JPH09502879A - 不溶性生合成生成物の回収法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 固相細胞マスから不溶性発酵生成物を回収する方法が開示されており、前記方法は、細胞マスを可溶化するために発酵ブイヨンを処理し、そして不溶性（生成物含有）相から液相を既知の方法により分離することを含んで成る。細胞マスの可溶化は、細胞を溶解するために、アルカリ又は酸化合物による１又は複数回の処理により、又は細胞マスの酵素処理により実施され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 不溶性生合成生成物の回収法 発明の分野 本発明は、細胞マスを含む発酵ブイヨンからの所望の不溶性発酵生成物の回収 のための新規回収法に関し、ここで前記方法は、適切なアルカリ又は酸により発 酵ブイヨンを１度又は数度、処理することによってその発酵ブイヨンの固形細胞 マス相を溶解し、そして続いて、前記固形（生成物含有）相から、得られる液相 を分離することを含んで成る。 発明の背景 ほとんどの発酵生成物は発酵培地に可溶性である。そのような生成物の例は、 酵素、アミノ酸及び有機酸である。これは、典型的な液体−固体分離技法（たと えば、遠心分離機、フィルター又はセットラー）による細胞マスからの発酵生成 物の分離を可能にする。水性発酵ブイヨンに不溶性である発酵生成物は、溶媒中 への抽出によりしばしば精製され、ここで生成物は水性発酵ブイヨンよりも一層 溶解性であり、従って細胞マスから生成物を分離する。例としては、ステロール 及び脂質が挙げられる。 水性発酵ブイヨンに不溶性であり、そしてこのために、抽出目的のための溶媒 の使用が不可能であるか又は実用に適しない生成物が存在する。そのような場合 、対象の固体生成物は、固体細胞マス相及び液相発酵ブイヨンの両者から分離さ れるべきである。そのような分離のための方法は一般的ではない。１つの可能性 は、お互いから固体を濾過するために粒子サイズの差異を利用することである。 もう１つは、分離を導びく、異なった速度での固体の密度及び沈降の差異を利用 することである。本発明は、液相及び固相（生成物を含む）をもたらす細胞マス を実際に溶解することによって、典型的な液体−固体分離技法が細胞マスから固 体生成物を分離するために使用され得ることを示す。 発明の要約 細胞マス含有発酵ブイヨンから所望の不溶性発酵生成物の回収のための方法が 記載されており、ここで前記発酵ブイヨン中の１つの固相は所望の生成物を含み 、そして第２の固相は生物又は細胞マスを含む。回収工程は、所望する生成物部 分の溶解性に悪影響を与えないで、細胞マス部分のみを溶解するよう、両固相を 含む発酵ブイヨンを処理することを包含する。これは、結果的に既知の液体−固 体分離技法により分離され得る固相及び液相をもたらす。 本発明の態様においては、細胞マス相の可溶化は、細胞マスを溶解するような 高温で適切な酸又はアルカリにより発酵ブイヨンを処理することによって影響さ れ、所望する生成物を回収するためにより容易に分離され得る固体−液体相をも たらす。本発明の観点においては、酸又はアルカリによる処理は所望する生成物 の回収を導びく単一の段階であり、又は前記アルカリ／酸処理段階は任意に１回 又は数回くり返えされ得、それによって、固体−液体相をもたらす元の酸／アル カリ処理段階が実施された後、液体が捨てられ、そして残る固相（主に所望する 生成物であるが、しかしまた、細胞マス又は他の残骸も含む）がいづれかの残留 する溶解されていない細胞マスをさらに溶解するために適切な酸又はアルカリの いづれかによりさらに処理され得る。 もう１つの態様においては、発酵ブイヨンの固相における細胞マ スは、細胞マスの酵素処理により溶解され得る。特に、発酵ブイヨンは、細胞を 破壊するために１又は複数の酵素により処理され得る。溶解された細胞は、次に 、当業者に知られている方法により生成物含有相から分離される。そのような酵 素処理に続いて、任意に上記のような追加の酸／アルカリ処理を行なうことがで きる。 本発明の好ましい態様においては、所望する生成物は不溶性生成物、たとえば インジゴ、メラニン、グルカン又はそれらの誘導体である。 図面の簡単な説明 第１図は本発明の回収方法の一般化された略図である。 第２図は例３に記載される回収方法の略図であり、ここで２種のアルカリ処理 が不溶性生成物を回収するために使用されている。 第３図は例４に記載される回収方法の略図であり、ここで１種のアルカリ及び １種の酸処理が不溶性生成物を回収するために使用されている。 