JPH0933528A - 免疫分析用反応試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 短波長での測定が可能で、測定装置のセル汚
損性が低いリポソームを担体として用い、該リポソーム
にタンパク質関連物質からなる免疫学的物質が固定化さ
れている免疫分析用反応試薬及びその製造方法におい
て、抗原又は抗体のリポソームへの固定化を効率良く行
うことができ、且つ保存中にリポソーム自体が凝集を生
ずることのない、高感度な免疫分析用反応試薬及びその
製造方法を提供する 【構成】 リポソームにペプチド、ポリペプチド又はタ
ンパク質からなる免疫学的物質が固定化されてなる免疫
分析用反応試薬の製造方法において、免疫学的物質を不
活性化させない性質と免疫学的物質のリポソームへの固
定化を促進する性質を併有する、リポソームを安定化さ
せる物質を用いて、リポソームへ免疫学的物質を固定す
る。リポソームに免疫学的物質を固定する際に使用され
る前記物質は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タ
ンパク質、並びにアミノ基或いはカルボキシル基を含む
合成高分子化合物から選ばれたものが使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポソームへのペプチ
ド、ポリペプチド又はタンパク質からなる免疫学的物質
の固定化に、固定化助剤を使用した免疫分析用反応試薬
及びその製造方法に関し、更に詳細には、固定化助剤と
して免疫学的物質を不活性化させない性質と免疫学的物
質のリポソームへの固定化を促進する性質を併有する、
リポソームを安定化させる物質を用いて固定化を行うこ
とにより、固定化効率が飛躍的に向上し、また得られた
免疫学的物質固定化リポソームの安定性が増大された免
疫分析用反応試薬及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、
各種疾患の臨床診断薬等において極めて重要であり、従
来種々の免疫測定法が知られている。

【０００３】その中でも、抗原性物質又は抗体を固定化
させた担体に被検物質中の抗体又は抗原性物質を反応さ
せて生じた凝集量を目視又は分光光度計を使用して測定
し、その結果を予め作成しておいた標準検量線と照合さ
せて、抗体又は抗原性物質を定量する方法が凝集反応に
よる免疫測定法として知られている。このような免疫分
析法に用いられる免疫分析用反応試薬の担体としては、
従来ポリスチレン等の合成ラテックス粒子が用いられて
いる。従来の合成ラテックス粒子を担体として用いた免
疫分析用反応試薬はその表面が疎水性であるために、抗
原抗体反応を起こすための好適な水溶液中のｐＨ７〜
７．５では、特に疎水結合による凝集が起こりやすく非
特異凝集する傾向があり、分析精度において安定性に欠
けるきらいがあった。このために合成ラテックス粒子を
担体として用いた免疫分析用反応試薬には、このような
非特異凝集を抑えるために種々の添加剤を加える技術
が、既に特許出願（例えば、特公平３−１４２３６０号
公報等）されている。

【０００４】更に最近では、この様なラテックス免疫分
析用反応試薬を汎用生化学自動分析機に適用し、被検体
中の抗原又は抗体を測定することが行われているが、合
成ラテックス粒子を担体として用いた免疫分析用反応試
薬が自動分析機の反応セルに付着して汚染し、測定精度
に影響を与えることが問題となっている。これらの問題
を解決すべく、ラテックス粒子に替えてリポソームを担
体として用いたリポソーム免疫分析用反応試薬（特開平
６−３３５８号公報、特開平６−２３００１０号公報）
が提案されている。

【０００５】前記特開平６−３３５８号公報では、リポ
ソームがリン脂質由来の親水性表面を有するためにタン
パク質の非特異吸着が低減されるので、リポソーム凝集
反応試薬はラテックス凝集反応試薬に比べて測定試薬の
高感度化が可能であるとされている。また、凝集量を測
定するための凝集反応試薬の担体としてリポソームを用
いると、担体自体の濁度が小さいことからラテックス凝
集反応試薬では不可能な３４０ｎｍ程度の短波長域での
測定が可能となるので、リポソーム凝集反応試薬はラテ
ックス凝集反応試薬に比べて広範囲な濃度の被測定物質
に対応が可能となる。また、リポソーム凝集反応試薬は
自動分析機の反応セルに付着して反応セルを汚染するこ
とが少ないとされている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、リポソ
ームは一般に負に帯電しており、このような帯電傾向を
持つペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（以下、タ
ンパク質等関連物質という）を抗原又は抗体としてリポ
ソームに固定化する場合には、特にタンパク質をリポソ
ームに固定化する場合には、両者が電気的に反発して固
定化が効率よく行われないという問題があり、また、こ
のようにして得られた免疫分析用反応試薬を被検体の測
定に用いた場合、充分な測定感度が得られないという欠
点があった。

【０００７】また、抗原又は抗体として水溶性ペプチ
ド、水溶性ポリペプチド又は水溶性タンパク質（以下、
水溶性タンパク質等関連物質という）をリポソームに固
定化する場合には、特に水溶性ペプチドを固定する場合
には、これらの水溶性タンパク質等関連物質が固定され
たリポソーム自体は凝集を生じ易く、このような免疫分
析用反応試薬は保存性に劣り、その結果、測定感度が悪
いという問題があった。

