JPH09308482A - 植物プロトプラストの選抜方法 - Google Patents
植物プロトプラストの選抜方法Info
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- JPH09308482A JPH09308482A JP8125390A JP12539096A JPH09308482A JP H09308482 A JPH09308482 A JP H09308482A JP 8125390 A JP8125390 A JP 8125390A JP 12539096 A JP12539096 A JP 12539096A JP H09308482 A JPH09308482 A JP H09308482A
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- plant
- protoplasts
- protoplast
- cell
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- Pending
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 双子葉植物及び単子葉植物を材料として得ら
れたプロトプラストの選抜方法において、その細胞分裂
能が高く、また遺伝子導入効率の優れたプロトプラスト
を簡便かつ迅速に、しかも多量に選抜する。 【解決手段】 まず完熟種子からカルスを誘導し、その
カルスをＲ２液体培地に移して振とう培養した後、ＭＳ
液体培地で培養し、培養細胞を酵素処理することにより
プロトプラストを単離する。単離したプロトプラストを
遠心加速度と流れの力を利用して細胞を連続的に分離す
るＣＣＥ法を用いて大きさの差により分離する。
れたプロトプラストの選抜方法において、その細胞分裂
能が高く、また遺伝子導入効率の優れたプロトプラスト
を簡便かつ迅速に、しかも多量に選抜する。 【解決手段】 まず完熟種子からカルスを誘導し、その
カルスをＲ２液体培地に移して振とう培養した後、ＭＳ
液体培地で培養し、培養細胞を酵素処理することにより
プロトプラストを単離する。単離したプロトプラストを
遠心加速度と流れの力を利用して細胞を連続的に分離す
るＣＣＥ法を用いて大きさの差により分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、双子葉植物及び
単子葉植物においてこれらの植物からプロトプラストを
単離することが可能であり、品種改良のためこれらの植
物から単離したプロトプラストに効率的に有用遺伝子を
導入し、かつ導入後のプロトプラストの細胞分裂能が高
いプロトプラストを選別するための方法に関するもので
ある。また遺伝子導入に限らず、異なった２種類の植物
から調製したプロトプラストを融合して培養することに
よって全く新しい植物を創成する場合にも有効な方法で
ある。
単子葉植物においてこれらの植物からプロトプラストを
単離することが可能であり、品種改良のためこれらの植
物から単離したプロトプラストに効率的に有用遺伝子を
導入し、かつ導入後のプロトプラストの細胞分裂能が高
いプロトプラストを選別するための方法に関するもので
ある。また遺伝子導入に限らず、異なった２種類の植物
から調製したプロトプラストを融合して培養することに
よって全く新しい植物を創成する場合にも有効な方法で
ある。
【０００２】
【従来の技術】 植物の品種改良には従来人工交配が行
われていた。この方法は、人手や昆虫等により受粉させ
良い形質を持った植物を選抜するというたいへんな労力
と時間を必要とするばかりでなく、同種間の植物また
は、近縁種の植物に限られていた。最近、植物において
も分子生物学を利用した技術が導入されており、病害虫
に強い、寒さに強い等の有益な遺伝子を直接細胞に導入
する遺伝子導入法が新しい植物体作製のための技術とし
て用いられてきている。植物細胞には動物細胞と違い細
胞膜の外側に細胞壁があり、この状態では遺伝子導入法
は使用できない。このため、細胞壁の主成分であるセル
ロースを溶かすセルラーゼなどの酵素を用いて細胞壁を
溶かし、細胞壁のないプロトプラストという状態にする
ことにより遺伝子導入法が可能となる。このようなプロ
トプラストから植物体を再生することが可能になれば、
これまでになかった全く新しい植物だけではなく、われ
われ人類の使用目的に合致した、例えば農作物の場合に
は収量の高い、味の良い、さらには病害虫や気候的な被
