JPH09224690A - ビオチンの製造方法 - Google Patents
ビオチンの製造方法Info
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- JPH09224690A JPH09224690A JP8057044A JP5704496A JPH09224690A JP H09224690 A JPH09224690 A JP H09224690A JP 8057044 A JP8057044 A JP 8057044A JP 5704496 A JP5704496 A JP 5704496A JP H09224690 A JPH09224690 A JP H09224690A
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- plasmid
- adenosyl
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 組み換え微生物を用いる改良されたビオチン
の製造方法の提供 【解決手段】 Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵
素遺伝子を担持するプラスミドを含んでなる微生物の培
養。
の製造方法の提供 【解決手段】 Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵
素遺伝子を担持するプラスミドを含んでなる微生物の培
養。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組み換え微生物を
用いるビオチンの製造方法に関する。
用いるビオチンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から特定の有用物質の生産能を高め
るべく各種の変異株が創製されてきた。例えば、動植物
および微生物にとって重要なビタミンであるビオチンを
特定の有用物質とするその生産菌について概観すると、
バシルス（Bacillus）属、クロモバクテリウム（Chromo
bacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属およ
びアースロバクター（Arthrobacter）属等の微生物に人
工的突然変異を生起せしめたものが知られている。さら
に、近年の遺伝子組換え法に適用する宿主−ベクター系
の宿主として、具体的にはエシェリヒア（Escherichi
a）属に属するα−デヒドロビオチン耐性株（例えば、
特開昭６１−１４９０９１号公報参照）、ビオチンによ
るフィードバック抑制が解除された株（例えば、特開昭
６１−２０２６８６号公報参照）および酢酸生産能が低
減した株（例えば、ヨーロッパ特許公開第０３１６２２
９号明細書参照）が知られており、またエシェリヒア属
以外に属するものとしては、特定の組換えプラスミドの
宿主としてバシルス属、シュードモナス属またはサッカ
ロミセス（Saccharomyces）属に属する微生物の使用が
知られている（例えば、特開昭６４−４４８８９号公報
参照）。なお、前記特許公報等はそれぞれ対応する宿主
の組換えプラスミドによる形質転換体を用いるビオチン
の製造方法を公表している。
るべく各種の変異株が創製されてきた。例えば、動植物
および微生物にとって重要なビタミンであるビオチンを
特定の有用物質とするその生産菌について概観すると、
バシルス（Bacillus）属、クロモバクテリウム（Chromo
bacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属およ
びアースロバクター（Arthrobacter）属等の微生物に人
工的突然変異を生起せしめたものが知られている。さら
に、近年の遺伝子組換え法に適用する宿主−ベクター系
の宿主として、具体的にはエシェリヒア（Escherichi
a）属に属するα−デヒドロビオチン耐性株（例えば、
特開昭６１−１４９０９１号公報参照）、ビオチンによ
るフィードバック抑制が解除された株（例えば、特開昭
６１−２０２６８６号公報参照）および酢酸生産能が低
減した株（例えば、ヨーロッパ特許公開第０３１６２２
９号明細書参照）が知られており、またエシェリヒア属
以外に属するものとしては、特定の組換えプラスミドの
宿主としてバシルス属、シュードモナス属またはサッカ
ロミセス（Saccharomyces）属に属する微生物の使用が
知られている（例えば、特開昭６４−４４８８９号公報
参照）。なお、前記特許公報等はそれぞれ対応する宿主
の組換えプラスミドによる形質転換体を用いるビオチン
の製造方法を公表している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】微生物産生の有用物質
としてビオチンを例にとると、前述の変異株はいずれも
所定の目的は達成しているとはいえ、いまだ改良の余地
がある。例えば、前記公報のうちヨーロッパ特許出願公
開第０３１６２２９号明細書は前述のごとくビオチンに
よるフィードバック抑制が解除された脱抑制変異株に、
さらに酢酸産生能が低減する形質を付与せしめた変異株
を宿主とし用いることが提案されている。そしてこのよ
うな宿主微生物に、ビオチン生産能を有するエシェリヒ
ア コリ（Escherichia coli）より得たビオチンオペロ
ンをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドを含
有せしめてなる組換えエシェリヒア コリを用い、グル
コースを基質とする安価で、しかも従来と比べ効率的な
ディ・ノボ（de novo）合成によるビオチンの生産方法
も公表されている。
としてビオチンを例にとると、前述の変異株はいずれも
所定の目的は達成しているとはいえ、いまだ改良の余地
がある。例えば、前記公報のうちヨーロッパ特許出願公
開第０３１６２２９号明細書は前述のごとくビオチンに
よるフィードバック抑制が解除された脱抑制変異株に、
さらに酢酸産生能が低減する形質を付与せしめた変異株
を宿主とし用いることが提案されている。そしてこのよ
うな宿主微生物に、ビオチン生産能を有するエシェリヒ
ア コリ（Escherichia coli）より得たビオチンオペロ
ンをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドを含
有せしめてなる組換えエシェリヒア コリを用い、グル
コースを基質とする安価で、しかも従来と比べ効率的な
ディ・ノボ（de novo）合成によるビオチンの生産方法
も公表されている。
【０００４】しかし、さらに有用物質、例えばビオチン
の産生能の向上に資する変異菌株を入手することの必要
性は現在も変わることなく存在する。そこで、本発明の
目的は、特にビオチンの生産に有利に用いることができ
る組み換え体プラスミドを含有せしめた微生物を利用す
ることにより、さらに、効率の良いビオチン類の製造方
法を提供することにある。
の産生能の向上に資する変異菌株を入手することの必要
性は現在も変わることなく存在する。そこで、本発明の
目的は、特にビオチンの生産に有利に用いることができ
る組み換え体プラスミドを含有せしめた微生物を利用す
ることにより、さらに、効率の良いビオチン類の製造方
法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビオチン
生合成の最終段階であるデチオビオチンからビオチンへ
の反応にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンが必要である
