JPH09501780A - 顕微鏡に用いられるコントラスト装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、薄いプレパラートおよび厚いプレパラートにおける無色の位相対象物を顕微鏡で目に見えるようにするための新規のコントラスト法に関する。本発明は、適当な絞りによって照明光路内の特定の空間的フーリエ成分がフィルタリングされることによって特徴付けられている。照明光路のフーリエ平面にディフューザが挿入されることにより、特定のフーリエ成分が完全に消滅してしまうことが阻止される。これによって、斜光照明の従来の方法の欠点が回避され、簡単な手段によって位相対象物の高価な画像が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 顕微鏡に用いられるコントラスト装置 位相対象物、たとえば細胞におけるコントラスト形成のためには、顕微鏡にお いてノマルスキー系の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）、ホフマン系のモジュレ ーションコントラスト（ＨＭＣ）および斜光照明（Ｓｃｈｉｅｆｅ Ｂｅｌｅｕ ｃｈｔｕｎｇ）（ＳＢ）が使用される。 ＤＩＣは偏光された光線を用いて実施され、規定の厚さを超える対象物では、 もはや鮮明な画像を与えない。ＤＩＣは別の欠点をも持っており、たとえばプラ スチック培養皿内の細胞では使用不可能である。 ＨＭＣもＤＩＣ同様に規定のプレパラート厚さを超えると良好な画像を与えな い。ＳＢは過剰コントラスト化された、対象物とは似ていない画像を与える。こ のような画像では、高い倍率の場合にもはや細部を認識することができない。さ らに、上記３つの方法では全て１つの画豫方向、つまり上下または左右の方向で しかコントラストが得られない。 本発明の課題は、公知先行技術の欠点を取り除くことである。この課題は請求 項１に記載の装置により解決される。本発明の有利な構成は請求項２以下に記載 されている。 顕微鏡光路、つまり顕微鏡を通る光線ビームの光路には、常に少なくとも２つ のフーリエ平面が存在している。これらのフーリエ平面は、画像平面に画像を形 成する空間的なフーリエ成分がこれらのフーリエ平面に空間的に解像されて存在 していて、これらのフーリエ成分に影響を与えることができることにより特徴付 けられている。このことは、たとえば選択的にフーリエ平面内の小さな側方残分 を除いて全てのフーリエ成分が絞られるような斜光照明において行われる。この 既に久しく知られている照明形式には、たいていのフーリエ成分の脱落により画 像が対象物に全く似ていないという欠点がある。請求項１に記載の本発明の決定 的な思想は、画像形成のために片側斜光照明の場合よりも多くのフーリエ成分を 可能にし、ひいては画像を対象物に酷似させることにある。このことは本発明の 有利な構成では、たとえば単純な孔付絞りまたは単純なセクタ絞りが使用される のではなく、１／４リング絞りが使用され、この１／４リング絞りに場合によっ てはディフューザが後置されることにより達成することができる。また、絞りの 透過率自体を空間的に可変に形成することもできる。これにより、たとえば重畳 された多角斜光照明が得られる。厚い対象物を検査する際には、ディフューザは 必ずしも必要とならない。なぜならば、この場合対象物自体がディフューザとし て作用するからである。 請求項２に記載の本発明の構成では、付加的に結像光路のフーリエ平面にモジ ュレータが配置されている。このモジュレータは直接光線のフーリエ成分を弱め 、こうして同じく対象物に似た画像を生ぜしめる。請求項３に記載の本発明の構 成では、画像のほぼ直交する２つの空間方向でコントラストが形成される。モジ ュレータはディフューザ接続の有無にかかわらず使用することができる。 厚い位相対象物の画像のコントラストは、慣用のコントラスト法に比べて著し く改善される。このためには、本発明によるコントラスト装置を照明光路に挿入 すれば十分となる。それに対して別のコントラスト法は結像光路にも影響を与え なければならない。したがって、既存の顕微鏡に問題なく、以下に説明する階調 コントラストを後装備することができる。この階調コントラストは厚い位相対象 物に対しても、薄い位相対象物に対しても使用可能である。コントラストの強さ は調節することができる。慣用の位相コントラスト対物レンズの使用時では、本 発明によればハロの減じられた位相コントラストをも形成することができる。ま た、位相コントラストと階調コントラストとから成る可変の組み合わせを調節す ることもできる。階調コントラストは別のコントラスト法とは異なり、画像平面 のほぼ直交する２つの方向で形成される。