DE19514358A1

DE19514358A1 - Kontrastvorrichtung für Mikroskopie

Info

Publication number: DE19514358A1
Application number: DE19514358A
Authority: DE
Inventors: Hans-Ulrich Dr Dodt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: EP0705451A1; DE19514358C2; WO1995029420A1; JPH09501780A; DE9406545U1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Kontrastvorrichtung für Mikroskopie.

Zur Kontrasterzeugung bei Phasenobjekten wie z. B. Zellen werden in der Mikroskopie der Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) nach Nomarski, der Modulationskontrast nach Hoffmann (HMC) und die Schiefe Beleuchtung (SB) verwandt.

Der DIC arbeitet mit polarisiertem Licht und gibt bei Objekten ab einer bestimmten Dicke keine klaren Bilder mehr. Er hat auch andere Nachteile, beispielsweise ist er bei Zellen in Plastikkulturschalen nicht einsetzbar.

Der HMC gibt, wie der DIC, ab einer gewissen Präparatdicke keine guten Bilder. SB gibt überkontrastierte, objektunähnliche Bilder, auf denen bei hoher Vergrößerung keine Details mehr zu erkennen sind. Weiterhin ergeben alle drei Verfahren Kontrast nur in einer Bildrichtung, also nur oben/unten oder links/rechts.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen. Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im Mikroskopstrahlengang, also dem Gang der Lichtstrahlen durch das Mikroskop, gibt es immer mindestens 2 Fourierebenen. Sie sind dadurch gekennzeichnet, das sich in ihnen die räumlichen Fourierkomponenten aus denen das Bild in der Bildebene entsteht, räumlich aufgelöst befinden und beeinflußt werden können. Dies geschieht z. B. bei der schiefen Beleuchtung, bei der selektiv bis auf einen kleinen seitlichen Rest in der Fourierebene alle Fourierkomponenten ausgeblendet werden. Diese seit langem bekannte Beleuchtungsart hat den Nachteil, daß das Bild durch das Herausfallen der meisten Fourierkomponenten sehr objektunähnlich wird. Die entscheidende Idee der Erfindung nach Anspruch 1 besteht nun darin, mehr Fourierkomponenten als bei der einseitig schiefen Beleuchtung zur Bildentstehung zuzulassen, und damit das Bild objektähnlicher zu machen. Dies kann nach einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung z. B. dadurch erreicht werden, daß man nicht eine einfache Loch- oder Sektorenblende benutzt sondern eine Viertelsringblende und dieser eventuell einen Diffusor nachschaltet. Man kann auch die Transmission der Blende selbst räumlich variabel gestalten, um so etwas wie eine gewichtete mehrseitig schiefe Beleuchtung zu erhalten. Bei Untersuchung dicker Objekte ist der Diffusor nicht unbedingt erforderlich, da dann das Objekt selbst als Diffusor wirkt.

Bei Ausführung der Erfindung nach Anspruch 2 wird zusätzlich in einer Fourierebene des Abbildungsstrahlenganges ein Modulator angeordnet. Er schwächt die Fourierkomponenten des direkten Lichtes ab, und bewirkt so ebenfalls ein objektähnlicheres Bild. In der Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 3 wird in 2 im wesentlichen orthogonalen Raumrichtungen des Bildes Kontrast erzeugt. Der Modulator kann mit und ohne Einschaltung des Diffusors verwendet werden.

Der Kontrast der Bilder dickerer Phasenobjekten wird gegenüber den herkömmlichen Kontrastverfahren wesentlich verbessert. Hierzu reicht es aus, eine Kontrastvorrichtung gemäß der Erfindung im Beleuchtungsstrahlengang einzusetzten, während andere Kontrastverfahren auch den Abbildungsstrahlengang beeinflussen müssen. Existierende Mikroskope können somit problemlos mit dem unten beschriebenen Gradientenkontrast nachgerüstet werden. Der Gradientenkontrast ist sowohl für dicke als auch dünne Phasenobjekte einsetzbar, die Stärke des Kontrastes kann reguliert werden. Bei Gebrauch herkömmlicher Phasenkontrastobjektive kann mit der Erfindung auch Phasenkontrast mit reduziertem Halo erzeugt werden. Es kann auch eine variable Kombination aus Phasen- und Gradientenkontrast eingestellt werden. Der Gradientenkontrast entsteht im Gegensatz zu anderen Kontrastverfahren in zwei im wesentlichen orthogonalen Richtungen der Bildebene. Der Gradientenkontrast kann an vorteilhaft auch an verschiedenen Spezialmikroskopen wie Infrarot-, Polarisations- und Fluoreszensmikroskopen verwendet werden.