第４図は例５に記載される回収方法の略図であり、ここで１種のアルカリ処理 が不溶性生成物を回収するために使用される。 発明の詳細な記載 ほとんどの発酵生成物は発酵ブイヨンに可溶性であり、そして従って、標準の 方法により容易に回収される。発酵生成物が不溶性である情況においては、その 不溶性生成物を回収しようとする場合、特別な問題が直面する。たとえば、不溶 性生成物は溶媒中への抽出により回収され又は精製され、ここで前記生成物は水 性発酵ブイヨンよりもより溶解性であり、従って細胞マスから生成物を分離する 。本発明は、生成物よりもむしろ細胞マスを溶解することによって 、典型的な液体−固体分離技法が細胞マスから所望する固体生成物を分離するた めに使用され得ることを示す。 生合成路は、化学的中間体の生産性を高め、そして細菌性発酵工程において複 合生物学的システムの最終生成物を実質的に変えるよう酵素複合体の活性を高め るように特別に操作され得る。一般的に、生合成路を遺伝的に操作することによ って、合成有機化学反応に対立するものとして細菌発酵を通して特製品及び複合 化学物質の商業的規模の量を生成することが現在可能である。この化学物質の生 合成製造は、化学合成に経済的及び環境的に好ましい二者択一性を付与する。 アメリカ特許第4,520,103号（引用により本明細書に組込まれる）は、インド ールフリー培地において増殖された、遺伝的に形質転換された微生物におけるイ ンジゴの微生物学的生成についての方法を記載する。アメリカ特許第5,173,425 号（引用により本明細書に組込まれる）は、複合成分ナフタレンジオキシゲナー ゼ酵素の発現をコードするDNAにより形質転換されている微生物においてのナフ タレンジオキシゲナーゼ活性の増強についての方法を記載する。それらの細胞は インドールの存在下で培養される場合、インジゴを生成することができる。イン ジゴのような化合物は、出発材料、たとえばデノボ(de novo)合成におけるグル コースから生成され得る。Murdock，et al.，Bio Tech， Vol.11，381〜386ペー ジ。他の化学物質、たとえばキナ酸及びカテコールはまた、グルコースから出発 して生合成的に生成されている。（たとえば、アメリカ特許第 5,168,056号、US SN 07／906,976及び07／389,738号を参照のこと、これらの開示は引用により本 明細書に組込まれる。）他の化合物、たとえばメラニン、インドールの異種ポリ マー及びカルボキシ−インドールは生合成工程により製造され得る。（たとえば 、EP 036 3792 A1及びWO92／00373を参照のこと。） 上記のように、そのような化学物質の生合成製造は、環境的及び費用−有効性 見解から好都合である。しかしながら、発酵ブイヨン培地からのそのような生成 物の回収は、得られる生成物、たとえばインジゴ、メラニン又はグルカンが不溶 性である場合、ユニークな問題を導びく。本発明は、発酵ブイヨンから、精製さ れた不溶性生成物の高収率回収法を提供する。 本明細書で使用される場合、“所望の不溶性発酵生成物”とは、発酵ブイヨン に不溶性である、発酵により製造されるいづれかの生成物を意味する。例として 、インドール様化合物、たとえばインジゴ、グルカン、メラニン及び関連するポ リマー化合物を挙げることができるが、但しこれだけには限定されない。それら の化合物は不溶性発酵生成物のみの例として列挙されており、本発明を限定する ものではない。本明細書に記載される技法は、いづれの不溶性発酵生成物にも適 用され得る。 本明細書に使用される場合、“細胞マス”又は“バイオマス”とは、固体生成 物を生成するために液体培養で増殖され得る、いづれかの細胞又は細胞フラグメ ント、組換え又は天然の細胞を意味する。 発酵生成物の製造のための通常の細胞は、エスシェリシア(Escherichia)、プ スードモナス(Pseudomonas)、クレビシエラ（Klebsiella）、スチゾフィラム(Sc hizophyllum)、クロモバクテリウム(Chromobacterium)、ストレプトミセス(Stre ptomyces)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム（Brev ibacterium）、バシラス(Bacillus)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペリギ ラス(Aspergillus)、トリコダーマ(Trichodama)、カンジダ(Candida)、サッカロ ミセス(Saccharomyces)、ネウロスポラ (Neurospora)、及びアクロモナス(Acromonas)を包含するが、但しこれだけには 限定されない。