JPH09500864A

JPH09500864A - 高純度ベーターカロチン

Info

Publication number: JPH09500864A
Application number: JP6511290A
Authority: JP
Inventors: ハイ，ダブリュ．ジョフリー
Original assignee: ナチュラルカロチンコーポレイション
Priority date: 1992-10-27
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1997-01-28
Also published as: EP0666845B1; WO1994010140A1; ATE194830T1; AU5453094A; AU681868B2; DE69329070D1; EP0666845A1; CA2147825A1; US5310554A

Abstract

(57)【要約】高純度天然ベーターカロチンの及びベーターカロチンの９−cis 異性体の組成物、並びに植物物質、好都合にはドウナリエラ(Dunaliella)種からのこれらの組成物の製造方法を提供する。一般に、この組成物は約50％以上のベーターカロチン及び40％以上の全trans ベーターカロチンを含み、そしてあるケースにおいては75％以上の９−cis ベーターカロチンを含みうる。この組成物はヒト又はその他の動物への投与、特に薬理剤又は補助食品としての様々な製剤及び投与体における経口導入にとって適切である。

Description

【発明の詳細な説明】高純度ベーターカロチン発明の背景本発明は一般に精製天然ベーターカロチンの組成物及び植物からのその精製のための方法に関する。より詳しくは、ベーターカロチン調製品は全てのtrans 異性体に比して９−cis 異性体に富んでいる。この精製ベーターカロチンは様々な治療及び予防用途におけるビタミンＡ補助食品として、薬品として、そして特に高純度９−cis ベーターカロチンを含む調製品として、抗酸化剤として有用である。カロチンはビタミンＡの化学前駆体である。カロチンより合成されるビタミンＡはヒトを含む動物における多種多様な生理学的過程にとって本質的である。例えば、ビタミンＡは視覚において重要であり、そしてビタミンＡ欠乏症は夜間視力の欠失又は失明をも招きうる。カロチンは、アルファー、ベーター及びガンマーカロチンを含む複数の形態より成る。これらのうち、ベーターカロチン異性体は最大のビタミンＡ活性を有しており、そして自然中で最も主流となっており、濃緑色葉状野菜、黄色及び橙色野菜及び果実、並びに藻類において見い出せる。食用植物の中のベーターカロチンの濃度は比較的低く、従って大量に消費せねばならないか、又はベーターカロチンは補助食品として供給されねばならない。より近年になって、ベーターカロチンは心臓病及び心臓発作、並びに一定タイプの癌、例えば乳、肺、結腸、前立腺及び頸部の癌の危険性を予防又は抑えるものと報告されている。健康及び着色産業における市場の増大に合致するため、ベーターカロチンを精製する数多くの方法が提唱されている。しかしながら、あるにしてもわずかな手順しか、消費者及び規制機関への許容性を維持しながら、同時に経済的に天然起源から高純度の化合物を調製する要望により強いられる数多くの障害を、有効に乗り超えていない。例えば、Riiezgの米国特許第4,439,629 号は藻類を水酸化カルシウムで高温において処理してクロロフィルをけん化し、そして残留物を得、これを次に濾過し、乾燥し、そしてハロゲン化炭化水素又は脂肪族もしくは芳香族炭化水素の如きの溶媒で抽出し、次いで再結晶化させてリッチな全trans ベーターカロチンを得ることを述べている。 Keatらの米国特許第5,019,668 号は、食用油を利用し、そして混合物をかなり高めた温度の真空蒸留に委ねるエステル化工程によるやし油からのカルテノイドの回収を述べている。これらの調製品中のベーターカロチンの濃度は約1.9 ％までと述べられている。 Nomuraらの米国特許第4,680,314 号は、藻類を濃縮し、そしてベーターカロチンを植物油の如きの食用油により高温、即ち66℃〜100 ℃で抽出する工程を述べている。油抽出物中のカロチンの濃度は1.9 ％程度であると報告されている。これもNomuraらのものである米国特許第4,713,398 号は、藻類から調製した食用油媒質の0.5 〜7.5 重量％の濃度でのカロチン組成物を述べている。ベーターカロチンは化学合成により調製されてきているが、しかし全trans 形態のみの生産をもたらし、ベーターカロチンのcis −異性体はわずかでしかない。高純度の天然ベーターカロチン組成物、特にベーターカロチンの９−cis 異性体に富む組成物を製造する方法の必要性が当業界において明らかに残っている。所望の方法はベーターカロチンを、その酸化防止能を維持する形態において、且つ食品及び健康規制機関並びに消費者により許容される形態において提供するであろう。更に、この方法はベーターカロチン含有組成物を大量スケール、且つ経済的に可能な状況で製造する能力を供すべきである。かなり驚くべきことに、本発明はこれら及びその他の関連の要望に応えている。発明の概要本発明は、天然の高純度ベーターカロチン及びベーターカロチンの９−cis 異性体の組成物、並びに植物物質からのその製造方法を提供する。