［Biosci．Biotech．Biochem.，５６，１７８０（１９
９２）等］こと、及びビオチン生合成中間体である７、
８−ジアミノペラルゴン酸のアミノ基供与体がＳ−アデ
ノシル−Ｌ−メチオニンである［J．Biol．Chem.，２５
０，４０２９（１９７５）等］ことに着目し、ビオチン
生産菌のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生成能を強
化することによりビオチン生産量が向上すると予想し
た。
生合成の最終段階であるデチオビオチンからビオチンへ
の反応にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンが必要である
［Biosci．Biotech．Biochem.，５６，１７８０（１９
９２）等］こと、及びビオチン生合成中間体である７、
８−ジアミノペラルゴン酸のアミノ基供与体がＳ−アデ
ノシル−Ｌ−メチオニンである［J．Biol．Chem.，２５
０，４０２９（１９７５）等］ことに着目し、ビオチン
生産菌のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生成能を強
化することによりビオチン生産量が向上すると予想し
た。
【０００６】こうして、ビオチン生産菌からＳ−アデノ
シル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を分離し、この遺
伝子を利用することによりビオチン蓄積量が著しく増大
した株を取得することに成功した。
シル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を分離し、この遺
伝子を利用することによりビオチン蓄積量が著しく増大
した株を取得することに成功した。
【０００７】したがって、本発明によれば、Ｓ−アデノ
シル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を担持するプラス
ミド及びビオチンオペロンを含んでなる微生物を栄養培
地で培養し、培養物よりビオチンを回収することを特徴
とするビオチンの製造方法が提供される。
シル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を担持するプラス
ミド及びビオチンオペロンを含んでなる微生物を栄養培
地で培養し、培養物よりビオチンを回収することを特徴
とするビオチンの製造方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の方法によれば、ビオチン
は、その前駆体、特にデチオビオチンの強化された生産
性を伴って、ビオチン自体の生産性も高めることができ
る。
は、その前駆体、特にデチオビオチンの強化された生産
性を伴って、ビオチン自体の生産性も高めることができ
る。
【０００９】このような方法において用いられる微生物
は、ビオチンオペロンを宿主菌の染色体上に有するか、
またはビオチンオペロンがプラスミドに担持されて導入
されたもののいずれであってもよい。好ましくは、プラ
スミドに担持された形態のビオチンオペロンを有する微
生物が使用される。より好ましくは、Ｓ−アデノシル−
Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を担持するのと同じプラ
スミド上にビオチンオペロンが組み込まれている形態で
存在する微生物が使用される。これらの微生物は、無
論、それらの染色体上にもビオチンオペロンを有するも
のであってもよい。
は、ビオチンオペロンを宿主菌の染色体上に有するか、
またはビオチンオペロンがプラスミドに担持されて導入
されたもののいずれであってもよい。好ましくは、プラ
スミドに担持された形態のビオチンオペロンを有する微
生物が使用される。より好ましくは、Ｓ−アデノシル−
Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を担持するのと同じプラ
スミド上にビオチンオペロンが組み込まれている形態で
存在する微生物が使用される。これらの微生物は、無
論、それらの染色体上にもビオチンオペロンを有するも
のであってもよい。
【００１０】宿主微生物としては、エシェリヒア属の微
生物を都合よく使用することができ、この場合、ビオチ
ンオペロンはエシェリヒア属に由来するものが有利に使
用できる。
生物を都合よく使用することができ、この場合、ビオチ
ンオペロンはエシェリヒア属に由来するものが有利に使
用できる。
【００１１】本発明に用いられるＳ−アデノシル−Ｌ−
メチオニン合成酵素遺伝子は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メ
チオニン合成酵素活性を有する蛋白質をコードするもの
であれば如何なる遺伝子配列を有するものでもかまわな
いが、好ましくはエシェリヒア コリのＳ−アデノシル
−Ｌ−メチオニン合成酵素蛋白質をコードする遺伝子を
挙げることができる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
合成酵素遺伝子は、たとえば、既知のエシェリヒア コ
リのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子配
列［J．Biol．Chem.，２５９，１４５０５，（１９８
４）］をもとにその翻訳領域を挟む２つのプライマー合
成遺伝子を用いて例えばＰＣＲ（Polymerase Chain Rea
ction）法等で取得することができる。得られるＳ−ア
デノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子がプロモータ
ーを有する場合はそのままプラスミドに連結し、本発明
に用いてもよいが、場合により他のエシェリヒア コリ
発現プロモーター（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子のｂｌａプロモーター）に連結
し、また例えば、市販の誘導型プロモーターを有するプ
ラスミドベクター（例えば、ｔａｃ系誘導型プロモータ
ーを有するｐＫＫ２２３−３、ファルマシア社製、など
が挙げられる）に連結し、用いることができる。
メチオニン合成酵素遺伝子は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メ
チオニン合成酵素活性を有する蛋白質をコードするもの
であれば如何なる遺伝子配列を有するものでもかまわな
いが、好ましくはエシェリヒア コリのＳ−アデノシル
−Ｌ−メチオニン合成酵素蛋白質をコードする遺伝子を
挙げることができる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
合成酵素遺伝子は、たとえば、既知のエシェリヒア コ
リのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子配
列［J．Biol．Chem.，２５９，１４５０５，（１９８
４）］をもとにその翻訳領域を挟む２つのプライマー合
成遺伝子を用いて例えばＰＣＲ（Polymerase Chain Rea
ction）法等で取得することができる。得られるＳ−ア
デノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子がプロモータ
ーを有する場合はそのままプラスミドに連結し、本発明
に用いてもよいが、場合により他のエシェリヒア コリ
発現プロモーター（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子のｂｌａプロモーター）に連結