【０００８】そこで本発明は、短波長での測定が可能
で、測定装置のセル汚損性が低いリポソームを担体とし
て用い、該リポソームにタンパク質関連物質からなる免
疫学的物質が固定化されている免疫分析用反応試薬及び
その製造方法において、抗原又は抗体のリポソームへの
固定化を効率良く行うことができ、且つ保存中にリポソ
ーム自体が凝集を生ずることのない、高感度な免疫分析
用反応試薬及びその製造方法を提供することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記した問題点を解決す
るために、本発明の免疫分析用反応試薬の製造方法は、
リポソームにペプチド、ポリペプチド又はタンパク質
（タンパク質関連物質）からなる免疫学的物質が固定化
されてなる免疫分析用反応試薬の製造方法において、免
疫学的物質を不活性化させない性質と免疫学的物質のリ
ポソームへの固定化を促進する性質を併有する、リポソ
ームを安定化させる物質を用いて、リポソームへ免疫学
的物質を固定することを特徴とする。

【００１０】本発明の免疫分析用反応試薬の製造方法
は、具体的には、免疫学的物質を不活性化させない性質
と免疫学的物質のリポソームへの固定化を促進する性質
を併有する、リポソームを安定化させる物質をリポソー
ムに固定化した後、得られたリポソームに免疫学的物質
を固定化することを特徴とする。

【００１１】本発明の免疫分析用反応試薬の別の具体的
な製造方法は、水溶性ペプチド、水溶性ポリペプチド又
は水溶性タンパク質（水溶性タンパク質関連物質）から
なる水溶性免疫学的物質を不活性化させない性質と水溶
性免疫学的物質のリポソームへの固定化を促進する性質
を併有する、リポソームを安定化させる物質に対して、
水溶性免疫学的物質を固定化した後、得られたリポソー
ムを安定化させる物質をリポソームに固定化することを
特徴とする。

【００１２】前記「免疫学的物質（又は水溶性免疫学的
物質）を不活性化させない性質と免疫学的物質のリポソ
ームへの固定化を促進する性質を併有する、リポソーム
を安定化させる物質」（固定化助剤と略す）は、具体的
にはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、
並びにアミノ基或いはカルボキシル基を含む合成高分子
化合物から選ばれたものであり、好ましくは、α−グロ
ブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、アルブミ
ン、酵素等が挙げられ、特に好ましくは γ−グロブリ
ン、アルブミンが用いられる。リポソームに固定される
べき免疫学的物質の電荷がリポソームと同等の場合に
は、固定化助剤の電荷は、リポソームと免疫学的物質の
電荷による反発力を緩和するような電荷を持つものが好
ましい。

【００１３】本発明の免疫分析用反応試薬は上記の各製
造方法により製造されたものであることを特徴とする。

【００１４】本発明の免疫分析用反応試薬は、抗原抗体
反応で生じた凝集量を測定するために使用される。

【００１５】本発明においては、上記のようにリポソー
ムへの免疫学的物質の固定化に固定化助剤を使用するこ
とにより、リポソームと免疫学的物質との電荷による反
発を緩和することができ固定化効率が飛躍的に向上す
る。また、これまで固定化が困難であったペプチドなど
の低分子量の水溶性タンパク質関連物質をリポソームへ
固定化しても、該固定化リポソームからなる免疫分析用
反応試薬の保存中にリポソームが凝集するのを防止で
き、試薬の安定性が増大する。

【００１６】本発明において「免疫学的物質」とは、抗
原又は抗体をいう。以下に本発明をさらに詳細に説明す
る。

【００１７】本発明において、リポソームとしてはリン
脂質及びコレステロールを主要構成成分とするものであ
れば、従来使用されている何れのものを用いてもよい
が、粒径が５０ｎｍ〜５μｍ、特に１００ｎｍ〜６００
ｎｍのものが好ましい。この範囲の粒径のリポソーム
は、その保存中に沈澱しにくいので試薬の安定性に優
れ、しかも、分光光度計及びスライド凝集法等による濁
度の測定において好ましい。また、リン脂質とコレステ
ロールの比が１：１前後であり、リン脂質中の脂肪酸残
基は、炭素数が１２〜１８、特に偶数であることがリポ
ソームの形成に好ましい。本発明に使用されるリポソー
ムには、非重合性リポソームのみならず、重合性リン脂
質を用いたリポソームも使用できる。

【００１８】本発明の免疫分析用反応試薬は、例えば以
下に示す方法で製造されるがこれに限定されるものでは
ない。

【００１９】リポソームの調製方法は、リン脂質、コレ
ステロール、必要があれば架橋剤導入リン脂質からボル
テキシング法（Vortexing 法）又はガラスビーズを使用
する方法が使用される。

【００２０】前記方法に使用される架橋剤としては、例
えば、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（略語：ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシン
イミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート
（略語：ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−
マレイミドフェニル）アセテート（略語：ＳＭＰＡ）、
Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
プロピオネート（略語：ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイ
ミドブチリルオキシ）サクシンイミド（略語：ＧＭＢ
Ｓ）及びＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サク
シンイミド（略語：ＥＭＣＳ）等が挙げられる。