即ち、一態様において、本発明は実質的に精製された天然のベーターカロチン異性体を、40％以上の９−cis ベーターカロチン及び約50％未満の全trans ベーターカロチンの相対量で含んで成り、より典型的には約50％以上の９−cis ベーターカロチン及び 40％以下の全trans −ベーターカロチンの相対量で含んで成る。これらの調製品中のアルファーカロチンの量は通常存在しているカロチンの全量の約10％未満である。この調製品は天然起源、好都合にはドウナリエラ(Dunaliella)種の如きの藻類に由来しているため、この組成物は更にその他のカルチノイド類（一般には約２％以下）及びその他のcis −ベーターカロチン異性体（一般に約３％以下）を含んで成りうる。この組成物は実質的に有機溶媒を含まず、そしてそれ故ヒト又はその他の動物への投与にとって適当である。他の態様において、本発明に供される、薬理組成物を含む該組成物は、約60％以上の９−cis ベーターカロチン及び25％以下の全trans ベーターカロチンを含んで成り、そしてあるケースにおいてはそのベーターカロチンは75％以上９−ci s ベーターカロチンでありうる。高純度９−cis ベーターカロチンの製剤は経口導入にとって特に有用である。この高純度天然ベーターカロチン調製品は薬剤又は補助食品として、薬理学的に許容される担体、防腐剤、ビタミン補助剤、又はヒトもしくはその他の動物、例えば家畜への投与のための様々な製剤及び投与体のその他の医薬剤と組合せてよい、この製剤は典型的にはカプセル、液体、錠剤又は粉末である。更なる別の観点において、本発明は簡単且つ経済的な、植物からのベーターカロチンの９−cis 異性体を含むベーターカロチンの精製のための方法を提供する。植物材料、例えば藻類を溶媒又は複数の溶媒の混合物、典型的には有機溶媒、例えばヘキサン、石油エーテル、シクロヘキサン、酢酸エチル、エタノール等で抽出して、カロチンの粗混合物を供する。その溶媒をその抽出物から除去し、そしてその抽出物を次に非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテル、シクロヘキサン等に溶解し、そして不活性化アルミナのカラムでクロマトグラフィーにかける。精製ベーターカロチンを含む画分を次にこのカラムが集める。ベーターカロチンの高純度９−cis 異性体を得るため、一の方法において、カラムから集めた高純度天然ベーターカロチンを更に処理する。典型的には、精製ベーターカロチンを非極性溶媒の中に約35〜55℃において溶かして飽和溶液を形成し、これを冷却して全trans ベーターカロチン部を結晶化させる。次にその溶媒を上清液から除去し、実質的に９−cis ベーターカロチンに富む調製品を得る。その手順、即ち、温めた非極性溶媒の中での溶解、全trans ベーターカロチンを結晶化させるための冷却、結晶からの溶液の分離、及び９−cis ベーターカロチンに更に富む調製品を得るための溶媒の除去の手順は繰り返してよい。図面の簡単な説明図１は初期分画後の非常にリッチな天然ベーターカロチンを示すクロマトグラフィーである。図２Ａは、図１と同じ材料であるが、β−カロチン異性体をVydac カラムの利用により分解したクロマトグラフィーである。図２Ｂ及び２Ｃは、ベーターカロチンの９−cis 異性体及び全−trans 異性体それぞれに富む調製品を得るためのその後の精製工程に由来するクロマトグラフィーである。特定の態様の詳細本発明は、高度に精製された天然ベーターカロチン及び高純度天然ベーターカロチンを含む組成物の調製のための方法を提供する。この方法は一般に、粗植物抽出物の中性及び極性脂質からのベーターカロチンの分離、並びに酸素含有カルチノイドの除去を包括している。更に、ベーターカロチンの天然高純度９−cis 異性体の調製品及び組成物の調製のための方法を提供する。この組成物は配合され、そして様々なふうに、例えばとりわけヒト及び他の動物のための補助食品のために、並びに一定の腫瘍性症状の処置のために利用されうる。本発明のベーターカロチン含有組成物、様々な植物材料、例えば藻類、やし、野菜、例えばほうれん草、ブロッコリ、むらさきごやし及びその他の植物から調製されうる。この方法は、にんじん及びさつまいも等からの全trans 異性体の精製にも利用されうる。藻類のうちで、好適な綱は緑藻類(Chlorophyta)であり、そのうちで特に好ましい属はドウナリエラである。その他の属もカロチンが比較的大量に生産されうる限り利用できうる。培養技術は各藻類細胞の中に存在しているカロチンの量を有意に高めうる。典型的には、この藻類は浅いタンク、バイオリアクター、手製又はナチュラルポンドの中で、幅広い温度域、例えば15〜50℃、より好ましくは約25〜45℃の温度で増大させる。好ましくはこの培養培地は塩水とするが、しかし新鮮な水を利用してもよい。新鮮な水は培養培地としての塩の添加により生理食塩水に仕上げることができうる。この培地は硝酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、鉄及び微量鉱物の添加により補助されうる。藻類の大スケール繁殖は例えば引用することで本明細書に組入れるA.Richmond，Handbook of Microalgal Mass Culture ，CRC Pres s，Boca Raton，F1 (1986)に記載されている。藻類培養物が、吸収の決定に従い所望の密度、例えば約0.25〜0.5 グラム乾燥重量／リットルに達したら、その藻類をタンク又はポンドから、分散藻を含むスラリーを水で汲み出すことにより回収する。