し、また例えば、市販の誘導型プロモーターを有するプ
ラスミドベクター（例えば、ｔａｃ系誘導型プロモータ
ーを有するｐＫＫ２２３−３、ファルマシア社製、など
が挙げられる）に連結し、用いることができる。
【００１２】ビオチンオペロンとしては、例えばエシェ
リヒア属、バシルス属、セラチア属（Serratia）由来の
ビオチンオペロン等があげられる。エシェリヒア属由来
としてはエシェリヒア コリ由来のビオチンオペロン
（特開昭６１−２０２６８６号公報参照）があげられ
る。該ビオチンオペロンには、ビオチン生合成に関与す
るｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ
の５つの遺伝子がコードされている。また、これらのビ
オチンオペロンの一部を改変したものも本発明では用い
ることができ、例えば、エシェリヒア コリのビオチン
オペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍のいず
れかの塩基配列が野生型に比べて少なくとも１塩基対変
異しているもの等が挙げられる。ここにいうビオチンオ
ペロンの制御領域とは、ｂｉｏＡとｂｉｏＢの間に存在
するｒ鎖を示す配列表の配列番号１、及びより詳細に
は、図１に示す塩基配列のうちｂｉｏＢ開始コドンＡＴ
ＧのＡを１として−１番目の塩基対から−８６番目の塩
基対までの領域をいい、ｂｉｏＢ開始コドン近傍とは、
ｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として１番目の塩基
対から６番目の塩基対までの領域をいう。さらに具体的
には、ｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として上流−
５３番目、−５番目、下流４番目の少なくともいずれか
ひとつのＧＣ対がＡＴ対に変異されたもの等が挙げられ
る（特開平５−２１９９５６号公報参照）。
リヒア属、バシルス属、セラチア属（Serratia）由来の
ビオチンオペロン等があげられる。エシェリヒア属由来
としてはエシェリヒア コリ由来のビオチンオペロン
（特開昭６１−２０２６８６号公報参照）があげられ
る。該ビオチンオペロンには、ビオチン生合成に関与す
るｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ
の５つの遺伝子がコードされている。また、これらのビ
オチンオペロンの一部を改変したものも本発明では用い
ることができ、例えば、エシェリヒア コリのビオチン
オペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍のいず
れかの塩基配列が野生型に比べて少なくとも１塩基対変
異しているもの等が挙げられる。ここにいうビオチンオ
ペロンの制御領域とは、ｂｉｏＡとｂｉｏＢの間に存在
するｒ鎖を示す配列表の配列番号１、及びより詳細に
は、図１に示す塩基配列のうちｂｉｏＢ開始コドンＡＴ
ＧのＡを１として−１番目の塩基対から−８６番目の塩
基対までの領域をいい、ｂｉｏＢ開始コドン近傍とは、
ｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として１番目の塩基
対から６番目の塩基対までの領域をいう。さらに具体的
には、ｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として上流−
５３番目、−５番目、下流４番目の少なくともいずれか
ひとつのＧＣ対がＡＴ対に変異されたもの等が挙げられ
る（特開平５−２１９９５６号公報参照）。
【００１３】本発明で用いられるプラスミドとしては、
例えばエシェリヒア属、バシルス属またはセラチア属に
属する微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるもの
があげられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生
物に保持されているプラスミドであり、ｐＢＲ３２２系
プラスミド、コリシン（Col１）Ｅ１系プラスミド、ラ
ムダーファージ系などの通常使用されているものが挙げ
られる。ビオチンオペロンを有するプラスミドとして
は、例えばｐＸＢＡ３１２（エシェリヒア コリＤＲＫ
−３３２３［ｐＸＢＡ３１２］（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
１７）由来、特開平２−５０２０６５号公報）、ｐＸＢ
ＲＰ３１９（エシェリヒア・コリＭＭ４４／ｐＸＢＲＰ
３１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４）］由来のもの、及
びそれらの誘導体等があげられる。
例えばエシェリヒア属、バシルス属またはセラチア属に
属する微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるもの
があげられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生
物に保持されているプラスミドであり、ｐＢＲ３２２系
プラスミド、コリシン（Col１）Ｅ１系プラスミド、ラ
ムダーファージ系などの通常使用されているものが挙げ
られる。ビオチンオペロンを有するプラスミドとして
は、例えばｐＸＢＡ３１２（エシェリヒア コリＤＲＫ
−３３２３［ｐＸＢＡ３１２］（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
１７）由来、特開平２−５０２０６５号公報）、ｐＸＢ
ＲＰ３１９（エシェリヒア・コリＭＭ４４／ｐＸＢＲＰ
３１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４）］由来のもの、及
びそれらの誘導体等があげられる。
【００１４】Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素
遺伝子をこれらのプラスミドに連結して用いることも可
能であり、好ましい例としては後述の実施例３で得られ
たプラスミドｐＢＭＰ３１９，ｐＸＭＨ３１２３，ｐＢ
ＲＭ３６，ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ９１０等が挙げ
られる。
遺伝子をこれらのプラスミドに連結して用いることも可
能であり、好ましい例としては後述の実施例３で得られ
たプラスミドｐＢＭＰ３１９，ｐＸＭＨ３１２３，ｐＢ
ＲＭ３６，ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ９１０等が挙げ
られる。
【００１５】本発明で宿主菌株として用いられる微生物
としては、ビオチン産生蓄積能を有する微生物であれば
いずれでもよく、例えばエシェリヒア属、バシルス属ま
たはセラチア属に属する微生物等が挙げられる。このう
ちエシェリヒア コリ属に属する微生物が好ましい。
としては、ビオチン産生蓄積能を有する微生物であれば
いずれでもよく、例えばエシェリヒア属、バシルス属ま
たはセラチア属に属する微生物等が挙げられる。このう
ちエシェリヒア コリ属に属する微生物が好ましい。
【００１６】エシェリヒア属に属する微生物としては、
例えばエシェリヒア コリ ＩＦＯ１４４１０、エシェ
リヒア コリ Ｗ−３１１０（ＩＦＯ １２７１３）お
よびその由来株エシェリヒア コリ ＤＲ−８５（特開
昭６１−２０２６８６号公報参照）、エシェリヒア コ
リ ＤＲ−３３２（特開昭６２−１５５０８１号公報参
照）、エシェリヒア コリ ＤＲＫ−３３２３（特表平