害に耐えることが可能な品種を作り出すことが出来るよ
うになる。
われていた。この方法は、人手や昆虫等により受粉させ
良い形質を持った植物を選抜するというたいへんな労力
と時間を必要とするばかりでなく、同種間の植物また
は、近縁種の植物に限られていた。最近、植物において
も分子生物学を利用した技術が導入されており、病害虫
に強い、寒さに強い等の有益な遺伝子を直接細胞に導入
する遺伝子導入法が新しい植物体作製のための技術とし
て用いられてきている。植物細胞には動物細胞と違い細
胞膜の外側に細胞壁があり、この状態では遺伝子導入法
は使用できない。このため、細胞壁の主成分であるセル
ロースを溶かすセルラーゼなどの酵素を用いて細胞壁を
溶かし、細胞壁のないプロトプラストという状態にする
ことにより遺伝子導入法が可能となる。このようなプロ
トプラストから植物体を再生することが可能になれば、
これまでになかった全く新しい植物だけではなく、われ
われ人類の使用目的に合致した、例えば農作物の場合に
は収量の高い、味の良い、さらには病害虫や気候的な被
害に耐えることが可能な品種を作り出すことが出来るよ
うになる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】 本発明は、双子葉植
物及び単子葉植物を材料として得られたプロトプラスト
の選抜方法において、その細胞分裂能が高く、また遺伝
子導入効率の優れたプロトプラストを簡便かつ迅速に、
しかも多量に選抜することを目的とする。
物及び単子葉植物を材料として得られたプロトプラスト
の選抜方法において、その細胞分裂能が高く、また遺伝
子導入効率の優れたプロトプラストを簡便かつ迅速に、
しかも多量に選抜することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】 本発明者らは双子葉植
物及び単子葉植物を材料として得られたプロトプラスト
のうち、その大きさがより大きいプロトプラストのほう
が遺伝子導入効率が高いことを発見した。このプロトプ
ラストを大きさの差に応じて分離し、このうちより大き
いプロトプラストを用いることにより、遺伝子導入効率
は３倍向上した。すなわち、遠心力と流れの力を利用し
て連続的に細胞を分離する、一般にカウンターフロー遠
心エルトリエーション法（以下ＣＣＥ法と呼ぶ）と呼ば
れる方法を利用して、プロトプラストを大きさの違いに
より分離することにより、細胞分裂能が高く、また遺伝
子導入効率の優れたプロトプラストを簡便かつ迅速に、
しかも多量に分離することが可能となり、植物の品種改
良の効率向上を図ることができる。
物及び単子葉植物を材料として得られたプロトプラスト
のうち、その大きさがより大きいプロトプラストのほう
が遺伝子導入効率が高いことを発見した。このプロトプ
ラストを大きさの差に応じて分離し、このうちより大き
いプロトプラストを用いることにより、遺伝子導入効率
は３倍向上した。すなわち、遠心力と流れの力を利用し
て連続的に細胞を分離する、一般にカウンターフロー遠
心エルトリエーション法（以下ＣＣＥ法と呼ぶ）と呼ば
れる方法を利用して、プロトプラストを大きさの違いに
より分離することにより、細胞分裂能が高く、また遺伝
子導入効率の優れたプロトプラストを簡便かつ迅速に、
しかも多量に分離することが可能となり、植物の品種改
良の効率向上を図ることができる。
【０００５】
【発明の実施の形態】 以下に本発明の実施例を挙げて
具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
るものではない。
具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
るものではない。
【０００６】本実施例で採用したプロトプラストの分離
プロセスのフローの１例を図１に示す。本実施例では、
まず完熟種子からカルスを誘導し、そのカルスをＲ２液
体培地（Ohiraら(1973) Plant Cell Physiol. 14，1113
-1121）に移して振とう培養した後、ＭＳ液体培地（Mur
ashige＆ Skoog(1962) Physiol.Plant. 15，473-479）
で培養し、培養細胞を酵素処理することによりプロトプ
ラストを単離する。単離したプロトプラストを遠心加速
度と流れの力を利用して細胞を連続的に分離するＣＣＥ
法を用いて大きさの差により分離する。分離したプロト
プラストを培養または遺伝子導入を行う。