Die Erfindung wird klar werden anhand der folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Bezug auf die begleitenden Zeichnungen, in welchen

Fig. 1 eine schematische Ansicht des Strahlenganges einer Ausführungsform der Erfindung:

Fig. 2 eine bevorzugte Ausführungsform eines Raumfilters für eine Vorrichtung gemäß der Erfindung;

Fig. 3 eine schematische Ansicht des Strahlenganges in Objektnähe einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 4 das Pupillenbild eines Phasenkontrastobjektivs im Mikroskop bei Verwendung einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 5A das Pupillenbild bei Verwendung einer Ausführungsform mit Modulator;

Fig. 5B relative Lage von Raumfilter und Modulator im Strahlengang;

Fig. 6 den schematischen Aufbau einer Ausführungsform der Erfindung in Kombination mit einem Infrarotmikroskop zeigt.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Vorrichtung zur Beleuchtung dicker Objekte (Gradientenkontrast)

Der Kontrast wird bei Phasenobjekten mit der vorliegenden Erfindung durch einen Raumfilter erzeugt, der in der Fourierebene einen Beleuchtungsgradienten generiert. Dies wird dadurch erreicht, daß die hintere Fokalebene des Kondensors durch ein geeignetes Linsensystem an zugängliche Stelle vor der Lichtquelle abgebildet wird. Wie Fig. 1 zeigt, werden zwischen den Mikroskopkörper (1) und die Halogenlampe (2) zwei Linsen L1 und L2 der Brennweite f1 mit dem Abstand 2× f1 gesetzt. Hierbei wird die Leuchtwendel (3) der Lampe (2) von Unendlich nach Unendlich abgebildet. Am Punkt f1 zwischen den beiden Linsen ist nun die hintere Fokalebene = Fourierebene (4) des Kondensors (nicht gezeigt) abgebildet. Ebenfalls in diese Ebene wird die Leuchtwendel der Lampe abgebildet. Der Kontrast wird nun durch einen geeigneten Raumfilter = Blende (5) , der an dieser Stelle zentrierbar an gebracht ist, erzeugt.

Fig. 2 zeigt eine Ausführung des Filters, wie er für die Beobachtung von Hirnschnitten verwendet wird. Er ist im wesentlichen eine Kombination aus Zentralblende (6) und 90 Grad Sektorenblende (7). Die Breite des wirksamen Viertelringes (8), der noch zur Beleuchtung in der Apertur des Objektives wirksam ist, beträgt vorteilhaft 1/2-1/10 des Radius der Objektivpupille des Mikroskops. Mit schmäler werdendem Beleuchtungsring steigt der Kontrast des Bildes. Es können auch freie Sektoren bis zu 180 Grad verwendet werden. 90 Grad Sektoren geben maximalen Kontrast in den beiden orthogonalen Raumrichtungen.

Wie Fig. 3 zeigt, wird der gesteigerte Kontrast dadurch erklärt, daß das Objekt wie beispielsweise Hirnschnitte nicht mehr mit einem vollen Lichtkonus (9) beleuchtet wird, sondern nur noch mit einem gekrümmten, spitz zulaufendem Lichtschwert (10). Hierdurch entsteht im Hirnschnitt über und unter dem Fokus viel weniger Streulicht, als bei der üblichen Vollkonusbeleuchtung: Man kann tiefer in den Hirnschnitt hineinsehen. Die schiefe Beleuchtung sorgt dabei für eine Darstellung der Phasenobjekte, das Bild ähnelt DIC Aufnahmen.