２−５０２６５号公報参照）、エシェリヒア コリ Ｂ
Ｍ４０６２（特表昭６４−５０００８１号公報参照）、
エシェリヒア コリＢＤ１０［ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２
５株よりプラスミドを除去した宿主菌株］、同ＡＮＡ９
１［ＦＥＲＭ ＢＰ−４４９２８株よりプラスミドを除
去した宿主菌株］等が挙げられる。
例えばエシェリヒア コリ ＩＦＯ１４４１０、エシェ
リヒア コリ Ｗ−３１１０（ＩＦＯ １２７１３）お
よびその由来株エシェリヒア コリ ＤＲ−８５（特開
昭６１−２０２６８６号公報参照）、エシェリヒア コ
リ ＤＲ−３３２（特開昭６２−１５５０８１号公報参
照）、エシェリヒア コリ ＤＲＫ−３３２３（特表平
２−５０２６５号公報参照）、エシェリヒア コリ Ｂ
Ｍ４０６２（特表昭６４−５０００８１号公報参照）、
エシェリヒア コリＢＤ１０［ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２
５株よりプラスミドを除去した宿主菌株］、同ＡＮＡ９
１［ＦＥＲＭ ＢＰ−４４９２８株よりプラスミドを除
去した宿主菌株］等が挙げられる。
【００１７】上記のプラスミドを用いて宿主菌を形質転
換する方法としては、それ自体既知の方法、例えばエシ
ェリヒア属に属する微生物を宿主とする場合は、上記の
モレキュラー・クローニング ア・ラボラトリー・マニ
ュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSp
ring Habor Laboratory）、１９８２に記載されている
方法等があげられる。こうして得られた形質転換体は、
エシェリヒア属に属する微生物を培養するのに通常用い
られている栄養培地、培養条件下で培養することによっ
て、培養液中にビオチンを著量蓄積することができる。
換する方法としては、それ自体既知の方法、例えばエシ
ェリヒア属に属する微生物を宿主とする場合は、上記の
モレキュラー・クローニング ア・ラボラトリー・マニ
ュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSp
ring Habor Laboratory）、１９８２に記載されている
方法等があげられる。こうして得られた形質転換体は、
エシェリヒア属に属する微生物を培養するのに通常用い
られている栄養培地、培養条件下で培養することによっ
て、培養液中にビオチンを著量蓄積することができる。
【００１８】例えば、本発明の培養に用いられる培地
は、用いられる微生物が利用し得る栄養源を含むものな
ら、液状でも固状でもよいが、大量に処理するときには
液体培地を用いるのがより適当である。培地には同化し
得る炭素源、消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素
等が適宜配合される。炭素源としては、たとえばブドウ
糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、でん粉、マ
ンニトール、ソルビトール、グリセロール、油脂類
（例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、ごま油、ラード
油、チキン油など）、各種脂肪酸（例、ラウリン酸、ミ
リスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸
など）等が用いられる。窒素源としては、たとえば肉エ
キス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、脱脂大豆粉、コ
ーンスティープリカー、ペプトン、綿実粉、癈糖密、尿
素、チオ尿素、アンモニア、アンモニウム塩類（例、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなど）等を用いることができる。
さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニ
ッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩類、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用いられ
る。さらに、アミノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸、アラニン、リジン、バリン、メチオニン、プロリ
ン等）、ペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド
等）、ビタミン類（例、Ｂ1、Ｂ2、ニコチン酸、Ｂ12、
Ｃ等）、核酸類（例、プリン、ピリミジンおよびその誘
導体）等を用いてもよい。培地のｐＨを調節する目的で
無機または有機の酸、アルカリ類等を加えてもよく、あ
るいは消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量を用い
ることができる。作出された微生物に薬剤耐性が付与さ
れている場合には、対応する抗菌剤を培地に添加するこ
とによって汚染菌の混入を防ぐことができる。培養は振
とう培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件下で行
うのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望
ましい。培養期間は通常２４〜７２時間程度である。培
養を終了した後、培養液からのビオチン類の回収にあた
っては、ビオチン類の諸性質を利用して、一般の天然物
からの抽出精製に利用される諸方法が応用できる。例え
ば、培養物から菌体を除き、活性炭にビオチン類を吸着
させ、しかるのち溶出させてイオン交換樹脂で分離精製
するか、あるいは培養ろ液を直接イオン交換樹脂で処理
して分離精製し、水またはアルコールより再結晶するこ
とによりビオチン類を精製することができる。
は、用いられる微生物が利用し得る栄養源を含むものな
ら、液状でも固状でもよいが、大量に処理するときには
液体培地を用いるのがより適当である。培地には同化し
得る炭素源、消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素
等が適宜配合される。炭素源としては、たとえばブドウ
糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、でん粉、マ
ンニトール、ソルビトール、グリセロール、油脂類
（例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、ごま油、ラード
油、チキン油など）、各種脂肪酸（例、ラウリン酸、ミ
リスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸
など）等が用いられる。窒素源としては、たとえば肉エ
キス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、脱脂大豆粉、コ
ーンスティープリカー、ペプトン、綿実粉、癈糖密、尿
素、チオ尿素、アンモニア、アンモニウム塩類（例、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなど）等を用いることができる。
さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニ
ッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩類、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用いられ
る。さらに、アミノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸、アラニン、リジン、バリン、メチオニン、プロリ
ン等）、ペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド
等）、ビタミン類（例、Ｂ1、Ｂ2、ニコチン酸、Ｂ12、
Ｃ等）、核酸類（例、プリン、ピリミジンおよびその誘
導体）等を用いてもよい。培地のｐＨを調節する目的で
無機または有機の酸、アルカリ類等を加えてもよく、あ
るいは消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量を用い
ることができる。作出された微生物に薬剤耐性が付与さ
れている場合には、対応する抗菌剤を培地に添加するこ
とによって汚染菌の混入を防ぐことができる。培養は振
とう培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件下で行
うのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望
ましい。培養期間は通常２４〜７２時間程度である。培
養を終了した後、培養液からのビオチン類の回収にあた
っては、ビオチン類の諸性質を利用して、一般の天然物
からの抽出精製に利用される諸方法が応用できる。例え
ば、培養物から菌体を除き、活性炭にビオチン類を吸着
させ、しかるのち溶出させてイオン交換樹脂で分離精製
するか、あるいは培養ろ液を直接イオン交換樹脂で処理
して分離精製し、水またはアルコールより再結晶するこ
とによりビオチン類を精製することができる。
【００１９】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲をこれらの例に限定するこ
とを意図するものではない。
に説明するが、本発明の範囲をこれらの例に限定するこ
とを意図するものではない。
【００２０】実施例１ エシェリヒア コリのＳ−アデ
ノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子のクローニング （１） 染色体ＤＮＡの調製 大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ１４９８）株をＬ−培地
（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、グルコー
ス１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、）中、３７℃３
時間振とう培養を行い、対数増殖期の菌体を集洗後、フ
ェノール法［Biochim. Biophys. Acta. ７２，６１９
（１９６３）］による通常のＤＮＡ抽出法によって抽出
精製し、染色体ＤＮＡを得た。
ノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子のクローニング （１） 染色体ＤＮＡの調製 大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ１４９８）株をＬ−培地
（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、グルコー
ス１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、）中、３７℃３
時間振とう培養を行い、対数増殖期の菌体を集洗後、フ
ェノール法［Biochim. Biophys. Acta. ７２，６１９
（１９６３）］による通常のＤＮＡ抽出法によって抽出
精製し、染色体ＤＮＡを得た。
【００２１】（２） ＰＣＲ法によるＳ−アデノシル−
Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子の増幅 前記エシェリヒア コリ染色体ＤＮＡを鋳型にして、Ｓ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子［J．Bio
l．Chem.，２５９、１４５０５（１９８４）参照］の翻
訳領域を挟む２つの合成プライマー［５′−ＣＣＡＣＡ
ＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧＡＧＣ−３′（配列番号２）、
［５′−ＴＴＧＧＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧ−３′（配列番号３）］（ＴＡＫＡＲＡ社カス
タム合成）を用い、GaneAmpR PCR Reagent Kit（Ｔａｋ
ａｒａ社製）を使って、ＤＮＡ変性９２℃１分、プライ
マーのアニーリングは６０℃２分、プライマー伸張反応
は７２℃３分で、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子の増幅 前記エシェリヒア コリ染色体ＤＮＡを鋳型にして、Ｓ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子［J．Bio
l．Chem.，２５９、１４５０５（１９８４）参照］の翻
訳領域を挟む２つの合成プライマー［５′−ＣＣＡＣＡ
ＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧＡＧＣ−３′（配列番号２）、
［５′−ＴＴＧＧＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧ−３′（配列番号３）］（ＴＡＫＡＲＡ社カス
タム合成）を用い、GaneAmpR PCR Reagent Kit（Ｔａｋ
ａｒａ社製）を使って、ＤＮＡ変性９２℃１分、プライ
マーのアニーリングは６０℃２分、プライマー伸張反応
は７２℃３分で、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
【００２２】（３） Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
合成酵素遺伝子のクローニング 前記ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＡ
ＫＡＲＡ社製）で５′−Ｐを付加した後、クレノウフラ
グメント（ＴＡＫＡＲＡ社製）処理で末端を平滑末端と
して揃えて、クローニングベクター BluescriptIISK
（ＴＯＹＯＢＯ社製）の SmaI 部位に挿入し、ベクター
に存在するベーターガラクトシダーゼ遺伝子に対して逆
向きにＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子
が挿入されたｐＭＫ３０８プラスミドを選択した。
合成酵素遺伝子のクローニング 前記ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＡ
ＫＡＲＡ社製）で５′−Ｐを付加した後、クレノウフラ
グメント（ＴＡＫＡＲＡ社製）処理で末端を平滑末端と
して揃えて、クローニングベクター BluescriptIISK
（ＴＯＹＯＢＯ社製）の SmaI 部位に挿入し、ベクター
に存在するベーターガラクトシダーゼ遺伝子に対して逆
向きにＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子
が挿入されたｐＭＫ３０８プラスミドを選択した。