【００２１】まずリン脂質、コレステロール、必要に応
じて架橋剤を導入したリン脂質及び溶媒を含む混合物を
反応容器中で反応させた後、この混合物の溶媒を留去
し、吸引乾燥する。しかる後に、反応容器の壁面に薄膜
が形成されるので、この中に緩衝液を加え、必要あれば
更にガラスビーズを加え密栓して振とうし、リポソーム
懸濁液を得る。その後、一定のポアサイズを持ったポリ
カーボネートの膜を通すことによって、均一な粒径のリ
ポソームを得る。

【００２２】本発明で使用される固定化助剤は、リポソ
ームに物理吸着されて固定される場合はそのまま用い、
リポソームに共有結合される場合はリポソームに導入さ
れる上記架橋剤と反応する反応基を固定化助剤に予め導
入しておくか、若しくは上記架橋剤と反応するように固
定化助剤を還元剤などで処理して修飾しておく。次い
で、このようにして調製したリポソームと固定化助剤を
混合して緩衝液中で反応せしめれば、固定化助剤が表面
に固定化されたリポソームが得られる。その後、リポソ
ーム表面に固定化する免疫学的物質と反応するような反
応基を固定化助剤に導入する。

【００２３】次に、リポソーム表面に固定化される免疫
学的物質は、リポソーム表面上の固定化助剤と反応する
ような反応基を予め導入して修飾抗原又は修飾抗体とし
ておく。上記のようにして調製された固定化助剤固定化
リポソームと修飾抗原又は修飾抗体を混合して緩衝液中
で反応させて、免疫学的物質が表面に固定化されたリポ
ソームからなる本発明の免疫分析用反応試薬を得る。

【００２４】また、上記とは別の本発明の免疫分析用反
応試薬の製造方法は、最初に免疫学的物質と固定化助剤
を反応させ、この反応により得られた固定化助剤結合免
疫学的物質をリポソームに固定化する手順を用いてもよ
い。この方法は、特にペプチド等の水溶性タンパク質関
連物質をリポソームに固定化する場合にはリポソームの
凝集を抑制する上から好ましい。

【００２５】本発明においてリポソーム表面に固定化さ
れる抗体は、被測定抗原性物質を認識するモノクローナ
ル抗体及び／又はポリクローナル抗体が使用できる。免
疫分析用反応試薬に用いる際のリポソーム表面に固定化
される抗体の処方は、特に限定されるものではないが、
例えば、モノクローナル抗体をリポソーム表面に固定化
する処方、ポリクローナル抗体をリポソーム表面に固定
化する処方、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体
を同一のリポソーム表面に固定化する処方、モノクロー
ナル抗体を固定化したリポソームとポリクローナル抗体
を固定化した別のリポソームを抗体固定化後に混合する
処方等が挙げられる。

【００２６】前記のように、ポリクローナル抗体とモノ
クローナル抗体を併用した免疫分析用反応試薬では、抗
原と親和力の強いモノクローナル抗体がポリクローナル
抗体の低親和力を補い、且つ凝集特性に優れたポリクロ
ーナル抗体がモノクローナル抗体の組合せの選択の煩雑
を回避できる特徴を有する。このリポソーム表面に固定
化される抗体は、例えば、ＩｇＧ分画のまま用いてもよ
いし、そのフラグメントであるＦ（ａｂ’）₂ 化された
ものを用いてもよい。

【００２７】リポソーム表面に固定化される抗原は、主
に血漿タンパク、ウイルス性タンパク等が挙げられる。

【００２８】本発明の免疫分析用反応試薬による免疫分
析法に適用される被測定抗原性物質としては、ホルモン
（例えば、インシュリン、ＨＣＧ−β、成長ホルモン、
ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、サイロキシン、
トリヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴン、ソマ
トスタチン等）、酵素（例えば、エラスターゼ、アミラ
ーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エ
ノラーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、血清タンパ
ク質（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄ、ＣＲＰ、マクログロブリン、ＴＢＧ、アポタンパク
質等）、糖タンパク質、糖脂質、腫瘍関連抗原（例え
ば、ＣＥＡ、α−フェトプロテイン、フェリチン、ＣＡ
１９−９、ＣＡ１２５等）、ＤＮＡ結合タンパク質因
子、サイトカイン（例えば、インターフェロン、インタ
ーロイキン１、インターロイキン２等）、種々の細菌、
ウィルス、血液凝固系因子（例えば、ＦＤＰ、ＦＤＰ−
Ｅ、Ｄダイマー、ＳＦＭＣ、フィブリノーゲン、フィブ
ロネクチン、凝固因子、プラスミノーゲン、アンチプラ
スミン、ＡＴ−III 、ｔ−ＰＡ、ＰＩＣ、ＴＡＴ、ＰＩ
ＶＫＡII等）、原虫（例えば、真菌、連鎖球菌、肝炎ウ
ィルス、ヘルペスウィルス、エイズウィルス、トキソプ
ラズマ原虫、マラリア原虫、赤痢アメーバー等）が挙げ
られる。これらのうち特に大量の被検体を短時間で測定
する必要のある血清タンパク質、腫瘍関連抗原、ウィル
ス、血液凝固系因子等が好適に適用できる。