このスラリーを、藻類は通すがより大きな不要の物体は排除できる粗さであるスクリーンに通す。次にこのスラリーを、不要の水を除去するため、典型的にはエバポレーション、遠心、凝集、限外濾過、フローテーション等により濃縮する。一の態様において、スラリーの濃縮後、新鮮な温水の添加及び限外濾過により塩を大量に除去する。これはまた藻類細胞を壊し、ベーターカロチンを遊離させる。この濃縮物を次に適当な連続フロー遠心機、例えばクリームセパレーターの中で遠心し、連続的に取出されるカロチン及び脂質の上（クリーム）相を得る。これを適当な溶媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の中に以下の通りに溶解する。別の態様において、藻類材料を遠心、限外濾過等により脱水し、そしてカロチンを適当な有機溶媒の利用により藻類又はその他の植物調製品から抽出する。この抽出及びその後の精製手順は非酸化型カロチンの回収を最大とするため、一般に、低い光強度、及び真空下又は不活性ガス（例えば窒素）の雰囲気下で行う。抽出溶媒又は溶媒混合物は有機類、例えばヘキサン、ヘキサン類、ペンタン、ヘプタン、オクタン、石油エーテル、シクロヘキサン、酢酸エチル、アセトンもしくはエチルアルコール、又は無機類、例えば液体もしくは超臨界流体としての二酸化炭素であってよい。次にこの溶媒を粗抽出物から、典型的には真空下でエバポレートすることにより除去し、そしてその抽出物を最少量の適当な非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテル、シクロヘキサン等に溶かす。抽出及び再溶解したカロチン溶液を次にアルミナ、好ましくは不活性化（部分的にもしくは全体的に）アルミナ、又は珪酸、FLORISIL（珪酸マグネシウム）等のクロマトグラフィーに載せる。アルミナはそれを水性エタノール（エチルアルコール：水、70：30ｖ／ｖ）の中に懸濁することにより、又は似たような手順により不活性化させる。次にこのアルミナを水／アルコールスラリーとしてカラムの中に充填する。このカラムを一般には水を除くために例えばエタノールで洗い、次いでエタノール／ヘキサン混合物、例えば40％のエタノール：60％のヘキサンの混合物で洗う。カラムから全ての残留エタノールを完全に除くため、数カラム容量の適当な非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテル等の洗浄を、それに続く追加の洗浄を、典型的には少なくとも５〜６カラム容量の100 ％の非極性溶媒、例えばヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、石油エーテル等、しかしながら好ましくはヘキサンで行う。再溶解したカロチン抽出物を次にカラムに載せる。その抽出物をカラムを介して、典型的にはそれを溶解するのに用いたものと同一の非極性溶媒、好ましくはヘキサンを用いて洗う。燈赤色カロチンの主バンドを含む画分を集め、そして溶媒を典型的にはエバポレーションにより、好ましくは真空で除去する。これによりその画分は高純度天然ベーターカロチンを含む。本明細書で用いる「高純度天然ベーターカロチン」とは、30〜60％の全trans −ベーターカロチン、40〜70％の９−cis −ベーターカロチン、最大約10％までのアルファーカロチン、及び約６％以下のその他のモノ− cis 及びジ−cis ベーターカロチン異性体複合物を含んで成る組成物を意味する。本発明の高純度天然ベーターカロチンの典型的な調製品は50％の９−cis −ベーターカロチン、40％の全トランス−ベーターカロチン、５％のアルファーカロチン、２％のその他のカルチノイド類及び３％のcis −ベーターカロチン異性体を含んで成る。カラムからのベーターカロチン画分の溶離後、同一の溶媒による溶離を続け、そして主要着色バンドの直後の後の画分を回収し、ここで若干のベーターカロチンを含む淡黄色の残留カルチノイドの事実上全てを取り出すために更に４〜５倍カラム容量の溶離液を集める。このことは、プロビタミン補助品又は天然着色剤として有用である。定期的にカラムを洗って全てのより極性なカルチノイド、植物脂質及びクロロフィルをカラムから、一般にはアセトン及び／又はエタノールの如きの極性溶媒による逆洗浄によって除去する。この洗浄は溶媒の回収のためにエバポレーションによって更に処理する。固形物は捨てるか、又は動物の飼料もしくは健康食品に用いてよい。次にこのカラムを更なるカロチン精製のために保存するために40 ％のエタノール／非極性溶媒、それに続く純粋な非極性溶媒により前述の通りに洗ってよい。定期的に、緑色顔料及び藻脂質の堆積物は除去できないようになり、従ってカラムは上記の通りに新鮮なアルミナで再充填する必要がある。上記の通りに調製した天然高純度ベーターカロチンは更にもっと高純度な９−cis 異性体ベーターカロチンを含んで成る組成物を作るのに用いられうる。本明細書で用いている「高純度天然９−cis ベーターカロチン」とは、植物起源由来のアルファー及びベーターカロチンの混合物を意味し、これは60％より大の９−cis −ベーターカロチンを含んで成る。好ましくは、この天然９− cis −ベーターカロチンは、この組成物の70％以上、より好ましくは約80％以上、そして最も好ましくは90％以上を占めている。