この階調コントラストは種々の特殊顕 微鏡、たとえば赤外線顕微 鏡、偏光顕微鏡および蛍光顕微鏡においても使用することができるので有利であ る。 以下に、本発明の有利な実施例を図面につき詳しく説明する。 第１図は、本発明の１実施例による光路の概略図を示しており、 第２図は、本発明による装置に用いられる空間フィルタの有利な実施例を示し ており、 第３図は、本発明の１実施例による対象物近傍における光路の概略図を示して おり、 第４図は、本発明の１実施例を使用する際の、顕微鏡における位相コントラス ト対物レンズの瞳孔画像を示しており、 第５図は、赤外線顕微鏡との組み合わせで使用される、本発明の１実施例の概 略的な構造を示しており、 第６Ａ図は、モジュレータを用いる１実施例を使用する場合の瞳孔画像を示し ており、 第６Ｂ図は、光路内での空間フィルタとモジュレータとの相対的な位置を示し ている。 有利な実施例の説明 厚い対象物を照明するための装置（階調コントラスト） 本発明によればコントラストは位相対象物において空間フィルタによって形成 される。この空間フィルタはフーリエ平面において照明階調を発生させる。この ことは、コンデンサの後側焦点平面が適当なレンズ系によって光源前方のアクセ ス可能な個所に結像されることにより達成される。第１図に示したように、顕微 鏡本体１とハロゲンランプ２との間には、焦点距離ｆ１の２つのレンズＬ１，Ｌ ２が間隔２×ｆ１で設置される。ハロゲンランプ２の照明フィラメント３は無限 遠に結像される。両レンズの間の点ｆ１には、コンデンサ（図示しない）の後側 焦点平面＝フーリエ平面４が結像される。同じくこの平面には、ハロゲンランプ の照明フィラメントが結像される。コントラストは適当な空間フィルタ＝絞り５ によって形成される。この絞り５はこの個所でセンタリング可能に取り付けられ ている。 第２図は、脳切片を観察するために使用されるようなフィルタの構成が示され ている。このフィルタは主として中央絞り６と９０°セクタ絞り７とからの組み 合わせである。対物レンズのアパーチュア内で照明のためにまだ有効となる有効 １／４リング８の幅は、顕微鏡の対物レンズ瞳孔の半径の１／２〜１／１０であ ると有利である。この照明リングが狭くなるにつれて、画像のコントラストは増 大する。最大１８０°までの自由セクタを使用することもできる。９０°セクタ は両直交空間方向における最大コントラストを与える。 第３図に示したように、増大したコントラストは、 対象物、たとえば脳切片がもはや全円錐状の光線９で照明されずに、湾曲させら れて先細りになった剣状の光線１０でのみ照明される。これによって、脳切片に は焦点ので、汎用の全円錐状照明の場合よりもはるかに少ない散乱光しか生じな い。脳切片のはるかに深くまで覗き込むことができる。斜光照明により、位相対 象物の表示が得られ、画像はＤＩＣ撮影に似ている。 斜光照明がなぜ卓越した画像を提供するのか、という決定的な点は、中央絞り とセクタ絞りとの組み合わせの他に、特に厚い脳切片がディフューザとして作用 するという事実である。それ故に、対物レンズの瞳孔平面を観察すると、脳切片 が挿入された状態では鮮明な１／４リングではなく、不鮮明な照明階調が認めら れ、この照明階調は１／４リングの個所でまだ最大値を有している。フーリエ平 面のいかなる個所も完全に暗くはならないので、全てのフーリエ成分が画像形成 のために寄与している。この場合、重畳された多角斜光照明と呼ぶことができる 。過剰コントラスト化は回避され、極めて微細な細部がまだ認識可能となる。絞 りは、もはや対物レンズ瞳孔に結像されない、コンデンサアパーチュアにおける 象限の一部も照明されるように設定されている。コンデンサとしては、対物レン ズよりも高いアパーチュアの液浸コンデンサが使用されるので、暗視野顕微鏡の コントラスト増幅効果および解像度向上効果も発揮される。 階調コントラストのための空間フィルタは直接にコンデンサの後側焦点面また はこの焦点面に対して共役された平面に取り付けることができる。 薄い対象物を照明するための階調コントラスト 前記コントラスト法は薄い対象物に適用する場合には著しい過剰放射線および 著しいコントラストを生ぜしめる。この場合に重要となる変更は、ほぼフーリエ 平面の高さで１／４リング絞りの背後にディフューザ１１を導入することである （第１図）。これによって、ディフューザとして作用する脳切片の作用は、対象 物平面に脳切片を有する必要なしに得られる。対物レンズ瞳孔を観察すると、再 び拡散照明階調が認められる。 この照明階調の分配は種々様々に調節することができる。第１に１／４リング 絞りとディフューザとの間隔を変化させることによって行うことができる。