DE19511937C2 - Konfokales Auflichtmikroskop - Google Patents
Konfokales AuflichtmikroskopInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Reduzierung von Falschlicht in
konfokalen Direktsicht-Mikroskopen. Derartige Mikroskope gestatten
die Realtime-Untersuchung einer sehr dünnen Objektschicht bei
gegenüber herkömmlichen Mikroskopen verbessertem Kontrast und eine
drastische Verminderung von störenden Einflüssen außerhalb der
Schärfeebene gelegener Objektschichten (optisches Schneiden).
Bei derartigen Mikroskopen werden auf unterschiedliche Weise
Lichtpunkte in bestimmten Mustern in die Objektebene abgebildet und
Objekt und Lichtpunkte gemeinsam auf eine Lochmaske, in der sich
Löcher mit dem gleichen Muster befinden, wie das in die
Objektebene, projiziert. Die Wirkung dieser Anordnung ist seit
langem in der Mikroskopie als Schwarzschild-Villinger-Effekt
bekannt.
Um nicht nur einzelne Objektpunkte sichtbar werden zu lassen,
werden Muster und Objekt relativ zueinander bewegt und die
Anordnung so gestaltet, daß das zu betrachtende Bild relativ zum
Empfänger (Auge, Kamera) ruht.
Eine technisch sehr vorteilhaft zu realisierende Möglichkeit, das
Beleuchtungs- und Beobachtungsmuster exakt ineinander abzubilden,
ist die Nutzung der selben Lochmaske für die Beobachtung und
Beleuchtung (DE 23 60 197 A1, US 4,884,880, WO 88/07695 A1, US
4,806,004 ). Dabei wird jedes Loch des Musters über das Objekt in
sich selbst abgebildet, wenn das Objekt fokussiert ist.
Alle diese Anordnungen weisen die Schwierigkeit auf, daß das an der
vollen Fläche der Maske reflektierte, beleuchtende Licht selbst bei
extrem niedrigen Reflexionsgraden des Lochmaskenmaterials nahezu
die selbe Helligkeit aufweist, wie das vom Objekt
zurückreflektierte Nutzlicht. Diese Schwierigkeit macht den
gewünschten Effekt zunichte. Daher werden verschiedene
Möglichkeiten zur Bekämpfung des Falschlichtes angegeben und
genutzt.
In der DE 23 60 197 A1 und dem WO 88/07695 A1 werden dunkle Schichten,
die sowohl gerichtet als auch diffus reflektieren können
beschrieben. Die für die wirkungsvolle Unterdrückung des
Falschlichtes benötigen Reflexionsgrade von 0,01% und kleiner
lassen sich praktisch nicht erreichen.
Daher werden einzeln oder kombiniert weitere Mittel zur
Falschlichtunterdrückung verwendet.
Ein häufig genutztes Verfahren ist das in den 20iger Jahren von
August Köhler beschriebene Antiflexverfahren. Es arbeitet mit
polarisationsoptischen Mitteln. Polarisator und Analysator sind bei
diesem Verfahren gekreuzt. Wird beleuchtendes Licht an einer Stelle
des Beleuchtungsstrahlenganges reflektiert, so kann es den
Analysator nicht passieren. Kurz vor dem Objektiv ist eine λ/4-
Platte in dem Strahlengang angeordnet, die sowohl auf dem Hin- als
auch auf dem Rückweg durchlaufen wird.
Dabei wird die Polarisationsebene um 90° gedreht und das vom Objekt
zurückkehrende Licht kann den Polarisator passieren. Dieses
Verfahren wird auch in der DE 23 60 197 A1 und im WO 88/07695 A1
beschrieben. Es hat jedoch den Nachteil, daß es die möglichen
Untersuchungsmöglichkeiten bei doppelbrechenden Objekten
einschränkt und einen geringeren Wirkungsgrad aufweist, als andere
mögliche Methoden, wenn mit Polarisatoren gearbeitet werden soll,
die mit ökonomisch vertretbarem Aufwand gefertigt werden können.
Außerdem erfordert es polarisationsoptisch einwandfreie
Bauelemente im Strahlengang zwischen Polarisator und Analysator.