典型的には、９−cis −ベーターカロチン、又は、全trans −ベーターカロチンの比は3.0 ：１以上、好ましくは約5.0 ：１以上であろう。高純度天然９−cis −ベーターカロチンは、高純度ベーターカロチン調製品をこのベーターカロチンを溶解するのに必要な最少量の温めた（典型的には40〜50 ℃）非極性溶媒の中に溶かすことにより作られる。様々な非極性溶媒、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、石油エーテルが利用されうるが、しかしヘキサンが好ましい。この溶液を一般には約−20℃まで冷却して、ベーターカロチンの全trans 異性体の優先的な結晶化を起こさせる。この結晶を次に上清液から、任意の通常の分離法、例えば濾過、遠心、デカント等により分離させる。その残留上清液をその溶媒を除去するためにエバポレートし、高純度の９−cis −ベーターカロチン異性体を含んで成るカロチン調製品を残す。この最終調製品は実質的に有機溶媒を含まないであろう。実質的に含まないとは、調製品が有機溶媒を全く含まないか微量でしか含まないことを意味し、そしてどのような状況においても規制機関により認められているヒトへの投与のための量を超えないであろう。追加の全trans ベーターカロチンを除去するため、及びより高純度な９−cis −ベーターカロチン調製品を得るため、９−cis −異性体を含む上清液を再エバポレートに付し、上記の通りの最少量の溶媒に再溶解し、そして冷却により再結晶化させる。得られる全trans ベーターカロチン副産物は典型的には75％以上の純度であり、そして様々な目的、例えばビタミンＡの起源、天然着色産物、又は疾患予防もしくは処置のために利用できる。高純度天然ベーターカロチン及び９−cis ベーターカロチンの組成物は多種多様な用途、例えば薬品及び食用ビタミン補給剤にとって有用である。意図する投与の態様及び意図する目的に依存して、この組成物は固体、半固体もしくは液体投与形態、例えば錠剤、カプセル、ピル、マイクロビーズ、ビーズレット、粉末、顆粒、結晶、液体、懸濁物、リポソーム等の形態、好ましくは比較的正確な投与量の投与にとって適切な単位投与形態であってよい。この組成物は慣用の薬理担体又は賦形剤を含んでよく、そして更にその他の医薬剤又はビタミン、薬理剤、担体等を含みうる。本発明の高純度天然ベーターカロチン及び９−cis ベーターカロチンは副作用なしで比較的大量に投与できうるが、しかしながら無秩序な使用は肌を黄色くしうる。一定のタイプの腫瘍形成、心臓血管病等に感受性な患者における緊急な病気を予防するために、又は緩やかもしくはボーダーラインの疾患にのみ苦しむ者にこの組成物を投与する場合、その投与量は低めの維持レベルに従って調節されうる。経口投与にとって適当な固形組成物に関して、高純度天然ベーターカロチン及び９−cis ベーターカロチンは独立して、又は慣用の無毒な固形担体、例えば薬理級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を配合してよい。かかる組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、粉末、顆粒、結晶、徐放性製剤等の形状をとってよく、そして約10〜100 ％、好ましくは約25〜90 ％の活性成分を含んでよい。液状薬理投与用組成物は例えば、高純度の天然ベーターカロチン及び／又は９ −cis ベーターカロチン、並びに任意的に薬理アジュバントを、懸濁又は溶解用担体、例えば鉱物もしくは植物油等に溶かし、これにより溶液又は懸濁物を形成することによって調製できうる。これらの配合物中の高純度天然ベーターカロチン又は９−cis ベーターカロチンの濃度は幅広く変えることができ、そして主として、意図する用途、粘度等により、選定する特定の投与態様に従って選ばれるであろう。食用補給剤として、高純度の天然ベーターカロチン又は９−cis ベーターカロチンは油として、カプセルの中に懸濁されて、もしくはビーズレットとして供給させることができ、又は投与の慣用手段として食品の中に直接組込むことができる。所望するなら、投与すべき薬理組成物の微量の非毒性補助物質、例えば酸化防止剤、例えばビタミンＥ（トロコフェロール）、BHA，BHT、pH緩衝剤、例えばモノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等をも含みうる。かかる投与形態を調製するための実際の方法は当業者に知られているか、又は自明である。例えば、引用することで本明細書に組入れるRemington のRharmacentical Science、第17版、Mack Publishin g Company，Easton，PA (1985)を参照のこと。投与すべき組成物又は製剤はあらゆる状況において、対象者における病気の症状を緩和もしくは治すため、又はその緊急性を阻止するために有効な量の所定量の高純度天然ベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチンを含むであろう。本発明の精製ベーターカロチン組成物はヒト又は脊椎動物への適用にとっての様々な治療的又は予防的用途のために投与してよい。この組成物はビタミン調製品として、単独で、又はその他のビタミンと一緒に、ビタミンＡの補給食的摂取のために利用でき、そしてそれ故ビタミンＡ欠乏症にかかわる症状を処置又は予防する。