【００２９】被測定抗体物質には、例えば、ウィルスに
対する抗体（例えば、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ等）、ＡＳ
Ｏ、ＲＦ、各種自己抗体、抗核抗体等が挙げられる。

【００３０】本発明の免疫分析用反応試薬を用いた免疫
分析法による被検試料中の成分の定量は、例えば次のよ
うにして行われる。まず、本発明の免疫分析用反応試薬
及び測定対象を含む試料を適当な緩衝液（例えば、ＴＥ
Ｓ緩衝液）中で混合し、抗原抗体反応を引き起こさせ、
それに伴うリポソームの凝集を形成させる。その凝集量
に依存した光の透過光の減少を分光光度計又は汎用生化
学自動分析機等により測定し、例えば予め作成した検量
線との照合により、試料中の測定対象物の量を測定する
ことができる。

【００３１】

【実施例】以下の実施例はリポソーム免疫分析法による
ＡＳＯ（ＳＬＯに対する抗体）検出用免疫分析用反応試
薬の製造（実施例１）、及びペプチドのリポソーム表面
への固相化（実施例２）に本発明を適用したものである
が、これらは単なる例示であり、本発明を限定するもの
ではない。

【００３２】〔実施例１〕本実施例１は免疫学的物質と
してＳＬＯ抗原を用い、固定化助剤として牛ＩｇＧタン
パク質を用いてＳＬＯをリポソームへ固定した免疫分析
用反応試薬の製造に関する。本実施例１で使用される材
料の略称、及び材料の調製方法は以下の通り定義され
る。 ＤＰＰＣ：ジパルミトイルフォスファチジルコリン Ｃｈｏｌ．：コレステロール ＤＴＰ−ＤＰＰＥ：ジチオピリジル化ジパルミトイルフ
ォスファチジルエタノールアミン ＳＰＤＰ：Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸 ＤＴＴ：ジチオスレイトール ＴＥＳ緩衝液：０．０１Ｍ ＴＥＳ，０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌからなる溶液 ＢＧＧ：牛血清から精製したＣｈｏｎ．Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎII分画 ＳＬＯ抗原：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓより培養し精製して得たもの（旭化成（株）製） Ａａｍ溶液：アクリルアミド及びＢｉｓ−アクリルアミ
ドを精製水に溶解し、ゲル濃度２．５％、架橋度５％に
なるように調整した溶液 （１）リポソームの調製 ＤＰＰＣ：５０μＭ、Ｃｈｏｌ：５０μＭ、ＤＴＰ−Ｄ
ＰＰＥ：５μＭのクロロホルム溶液を１００ｍｌ容ナシ
型フラスコに分注し、加温しながらエバポレーションし
てクロロホルムを留去した。このとき脂質及びコレステ
ロールはフラスコ内壁に薄膜を形成した。更にフラスコ
を１時間以上減圧下に置き、溶媒を完全に除去した。

【００３３】その後、２ｍｌのＡａｍ溶液、２ｇのガラ
スビーズを加え激しく撹拌して薄膜を剥がしとった。ガ
ラスビーズを除去した後、脂質懸濁液をエクストゥルー
ダーを用いて０．２μｍまでサイジングして粒径の均一
なリポソームを調製した。リポソームに内包されなかっ
たＡａｍ溶液はＴＥＳに一昼夜透析することによって除
去した。その後リン濃度を測定し１０ｍＭに調整した。

【００３４】（２）タンパク質の還元 タンパク質としてＢＧＧをＴＥＳ緩衝液に溶解後、タン
パク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整した。ＢＧＧ溶液１
ｍｌに１Ｍ ＤＴＴ２０ｕｌを加え、室温で３時間反応
させた。その後、ＴＥＳ緩衝液で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５（商品名、Pharmacia 社製）でゲル濾過
し、未反応のＤＴＴを除去した。得られたＢＧＧ溶液
は、ＴＥＳ緩衝液で希釈して濃度を２．０ｍｇ／ｍｌに
調整した。

【００３５】（３）固定化助剤（ＢＧＧ）結合リポソー
ムの調製 前記（１）で調製したリポソーム（リン濃度１０ｍＭ）
１ｍｌと前記（２）で調製したＢＧＧ溶液１ｍｌを混合
し、４℃で１６−２０時間転倒混和させながら反応させ
た。その後、ＴＥＳ緩衝液で平衡化したセファロースＣ
Ｌ−４Ｂ（商品名、Pharmacia 社製）でゲル濾過を行
い、未反応のＢＧＧを除去し、リポソーム分画を分取し
た。得られたＢＧＧが結合しているリポソームについて
リン定量を行い濃度を決定した後、ローリー法によりリ
ンあたりのタンパク質結合量を求めた。また、粒度分布
測定機（日キ装株式会社製：ＢＩ−９０）により粒径の
確認を行った。