Der entscheidende Punkt, warum die schiefe Beleuchtung hier hervorragende Bilder liefert, ist neben der Kombination von Zentral- und Sektorenblende vor allem die Tatsache, daß der dicke Hirnschnitt als Diffusor wirkt. Bei Betrachtung der Pupillenebene des Objektivs sieht man deshalb, bei eingelegtem Hirnschnitt, keinen scharfen Viertelring, sondern einen verschwommenen Beleuchtungsgradienten, der an der Stelle des Viertelrings noch sein Maximum hat. Keine Stelle der Fourierebene ist völlig dunkel, so daß alle Fourierkomponenten zur Bildentstehung beitragen. Man könnte von einer gewichteten rundumschiefen Beleuchtung sprechen. Überkontrastierung wird vermieden und feinste Details sind noch erkennbar. Die Blende ist so bemessen, daß auch noch der Teil des Quadranten in der Kondensorapertur, der nicht mehr in die Objektivpupille abgebildet wird, beleuchtet wird. Da als Kondensor ein Immersionskondensor höherer Apertur als das Objektiv dient, kommen auch noch kontrastverstärkende und auflösungserhöhende Effekte der Dunkelfeldmikroskopie zum Tragen.

Der Raumfilter für den Gradientenkontrast kann auch direkt in der hinteren Fokalebene des Kondensors oder in anderen dazu konjugierten Ebenen angebracht werden.

Gradientenkontrast für die Beleuchtung dünner Objekte

Das beschriebene Kontrastverfahren führt bei Anwendung an dünnen Objekten zu starker Überstrahlung und zu starkem Kontrast. Die entscheidende Modifikation ist hier nun die Einführung eines Diffusors (11) hinter der Viertelsringblende, etwa in Höhe der Fourierebene (Fig. 1). Man erreicht damit die Wirkung des als Diffusor wirkenden Hirnschnitts, ohne einen Hirnschnitt in der Objektebene haben zu müssen. Bei Betrachtung der Objektivpupille sieht man wieder einen diffusen Beleuchtungsgradienten.

Die Verteilung dieses Beleuchtungsgradienten kann nun auf verschiedenste Weise reguliert werden: Einmal durch Variation des Abstandes Viertelsringblende - Diffusor. Auch durch Verschieben der Linse L2 gegen den Diffusor kann der Ausschnitt und damit die Steilheit des abgebildeten Beleuchtungsgradienten bequem geändert werden. Weiterhin läßt sich der Beleuchtungsgradient durch Einklappen oder Verschieben verschiedener Ringblenden oder durch Wechsel verschieden starker Diffusoren verändern. Eine andere Möglichkeit zur Variation des Gradienten ist es, die Blende aus Polarisationsfolie herzustellen, und vor diese einen drehbaren Polarisator zu setzen. Dadurch erhält man eine Blende einstellbarer Transmission, was man natürlich auch durch Neutralfilterfolien verschiedener Transmission als Blendenmaterial erreichen kann.

Schließlich kann man den Gradienten auch ohne Diffusor durch Aufdampfen verlaufender Reflexions- oder Absorptionsschichten auf Glasplättchen erzeugen, wobei die Transmission an jedem Punkt des Glasplättchens die Wirkung der oben beschriebenen Kombination von Ringblende und Diffusor imitieren muß. Letztlich kann dieser Gradient auch durch Flüssigkristallbausteine (LC-SLM) realisiert werden. Dies hat den Vorteil, daß der Gradient beliebig per Rechner eingestellt werden kann. Hiermit wären auch mehrere konzentrische Ringe realisierbar, die in Verbindung mit phasenverschiebenden Komponenten zu Überauflösungen führen sollen (Toraldo-Aperturen).

Statt eines Viertelringes können auch Ringe bis zu 180 Grad verwendet werden.