また 、レンズＬ２をディフューザに向かって移動させることによっても、切抜き部を 、ひいては結像された照明階調の勾配を簡便に変化させることができる。さらに 、種々のリング絞りの挟入またはシフトによるか、種々の強度のディフューザの 交換によっても、照明階調を変化させることができる。階調を変化させるための さらに別の手段は、絞りを偏光シートから製造し、この偏光シートの手前に回転 可能なポラライザを設置することである。これによって、調節可能な透過率を有 する絞りが得られ、このことは当然ながら絞り材料として種々の透過率を有する ニュートラルフィルタシートによっても達成することができる。 また、ガラスプレート上に延びる反射層または吸収層を蒸着させることによっ て、ディフューザなしでも階調を形成することができる。この場合、ガラスプレ ートの各点における透過率はリング絞りとディフューザとの上記組み合わせの作 用を模倣しなければならない。さらに、この階調は液晶構成素子（ＬＣ−ＳＬＭ ）によっても実現することができる。このことは次のような利点を持っている。 すなわち、コンピュータにより階調を任意に調節することができる。これによっ て、複数の同心的なリングも実現可能となる。これらのリングは位相シフト成分 と相まって過剰解像度を生ぜしめると望ましい（トラルドアパーチュア ；Ｔｏ ｒａｌｄｏ−Ａｐｅｒｔｕｒｅｎ）。 １／４リングの代わりに、１８０°までのリングを使用することもできる。 階調コントラストを有するハロ現象なしの位相コントラスト 本発明による装置を位相コントラスト対物レンズとの組み合わせで使用するこ とができる。汎用の位相コントラスト対物レンズが使用されると、本発明によれ ば通常のハロなしの位相コントラストをも形成することが可能となる。このため には、ディフューザか、ま たは有利にはレンズＬ２が移動させられて（第１図）、階調１２の著しく明るい 部分が対物レンズで位相リング１３を一緒に取り囲むようにする（第４図）。こ の場合、ハロなしの細胞の位相コントラスト像が得られる。次に、対物レンズＬ ２がディフューザから離れる方向で移動させられると、瞳孔像における階調最大 部は外方に向かって変位し、位相リングはもはや直接に照明されなくなる。顕微 鏡画像は位相コントラスト像からＤＩＣ状の画像に変化する。本発明の特別な利 点は、この移行を連続的に調節することができることである。位相リングを一緒 に照明することは、ディフューザなしでも、厚い対象物の使用時では極めて微細 な構造のコントラストを高める。 階調コントラストを有する赤外線顕微鏡 プレパラートを照明するために可視光線の代わりに近赤外線領域の放射線が使 用されると、赤外線に敏感なビデオカメラを使用して、厚い対象物を一層深くま で覗き込むことができる。その理由は、赤外線が可視光線よりも僅かにしか散乱 されないことである。本発明により形成された階調コントラストは、可視光線の 場合と同様に位相対象物におけるコントラスト形成のために使用することができ るので有利である。特に８００ｎｍを越える波長を有する放射線を使用すること もできる。この波長では、もはや汎用のシートポラライザを用いるＤＩＣを使用 することができない。なぜ ならば、この偏光シートは８００ｎｍよりも上では偏光作用を失うからである。 第５図に示したように、本発明による装置は有利には次の構成部分から成ってい る。すなわち、光源１が設けられていて、この光源１の放射線からは、長波長の 赤外線が、光線および短波長の赤外線に対して透過性の加熱防止フィルタ１４に よってフィルタリング除去される。この光線は前述したように階調コントラスト 装置１５を通過して、顕微鏡１６に入射する。近赤外線領域にある所望の波長範 囲だけがフィルタ１７を透過される。顕微鏡に形成された画像は、赤外線に敏感 なカメラ１８によって捉えられ、モニタ１９に表示される。 落射蛍光顕微鏡における階調コントラストの使用 １／４リング照明は顕微鏡の落射照明においても使用することができる。この 場合にも、１／４リング照明を用いて厚い対象物に対して、慣用の落射照明を用 いるよりも大きな侵入深さが得られる。特に蛍光顕微鏡においては、散乱光を減 少させる目的で本発明を使用することができる。位相対象物を表示する必要はな いので、照明のためには全リングを使用することもできる。その場合、光線は肉 薄な中空コーンとして入射して、焦点面でのみ、有効な蛍光励起のために必要な 強度に達する。これによって、焦点面の外側の蛍光構造は共焦点顕微鏡の場合と 同様に極めて僅かにしか見えなくなる。 偏光顕微鏡における階調コントラストの使用 ＤＩＣとは異なり、階調コントラストは偏光顕微鏡と組み合わせることもでき る。その場合、画像において偏光コントラストと階調コントラストとの組み合わ せが得られる。 