所望する化合物を製造するために使用されるそれらの細胞は、当 業者に知られている標準の方法により変性された組換え又は天然に存在する生物 であり得る。 本明細書に使用される場合、適切なアルカリとは、十分な量で使用される場合 、細胞マスが溶解される点への発酵ブイヨンのpHの上昇をもたらすいづれかの化 合物を意味する。そのようなアルカリ化合物は、水酸化カリウム、水酸化ナトリ ウム及びアンモニアを包含するが、但しこれだけには限定されない。 本明細書に使用される場合、適切な酸とは、十分な量で使用される場合、細胞 マスが溶解される点への発酵ブイヨンのpHの低下をもたらすいづれかの化合物を 意味する。そのような酸化合物は、硫酸、弗化水素酸、塩化水素酸、臭化水素酸 、ヨウ化水素酸、リン酸、過塩素酸、硝酸、蟻酸及び酢酸を包含するが、但しこ れだけには限定されない。好ましいアルカリ及び酸は、本願明細書の例で使用さ れるものである。 本明細書で使用される場合、“高められた温度”とは、室温以上のいづれかの 温度、好ましくは約40〜100℃、及び最とも好ましくは約90〜95℃の温度を意味 する。より低い温度は本発明の工程で作動するが、しかしアルカリ又は酸処理の 温度を高めることによって、溶解の速度が高められ、それによって全体の回収工 程の効率及び費用−有効性を改良することが見出された。 本明細書で使用される場合、“適切な期間”とは、実質的にすべての細胞マス を溶解するのに十分な期間を意味する。そのような可溶化のために必要な期間は 、添加されるアルカリ又は酸の量、反応が行なわれる温度（より高い温度は短い 期間をもたらす）及び発酵生成物の回収の当業者により容易に理解される他の要 因に依存して 変化するであろうことが理解される。その期間は約１〜12時間であり得る。 不溶性発酵生成物の回収はまた、発酵ブイヨンと細胞マスを溶解するための適 切な酵素とを接触し、従って固体（不溶性）生成物含有相から分離され得る別々 の相を形成することによっても、もたらされ得る。適切な酵素は、リゾチーム、 プロテアーゼ、DNアーゼ、RNアーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ 又はそれらの組合せを包含するが、但しこれだけには限定されない。そのような 酵素をコードする遺伝子は不溶性生成物を製造するために使用される生物中に挿 入され、そのような遺伝子は、発酵が完結された後でのみ（回収工程の間）、適 切な制御調節により誘発される。そのような工程においては、外因性添加は、溶 解のために必要とされる酵素は細胞マスにより生成されるので、細胞マスを溶解 するために必要とされない。 細胞マスが溶解された後すぐに、液体は標準の液体−固体分離操作により不溶 性生成物から分離され得る。それらの操作は濾過、重力沈降及び遠心分離を包含 するが、但しこれだけには限定されない。 濾過は、Fermentation and Biochemical Engineering Handbook(Ed．H．C．Vo gel，Noyes Publications，1983)において、“スクリーン又は織物、砂又は珪藻 土、又はガラスフォーム又は焼結された金属のような多孔性材料であり得るフィ ルター媒体に液体を通すことによって液体から固体を分離する工程。固体は媒体 に保持される”として定義される。新しいフィルター媒体はポリマー及びセラミ ックを包含する。フィルター媒体のタイプ及び使用される装置は、最終生成物の 所望する性質に依存するであろう。液体が生成物である場合、濾液の透明性が主 な関心である。生成物が乾燥される予 定である場合、最大量の液体の除去が所望されるであろう。 重力沈降は、重力沈殿による液体からの固体粒子の分離である。そのような装 置は、乱れを最少にするように企画された入口、固体を放出点に移動するための 手段及び透明にされた液体の除去のための手段により典型的に特徴づけられる。 遠心分離においては、遠心分離力が液体から固体粒子を除去するために重力を 高めるように適用される。相分離を付与するために使用されるいづれかの回転機 械が遠心分離機として分類され得る。本発明においては、上記の通常の液体−固 体分離とは違って、所望する生成物が、細胞マス相である場合、固相に存在する 。従って、１つ又は他の相を溶解することが必要である。本明細書に記載される ように細胞マス相を溶解することによって、所望する生成物（及びその活性）は 悪影響を受けないであろうことが見出された。