Phasenkontrast ohne Haloerscheinungen mit dem Gradientenkontrast

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in Kombination mit Phasenkontrastobjektiven verwendet werden. Bei Verwendung der üblichen Phasenkontrastobjektive ist es möglich, mit der Erfindung auch Phasenkontrast ohne die üblichen Halos zu erzeugen. Hierzu wird entweder der Diffusor oder bevorzugt die Linse L2 so verschoben (Fig. 1), daß der deutlich hellere Teil des Gradienten (12) den Phasenring (13) im Objektiv mit einschließt (Fig. 4). Man erhält dann Phasenkontrastbilder der Zelle ohne Halos. Verschiebt man nun L2 vom Diffusor weg, so wandert das Gradientenmaximum im Pupillenbild nach außen und der Phasenring wird nicht mehr direkt beleuchtet. Das mikroskopische Bild wandelt sich vom Phasenkontrastbild in ein DIC-artiges Bild. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, daß dieser Übergang kontinuierlich eingestellt werden kann Mitbeleuchtung des Phasenrings erhöht auch ohne Diffusor, bei Verwendung von dicken Objekten, den Kontrast sehr feiner Strukturen.

Infrarotmikroskopie mit dem Gradientenkontrast

Wird Strahlung des nahen Infrarotbereichs statt sichtbarem Licht zur Beleuchtung des Präparats verwendet, so kann man bei Verwendung einer infrarotempfindlichen Videokamera tiefer in dicke Objekte hineinsehen. Der Grund ist, daß Infrarotstrahlung weniger gestreut wird als sichtbares Licht. Der durch die Erfindung erzeugte Gradientenkontrast kann vorteilhaft wie bei sichtbarem Licht zur Kontrasterzeugung bei Phasenobjekten eingesetzt werden. Es kann insbesondere auch Strahlung mit einer Wellenlänge über 800 nm verwendet werden. Bei diesen Wellenlängen kann der DIC mit den üblichen Folienpolarisatoren nicht mehr benutzt werden, da die Polarisationsfolien oberhalb von 800 nm ihre polarisierende Wirkung verlieren. Wie Fig. 5 zeigt, besteht die Erfindung vorteilhaft aus folgenden Komponenten. Der Lichtquelle 1, aus deren Strahlung das längerwellige Infrarot mit einem, für Licht und kurzwelliges infrarotdurchlässigen, Hitzeschutzfilter (14) herausgefiltert wird. Das Licht durchläuft, wie beschrieben die Gradientenkontrastvorrichtung (15) und tritt ins Mikroskop (16) ein. Nur der gewünschte Wellenlängenbereich im nahen Infrarot wird durch den Filter (17) durchgelassen. Das im Mikroskop entstehende Bild wird von einer infrarotempfindlichen Kamera (18) aufgefangen und auf einem Monitor (19) dargestellt.

Verwendung des Gradientenkontrastes in der Auflicht- und Fluoreszensmikroskopie

Die Viertelringbeleuchtung kann auch in der Auflichtbeleuchtung von Mikroskopen verwendet werden. Auch hier erreicht man mit ihr eine größere Eindringtiefe in dicke Objekte als mit herkömmlicher Auflichtbeleuchtung. Insbesondere in der Fluoreszensmikroskopie kann die Erfindung zur Reduktion von Streulicht verwendet werden. Da keine Phasenobjekte dargestellt werden müssen, kann auch ein Vollring zur Beleuchtung verwendet werden. Das Licht fällt dann als dünnwandiger Hohlkegel ein und erreicht nur in der Fokusebene, die für effektive Fluoreszenzanregung notwendigen Intensitäten. Hiermit werden fluoreszierende Strukturen außerhalb der Fokusebene ähnlich wie bei der konfokalen Mikroskopie wesentlich weniger sichtbar.

Verwendung des Gradientenkontrastes in der Polarisationsmikroskopie

Im Gegensatz zum DIC kann der Gradientenkontrast auch mit Polarisations mikroskopie kombiniert werden. Man erhält dann eine Kombination von Polarisations- und Gradientenkontrast im Bild.