プロセスのフローの１例を図１に示す。本実施例では、
まず完熟種子からカルスを誘導し、そのカルスをＲ２液
体培地（Ohiraら(1973) Plant Cell Physiol. 14，1113
-1121）に移して振とう培養した後、ＭＳ液体培地（Mur
ashige＆ Skoog(1962) Physiol.Plant. 15，473-479）
で培養し、培養細胞を酵素処理することによりプロトプ
ラストを単離する。単離したプロトプラストを遠心加速
度と流れの力を利用して細胞を連続的に分離するＣＣＥ
法を用いて大きさの差により分離する。分離したプロト
プラストを培養または遺伝子導入を行う。
【０００７】ＣＣＥ法を図２〜図５を用いて説明する。
ＣＣＥ法は、図４に示すように、試料に遠心力を付与す
るために高速回転するロータプレート５と、このロータ
プレート５の内部に設けられた前記試料を遠心分離する
分離チャンバ７と、この分離チャンバ７とロータ軸心対
称位置に配され、分離チャンバ７とほぼ同形状のカウン
タバランサ８と、この分離チャンバ７に連続的に試料を
注入する試料注入路１２と、該分離チャンバ７から連続
的に試料を排出する試料排出路１３と、該試料注入路１
２と試料排出路１３を内蔵するシャフト１０、試料を分
離チャンバ７に注入するためのポンプ１８から構成され
ている機器と、ロータプレート５を高速回転させる遠心
分離機（図示せず）と分離されたサンプルをフラクショ
ンとして回収するためのプラスチック製等のフラクショ
ンの本数分のチューブ１９から構成される。ロータプレ
ート５は、透明な分離チャンバ７とカウンタバランサ８
及びパイプ９、１１を保持した状態で遠心分離機のカッ
プリング６上に載置し、この状態で遠心分離機のモータ
（図示せず）による回転力を受けて高速回転する。この
ロータプレート５のロータ軸心対称位置には、図５に示
すように、ロータ軸心と平行に埋設された分離チャンバ
受容部１４とカウンタバランサ受容部１５がそれぞれ分
離チャンバ７とカウンタバランサ８をその内部に収納す
るために設けられている。また、分離チャンバ受容部１
４とカウンタバランサ受容部１５との間には、パイプ受
容部１６が設けられている。
ＣＣＥ法は、図４に示すように、試料に遠心力を付与す
るために高速回転するロータプレート５と、このロータ
プレート５の内部に設けられた前記試料を遠心分離する
分離チャンバ７と、この分離チャンバ７とロータ軸心対
称位置に配され、分離チャンバ７とほぼ同形状のカウン
タバランサ８と、この分離チャンバ７に連続的に試料を
注入する試料注入路１２と、該分離チャンバ７から連続
的に試料を排出する試料排出路１３と、該試料注入路１
２と試料排出路１３を内蔵するシャフト１０、試料を分
離チャンバ７に注入するためのポンプ１８から構成され
ている機器と、ロータプレート５を高速回転させる遠心
分離機（図示せず）と分離されたサンプルをフラクショ
ンとして回収するためのプラスチック製等のフラクショ
ンの本数分のチューブ１９から構成される。ロータプレ
ート５は、透明な分離チャンバ７とカウンタバランサ８
及びパイプ９、１１を保持した状態で遠心分離機のカッ
プリング６上に載置し、この状態で遠心分離機のモータ
（図示せず）による回転力を受けて高速回転する。この
ロータプレート５のロータ軸心対称位置には、図５に示
すように、ロータ軸心と平行に埋設された分離チャンバ
受容部１４とカウンタバランサ受容部１５がそれぞれ分
離チャンバ７とカウンタバランサ８をその内部に収納す
るために設けられている。また、分離チャンバ受容部１
４とカウンタバランサ受容部１５との間には、パイプ受
容部１６が設けられている。
【０００８】ＣＣＥ法の装置は回転している分離チャン
バ内の試料に遠心力とこれと反対方向から与えた流れの
力を作用させ、両者のつりあう位置が試料の大きさによ
って異なることを利用して分離するというものである。
このため、常に遠心力と反対方向に流れの力を作用させ
なければならないため、ロータプレート５に対して常時
外部から所定量の液体を注入させなければならない。従
って、従来からこの種のシステムは、試料注入路１２と
試料排出路１３を内臓するシャフト１０は、当然、非回
転状態に保たなければ液体を連続的に注入及び排出する
ことは困難であるため、回転状態にあるロータプレート
５との接合部分には面シール方式を採用している。
バ内の試料に遠心力とこれと反対方向から与えた流れの
力を作用させ、両者のつりあう位置が試料の大きさによ
って異なることを利用して分離するというものである。