【００２３】実施例２ 発現系の構築 実施例１で得られたプラスミドｐＭＫ３０８を制限酵素
ＸｂａＩ、ＸｈｏＩで切断後、クレノウフラグメント処
理で末端を平滑末端として揃えて、プラスミドｐＢＲ３
２２のＳｓｐＩ部位に挿入し、ｂｌａプロモーターに対
して正方向に挿入されたｐＭＴＡ２を選択した。
ＸｂａＩ、ＸｈｏＩで切断後、クレノウフラグメント処
理で末端を平滑末端として揃えて、プラスミドｐＢＲ３
２２のＳｓｐＩ部位に挿入し、ｂｌａプロモーターに対
して正方向に挿入されたｐＭＴＡ２を選択した。
【００２４】実施例３ ビオチンオペロンの導入 （１）野性型ビオチンオペロンを含むプラスミドの構築 エシェリヒア コリＭＭ４４／ｐＸＢＲＰ３１９（ＩＦ
Ｏ １５７２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４）より常法に
より取得されるｐＸＢＲＰ３１９は、ビオチンオペロン
を含むプラスミドである。エシエリヒア コリＤＲＫ３
３２３／ｐＸＢＡ３１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７、
特開平２−５０５０６５号公報参照）株から常法により
取得されるｐＸＢＡ３１２はビオチンオペロンを含むプ
ラスミドである。プラスミドｐＸＢＲ３１９およびｐＸ
ＫＲ４０１はｐＸＢＡ３１２由来のコピー数の異なるプ
ラスミドである。プラスミドｐＸＢＲ３１９は、次のよ
うに作製した。ｐＸＢＡ３１２を制限酵素ＥｃｏＲＩに
より完全切断後、制限酵素ＰｓｔＩで部分切断し（切断
部位が２箇所存在するため、ｂｉｏＤ内のＰｓｔＩサイ
トを残した断片を選択する）、ビオチンオペロンを完全
に含む断片を回収する。次に、この断片をプラスミドｐ
ＢＲ３２２（ＴＡＫＡＲＡ社製）のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位に挿入して、プラスミドｐＸＢＡ３１２に比ベコ
ピー数が少ない野性株ビオチンオペロンを有するプラス
ミドｐＸＢＲ３１９を作製した。プラスミドｐＸＫＲ４
０１は次のように作製した。プラスミドｐＭＷ１１９
（ニッポンジーン社製）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＡｔ
ａＩＩを用いて完全に切断した。得られた約２.４ｋｂ
ｐの断片を、クレノウフラグメント処理を末端を平滑末
端として揃えた。一方、プラスミドｐＢＲ３２２を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩを用いて完全に切断し
た。得られた約１.４ｋｂｐの断片を、クレノウフラグ
メント処理で末端を平滑末端として揃えた。これら２つ
の断片をＤＮＡライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社
製）を用いて連結させ、制限酵素ＸｂａＩを用いて切断
した。この約３.８ｋｂｐの断片をプラスミドｐＸＢＡ
３１２の制限酵素ＸｂａＩ切断により得られるビオチン
オペロンを含む約６.０ｋｂｐの断片にＤＮＡライゲー
ションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結させ
た。得られたプラスミドｐＸＫＲ４０１は、コピー数が
５以下の野性型ビオチンオペロンを有するプラスミドで
ある。
Ｏ １５７２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４）より常法に
より取得されるｐＸＢＲＰ３１９は、ビオチンオペロン
を含むプラスミドである。エシエリヒア コリＤＲＫ３
３２３／ｐＸＢＡ３１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７、
特開平２−５０５０６５号公報参照）株から常法により
取得されるｐＸＢＡ３１２はビオチンオペロンを含むプ
ラスミドである。プラスミドｐＸＢＲ３１９およびｐＸ
ＫＲ４０１はｐＸＢＡ３１２由来のコピー数の異なるプ
ラスミドである。プラスミドｐＸＢＲ３１９は、次のよ
うに作製した。ｐＸＢＡ３１２を制限酵素ＥｃｏＲＩに
より完全切断後、制限酵素ＰｓｔＩで部分切断し（切断
部位が２箇所存在するため、ｂｉｏＤ内のＰｓｔＩサイ
トを残した断片を選択する）、ビオチンオペロンを完全
に含む断片を回収する。次に、この断片をプラスミドｐ
ＢＲ３２２（ＴＡＫＡＲＡ社製）のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位に挿入して、プラスミドｐＸＢＡ３１２に比ベコ
ピー数が少ない野性株ビオチンオペロンを有するプラス
ミドｐＸＢＲ３１９を作製した。プラスミドｐＸＫＲ４
０１は次のように作製した。プラスミドｐＭＷ１１９
（ニッポンジーン社製）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＡｔ
ａＩＩを用いて完全に切断した。得られた約２.４ｋｂ
ｐの断片を、クレノウフラグメント処理を末端を平滑末
端として揃えた。一方、プラスミドｐＢＲ３２２を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩを用いて完全に切断し
た。得られた約１.４ｋｂｐの断片を、クレノウフラグ
メント処理で末端を平滑末端として揃えた。これら２つ
の断片をＤＮＡライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社
製）を用いて連結させ、制限酵素ＸｂａＩを用いて切断
した。この約３.８ｋｂｐの断片をプラスミドｐＸＢＡ
３１２の制限酵素ＸｂａＩ切断により得られるビオチン
オペロンを含む約６.０ｋｂｐの断片にＤＮＡライゲー
ションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結させ
た。得られたプラスミドｐＸＫＲ４０１は、コピー数が
５以下の野性型ビオチンオペロンを有するプラスミドで
ある。
【００２５】（２）変異型ビオチンオペロンを含むプラ
スミドの構築 図１に示すビオチンオペロンの制御領域に変異をもつプ
ラスミドを構築した。前記のプラスミドｐＸＫＲ４０１
のｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として上流−５３
番目のＧＣ対がＡＴ対に変異された（特開平５−２１９
９５６号公報参照）プラスミドｐＸＫＳ９１２を以下の
ようにして構築した。プラスミドｐＸＫＲ４０１を制限
酵素ＥｃｏＴ２２１およびＮｃｏＩを用いて完全に切断
し、約８.２ｋｂｐ断片を得た。この断片とプラスミド
ｐＡＭＰ９１２（特開平５−２１９９５６号公報参照）
の制限酵素ＥｃｏＴ２２１およびＮｃｏＩを用いて完全
に切断し得られた約０.８８ｋｂｐ断片とをＤＮＡライ
ゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結さ
せた。得られたプラスミドｐＸＫＳ９１２はコピー数が
５以下の変異型ビオチンオペロンを有するプラスミドで
ある。
スミドの構築 図１に示すビオチンオペロンの制御領域に変異をもつプ
ラスミドを構築した。前記のプラスミドｐＸＫＲ４０１
のｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として上流−５３
番目のＧＣ対がＡＴ対に変異された（特開平５−２１９
９５６号公報参照）プラスミドｐＸＫＳ９１２を以下の
ようにして構築した。プラスミドｐＸＫＲ４０１を制限
酵素ＥｃｏＴ２２１およびＮｃｏＩを用いて完全に切断
し、約８.２ｋｂｐ断片を得た。この断片とプラスミド
ｐＡＭＰ９１２（特開平５−２１９９５６号公報参照）