【００３６】（４）ＢＧＧ結合リポソームへの反応基の
導入 前記（３）で作製したＢＧＧ結合結合リポソーム１ｍｌ
中の総タンパク質量１ｍｇあたり３０ｍＭ ＳＰＤＰ２
０ｕｌを加え、室温で３０分間反応させた。その後、未
反応のＳＰＤＰを１００倍以上のＴＥＳ緩衝液で透析す
ることにより除去した。その後リン濃度を測定し３．５
ｍＭとなるように調整した。

【００３７】（５）ＳＬＯ抗原の活性化 ＴＥＳ緩衝液にタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌになるよ
うに溶解したＳＬＯ抗原溶液１ｍｌにＤＴＴを終濃度１
０ｍＭになるように添加し、室温で３０分間反応させ
た。その後、ＴＥＳ緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５（商品名、Pharmacia 社製）でゲル濾過してＤ
ＴＴを除去した。得られた活性化ＳＬＯ抗原溶液はロー
リー法により、タンパク質量を測定し、濃度が７．０ｍ
ｇ／ｍｌになるように調整した。

【００３８】（６）ＳＬＯ抗原結合リポソームの調製 前記（４）のＳＰＤＰを導入したＢＧＧ結合リポソーム
１ｍｌと、前記（５）で調製した活性化ＳＬＯ抗原溶液
をそれぞれ１ｍＭリポソームあたりＡ：０．２ｍｇ，
Ｂ：０．４ｍｇ，Ｃ：０．８ｍｇを混合し、４℃で１６
−２０時間転倒混和させながら反応させた。その後、Ｔ
ＥＳ緩衝液で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂ（商品
名、Pharmacia 社製）でゲル濾過を行い、未反応のＳＬ
Ｏ抗原を除去し、リポソーム分画を分取した。得られた
リポソームについてリン定量を行い濃度を決定し、ＳＬ
Ｏ抗原量の異なる本実施例１のＳＬＯ抗原結合リポソー
ム試薬を３種類（Ａ、Ｂ、Ｃ）得た。

【００３９】（７）ＳＬＯ抗原感作量の測定、粒径の測
定、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後、
ＰＡＧＥ）、及びＡＳＯ（抗ＳＬＯ抗体）の測定 本実施例１の３種類のＳＬＯ抗原結合リポソーム試薬
（Ａ、Ｂ、Ｃ）について、ローリー法によりリン濃度１
ｍＭあたりのＳＬＯ抗原タンパク質結合量（感作量）を
求めた。また、粒度分布測定機によりその粒径の確認を
行った。各測定結果を下記表１に示す。使用したＳＬＯ
量及び総タンパク質結合量（感作量）も下記表１に併記
する。

【００４０】また、本実施例１の３種類のＳＬＯ抗原結
合リポソーム試薬（Ａ、Ｂ、Ｃ）についてＡＳＯの測定
を日立７１５０形自動分析機を用いて行った。パラメー
ターは本実施例１における検体（抗ＳＬＯ抗体量５５０
ＩＵ／ｍｌ）量１０μｌ、第１試薬（ＴＥＳ緩衝液１０
ｍＭ ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．５）３００μｌ、第２試
薬（各リポソーム試薬）１００μｌを用い、測定波長は
主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎｍを用い、測光ポイ
ントは２８ポイントと５０ポイントの２ポイント分析に
より約５分間吸光度変化量を求めた。測定結果を下記の
表２に示す。

【００４１】また、本実施例１−（Ｂ）のＳＬＯ抗原結
合リポソーム試薬についてサンプル対緩衝液を３：１と
し、２０ｕｌ／ｗｅｌｌでＣＢＣ染色してなるＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（４−１２％）を図１に示す。図１によれば、
本実施例１のリポソーム試薬はＳＬＯ抗原及びＢＧＧの
タンパク質バンドが共に確認される。

【００４２】〔比較例１〕 （１）リポソームの調製 前記実施例１−（１）と同じ操作を行ってリポソームを
調製した。

【００４３】（２）ＳＬＯ抗原の活性化 前記実施例１−（５）と同じ操作を行って活性化された
ＳＬＯ抗原溶液を得た。但し、最終タンパク質濃度を
４．０ｍｇ／ｍｌになるように調整した。

【００４４】（３）ＳＬＯ抗原結合リポソームの調製 本比較例１の前記（１）で調製したリポソームと前記
（２）で調製したＳＬＯ抗原を等量混合し、４℃で１６
−２０時間転倒混和させながら反応させた。その後、Ｔ
ＥＳ緩衝液で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂ（商品
名、Pharmacia 社製）でゲル濾過を行い、未反応のＳＬ
Ｏ抗原を除去し、リポソーム分画を分取した。得られた
リポソームについてリン定量を行い濃度を決定し、本比
較例１のＳＬＯ抗原結合リポソーム試薬を得た。