ベーターカロチン及び特に９−cis ベーターカロチンは酸化防止剤であり、それらは動物及びヒトの組織において見い出せる低部分酸素圧において脂質環境の中で機能できるため、本発明の組成物はフリーラジカル及び脂質自己酸化にかかわる様々な病気又は病理症状の予防又は処置においても利用できうる。他の用途において、高純度の天然ベーターカロチン又は９−cis ベーターカロチンは様々な癌、特に上皮細胞癌のために治療的又は予防的に投与される。ベーターカロチン調製品は動物における様々な腫瘍に対して有意義な保護を示す。ベーターカロチンの予防又はその他の有利な効果を樹立せしめる癌の動物モデルはとりわけ皮膚癌、例えば紫外光により誘発されるもの（Epstein，Photochem.Pho tobiol .，25:211 (1977)及びMathens-RothのCurrent Chemotherapy and Infecti ous Diseases 編、Nelson and Grassi，Amer.Soc.Microbiol.，Wash.D.C.p.1503 (1980)）、乳癌(Santamaria ら、Med.Biol.Environ.12:533 (1984))、線維肉腫( Combsら、Nutr.Cancer 12:371 (1989))、表皮癌腫(Shklar ら、Nutr.Cancer 1 2:321 (1989))、胃癌(Santamaria ら、J.Nutr.Growth Cancer． 4:175 (1987)) 、結腸癌(Santamaria ら、Prev.Med． 18:603 (1989))、外分泌性膵臓腫瘍(Wout ersonら、Cancer Lett. 42:79 (1988))、膀胱癌(Mathews-Roth らOncology 48:1 77 (1991))及びウィルス誘発癌(Seifterら、J.Natl.Can.Inst. 78:1211 (1982)) である。従って、本発明のベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチン調製品は、ヒトにおけるものを含む様々な癌のための治療法における利用を意図する。ベーターカロチン調製品はヒトにおける腫瘍、例えば肺癌、例えば鱗細胞癌腫、胃腸管癌、例えば口(StichらIntl.J.Cancer 42:1 95（1988）及びStich らのCarotenoids:Chemistry and Biology 、編Krinsky ら、Plenum Press，p.313 (1990))、咽頭、喉頭(MackerrasらAmer.J.Epidemiol． 123:980 (1988))、食道、胃（Graham らNutr.Cancer 13:19 (1990))、結腸(San tamaria らPrev.Med 18:603 (1989)、TempleらJ.Natl.cancer Inst． 78:1211（ 1987）及びGrahamらJ.Natl.Cancer Inst． 61:709 (1978))、直腸、膀胱(Comsto ck らAmer.J.Clin.Nutr． 53:260s（1991）、Tyler らEur.J.Surg.Oncol． 12:3 5（1986）及びMathews-RothらOncology 48:177 (1991))及び頸(PalanらAmer.J.O bstet.Gynecol. 161:1649 (1989))の癌を処置、阻止又はそうでなければ予防するのに有用であることが示されている。ベーターカロチンは皮膚癌、例えば黒色腫(Comstock ら、前掲)、並びに頭及び首の表皮癌(Shklar， Natl.Cancer 12:3 21 (1989))を予防又は阻止するのに有効であることも示されている。分泌腺、例えば膵臓の癌腫(WoutersonらCancer Lett. 42:79( 1988))及び乳の癌腫(Basu， J.Amer.Coll.Nutr． 6:451（1987）及びSantamariaら、Med.Biol.Environ. 12:5 33 (1984))並びに口腔、口腔咽頭部及び乱の粘膜不全形成(MalakerらClin.Inves t.Med. 10:B113 (1987))もベーターカロチンにより処置されていることが報告されている。以上の文献はそれぞれ引用することで本明細書に組入れる。従って、本発明の高純度ベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチン調製品は、純度の低いベーターカロチン調製品に対して少なくともある程度応答性であると示されている腫瘍の治療又は予防において極めて有用である。９− cis 異性体はベーターカロチンの他の異性体に比べて有効な酸化防止剤であり、且つよりよく吸収されるものであると信じられているため、この異性体の調製品はこれらの腫瘍の処置又は予防において特に好ましい。高純度天然ベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチン組成物は早期老化の作用、例えば日光の如きの紫外線への暴露により誘発されるタンパク質及びコラーゲン組織への損傷を削減するために肌又はその他の組織に塗布することもできる。肌へのベーターカロチン調製品の局所塗布はクリーム、オイントメント、液体等の形態であるか、又は化粧品及びトワレーの中に組込んでよい。