結像光路における付加的なモジュレータを有する階調コントラスト ディフューザなしの構成において階調コントラストの不等な照明を改善するた めには、結像光路においても対物レンズ側の瞳孔平面またはこの平面の結像平面 にモジュレータを導入することができる。このことが結像平面で行われると、対 物レンズを変調しなくて済むという利点が得られる。１０〜２０％の透過率を有 するモジュレータ２０（セクタ蒸着されたガラスプレート）は、直接照明の１／ ４リング２１を完全にカバーするように形成されている（第６Ａ図）。第６Ｂ図 には、照明・結像光路のフーリエ平面における空間フィルタおよびモジュレータ の配置形式が示されている。モジュレータは一時的にＤＩＣスライダの代わりに 導入することもできる。１／４リング絞りはコントラストを調節するために偏光 シートから形成することができる（上記参照）。また、モジュレータを用いても 直交方向におけるコントラストが得られる。１／４リング絞りの後方でのディフ ューザの使用の有無に関わらず、モジュレータの制限部を不鮮明に形成すること もできる。これによって、鮮明な縁部のハロ状副効果を回避することができる。 ディフューザの使用および場合によっては不鮮明に制限された位相リングの使用 に基づき、古典的な位相コントラストにおいてもハロ現象を減少させることがで きる。 階調コントラストを有する立体顕微鏡 顕微鏡において２つの独立したビーム経過が提供されると、階調コントラスト を用いて立体画像を形成することが可能となる。このためには、たとえば互いに 反対の側に位置する１／４リング状の２つの切欠きを備えたセクタ絞りにおいて 、これらの切欠きをカラーフィルタまたは直交ポラライザで覆うことができる。 たとえば接眼レンズアイカップにこのようなポラライザまたはカラーフィルタが 挿入されると、立体画像が得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．顕微鏡に用いられるコントラスト装置において、 ─該コントラスト装置が顕微鏡光路のフーリエ平面内または少なくともフーリエ 平面の近傍に配置されており、 ─該コントラスト装置が、照明階調のような斜光照明の特別な形によってコント ラストを形成していることを特徴とする、顕微鏡に用いられるコントラスト装置 。 ２．顕微鏡光路の第１の照明側のフーリエ平面にセクタ絞りを実施するための 装置（２０）が設けられており、さらに顕微鏡光路の第２の結像側のフーリエ平 面に光線強度をモジュレーションするための装置（２１）が設けられていること を特徴とする、顕微鏡に用いられるコントラスト装置。 ３．該コントラスト装置が同時に画像平面の２つの方向でコントラストを形成 する、請求項１または２記載のコントラスト装置。 ４．有利にはセクタ絞りの形の空間フィルタ（５）が設けられている、請求項 １から３までのいずれか１項記載のコントラスト装置。 ５．ディフューザ（１１）が設けられている、請求項１から４までのいずれか １項記載のコントラスト装 置。 ６．コントラストが、有利には光路に沿ったディフューザ（１１）またはレン ズ（Ｌ２）の移動可能性に基づき可変である、請求項１から５までのいずれか１ 項記載のコントラスト装置。 ７．コントラストが、空間フィルタ（５）の可変調節可能な透過率に基づき調 節可能である、請求項１から６までのいずれか１項記載のコントラスト装置。 ８．位相コントラスト対物レンズとの組み合わせで、ハロの減じられた位相コ ントラスト状の画像が形成されるようにコントラスト装置が調節可能である、請 求項１から７までのいずれか１項記載のコントラスト装置。 ９．画像のコントラストが、位相コントラストと階調コントラストとの間で可 変調節可能である、請求項１から８までのいずれか１項記載のコントラスト装置 。 １０．該コントラスト装置が赤外線を用いて作動可能であり、しかも画像撮影 の目的で赤外線に敏感なカメラが設けられている、請求項１から９までのいずれ か１項記載のコントラスト装置。 １１．該コントラスト装置が落射光路のフーリエ平面内または少なくとも該フ ーリエ平面の近傍に配置されており、対象物が全中空コーンまたは部分中空コー ンによって照明されていて、蛍光状態にもたらされる ようになっている、請求項１から１０までのいずれか１項記載のコントラスト装 置。 １２．該コントラスト装置が偏光顕微鏡の顕微鏡光路に配置されている、請求 項１から１１までのいずれか１項記載のコントラスト装置。 １３．セクタ絞りが、互いに向かい合って位置する部分リング状の２つの切欠 きを有しており、部分光路に影響を与える適当な手段、たとえばポラライザによ って立体顕微鏡が作動されるようになっている、請求項１から１２までのいずれ か１項記載のコントラスト装置。