【００４５】（４）ＳＬＯ抗原感作量の測定、粒径の測
定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡＳＯ（抗ＳＬＯ抗体）の
測定 本比較例１のＳＬＯ抗原結合リポソーム試薬について、
ローリー法によりリン濃度１ｍＭあたりのＳＬＯ抗原タ
ンパク質結合量を求めた。また、粒度分布測定機により
その粒径の確認を行った。各測定結果を下記表１に示
す。使用したＳＬＯ量及び総タンパク質結合量（感作
量）も下記表１に併記する。

【００４６】また、本比較例１のＳＬＯ抗原結合リポソ
ーム試薬についてＡＳＯの測定を前記実施例１と同様に
して行い、その結果を下記の表２に示す。また、本比較
例１のＳＬＯ抗原結合リポソーム試薬のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを図１に示す。図１によれば、本比較例１のリポソー
ム試薬はＳＬＯ抗原のみのタンパク質バンドが確認され
る。

【００４７】〔比較例２〕前記実施例１−（１）から
（３）までと同様の操作のみ行い、ＢＧＧ結合リポソー
ム分画を得、本比較例２のＢＧＧ結合リポソーム試薬と
した。本比較例２のＢＧＧ結合リポソーム試薬について
粒度分布測定機によりその粒径を調べた結果を下記表１
に示す。また総タンパク質結合量（感作量）も下記表１
に併記する。

【００４８】また、本比較例２のＢＧＧ結合リポソーム
試薬についてＡＳＯの測定を前記実施例１と同様にして
行い、その結果を下記の表２に示す。また、本比較例２
のリポソーム試薬のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に示す。図
１によれば、本比較例２のリポソーム試薬はＢＧＧのみ
のタンパク質バンドが確認される。

【００４９】

【表１】

【００５０】表１によれば、前記実施例１−（Ｂ）のＳ
ＬＯ抗原結合リポソーム試薬と、前記比較例１のＳＬＯ
抗原結合リポソーム試薬に使用したＳＬＯ抗原量は同量
なのにも関わらず、実施例１−（Ｂ）に示す通り、ＢＧ
Ｇを介することにより１．５倍のＳＬＯ抗原がリポソー
ムに感作されたことが示されている。更に、ＢＧＧを介
することにより、ＳＬＯ抗原がＢＧＧを介さない方法の
半分の濃度で同等の感作量を得ることができることが分
かる。

【００５１】

【表２】

【００５２】表２によれば、前記実施例１−（Ｂ）５の
ＳＬＯ抗原結合リポソーム試薬と、前記比較例１のＳＬ
Ｏ抗原結合リポソーム試薬に使用したＳＬＯ抗原量は同
量なのにも関わらず、ＢＧＧを介することにより１．３
倍の吸光度変化量を得ることができたことを示す。更
に、ＢＧＧを介することにより、使用したＳＬＯ抗原が
半分の濃度で同等の吸光度変化量を得ることができるこ
とがわかる。また、前記比較例２では全く吸光度変化が
なく、前記実施例１ではＳＬＯ抗原に特異的な吸光度変
化量であることが確認された。

【００５３】〔実施例２〕本実施例２は、免疫学的物質
としてペプチドを用い、固定化助剤としてＢＧＧを用
い、該ＢＧＧを該ペプチドに結合させたものをリポソー
ムに固定した免疫分析用反応試薬の製造に関する。

【００５４】ＢＧＧ中のアミノ基の定量 ＢＧＧを用い、該タンパク質中のアミノ基をｏ−フタル
アルデヒド（略語：ＯＰＡ）法にて定量した。

【００５５】任意に希釈したサンプルおよびスタンダー
ド（０．１ｍＭ−１ｍＭグリシン溶液）１０μｌにＯＰ
Ａ溶液〔ＯＰＡ１２０ｍｇをエタノール１．５ｍｌに溶
解し、１２．５ｍＭホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．
４）１００ｍｌに加え、得られた溶液の１ｍｌに２−メ
ルカプトエタノール３μｌを加えた溶液〕１００μｌを
添加し、室温で１５分間反応させた後、０．５Ｍ Ｎａ
ＯＨ３ｍｌを加えて反応を停止した。この溶液に対して
励起光３４０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍでその蛍光強度
を測定し、検量線よりアミノ基の濃度を求め、一方で上
記サンプルのタンパク質濃度を既にキットとして市販さ
れているＢＣＡ Protein assay reagents(PIERCE 社
製）に従い測定した。これらの結果よりＢＧＧ１分子中
に３０分子のアミノ基が認められた。

【００５６】ペプチドとＢＧＧの結合 以下のようにしてカルボジイミド法にてＢＧＧに下記の
式（１）のペプチド

【００５７】

【化１】

【００５８】を感作させた。

【００５９】まずＢＧＧを精製水で溶解した。ＢＧＧ１
分子中３０分子のアミノ基が存在するため、ＢＧＧに対
してモル比で３０倍量の上記式（１）のペプチドを加
え、さらにペプチドに対してモル比で１００倍量のカル
ボジイミド（同仁化学研究所製）を加え、４℃で一晩放
置した。次にセファデックスＧ−２５（商品名、Pharma
cia 社製）でゲル濾過を行い未反応のペプチドを除去
し、ペプチド感作ＢＧＧを調製した。