このため、常に遠心力と反対方向に流れの力を作用させ
なければならないため、ロータプレート５に対して常時
外部から所定量の液体を注入させなければならない。従
って、従来からこの種のシステムは、試料注入路１２と
試料排出路１３を内臓するシャフト１０は、当然、非回
転状態に保たなければ液体を連続的に注入及び排出する
ことは困難であるため、回転状態にあるロータプレート
５との接合部分には面シール方式を採用している。
【０００９】ＣＣＥ法での細胞の分離ではまず、図２に
示すように、ロータプレート５内の分離チャンバ７に分
離する試料に適した、例えば培地または試料と浸透圧の
等しい液体２０を試料を含まない状態で分離チャンバ７
内に一定の流量でポンプ１８を使って送り込みながら、
該ロータプレート５を高速回転させる。そこに培地また
は試料と浸透圧の等しい液体に浮遊した試料を分離チャ
ンバ７内に注入すると、分離チャンバ７内で試料は、そ
の密度や大きさに応じて遠心力による沈降速度と流れの
力がバランスする位置に静止する。つまり、大きさの大
きい試料は半径方向の外側に、大きさの小さい試料は半
径方向側に集まる。試料がそれぞれバランスしたこの状
態から液体の流れの力を上げる、つまり流量を増やす
か、回転数を落とすことにより、大きさの小さい試料か
ら分離チャンバ７を流出し、順次フラクションとしてチ
ューブに回収され、大きさ別に分離される。以下各工程
についてイネ（“朝の光”）のプロトプラストを用いて
詳述する。
示すように、ロータプレート５内の分離チャンバ７に分
離する試料に適した、例えば培地または試料と浸透圧の
等しい液体２０を試料を含まない状態で分離チャンバ７
内に一定の流量でポンプ１８を使って送り込みながら、
該ロータプレート５を高速回転させる。そこに培地また
は試料と浸透圧の等しい液体に浮遊した試料を分離チャ
ンバ７内に注入すると、分離チャンバ７内で試料は、そ
の密度や大きさに応じて遠心力による沈降速度と流れの
力がバランスする位置に静止する。つまり、大きさの大
きい試料は半径方向の外側に、大きさの小さい試料は半
径方向側に集まる。試料がそれぞれバランスしたこの状
態から液体の流れの力を上げる、つまり流量を増やす
か、回転数を落とすことにより、大きさの小さい試料か
ら分離チャンバ７を流出し、順次フラクションとしてチ
ューブに回収され、大きさ別に分離される。以下各工程
についてイネ（“朝の光”）のプロトプラストを用いて
詳述する。
【００１０】（実施例１） プロトプラストをＣＣＥ法
によりそのサイズに応じて分離し、それらを培養した例 供試植物 イネ（“朝の光”） 完熟種子からのカルスの誘導 “朝の光”の完熟種子の穎を剥離した後、７０％エタノ
ールに５分、２％次亜塩素酸ナトリウムに２０分間浸し
殺菌した。この種子を０.３％ゲルライトで固めた３％
ショ糖及び２mg/l２,４-ジクロロフェノキシ酢酸（２,
４-Ｄ）を含むＭＳ培地に置床し、２５℃の暗黒下で約
１ヶ月間培養して発芽させ、この胚軸よりカルスを誘導
した。カルスは、１mg/l ２,４-Ｄと３％ショ糖を含む
Ｒ２液体培地に懸濁し、２５℃の暗黒下１００rpmの旋
回培養を２週間行い、培養細胞を得た。
によりそのサイズに応じて分離し、それらを培養した例 供試植物 イネ（“朝の光”） 完熟種子からのカルスの誘導 “朝の光”の完熟種子の穎を剥離した後、７０％エタノ
ールに５分、２％次亜塩素酸ナトリウムに２０分間浸し
殺菌した。この種子を０.３％ゲルライトで固めた３％
ショ糖及び２mg/l２,４-ジクロロフェノキシ酢酸（２,
４-Ｄ）を含むＭＳ培地に置床し、２５℃の暗黒下で約
１ヶ月間培養して発芽させ、この胚軸よりカルスを誘導
した。カルスは、１mg/l ２,４-Ｄと３％ショ糖を含む
Ｒ２液体培地に懸濁し、２５℃の暗黒下１００rpmの旋
回培養を２週間行い、培養細胞を得た。
【００１１】プロトプラストの単離 培養細胞を１mg/l ２,４-Ｄと６％ショ糖を含むＭＳ液
体培地に移し３日培養後、細胞を低速遠心（８００rp
m，３分）により集め、プロトプラスト洗浄液で一度洗
浄した後、細胞間物質であるペクチンを分解する酵素と
してペクトリアーゼ、細胞壁を分解する酵素としてセル
ラーゼ、そしてマンニトール、デキストラン硫酸ナトリ
ウム、塩化カルシウムを含む酵素液を加え、３０℃，３
０rpm，１時間振とうした後、３０℃，３時間静置し
た。処理後、３０μｍ径のナイロンメッシュを通し、プ
ロトプラストを単離した。
体培地に移し３日培養後、細胞を低速遠心（８００rp