心臓血管病、例えば心不整脈、心筋梗塞、狭心症(Riemersmaら、Lancet i:337 (1991))及び発作の危険性も本発明の高純度天然ベーターカロチン又は９−cis ベーターカロチン組成物により減じることができる。本発明の高純度ベーターカロチン調製品のための他の目的には、純度の低い又は合成ベーターカロチン調製品による処置より有利であると報告されているもの、例えばDuchenne筋ジストロフィー(Patsch ら、Clin．Res. 33:441A (1985))及び白内障(Jacquesら、Am.J.Clin.Nutr． 53:352S (1991))が含まれる。ベーターカロチンはまた、Ｔ及びＢリンパ球増殖応答(Bendichら、J.Nutr． 116:2254 (1 986))、例えばＴ細胞エフェクター機能を高める、例えば細胞障害性Ｔ細胞、NK 細胞(Prabhala ら、Clin.Res． 36:142A (1988))の機能を高める、インターロイキンの産生を高める、抗腫瘍免疫力を向上させる（Tomita ら、J.Natl.Can.Inst . 78:679 (1987))及び細菌の破壊の際のフリーラジカルによる損傷から多形核細胞を保護する(Anderson and Theoron， World Rev.Nutr.Diet．(1989))ことも報告されている。ベーターカロチンの合成調製品は全trans 形態のみを含み、一方、緑色植物組織由来の天然カロチンは異性体の混合物を含み、そして本発明の組成物は９−cis 異性体が特に高く、これは合成全trans 異性体よりも優れた酸化防止剤であると信じられる。更に天然起源由来のベーターカロチンは全trans 形態よりも胃腸管で10倍以上に吸収されることが報告されている（Be n-Amotzら、J.Nutr． 119:1013 (1989))。本薬理組成物は、予防的及び／又は治療的処置のための経口、局所、局在又は非経口（即ち、静脈内、皮下又は筋肉内）投与を意図する。好ましくは、この薬理組成物は経口投与する。上記の通り、ベーターカロチンの９−cis 異性体はより優れた酸化防止剤であり、且つ全trans ベーターカロチンよりよく吸収される。この組成物は慣用のよく知られた滅菌技術によって滅菌されうる。この組成物は、生理学的条件に近づけるのに必要な、及び慣用の投与にとっての組成物を調製するのに必須な薬理学的に許容される補助剤、例えばpH調節剤及び緩衝剤、並びに導入ビヒクル、例えば植物油又は鉱物油を含みうる。薬理投与用化合物を調製するための実際の方法は当業者に知られているか又は自明であり、そして例えばRemington のPharmaceutical Science前掲に詳細されている。本発明の組成物は腫瘍性又は心臓血管病に既に苦しむホストに、前述のように、その病気及びその合併症を治す又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与する。このことを達成せしめるのに適度な量を「治療的に有効な投与量」と定義する。この用途にとって有効な量は病気の重症度、並びに処置する患者の体重及び一般状態に依存するであろうが、しかし一般には１日当り約５mg〜約2, 000mg の高純度ベーターカロチン又は９−cis ベーターカロチンであり、約10mg 〜約500mg／日の投与量がより一般的に利用される。長期にわたる維持投与量の必要なほどに調節されうる。本発明の組成物は非常に重症な状態、即ち、生命を脅かす又は潜在的に生命を脅かす状況において採用されうることを念頭におくべきである。かかるケースにおいて、実質的に過剰なこの組成物を投与することが処置医師により可能、且つ所望されると思われうる。脊椎動物用途にとっては高めのレベルを必要なだけ投与してよい。特定の病気、例えば前述の腫瘍、心臓血管病、免疫障害等を阻止又は処置するのに必要な高純度天然ベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチンの実際の量の決定は当業界において公知である標準的な実験法を介するであろう。予防用途において、高純度天然ベーターカロチン及び／又は９−cis ベーターカロチンを含む組成物を、ビタミンＡ欠乏症にかかわる病気又は酸化関連病に対して感受性又はその危険性のあるホストに投与して患者自身の病気に対する能力を高める。かかる量を「予防的に有効な投与量」と定義する。この用途において、ここでもその正確な量は患者の健康状態及び体重に依存するであろうが、しかし一般には１日当り約３mg〜約500mg 、より一般には１日当り約10mg〜約30mgに範囲する。この組成物単一又は複数投与は、処置医師又は看護人により選ばれる投与量レベル及びパターンで実施されうる。薬理組成物を含む本発明の組成物は単独で、又は治療もしくは予防補助剤として投与してよい。この組成物は例えばその他の抗癌もしくは抗心臓血管病治療剤と共に、又は食事療法の成分として投与してよい。以下の実施例は限定でなく例示のために提供する。実施例Ｉ高純度天然ベーターカロチンの調製本例は高純度ベーターカロチンの調製を述べる。ドウナリエラサリナ（Dunaliella Salina）を、４′×10′のタンク中のパドルホイールシステムより成る、４″水レベル付きの培養タンクの中で増やした。培養培地は2.5 Ｍの塩水と、0.2mM のリン酸塩、５mMのHCO₃、１mMのNO₃ 、鉄及び微量鉱物とし、そして管理光条件（表面から10〜12″において６台の1000ワットハライドライト）のもとで約55℃の温度に維持しておいた。