Gradientenkontrast mit zusätzlichem Modulator im Abbildungsstrahlengang

Um die ungleiche Ausleuchtung des Gradientenkontrastes bei seiner Ausführung ohne Diffusor zu verbessern, kann man auch im Abbildungsstrahlengang in der objektivseitigen Pupillenebene, oder in einer einer Abbildung dieser Ebene, einen Modulator einfügen. Wenn man dies in einer Abbildungsebene tut, hat es den Vorteil, daß das Objektiv nicht modifiziert werden muß. Der Modulator (20) (ein sektorenbedampftes Glasplättchen) mit einer Transmission um 10-20% ist so gestaltet, daß er den Viertelring (21) der direkten Beleuchtung vollständig überdeckt (Fig. 6A). Fig. 6B zeigt die Anordnung von Raumfilter und Modulator in den Fourierebenen von Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang. Der Modulator kann behelfsmäßig auch an der Stelle der DIC-Schieber eingebracht werden. Die Viertelsringblende kann zur Einstellung des Kontrastes aus Polarisationsfolie ausgeführt werden (s. o.). Man erhält auch mit dem Modulator Kontrast in orthogonale Richtungen. Mit und ohne Verwendung eines Diffusors nach der Viertelsringblende kann auch die Begrenzung des Modulators verschwommen ausgeführt werden. Damit können haloartige Nebeneffekte der scharfen Kanten vermieden werden. Durch Verwendung eines Diffusors und eventuell unscharf begrenzter Phasenringe können auch beim klassischen Phasenkontrast Haloerscheinungen verringert werden.

Stereomikroskopie mit dem Gradientenkontrast

Es ist möglich mit dem Gradientenkontrast stereoskopische Bilder zu erzeugen, wenn man zwei unabhängige Strahlenverläufe im Mikroskop schafft. Hierzu kann man z. B. bei einer Sektorenblende mit 2 einander gegenüberliegenden viertelringförmigen Aussparungen diese Aussparungen mit Farbfiltern oder orthogonalen Polarisatoren belegen. Wenn man nun z. B. in die Okularmuschel auch solche Polarisatoren oder Farbfilter legt, erhält man stereoskopische Bilder.

Claims

1. Kontrastvorrichtung für Mikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß

- sie in oder mindestens nahe einer Fourierebene des Mikroskopstrahlengangs angeordnet ist;
- sie den Kontrast durch eine besondere Form der schiefen Beleuchtung, z. B. einen Beleuchtungsgradienten, erzeugt.

2. Kontrastvorrichtung für Mikroskopie, gekennzeichnet durch

- eine Einrichtung zur Sektorenausblendung (20) in einer ersten beleuchtungsseitigen Fourierebene des Mikroskopstrahlenganges, und
- eine Einrichtung zur Modulation (21) der Lichtintensität in einer zweiten abbildungsseitigen Fourierebene des Mikroskopstrahlenganges.

3. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Kontrast gleichzeitig in 2 Richtungen der Bildebene erzeugt.

4. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen, gekennzeichnet durch einen Raumfilter (5) vorzugsweise in Form einer Sektorenblende.

5. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen gekennzeichnet durch einen Diffusor (11).

6. Vorrichtung nach vorangegangenen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast variabel ist, vorzugsweise durch Verschiebbarkeit des Diffusors (11) oder der Linse L2 entlang des Strahlenganges.

7. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast durch variabel einstellbare Transmission des Raumfilters (5) regulierbar ist.

8. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie so einstellbar ist, daß sie in Kombination mit Phasenkontrastobjektiven phasenkontrastartige Bilder mit reduziertem Halo erzeugt.

9. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast des Bildes zwischen Phasenkontrast und Gradientenkontrast variabel einstellbar ist.

10. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Infrarotlicht betreibbar ist, wobei zur Bildaufnahme eine infrarotempfindliche Kamera vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in oder mindestens nahe der Fourierebene des Auflichtstrahlenganges angeordnet ist, wobei das Objekt durch einen Voll- oder Teilhohlkegel beleuchtet ist und dadurch zum Fluoreszieren gebracht werden kann.

12. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Mikroskopstrahlengang eines Polaristionsmikroskops angeordnet ist.

13. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sektorenblende zwei gegenüberliegende teilringförmige Aussparungen enthält, und durch geeignete Beeinflussung der Teilstrahlengänge z. B. durch Polarisatoren Stereomikroskopie betrieben werden kann.