の制限酵素ＥｃｏＴ２２１およびＮｃｏＩを用いて完全
に切断し得られた約０.８８ｋｂｐ断片とをＤＮＡライ
ゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結さ
せた。得られたプラスミドｐＸＫＳ９１２はコピー数が
５以下の変異型ビオチンオペロンを有するプラスミドで
ある。
【００２６】（３）ビオチンオペロンをもつプラスミド
へのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子の
導入 前記プラスミドｐＸＢＲＰ３１９、ｐＸＢＡ３１２、ｐ
ＸＢＲ３１９、ｐＸＫＲ４０１およびｐＸＫＳ９１２の
ＥｃｏＲＩ部位に、実施例２で取得されたｐＭＴＡ２を
ＥｃｏＲＩで切断後、取得された発現型Ｓ−アデノシル
−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を含む断片をそれぞれ
挿入し、それぞれプラスミドｐＢＭＰ３１９、ｐＸＭＨ
３１２３、ｐＢＲＭ３６、ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ
９１０を取得した。
へのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子の
導入 前記プラスミドｐＸＢＲＰ３１９、ｐＸＢＡ３１２、ｐ
ＸＢＲ３１９、ｐＸＫＲ４０１およびｐＸＫＳ９１２の
ＥｃｏＲＩ部位に、実施例２で取得されたｐＭＴＡ２を
ＥｃｏＲＩで切断後、取得された発現型Ｓ−アデノシル
−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子を含む断片をそれぞれ
挿入し、それぞれプラスミドｐＢＭＰ３１９、ｐＸＭＨ
３１２３、ｐＢＲＭ３６、ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ
９１０を取得した。
【００２７】実施例４ ＡＮＡ９１株へのプラスミドの
導入 エシェリヒア コリＡＮＡ９１／ｐＸＢＲＰ３１９（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９２８）株よりアクリジンオレンジを
用いたキュアリングによりプラスミドを除去したＡＮＡ
９１株に常法のカルシウム法［J．Mol．Biol.，５３，
１０９，（１９７０）］によりプラスミドｐＢＭＰ３１
９を形質転換し、ＡＮＡ９１／ｐＢＭＰ３１９株を取得
した。
導入 エシェリヒア コリＡＮＡ９１／ｐＸＢＲＰ３１９（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９２８）株よりアクリジンオレンジを
用いたキュアリングによりプラスミドを除去したＡＮＡ
９１株に常法のカルシウム法［J．Mol．Biol.，５３，
１０９，（１９７０）］によりプラスミドｐＢＭＰ３１
９を形質転換し、ＡＮＡ９１／ｐＢＭＰ３１９株を取得
した。
【００２８】実施例５ ＤＲＫ３３２３株へのプラスミ
ドの導入 エシエリヒア コリＤＲＫ３３２３株（微工研条寄２１
１６号、特表平２−５０２６５号公報参照）にカルシウ
ム法によりプラスミドｐＸＭＨ３１２３、ｐＢＲＭ３
６、ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ９１０をそれぞれ形質
転換し、ＤＲＫ３３２３／ｐＸＭＨ３１２３、ＤＲＫ３
３２３／ｐＢＲＭ３６、ＤＲＫ３３２３／ｐＫＲＭ４２
およびＤＲＫ３３２３／ｐＫＳＭ９１０株をそれぞれ取
得した。
ドの導入 エシエリヒア コリＤＲＫ３３２３株（微工研条寄２１
１６号、特表平２−５０２６５号公報参照）にカルシウ
ム法によりプラスミドｐＸＭＨ３１２３、ｐＢＲＭ３
６、ｐＫＲＭ４２およびｐＫＳＭ９１０をそれぞれ形質
転換し、ＤＲＫ３３２３／ｐＸＭＨ３１２３、ＤＲＫ３
３２３／ｐＢＲＭ３６、ＤＲＫ３３２３／ｐＫＲＭ４２
およびＤＲＫ３３２３／ｐＫＳＭ９１０株をそれぞれ取
得した。
【００２９】実施例６ ビオチンの生産量 実施例４で取得されたＡＮＡ９１／ｐＢＭＰ３１９株お
よびコントロールとしてＡＮＡ９１／ｐＸＢＲＰ３１９
株の２株の菌体懸濁液をそれぞれ１２ｍｇ／ｌのテトラ
サイクリンを含む２ｘＹＴ寒天培地（トリプトン１６ｇ
／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ
および寒天１５ｇ／ｌ）に塗抹し、３７℃で約１６時間
保温した。生育したコロニーの１白金耳をグルコース３
０ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／ｌ、コーンスティー
プリカー５０ｇ／ｌ、硫安２ｇ／ｌ、ＤＬ−アラニン３
ｇ／ｌ、リン酸一カリウム１ｇ／ｌ、リン酸二カリウム
２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（７水和物）０.１ｇ／
ｌ、硫酸第一鉄（７水和物）０.０３ｇ／ｌ、硫酸マン
ガン（４−６水和物）０.０３ｇ／ｌ、ＤＬ−メチオニ
ン０.５g/ｌ（または無添加）およびチアミン塩酸塩０.
０２ｇ／ｌからなる培地（ｐＨ７.１）１ｍｌを含む試
験管に接種し、３７℃で３０時間振とうしながら培養を
行った。培養後の培養液を遠心分離し、ビオンチンを得
た。実施例５で得られたＤＲＫ３３２３／ｐＸＭＨ３１
２３、ＤＲＫ３３２３／ｐＢＲＭ３６、ＤＲＫ３３２３
／ｐＫＲＭ４２株、ＤＲＫ３３２３／ｐＫＳＭ９１０株
およびそれぞれのコントロールとしてＤＲＫ３３２３／
ｐＸＢＡ３１２、ＤＲＫ３３２３／ｐＸＢＲ３１９、Ｄ
ＲＫ３３２３／ｐＸＫＲ４０１、ＤＲＫ３３２３／ｐＸ
ＫＳ９１２株の合計８株を、まず前培養としてＬ−培地
（テトラサイクリン２０ｍｇ／ｌを含む）３０ｍｌを含
む２００ｍｌ容フラスコに寒天保存培地から一白金耳接
種して３７℃で１６時間振とう培養した。この前培養液
の０.６ｍｌをＨ−培地（リン酸二ナトリウム）（１２
水和物）１７.６ｇ／ｌ、リン酸一カリウム２.４ｇ／
ｌ、硫酸アンモニウム４.０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ
／ｌ、硫酸第一鉄（７水和物）０.１ｇ／ｌ、塩化カル
シウム（２水和物）０.０５ｇ／ｌ、塩化マンガン（４
水和物）０.０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（７水和
物）０.１ｇ／ｌ、グリコース５.０ｇ／ｌ、ＤＬ−アラ
ニン５.０ｇ／ｌ（ｐＨ７.１）２０ｍｌを含む５００ｍ
ｌ容坂口フラスコで３７℃で２４時間振とう培養した。
培養後の培養液を遠心分離し、ビオチンを得た。
よびコントロールとしてＡＮＡ９１／ｐＸＢＲＰ３１９
株の２株の菌体懸濁液をそれぞれ１２ｍｇ／ｌのテトラ
サイクリンを含む２ｘＹＴ寒天培地（トリプトン１６ｇ
／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ
および寒天１５ｇ／ｌ）に塗抹し、３７℃で約１６時間
保温した。生育したコロニーの１白金耳をグルコース３
０ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／ｌ、コーンスティー
プリカー５０ｇ／ｌ、硫安２ｇ／ｌ、ＤＬ−アラニン３
ｇ／ｌ、リン酸一カリウム１ｇ／ｌ、リン酸二カリウム
２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（７水和物）０.１ｇ／
ｌ、硫酸第一鉄（７水和物）０.０３ｇ／ｌ、硫酸マン
ガン（４−６水和物）０.０３ｇ／ｌ、ＤＬ−メチオニ
ン０.５g/ｌ（または無添加）およびチアミン塩酸塩０.
