泳動図」 ３、別紙の通り、第１２〜１７図を追加する。 第１５図 第１６図 第１７図 手続補正書 昭和６２年１１月６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質を夾雑物として混在するＤＮＡ含有水性
   溶液にキレート性を有する２価の重金属イオンを添加し
   た後加熱処理し、該溶液中に生成する沈殿を除去するこ
   とによりタンパク質を除去することからなる簡易タンパ
   ク質除去法。 ２、キレート性を有する２価の重金属イオンがＣｕ＾２
   ＾＋またはＺｎ＾２＾＋である特許請求の範囲第１項記
   載の簡易タンパク質除去法。 ３、タンパク質を夾雑物として混在するＤＮＡ含有水性
   溶液が細胞破砕液である特許請求の範囲第１項記載の簡
   易タンパク質除去法。