この分離は一般的に次の通りであ り、そして下記実験に詳細される。第１図に図示されるように、細胞マス及び所 望する生成物を含む発酵ブイヨンは発酵器から除かれ、そして酸又はアルカリと 接触せしめられ、そして加熱されるタンクに配置される。これは、多くの固体− 液体分離方法のいづれかにより固体生成物から分離されるよう、実質的な量の細 胞マスの溶解を引き起こすであろう。細胞マスの実質的な可溶化は、もちろん、 添加される酸又はアルカリの状態及び量／性質に依存する。一般的に、第１回の アルカリ／酸処理に基づいて、細胞マスの少なくとも約20％の可溶化が所望され る。可溶化のレベルは、個々の連続処理により所望する生成物の高められた純度 に影響を及ぼす。この工程は、残留する固相におけるいづれかの残留する細胞マ スをさらに溶解するために１又は数回反復され得る（再可溶化）。水の添加は、 必要な場合、固相をさらに洗浄するために使用され得る。洗浄段階は、所望する 生成物から細胞残骸を 希釈し又は洗い流すために必要である。 所望する生成物が本明細書に記載される工程により回収された後すぐに、その 生成物は任意に、当業者に知られている方法によりさらに精製され得る。 実験 次の例はインジゴの回収に関するけれども、それらの例は本発明の開示を限定 するものではない。本発明の追加の観点及び利点は、次の例及び本発明の好まし い態様の考慮に基づいて明らかになるであろう。 例１：インジゴ生成のための菌株 インジゴを、プソイドモナスプチダ（Pseudomonas putida）からのナフタレン ジオキシゲナーゼについての遺伝子をコードするプラスミドを有する組換えＥ． コリの培養により生成する。使用される菌株は、Sendar et al.，（アメリカ特 許第5,173,425号、この開示を引用により本明細書に組込む）により記載される プラスミドFd-911により形質転換されたFM５である。 例２：組換えＥ．コリによるインジゴの生成 例１からの生物を、最少塩培地においてグルコース供給されたバッチ下で14− Ｌ発酵器において増殖した。温度を35℃で調節し、pHを7.0に及び溶解された酸 素を空気飽和の20％に調節する。Ｌ−トリプトファンを供給し、インジゴを生成 する。Ｌ−トリプトファンをまず、FM５の染色体上にコードされるトリプトファ ナーゼ酵素の作用によりインドールに転換する。次に、そのインドールを、プラ スミド担持の遺伝子によりコードされるナフタレンジオキシゲナーゼ酵素系の作 用によりインジゴに転換する。20ｇ／Ｌまでのインジゴを、そのような工程によ り生成する。 例３：２回のアルカリ処理によるインジゴの回収 例２に記載されるようにして製造された12.0ｇ／Ｌのインジゴ及び147ｇ／Ｌ の合計固体(8.2％のインジゴ純度)を有するインジゴ含有発酵ブイヨンを、第２ 図に示されるようにして回収した。種々の段階の後のインジゴ純度が第１表に要 約されている。初期遠心分離を行ない、細胞マスからインジゴを特異的に分離し たが、しかし分離は観察されなかった。前記材料を水に再懸濁し、14.0ｇ／Ｌの インジゴにし、そしてNaOHを添加し、１％の最終濃度にした。これを15℃で12時 間維持した。遠心分離機を通した後、その得られるスラッジは、158ｇ／Ｌのイ ンジゴ及び68％のインジゴ純度のための232ｇ／Ｌの合計固形分を含み、純度は ８倍に高められた。水及びNaOHを添加し、115ｇ／Ｌのインジゴを付与し、そし て５％NaOH及び前記混合物を90℃に加熱し、そして12時間維持した。遠心分離に 続いて、水により元の体積に再懸濁し、そして第２回目の遠心分離を行なった。 得られるスラッジは、366ｇ／Ｌのインジゴ及び401ｇ／Ｌの合計固形分を有し、 91％のインジゴ純度が得られた。 例４：１回のアルカリ及び１回の酸処理によるインジゴの回収 12.0ｇ／Ｌ のインジゴ及び237ｇ／Ｌの合計固形分(5.1％のインジゴ純度) を有するインジゴ含有発酵ブイヨンを第３図に示されるようにして回収した。種 々の段階後のインジゴ純度は第２表に要約されている。水及びNaOHを発酵ブイヨ ンに直接的に添加し、0. 87％の最終濃度にし、そしてその混合物を80℃に加熱し、そして12時間維持した 。遠心分離からの得られるスラッジは、60.3ｇ／Ｌのインジゴ及び240ｇ／Ｌの 合計固形分を有し、これは25.1％のインジゴ純度に相当する。そのスラッジを水 に再懸濁し、そしてH₃PO₄を添加し、1.3％の最終濃度にした。このスラリーを60 ℃に加熱し、そして12時間維持した。