Bei einer anderen Methode (DE 23 60 197 A1, US 50 67 805) stellt man die Lochmaske
so geneigt in den Strahlengang, daß die Reflexe in einen Raum
außerhalb des genutzten Strahlenraumes zu liegen kommen. Dabei wird
das Muster ebenfalls in eine zur optischen Achse geneigte Ebene
abgebildet. Diese Schieflage ändert sich mit der
Objektivvergrößerung, außerdem variiert der Abbildungsmaßstab über
das Sehfeld. Beides ist vor allem für den Einsatz in
technologischen Bereichen nachteilig.
Eine andere Anordnung (gleichfalls in WO 88/07695 A1) beschreibt eine
zentral im Strahlengang gelegene Blende, die am Ort einer engen
Einschnürung liegt (Pupillenbild). Derartige Blenden verändern den
Bildcharakter vor allem bei mittleren Objektstrukturen nachteilig
(Absinken des Kontrastes mittlerer Ortsfrequenzen).
In der DE 38 26 317 C1 werden elektronische Mittel genannt, die das
Falschlicht unwirksam zu machen (Schwellwertschalter, Bildung eines
optischen Differenzbildes). Diese Methoden gestatten nur auf einem
Monitor die kontrastreiche Darstellung der zu untersuchenden
Objekte.
Die Erfindung geht von der Aufgabe aus, bei einem konfokalen
Auflichtmikroskop mit Nipkowscheibe störende Lichtreflexe im
Beleuchtungsstrahlengang sowie in Richtung
der Abbildung zu vermeiden.
Dieses wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1
erreicht. Die Lochmaske erscheint dabei im Bereich der Keile oder Prismen durch
Brechung um den Winkel -δ gekippt.
Damit die Reflexe von den Außenflächen der Keile oder Prismen in
einem außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich
reflektiert werden, kann auch die Beziehung α - δ < σ gelten, wobei σ der
Öffnungswinkel der die Lochmaske auf der Bildseite abbildenden
Optik ist.
Diese Anordnung erlaubt uneingeschränkt die Anwendung aller in der
Auflichtmikroskopie üblichen Untersuchungsmethoden in Verbindung
mit konfokaler Abbildung ohne Falschlicht von der Lochmaske.
Bei üblichen Gläsern (n 1,5) und einem Keilwinkel α = δ n/n-1 wird
ein achsenparallel einfallender Lichtstrahl an den der Lochmaske
zugewendeten Flächen und an den Lochmaskenaußenflächen unter einem
Winkel ρ größer 2σ reflektiert, so daß Reflexe von diesen Flächen
in einem Raum außerhalb des Öffnungsbereiches der Optik zu liegen
kommen. Das gleiche geschieht mit dem Reflex von den außen
liegenden Flächen der Keile oder Prismen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen
Darstellungen näher erläutert.
Es zeigt
Fig. 1 Die Gesamtanordnung eines erfindungsgemäßen konfokalen
Direktsichtmikroskopes
Fig. 2 Eine erfindungsgemäße Anordnung sowie den Strahlenverlauf
der reflektierten Strahlen
In Fig. 1 ist eine Beleuchtungsoptik 6 vorgesehen, die eine
Lichtquelle 7, eine Leuchtfeldblende 8 und eine Aperturblende 9
beinhaltet und über einen Strahlenteiler in Richtung einer im
Strahlengang geneigt angeordneten Lochmaske 1 nach Art einer
Nipkowscheibe so geführt wird, daß auf der Oberseite der
Lochmaske 1 ein Bild der Leuchtfeldblende 8 entsteht.
Lochmaske und Leuchtfeldblende werden durch eine Tubuslinse 12 und
ein Objektiv 13 in die Ebene eines betrachteten Objektes 14
abgebildet, das wiederum auf die Lochmaske zurück abgebildet wird
(konvokale Abbildung).
Die Lochmaske wird durch einen Motor 11 in eine Drehbewegung
versetzt, so daß das auf ihr befindliche Lochmuster sich über die
Objektebene bewegt.
Die zurückkehrenden Strahlen treten wiederum durch die Löcher der
Lochmaske hindurch und passieren den Strahlteiler 10.
Die Ebene der Lochmaske wird mit dem Bild des Objektes 14 über eine
Linse 15 sowie ein Bauernfeindprisma in ein Okular 17 abgebildet.
Die Elemente zwischen der Lochmaske 1 und dem Okular 17 sind
zweckmäßigerweise dabei in ihrem Durchmesser so bemessen, daß das
vom Objekt 14 zurückkehrende Licht ohne Beschnitt den Lichtweg
passieren kann, jedoch die an erfindungsgemäß vor und hinter der
Lochmaske angeordneten Prismen oder Keilen 2 und 3 sowie der
geneigten Lochmaske 1 selbst und an den Außenflächen des
vorzugsweise rhombisch ausgeführten Strahlteilers 10 reflektierten
Strahlen in einen Bereich außerhalb der Sehfeldblende des Okulars
17 gelangen.