カロチン生産を誘発するために硝酸制約を利用した。培養物が0.25ｇ乾燥重量／ｌの密度に達したら、藻類をその培養タンクから回収し、そしてみょうばんを用いて凝集させて藻類スラリーを形成させた。そのスラリーを珪藻土と混合し、そしてほとんどの水を除去するために真空濾過し、次いで温水（66℃）で処理し、そして真空で可能な限り乾燥させた。得られるケーキをヘキサンで抽出して粗カロチン調製品を除去した。次にヘキサン溶媒を40〜50℃において真空エバポレーションにより除去し、そして粗抽出物を可能な限り最少量のヘキサンの中に再溶解させた。次にこの溶液を以下の通りに用意した３″×12″のクロマトグラフィーカラムに載せた：クロマトグラフィー級の活性化アルミナ（酸化アルミニウム）（Aldrich Chemical C o.，Brockmangrade Ｉ、酸性、約150 メッシュ）を、それを２容量の水性エタノールの中で、70部のエチルアルコール、対30部の水の混合において一夜懸濁することにより不活性化させた。この不活性化アルミナを次に水／アルコール混合物中のスラリーとしてカラムの中に充填した。次にこのスラリーを４容量の無水エタノールでよく洗って水を除去し、続いて２倍カラム容量のヘキサン中の40％のエタノールで洗った。次にこのカラムを少なくとも５〜６カラム容量のヘキサンで洗って全ての残留エタノールを完全に除去した。次に粗カロチン抽出物を約100ml のヘキサン中でこのカラムに載せ、次いでこのカラムを介してヘキサンで洗った。橙赤色のカロチンの主要バンドを含む300ml の画分を集め、そして溶媒を真空エバポレーションにより除去した。この段階でベーターカロチンは、ベーターカロチンの様々な異性体を分解しないSupelco カラムを用い図１の代表的なクロマトグラフィーに示す通り、約90 〜95％精製されていた。ベーターカロチン異性体を分解しないVydac カラムでの類似の調製は、そのベーターカロチンが約55％の９−cis 異性体及び約45％の全 trans 異性体を含んで成ることを示す（図２Ａ）。主要着色バンドの直後に、ヘキサンによる溶離を別の容器の中に続け、ここでは事実上全ての淡黄色材料、主としてベーターカロチンとその他のカロチン及びカルチノイドを取出して集めるために２リットルを使用し、それは別の50〜80％の純度のベーターカロチン副産物として保存した。定期的にこのカラムを極性溶媒、典型的にはアセトン又はエタノールにより逆洗浄して酸素化カルチノイド、植物中性脂質及びクロロフィルをカラムの上から除去した。この材料は少量のアスタキサンチン及び／又はカンタキサンチンを含み、それらは養殖サケ及びコイのための着色剤として魚の飼料において価値がある。このカラムを40％のエタノール／ヘキサン溶媒及びヘキサンで前記の通りに洗い、更なるカロチン精製のために保存した。定期的に、前述の通りでは溶離できないクロロフィル及びその他の脂質の堆積により必要とされるため、カラムの上部２″〜３″を新鮮なアルミナに充め換えた。得られる高純度ベーターカロチンの調製品をエバポレートして溶媒を除去し、そして図１に示す通り約95％のベーターカロチン及び５％のアルファーカロチンを得た。純度は薄層クロマトグラフィー及びHPLCにより確認した。実施例II 高純度９−cis ベーターカロチンの生産本例は実施例Ｉ記載の通りに調製した高純度ベーターカロチンからの９−cis 異性体に富むベーターカロチンの生産を述べる。実施例Ｉ由来の高純度ベーターカロチンは飽和を達成するために最少量の温めた（約40〜50℃）のヘキサンの中に溶かした。この溶液を次に一般に約−20℃に冷却し、これはベーターカロチンのtrans 異性体の優先的な結晶化を引き起こす。この結晶を次にその上清液から、疎水性の0.22Ｍのナイロン膜フィルター(Mic ron Separations，Inc.，Cambridge，MA)を介する濾過により分離させた。９−c is 異性体に富む上清液（約75〜80％の９−cis 及び15〜20％の全trans ）並びに全trans 異性体を含む結晶（約80〜85％の全trans 及び10〜15％の９−cis ）の代表的な調製品のクロマトグラフィーをそれぞれ図２Ｂ及び２Ｃに示す。この上清液を次に真空のもとで、約40℃及び低強度ライトのもとで乾くまでエバポレーションして（精製工程は全て前記の通り）ヘキサンを除き、実質的に９ −cis 異性体に富むカロチン調製品が残った。これらの調製品からの９−cis 異性体の一般収量は約２〜３ｇであった。これらの精製手順による実験はパイロット及び製造ベルへと容易にスケールアップできる。実施例III カプセル製剤本例は、カプセル形態における経口投与を意図する本発明のベーターカロチンを含む食用組成物の配合を述べる。成分量高純度ベーターカロチン 30mg ビタミンＥ 400I.U. ビタミンＣ 500mg 上記の成分を組合せ、そしてヒトへの投与にとって適当なゼラチンカプセルの中に入れた。本発明は、ヒト及びその他の動物のための補助食品として有用であり、且つ一定の腫瘍形成を含む数多くの病気の治療において、及びその他の病気、例えば心臓血管病の予防において有用な、高純度天然ベーターカロチン及び９−cis ベーターカロチンを提供することが上記から明らかである。更に、本発明はプラント状況から、好都合には大スケール藻繁殖から、高純度天然ベーターカロチン及び９−cis ベーターカロチンを調製する経済的な方法を提供する。