遠心分離の後、スラッジは、97ｇ／Ｌのイ ンジゴ及び122ｇ／Ｌの合計固形分を有し、これは79.5％のインジゴ純度に相当 する。 例５：１回のアルカリ処理によるインジゴの回収 インジゴ含有発酵ブイヨンを、第４図に示されるようにして回収した。種々の 段階の後のインジゴ純度は第３表に要約されている。初期遠心分離からのスラッ ジは、23.5ｇ／Ｌのインジゴ及び182ｇ／Ｌの合計固形分を有し、これは12.9％ のインジゴ純度に相当する。水を添加し、そしてNaOHを添加し0.4％の最終濃度 にした。温度を60℃に上げ、そして12時間維持した。遠心分離の後、その得られ るスラッジは41.2ｇ／Ｌのインジゴ及び53.5ｇ／Ｌの合計固形分を有し、これは 77.0％のインジゴ純度に相当する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年４月１９日 【補正内容】 請求の範囲 １．不溶性発酵生成物を含む第１固相及び細胞マスを含む第２固相を含んで成 る水性発酵ブイヨンから所望する不溶性発酵生成物を回収するために有用な回収 方法であって： ａ）前記水性発酵ブイヨンを、細胞マスの少なくとも約20％を可溶化するのに 十分な時間、室温よりも高い温度で適切なアルカリ又は酸のいづれかにより１度 又は数度処理し、不溶性発酵生成物を含む第１固相を含む水性発酵ブイヨンをも たらし； ｂ）前記水性発酵ブイヨンから不溶性発酵生成物を含む第１固相を分離し；そ して ｃ）前記第１固相から不溶性発酵生成物を回収することを含んで成る方法。 ２．前記アルカリを、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアンモニアから 成る群から選択する請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記酸を、リン酸、硫酸、塩酸、硝酸及び過塩素酸から成る群から選択す る請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記温度が約40〜100℃である請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前記温度が約90〜95℃である請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記水性発酵ブイヨンと、適切なアルカリ又は酸とを約１〜12時間、接触 せしめる請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記段階ａ）に起因する第１固相を、不溶性発酵生成物を回収する前、前 記第１固相における残留する溶解されていない細胞マスを可溶化するために適切 なアルカリ又は酸のいづれかと共に１度又は数度、再懸濁することをさらに含ん で成る請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記所望する不溶性発酵生成物がインジゴ、メラニン又はグルカンである 請求の範囲第１項記載の方法。 ９．前記第２固相が細胞マスの酵素処理により可溶化される請求の範囲第１項 記載の方法。 10．前記酵素をリゾチーム、プロテアーゼ、DNアーゼ、RNアーゼ又はそれらの 組合せから成る群から選択される請求の範囲第９項記載の方法。 11．インジゴを含む第１固相及び細胞マスを含む第２固相を含んで成る水性発 酵ブイヨンからインジゴを回収する方法であって： ａ）前記発酵ブイヨンと、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアンモニア から成る群から選択された適切なアルカリとを、約40〜100℃の温度で、細胞マ スの少なくとも約20％を可溶化するのに十分な時間、接触せしめ； ｂ）前記水性ブイヨンからインジゴを含む第１固相を分離し； ｃ）インジゴを含む前記第１固相を、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び アンモニアから成る群から選択された適切なアルカリ又はリン酸、硫酸、塩酸、 硝酸及び過塩素酸から成る群から選択された適切な酸により、残留する不溶性細 胞マスを可溶化するのに十分な時間、約40〜100℃の温度で任意に再懸濁し； ｄ）前記水性ブイヨンから第１固相を分離し；そして ｅ）前記第１固相からインジゴを回収することを含んで成る方法。 12．前記アルカリが水酸化ナトリウムであり、そして前記酸がリン酸である請 求の範囲第11項記載の方法。 13．前記温度が約90〜95℃である請求の範囲第11項記載の方法。 