０２ｇ／ｌからなる培地（ｐＨ７.１）１ｍｌを含む試
験管に接種し、３７℃で３０時間振とうしながら培養を
行った。培養後の培養液を遠心分離し、ビオンチンを得
た。実施例５で得られたＤＲＫ３３２３／ｐＸＭＨ３１
２３、ＤＲＫ３３２３／ｐＢＲＭ３６、ＤＲＫ３３２３
／ｐＫＲＭ４２株、ＤＲＫ３３２３／ｐＫＳＭ９１０株
およびそれぞれのコントロールとしてＤＲＫ３３２３／
ｐＸＢＡ３１２、ＤＲＫ３３２３／ｐＸＢＲ３１９、Ｄ
ＲＫ３３２３／ｐＸＫＲ４０１、ＤＲＫ３３２３／ｐＸ
ＫＳ９１２株の合計８株を、まず前培養としてＬ−培地
（テトラサイクリン２０ｍｇ／ｌを含む）３０ｍｌを含
む２００ｍｌ容フラスコに寒天保存培地から一白金耳接
種して３７℃で１６時間振とう培養した。この前培養液
の０.６ｍｌをＨ−培地（リン酸二ナトリウム）（１２
水和物）１７.６ｇ／ｌ、リン酸一カリウム２.４ｇ／
ｌ、硫酸アンモニウム４.０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ
／ｌ、硫酸第一鉄（７水和物）０.１ｇ／ｌ、塩化カル
シウム（２水和物）０.０５ｇ／ｌ、塩化マンガン（４
水和物）０.０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（７水和
物）０.１ｇ／ｌ、グリコース５.０ｇ／ｌ、ＤＬ−アラ
ニン５.０ｇ／ｌ（ｐＨ７.１）２０ｍｌを含む５００ｍ
ｌ容坂口フラスコで３７℃で２４時間振とう培養した。
培養後の培養液を遠心分離し、ビオチンを得た。
【００３０】ビオチンの定量は、ビオチンとデチオビオ
チンの総量としてその濃度をアビジンを用いた比色定量
法［Methods in Enzymology Vol．ＸＶＶＩ．４９］に
より定量し、算出した。ビオチンの定量はラクトバシル
スプランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いたバイオア
ッセイ法で定量し、算出した。
チンの総量としてその濃度をアビジンを用いた比色定量
法［Methods in Enzymology Vol．ＸＶＶＩ．４９］に
より定量し、算出した。ビオチンの定量はラクトバシル
スプランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いたバイオア
ッセイ法で定量し、算出した。
【００３１】結果を図２及び図３に示す。この図より、
本発明の方法、すなわち、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオ
ニン合成酵素遺伝子をビオチンオペロンと共に担持する
プラスミドによる形質転換体すべてが、前記遺伝子をも
たず、ビオチンオペロンを担持するプラスミドによる形
質転換体に比し、有意に優れたビオチンおよびデチオビ
オチンの生産性を示すことが分かる。
本発明の方法、すなわち、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオ
ニン合成酵素遺伝子をビオチンオペロンと共に担持する
プラスミドによる形質転換体すべてが、前記遺伝子をも
たず、ビオチンオペロンを担持するプラスミドによる形
質転換体に比し、有意に優れたビオチンおよびデチオビ
オチンの生産性を示すことが分かる。
【００３２】
【発明の効果】本発明は、従来の組み換え微生物を用い
る技術に比し、有意に優れたビオチン類の発酵製造方法
が提供される。この優れた効果は、組み換え微生物の形
質転換をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝
子を担持するプラスミドを用いて行ったことにより得ら
れる。
る技術に比し、有意に優れたビオチン類の発酵製造方法
が提供される。この優れた効果は、組み換え微生物の形
質転換をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝
子を担持するプラスミドを用いて行ったことにより得ら
れる。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【図１】ビオチンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始
コドン近傍の塩基配列を示す図である。
コドン近傍の塩基配列を示す図である。
【図２】本発明と従来方法によるビオチン類の生産性の
比較を示すグラフである。なお、図中、（metk）は、Ｓ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子が存在す
ることを意味する。
比較を示すグラフである。なお、図中、（metk）は、Ｓ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子が存在す
ることを意味する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 神崎 直之 大阪府茨木市大正町２−15−203 (72)発明者 中濱 一雄 京都府長岡京市梅が丘１丁目16番地の２
Claims (5)
- 【請求項１】 Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵
素遺伝子を担持するプラスミド及びビオチンオペロンを
含んでなる微生物を栄養培地で培養し、培養物よりビオ
チンを回収することを特徴とするビオチンの製造方法。 - 【請求項２】 前記ビオチンオペロンがプラスミドに担
持されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記微生物がエシェリヒア コリであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記ビオチンオペロン及びＳ−アデノシ
ル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子が同一のプラスミド
に担持されている、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項５】 前記ビオチンオペロン及びＳ−アデノシ
ル−Ｌ−メチオニン合成酵素遺伝子がエシェリヒア コ
リに由来するものである、請求項１〜４のいずれか１項
に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8057044A JPH09224690A (ja) | 1996-02-21 | 1996-02-21 | ビオチンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8057044A JPH09224690A (ja) | 1996-02-21 | 1996-02-21 | ビオチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224690A true JPH09224690A (ja) | 1997-09-02 |
Family
ID=13044459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8057044A Pending JPH09224690A (ja) | 1996-02-21 | 1996-02-21 | ビオチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09224690A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999042591A1 (de) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von biotin |
| WO2003008591A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Bio Holdings Co., Ltd. | Adenosylmethionine synthetase from streptomyces sp., gene sequences coding the same and method for mass production of secondary metabolites including antibiotics thereof |
-
1996
- 1996-02-21 JP JP8057044A patent/JPH09224690A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999042591A1 (de) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von biotin |
| WO2003008591A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Bio Holdings Co., Ltd. | Adenosylmethionine synthetase from streptomyces sp., gene sequences coding the same and method for mass production of secondary metabolites including antibiotics thereof |
| KR100526770B1 (ko) * | 2001-07-16 | 2005-11-08 | 서주원 | 스트렙토마이세스 속 균주 유래의 아데노실메치요닌 생합성 효소, 이를 코딩하는 유전자 염기서열 및 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 대량 생산방법 |
| US7666631B2 (en) | 2001-07-16 | 2010-02-23 | Joo-Won Suh | Adenosylmethionine synthetase from streptomyces sp., gene sequences coding the same and method for mass production of secondary metabolites including antibiotics thereof |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061010 |