【００６０】ペプチド感作ＢＧＧの抗体との反応性確認 ペプチド感作ＢＧＧをマイクロプレートに５０μｇ／ｗ
ｅｌｌにて４℃で一晩固定化し、その後０．５％ＢＳＡ
溶液を１５０μｌ／ｗｅｌｌにて３７℃で１時間ブロッ
キングを行った。洗浄液Ｉ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
溶液）で３回洗浄後、抗ペプチドモノクローナル抗体を
１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応させ
た。洗浄液Ｉで３回洗浄後、１０００倍希釈したアルカ
リフォスファターゼ標識抗体（ＴＡＧＯ社製）溶液を添
加し、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液II（１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３．４ｍ
ＭＥＤＴＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄
後、基質液（１５ｍＭ Ｎａ₂ ＣＯ₃ ，１０ｍＭ Ｎａ
ＨＣＯ₃ ，４．５ｍＭ フェニルフォスフェート−２−
ナトリウム，２ｍＭ ４−アミノアンチピリン）１００
μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた。最
後に発色液（０．８％メタ過ヨウ素酸ナトリウム）５０
μｌ／ｗｅｌｌを添加して発色を波長４９０ｎｍ／６２
０ｎｍの吸光度で確認した。

【００６１】ＢＧＧへのＳＰＤＰ導入条件の決定 ＢＧＧをＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて１０ｍｇ／ｍ
ｌに調整し、この溶液１ｍｌ毎に３０ｍＭ ＳＰＤＰ溶
液を５，１０，２０，４０μｌ加え、室温で１時間反応
後、セファデックスＧ−２５（商品名、Pharmacia 社
製）でゲル濾過を行い未反応のＳＰＤＰを除去した。次
にＳＰＤＰ導入ＢＧＧをＤＴＴで還元し、遊離したジチ
オピリジル基を３４３ｎｍの吸光度で定量した。その結
果、検量線よりＢＧＧ１分子あたり５分子のＳＰＤＰを
導入するために必要な３０ｍＭ ＳＰＤＰ溶液量を決定
した。

【００６２】還元化条件の決定 導入された全てのＳＰＤＰを還元するために還元化条件
の決定を以下のようにして行った。

【００６３】即ち、ＳＰＤＰ導入ＢＧＧ（ＳＰＤＰ−Ｂ
ＧＧ）のバッファーを酢酸バッファー（ｐＨ４．５）に
交換し、タンパク質濃度を２．５ｍｇ／ｍｌに調整し、
このＳＰＤＰ溶液５００μｌに対して５，１０，２０ｍ
Ｍ ＤＴＴ溶液を２５μｌ混合し、室温で３０分間反応
させた。分解産物のジチオピリジル基をセファデックス
Ｇ−２５（商品名、Pharmacia 社製）でゲル濾過により
除去後、０．５ｍｇ／ｍｌ還元化ＳＰＤＰ−ＢＧＧを得
た。還元化ＳＰＤＰ−ＢＧＧ２．０ｍｌに対して５ｍＭ
４，４′−ジチオジピリジン溶液を８０μｌ添加し、
室温で３０分反応後、反応産物の４−チオピリドンを３
２４ｎｍの吸光度で定量することにより、還元化ＳＰＤ
Ｐ−ＢＧＧのチオール基の定量とし、還元化条件を決定
した。

【００６４】ペプチド感作ＢＧＧのリポソーム感作 ペプチド感作ＢＧＧにＳＰＤＰを導入し、還元後、あら
かじめリポソームに導入してあるジチオピリジル基との
交換反応によりペプチド感作ＢＧＧをリポソームへ以下
のようにして感作した（リポソーム組成は前記実施例１
と同様のものを用いた）。

【００６５】即ち、前記ＢＧＧへのＳＰＤＰ導入条件の
決定で得られた結果より、１０ｍｇ／ｍｌペプチド感作
ＢＧＧ２．２ｍｌに３０ｍＭ ＳＰＤＰ４０μｌ加え、
室温で１時間反応させた。次に、セファデックスＧ−２
５（商品名、Pharmacia 社製）を用いたゲル濾過によ
り、未反応のＳＰＤＰを除去し濃縮した後、前記還元化
条件の決定で得られた結果に従い、１０．７５ｍｇ／ｍ
ｌペプチド感作ＢＧＧ−ＳＰＤＰ２．０ｍｌに３０ｍＭ
ＤＴＴ２９１μｌ加え、室温で３０分反応させた後、
セファデックスＧ−２５（商品名、Pharmacia 社製）を
用いたゲル濾過によりＤＴＴを除去した。

【００６６】次にこの還元化ペプチド感作ＢＧＧ−ＳＰ
ＤＰと１０ｍＭリポソーム溶液を１：１で混合し、４℃
一晩放置した後、未反応のペプチド感作ＢＧＧ−ＳＰＤ
ＰをセファロースＣＬ−４Ｂ（商品名、Pharmacia 社
製）を用いたゲル濾過で除去した。