m，３分）により集め、プロトプラスト洗浄液で一度洗
浄した後、細胞間物質であるペクチンを分解する酵素と
してペクトリアーゼ、細胞壁を分解する酵素としてセル
ラーゼ、そしてマンニトール、デキストラン硫酸ナトリ
ウム、塩化カルシウムを含む酵素液を加え、３０℃，３
０rpm，１時間振とうした後、３０℃，３時間静置し
た。処理後、３０μｍ径のナイロンメッシュを通し、プ
ロトプラストを単離した。
【００１２】ＣＣＥ法によるプロトプラストの分離 プロトプラストの粒径を画像処理装置を用いて測定した
ところ、図６の１に示すようにＣＣＥ法で分離していな
いプロトプラストは１０〜２５μｍの細胞径の幅がある
ことがわかった。これを基にＣＣＥ法での分離条件を、
日立エルトリエータロータ細胞分離システムの取り扱い
説明書により算出し（図７）、日立エルトリエータロー
タ細胞分離システム Ｒ５Ｅ形エルトリエータロータで
分離をした。つまり、回転数１５００rpm，初期流量３m
l／minで、試料を含んだプロトプラストと浸透圧の等し
い０.５Ｍマンニトールのバッファ液を分離チャンバ内
７に送り、その後順次流量を図７の通り上げることによ
り、プロトプラストを大きさの小さいものから順番に流
出させた。その結果、図８の２，３，４に示すようにプ
ロトプラストをサイズに応じて２の“小プロトプラスト
（平均細胞径１１.１μｍ）”、３の“中プロトプラス
ト（平均細胞径１５.４μｍ）”、４の“大プロトプラ
スト４（平均細胞径１７.５μｍ）の３つの細胞群に分
離することができた。
ところ、図６の１に示すようにＣＣＥ法で分離していな
いプロトプラストは１０〜２５μｍの細胞径の幅がある
ことがわかった。これを基にＣＣＥ法での分離条件を、
日立エルトリエータロータ細胞分離システムの取り扱い
説明書により算出し（図７）、日立エルトリエータロー
タ細胞分離システム Ｒ５Ｅ形エルトリエータロータで
分離をした。つまり、回転数１５００rpm，初期流量３m
l／minで、試料を含んだプロトプラストと浸透圧の等し
い０.５Ｍマンニトールのバッファ液を分離チャンバ内
７に送り、その後順次流量を図７の通り上げることによ
り、プロトプラストを大きさの小さいものから順番に流
出させた。その結果、図８の２，３，４に示すようにプ
ロトプラストをサイズに応じて２の“小プロトプラスト
（平均細胞径１１.１μｍ）”、３の“中プロトプラス
ト（平均細胞径１５.４μｍ）”、４の“大プロトプラ
スト４（平均細胞径１７.５μｍ）の３つの細胞群に分
離することができた。
【００１３】プロトプラストの培養 大、中、小の３つの細胞群に分離したプロトプラストを
１０６個/mlの濃度で、予め４５℃で保温しておいたア
ガロース培地に懸濁し、径６cmのプラスチックシャーレ
に１mlずつプレートし、２５℃暗黒下 ３０rpm Ｒ２液
体培地中で振とう培養した。１週間毎に分裂したプロト
プラストの数を数え、細胞分裂率を算出した。その結
果、図９の２，３，４で示したＣＣＥ法により分離した
小、中、大３つのプロトプラストと、図９の１で示した
ＣＣＥ法で分離していないプロトプラストの細胞分裂率
を比較が得られた。ここで縦軸は細胞分裂率を示し、横
軸は培養期間を示す。この結果より、図９の４で示した
大プロトプラストではその細胞分裂率が図９の１で示し
たＣＣＥ法で分離していないプロトプラストの２倍高い
値であった。
１０６個/mlの濃度で、予め４５℃で保温しておいたア
ガロース培地に懸濁し、径６cmのプラスチックシャーレ
に１mlずつプレートし、２５℃暗黒下 ３０rpm Ｒ２液
体培地中で振とう培養した。１週間毎に分裂したプロト
プラストの数を数え、細胞分裂率を算出した。その結
果、図９の２，３，４で示したＣＣＥ法により分離した
小、中、大３つのプロトプラストと、図９の１で示した
ＣＣＥ法で分離していないプロトプラストの細胞分裂率
を比較が得られた。ここで縦軸は細胞分裂率を示し、横
軸は培養期間を示す。この結果より、図９の４で示した
大プロトプラストではその細胞分裂率が図９の１で示し
たＣＣＥ法で分離していないプロトプラストの２倍高い
値であった。
【００１４】（実施例２） プロトプラストをＣＣＥ法
によりそのサイズに応じて分離し、エレクトロポレーシ
ョン法を用いて遺伝子導入を行った例 上記〜までは実施例１と同様である エレクトロポレーション法によるプロトプラストへの
遺伝子導入 レポーター遺伝子としてβーグルクロニダーゼ（以後Ｇ
ＵＳと略す）遺伝子を用い、発現プラスミド、即ち、カ
リフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御
下に置かれたＧＵＳ遺伝子をｐＵＣ１９のマルチクロー
ニングサイトに挿入したｐＢＩ２２１プラスミドを大腸
菌を用いて増幅し、抽出精製した。本プラスミド１０μ
ｇをプロトプラスト１.５×１０６個に、３７５Ｖ／c
m、２２０μＦ、１回の条件でエレクトロポレーション
法により導入した。導入後２４時間培養し、その抽出液
を用いてＧＵＳにより生じる４ーメチルーウンベリフェ
ロンの蛍光強度（励起波長：３６５ｎｍ、発光波長：４
４８−４５０ｎｍ）を測定することにより比較した。図
１０はその測定結果であり、図中１で示したＣＣＥ法で
分離していないプロトプラストに導入したＧＵＳ遺伝子
の活性値を１とし、それを基準として図１０の２，３，
４で示したＣＣＥ法で分離した小、中、大それぞれのプ
ロトプラストの活性値を換算し、グラフに表したもので
ある。図１０の４で示した大プロトプラストはその遺伝
子導入効率が、図１０の１で示したＣＣＥ法で分離して
いないプロトプラストの３倍高い値であった。
によりそのサイズに応じて分離し、エレクトロポレーシ
ョン法を用いて遺伝子導入を行った例 上記〜までは実施例１と同様である エレクトロポレーション法によるプロトプラストへの
遺伝子導入 レポーター遺伝子としてβーグルクロニダーゼ（以後Ｇ
ＵＳと略す）遺伝子を用い、発現プラスミド、即ち、カ
リフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御
下に置かれたＧＵＳ遺伝子をｐＵＣ１９のマルチクロー
ニングサイトに挿入したｐＢＩ２２１プラスミドを大腸
菌を用いて増幅し、抽出精製した。本プラスミド１０μ
ｇをプロトプラスト１.５×１０６個に、３７５Ｖ／c
m、２２０μＦ、１回の条件でエレクトロポレーション
法により導入した。導入後２４時間培養し、その抽出液
を用いてＧＵＳにより生じる４ーメチルーウンベリフェ
ロンの蛍光強度（励起波長：３６５ｎｍ、発光波長：４
４８−４５０ｎｍ）を測定することにより比較した。図
１０はその測定結果であり、図中１で示したＣＣＥ法で
分離していないプロトプラストに導入したＧＵＳ遺伝子
の活性値を１とし、それを基準として図１０の２，３，
４で示したＣＣＥ法で分離した小、中、大それぞれのプ
ロトプラストの活性値を換算し、グラフに表したもので
ある。図１０の４で示した大プロトプラストはその遺伝
子導入効率が、図１０の１で示したＣＣＥ法で分離して
いないプロトプラストの３倍高い値であった。
【００１５】
【発明の効果】 本発明により選抜したプロトプラスト
は、細胞分裂率が選抜していないプロトプラストの２倍
高いプロトプラストであるばかりでなく遺伝子導入効率
も３倍高いことから、新しい植物の創成を効率的に行う
ことが可能となる。また本発明は、遺伝子導入法に限ら
ず細胞融合法においても有効である。更に、プロトプラ
ストからの細胞分裂がほとんど見られない植物に対して
も、本発明により細胞分裂率が向上すれば、品種改良が
困難であった植物にも新しい植物体創成の可能性が生じ
る。
は、細胞分裂率が選抜していないプロトプラストの２倍
高いプロトプラストであるばかりでなく遺伝子導入効率
も３倍高いことから、新しい植物の創成を効率的に行う
ことが可能となる。また本発明は、遺伝子導入法に限ら
ず細胞融合法においても有効である。更に、プロトプラ
ストからの細胞分裂がほとんど見られない植物に対して
も、本発明により細胞分裂率が向上すれば、品種改良が
困難であった植物にも新しい植物体創成の可能性が生じ
る。
【図１】プロトプラストの分離プロセスのフロー図。
【図２】カウンターフロー遠心エルトリエーション法で
使用する装置構成の一実施例を示す図。
使用する装置構成の一実施例を示す図。
【図３】カウンターフロー遠心エルトリエーション法で
使用するローターの一実施例を示す模式図。
使用するローターの一実施例を示す模式図。
【図４】カウンターフロー遠心エルトリエーション法で
使用するローターの一実施例を示す縦断面図。
使用するローターの一実施例を示す縦断面図。
【図５】カウンターフロー遠心エルトリエーション法で
使用するローターの一実施例を示す斜視図。
使用するローターの一実施例を示す斜視図。
【図６】プロトプラストの細胞径の分布図。
【図７】プロトプラストの分離条件を示す図。
【図８】カウンターフロー遠心エルトリエーション法で
分離した後のプロトプラストの分布図。