本明細書に挙げた全ての文献及び特許は本発明が属する業界の当業者のレベルの指標である。全ての文献及び特許は引用することで本明細書に組入れる。本発明を理解のし易さのために具体例及び実施例により説明してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく一定の変更及び改良が可能であることが明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０９Ｂ 61/00 9356−4ＨＣ０９Ｂ 61/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．植物からベーターカロチンを精製するための方法であって：植物を溶媒で抽出して抽出物中のカロチンの粗混合物を生成し；この抽出物からこの溶媒を除去し、そしてこの抽出物を非極性溶媒の中に再懸濁し；この抽出物を不活性化アルミナのカラムでクロマトグラフィーにかけ；そしてこのカラムから精製ベーターカロチンを含む画分を集める；ことを含んで成る方法。２．前記植物が藻である、請求項１記載の方法。３．前記藻がドウナリエラ種である、請求項２記載の方法。４．前記抽出溶媒が有機溶媒である、請求項１記載の方法。５．前記抽出溶媒が、ヘキサン類、ペンタン類、ヘプタン類、オクタン類、石油エーテル類、シクロヘキサン、酢酸エチル、エタノール及びそれらの混合物より選ばれうる、請求項４記載の方法。６．前記非極性溶媒がペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン又は石油エーテルである、請求項１記載の方法。７．前記アルミナが水性エタノールにより不活性化されたものである、請求項１記載の方法。８．請求項１記載の方法で調製された組成物であって、実質的に純粋な天然ベーターカロチン異性体を、40％以上の９−cis ベーターカロチン及び約50％未満の全trans ベーターカロチンの相対量で含んで成り、且つ実質的に有機溶媒を含まない、組成物。９．前記方法であって、更に下記の段階：精製ベーターカロチンを非極性溶媒の中で約35〜60℃において溶かして飽和溶液を形成せしめ；この溶液を約０℃〜−25℃に冷却して全trans ベーターカロチンを結晶化させ、次いでその溶液をこの結晶化全trans ベーターカロチンが分離させ；そしてこの溶液から前記溶媒を除去して９−cis ベーターカロチンに富む調製品を得ること；を含んで成る請求項１記載の方法。 10．前記精製ベーターカロチンをヘキサンに溶かす、請求項９記載の方法。 11．前記結晶化全trans ベーターカロチンを、濾過、遠心又はデカントにより前記溶液から分離する、請求項９記載の方法。 12．請求項９記載の方法により生成した組成物であって、75％以上の９−cis ベーターカロチンを含む実質的に純粋な天然ベーターカロチンを含んで成り、且つ有機溶媒を実質的に含まない、組成物。 13．前記９−cis ベーターカロチンに富む調製品により反復することを更に含んで成る請求項９記載の方法であって、非極性溶媒の中で約35〜60℃において溶かす；その溶液を冷却して全trans ベーターカロチンを結晶化させ、そしてその溶液をこの結晶から分離させる；そしてその溶媒を除去して９−cis ベーターカロチンに更に富む調製品を得る；段階を含んで成る方法。 14．請求項13記載の方法により生成した組成物であって、75％以上の９−cis ベーターカロチンを含む実質的に純粋な天然ベーターカロチンを含んで成り、且つ有機溶媒を実質的に含まない組成物。 15．実質的に純粋な天然ベーターカロチン異性体を、40％以上の９−cis ベーターカロチン及び約50％未満の全trans ベーターカロチンの相対量で含んで成り、且つ有機溶媒を実質的に含まない、組成物。 16．補助食品として利用するための、錠剤、カプセル又はマイクロビーズレットとして製剤化された、請求項15記載の組成物。 17．10％未満のアルファーカロチンを更に含んで成る、請求項15記載の組成物。 18．２％未満のアルファー及びベーターカロチン以外のカルチノイド並びに５％未満のその他のcis ベーターカロチン異性体を含んで成る、請求項17記載の組成物。 19．約60％以上の９−cis ベーターカロチン及び25％未満の全trans ベーターカロチンを含んで成る、請求項15記載の組成物。 20．薬理学的に許容される担体を更に含んで成る、請求項19記載の組成物。 21．補助食品として利用するための、錠剤、カプセル又はマイクロビーズレットとして製剤化された、請求項19記載の組成物。 22．75％以上の９−cis ベーターカロチンを含んで成る、請求項19記載の組成物。 23．薬理学的に許容される担体を更に含んで成る、請求項22記載の組成物。 24．補助食品として利用するための、錠剤、カプセル又はマイクロビーズレットとして製剤化された、請求項22記載の組成物。 25．ホストにおける腫瘍を阻害するための方法であって、このホストに、実質的に純粋な天然ベーターカロチン異性体を、40％以上の９−cis ベーターカロチン及び約50％未満の全trans ベーターカロチンの相対量で含んで成る腫瘍阻害量の薬理組成物を投与することを含んで成る方法。 26．約75％以上の９−cis ベーターカロチンを含んで成る前記薬理組成物をホストに投与することを含んで成る請求項25記載の方法。