【００６７】リポソームのペプチド感作ＢＧＧ−ＳＰＤ
Ｐ感作量の測定 リポソームへ感作されたペプチド感作ＢＧＧ−ＳＰＤＰ
量をタンパク質定量により、リポソームあたりの感作量
を以下のようにして求めた。

【００６８】即ち、タンパク質定量は既にキットとして
市販されているＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＰＩＥ
ＲＣＥ社製）を用いて定量した。その結果、単位リン量
（μｍｏｌ）あたり０．４−０．６ｍｇのタンパク質が
感作されていることが確認された。さらにこのときのリ
ポソームの粒径が感作前の状態で１０９ｎｍであったも
のが、感作後２００ｎｍ前後まで増加していることが確
認されたことからも、ＢＧＧを介してペプチドが感作さ
れていることが確認された。

【００６９】〔比較例３〕前記実施例１の（１）と同様
の組成の１０ｍＭ リポソーム懸濁液１ｍｌに前記実施
例２と同様のペプチドのＣ末端にシステインを導入した
もの２ｍｇ／ｍｌを等量混合し、４℃で一晩反応させ
た。反応後、リポソームは自然凝集し、ペプチド結合リ
ポソームを安定な状態で得ることができなかった。

【００７０】

【発明の効果】叙上の如く調製された本発明の免疫分析
用反応試薬及びその製造方法によれば、本発明の免疫分
析用反応試薬は、リポソームにタンパク質関連物質から
なる免疫学的物質が固定化されているにも関わらず、該
タンパク質関連物質の帯電傾向の影響が減じられ、リポ
ソームとの電気的反発が緩和されて、該タンパク質関連
物質のリポソームへの固定化を効率よく行なうことがで
き、その結果、本発明の免疫分析用反応試薬を用いた測
定は高感度である。

【００７１】また、本発明の免疫分析用反応試薬は、水
溶性ペプチド、水溶性ポリペプチド又は水溶性タンパク
質等の水溶性タンパク質等関連物質がリポソームに固定
されてなる場合でも、リポソーム自体が凝集を生じるこ
となく、免疫分析用反応試薬としての保存性が優れ、そ
の結果、本発明の免疫分析用反応試薬を用いた測定は高
感度である。

【００７２】本発明の免疫分析用反応試薬は、担体とし
てリポソームが使用されているので、短波長での測定が
可能で、測定装置のセル汚損性が低く、自動分析機によ
る測定が可能であるため、大量の検体を一度に短時間で
測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１−（Ｂ）のＳＬＯ抗原結合リポソーム
試薬についてサンプル対緩衝液を３：１とし、２０ｕｌ
／ｗｅｌｌでＣＢＣ染色してなるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４
−１２％）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅田 衛 茨城県結城市北南茂呂1075−２ 日水製薬 株式会社診断薬研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リポソームにペプチド、ポリペプチド又
   はタンパク質からなる免疫学的物質が固定化されてなる
   免疫分析用反応試薬の製造方法において、 免疫学的物質を不活性化させない性質と免疫学的物質の
   リポソームへの固定化を促進する性質を併有する、リポ
   ソームを安定化させる物質を用いて、リポソームへ免疫
   学的物質を固定することを特徴とする免疫分析用反応試
   薬の製造方法。
2. 【請求項２】 リポソームにペプチド、ポリペプチド又
   はタンパク質からなる免疫学的物質が固定化されてなる
   免疫分析用反応試薬の製造方法において、 免疫学的物質を不活性化させない性質と免疫学的物質の
   リポソームへの固定化を促進する性質を併有する、リポ
   ソームを安定化させる物質をリポソームに固定化した
   後、得られたリポソームに免疫学的物質を固定化するこ
   とを特徴とする免疫分析用反応試薬の製造方法。
3. 【請求項３】 リポソームに水溶性ペプチド、水溶性ポ
   リペプチド又は水溶性タンパク質からなる水溶性免疫学
   的物質が固定化されてなる免疫分析用反応試薬の製造方
   法において、 水溶性免疫学的物質を不活性化させない性質と水溶性免
   疫学的物質のリポソームへの固定化を促進する性質を併
   有する、リポソームを安定化させる物質に対して水溶性
   免疫学的物質を固定化した後、得られたリポソームを安
   定化させる物質をリポソームに固定化することを特徴と
   する免疫分析用反応試薬の製造方法。
4. 【請求項４】 前記免疫学的物質を不活性化させない性
   質と免疫学的物質のリポソームへの固定化を促進する性
   質を併有する、リポソームを安定化させる物質は、アミ
   ノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、並びにア
   ミノ基或いはカルボキシル基を含む合成高分子化合物か
   ら選ばれたものであることを特徴とする請求項１、２又
   は３記載の免疫分析用反応試薬の製造方法。
5. 【請求項５】 前記請求項１、２、３又は４記載の免疫
   分析用反応試薬の製造方法により得られたことを特徴と
   する免疫分析用反応試薬。
6. 【請求項６】 前記免疫分析用反応試薬が抗原抗体反応
   で生じた凝集量を測定するために使用されることを特徴
   とする請求項５記載の免疫分析用反応試薬。