分離した後のプロトプラストの分布図。
【図９】大きさの違いによるプロトプラストの細胞分裂
率の比較を示す図。
率の比較を示す図。
【図１０】大きさの違いによるプロトプラストの遺伝子
導入効率の比較を示す図。
導入効率の比較を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 かほる 東京都千代田区大手町二丁目６番２号 日 立工機株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】 植物の葉、茎、根等の植物組織、あるい
はそれら組織を培養して得られる植物細胞を酵素的に処
理して単離されるプロトプラストの選抜方法において、
プロトプラストが持つ細胞径の分布に対し、細胞径の最
小値と最大値の中間値以上の平均細胞径を持つプロトプ
ラスト集団を選抜する植物プロトプラストの選抜方法。 - 【請求項２】 所定の遠心力場に遠心力と逆方向に流れ
の力を与え、これら２つの力の釣り合いが粒子の大きさ
に依存することを利用して、上記プロトプラストを大き
さの差により選抜することを特徴とする請求項１記載の
植物プロトプラストの選抜方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8125390A JPH09308482A (ja) | 1996-05-21 | 1996-05-21 | 植物プロトプラストの選抜方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8125390A JPH09308482A (ja) | 1996-05-21 | 1996-05-21 | 植物プロトプラストの選抜方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09308482A true JPH09308482A (ja) | 1997-12-02 |
Family
ID=14908961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8125390A Pending JPH09308482A (ja) | 1996-05-21 | 1996-05-21 | 植物プロトプラストの選抜方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09308482A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011528225A (ja) * | 2008-07-16 | 2011-11-17 | ケイビーアイ・バイオファーマ，インコーポレイテッド | 流動床を使用して粒子を操作するための方法及びシステム |
| CN110915446A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广州建筑园林股份有限公司 | 一种基于叶茎隐芽促发的姜花繁育方法 |
-
1996
- 1996-05-21 JP JP8125390A patent/JPH09308482A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011528225A (ja) * | 2008-07-16 | 2011-11-17 | ケイビーアイ・バイオファーマ，インコーポレイテッド | 流動床を使用して粒子を操作するための方法及びシステム |
| JP2015180204A (ja) * | 2008-07-16 | 2015-10-15 | ケーセップ・システムズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 流動床を使用して粒子を操作するための方法及びシステム |
| CN110915446A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广州建筑园林股份有限公司 | 一种基于叶茎隐芽促发的姜花繁育方法 |
| CN110915446B (zh) * | 2019-12-26 | 2021-10-01 | 广州建筑园林股份有限公司 | 一种基于叶茎隐芽促发的姜花繁育方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060516 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060919 |