In Fig. 2 ist die Lochmaske 1 gemäß Fig. 1 um einen Winkel δ
geneigt gegen eine zur optischen Achse senkrechte Ebene in den
Strahlengang zwischen entgegengesetzt gerichteten Glaskeilen 2 und
3 mit einem (hier stark überhöht dargestellten) Keilwinkel
α = δ n/n-1 angeordnet, wobei die der Lochmaske zugekehrten Seiten
der Glaskeile im wesentlichen parallel zur Lochmaske orientiert
sind. Die Lochmaske erscheint im Bereich der Keile oder Prismen
durch Brechung um den Winkel -δ gekippt.
Der Glaskeil 3 kann hierbei auch eine von der Parallelen
abweichende Orientierung bezüglich der Lochmaske 1 und seiner
dieser zugewandten Seite aufweisen.
Damit die Reflexe von den Außenflächen der Keile oder Prismen in
einem außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich
reflektiert werden, kann auch die Beziehung α-δ<σ gelten, wobei σ der
Öffnungswinkel der die Lochmaske auf der Bildseite abbildenden
Optik ist.
Die dargestellte Gesamtdicke dg des Glaskeiles verhält sich zur
"reduzierten Dicke" dr des Glaskeiles wie die Brechzahl des Glases
zur Brechzahl der Luft.
Bei üblichen Gläsern (n 1,5) und einem Keilwinkel α = δ n/n-1 wird
ein achsenparallel einfallender Lichtstrahl L an den der Lochmaske
zugewendeten Flächen und an den Außenflächen unter einem Winkel ρ
größer 2δ reflektiert, so daß Reflexe von diesen Flächen in
einem Raum außerhalb des Öffnungsbereiches der Optik zu liegen
kommen.
Das gleiche geschieht mit dem Reflex von den außen liegenden
Flächen der Glaskeile.
In Fig. 2 stellt der Strahl 4 beispielhaft den Verlauf eines von der
der Lochmaske zugewendeten Fläche des Glaskeiles 2 reflektierten
Strahles dar.
Strahl 5 wird von der äußeren Seite des Glaskeiles reflektiert.
In beiden Fällen erfolgt, wie oben beschrieben, eine Reflexion in
einen außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich.
Die Erfindung ist nicht an die dargestellte Ausführungsform
gebunden sondern vorteilhaft in allen Anordnungen unter Verwendung
einer Lochmaske nach Art einer Nipkowscheibe anwendbar.
Claims (2)
1. Konfokales Auflichtmikroskop,
- - mit einem durch das Objektiv (13) geführten Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang
- - und einer im Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang
bildseitig des Objektivs (13) angeordneten Lochmaske (1)
nach Art und Funktion einer Nipkowscheibe, welche gegenüber
einer Ebene senkrecht zur Objektivachse um einen Winkel δ
geneigt ist,
dadurch gekennzeichnet, - - daß zur Beseitigung von störenden Lichtreflexen aus dem Beleuchtungsstrahlengang, der Lochmaske (1) an ihrer dem Objektiv (13) zugewandten Seite ein erstes optisches Prisma (2) vorgeordnet und an ihrer dem Objektiv (13) abgewandten Seite ein zweites optisches Prisma (13) nachgeordnet ist,
- - daß die beiden Prismen (2, 3) als Keilprismen mit einem Keilwinkel α ausgebildet sind und mit ihren der Lochmaske (1) benachbarten Keilflächen gegenüber der Lochmaske (1) im wesentlichen parallel ausgerichtet sind,
- - daß das zweite Prisma (3) relativ zu dem ersten Prisma (3) bezüglich eines Keilwinkels α entgegengesetzt angeordnet ist,
- - und daß der Keilwinkel α entweder größer ist als die Summe aus dem Kippwinkel δ und dem Öffnungswinkel σ, unter dem das Beobachtungslicht auf die Lochmaske (1) einfällt, oder gegeben ist durch die Gleichung α = δ * n/n-1, wobei n die Brechzahl des Prismenmaterials ist.
2. Konfokales Auflichtmikroskop nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die beiden Prismen (2, 3) aus Glas
bestehen.
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