14．前記個々のアルカリ及び酸段階が約１〜12時間、実施される請求の範囲第 13項記載の方法。 15．そのような回収方法に起因するインジゴ生成物を精製することをさらに含 んで成る請求の範囲第11項記載の方法。 16．前記方法から回収されたインジゴを精製することをさらに含んで成る請求 の範囲第１項記載の方法。 17．前記方法から回収されたインジゴを精製することをさらに含んで成る請求 の範囲第７項記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所望する生成物を含む第１固相及び細胞マスを含む第２固相を含んで成る 水性発酵ブイヨンから所望する不溶性発酵生成物を回収するために有用な回収方 法であって： ａ）前記第２固相を実質的に溶解するために前記水性発酵ブイヨンを処理し、 前記第１固相を含む水性発酵ブイヨンをもたらし；そして ｂ）前記水性発酵ブイヨンから第１固相を分離することを含んで成る方法。 ２．前記第２固相を、前記水性発酵ブイヨンと適切なアルカリ又は酸とを高温 で適切な期間、接触することによって可溶化する請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記アルカリを、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアンモニアから 成る群から選択する請求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記酸を、リン酸、硫酸、塩酸、硝酸及び過塩素酸から成る群から選択す る請求の範囲第２項記載の方法。 ５．前記温度が約40〜100℃である請求の範囲第２項記載の方法。 ６．前記温度が約90〜95℃である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記水性発酵ブイヨンと、適切なアルカリ又は酸とを約１〜12時間、接触 せしめる請求の範囲第２項記載の方法。 ８．ａ）第１固相における残留する溶解されなかった細胞マスを可溶化するた めに前孔第１固相を適切なアルカリ又は酸により高温で適切な時間、１又は複数 回懸濁し；そして ｂ）その得られる固相及び液相を分離することをさらに含んで成る請求の範囲 第１項記載の方法。 ９．前記アルカリを、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアンモニアから 成る群から選択する請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記酸を、リン酸、硫酸、塩酸、硝酸及び過塩素酸から成る群から選択す る請求の範囲第８項記載の方法。 11．前記温度が約40〜100℃である請求の範囲第８項記載の方法。 12．前記温度か約90〜95℃である請求の範囲第11項記載の方法。 13．前記水性発酵ブイヨンと、適切なアルカリ又は酸とを約１〜12時間、接触 せしめる請求の範囲第８項記載の方法。 14．前記所望する不溶性発酵生成物がインジゴ、メラニン又はグルカンである 請求の範囲第１項記載の方法。 15．前記第２固相が細胞マスの酵素処理により可溶化される請求の範囲第１項 記載の方法。 16．前記酵素をリゾチーム、プロテアーゼ、DNアーゼ、RNアーゼ又はそれらの 組合せから成る群から選択される請求の範囲第15項記載の方法。 17．インジゴを含む第１固相及び細胞マスを含む第２固相を含んで成る水性発 酵ブイヨンからインジゴを回収する方法であって： ａ）第２固相を実質的に可溶化するために、前記発酵ブイヨンと適切なアルカ リとを高温で適切な期間、接触せしめ； ｂ）前記水性ブイヨンから第１固相を分離し； ｃ）残留する不溶性細胞マスを可溶化するために、前記第１固相を適切な酸に より高温で適切な期間、再懸濁し；そして ｄ）前記水性ブイヨンから第１固相を分離することを含んで成り、但し、前記 段階ａ）のアルカリ処理及び段階ｃ）の酸処理がいづれの順序でも実施されるこ とを特徴とする方法。 18．前記アルカリが水酸化ナトリウムであり、そして前記酸がリ ン酸である請求の範囲第17項記載の方法。 19．前記アルカリ及び酸段階が約40〜100℃の温度で実施される請求の範囲第1 8項記載の方法。 20．前記温度が約90〜95℃である請求の範囲第19項記載の方法。 21．前記アルカリ及び酸段階が約１〜12時間、実施される請求の範囲第20項記 載の方法。 22．そのような回収方法に起因するインジゴ生成物を精製することをさらに含 んで成る請求の範囲第17項記載の方法。